ARGUMENT FÖR OCH EMOT LAGVALSFRIHET

I dokument Internationella makars rätt att välja tillämplig rättsordning - särskilt vid bodelning (sidor 36-39)

3.4 DISKUSSION

3.4.1 ARGUMENT FÖR OCH EMOT LAGVALSFRIHET

Jednym z pierwszych odkrytych czynników transkrypcyjnych odpowiedzialnych za różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych jest produkt genu TAZ (ang.

transciptional coactivator with PDZ-binding motif) - koaktywator transkrypcyjny z motywem wiążącym domenę PDZ. W zależności od jego ekspresji, MSC kierowane są na drogę adipogenezy lub osteogenezy. W celu zróżnicowania ADSC w kierunku osteocytów do medium hodowlanego należy dodać witaminę C, D, deksametazon, kwas walproinowy, BMP-2 (ang. bone morphogenic protein 2, białko morfogenetyczne kości) i glicerofosforan. Efektywność procesu różnicowania ADSC w kierunku osteocytów określa się poprzez pomiar aktywności fosfatazy alkalicznej oraz obserwację mikroskopową zawartości wapnia odkładanego w macierzy zewnątrzkomórkowej po wcześniejszym wybarwieniu komórek (Olkowska-Truchanowicz 2009). W celu zwiększenia wydajności różnicowania ADSC w kierunku osteocytów można zastosować nanorurki węglowe, co skutkuje zwiększonym odkładaniem wapnia oraz zwiększoną aktywnością metaboliczną osteocytów (Patel i in. 2018). Wykazano również, że niektóre antybiotyki mogą powodować zwiększoną wydajność różnicowania ADSC. Najsilniejszą indukcję osteogenezy, potwierdzoną pomiarem ekspresji markerów specyficznych dla osteocytów, wykazała amfoterycyna B w połączeniu z jonami miedzi Cu2+oraz penicyliną (Skubis i in. 2017).

3.2 Adipocyty

Różnicowanie ADSC w kierunku adipocytów wymaga obecności w pożywce różnicującej:

deksametazonu, insuliny, rozyglitazonu, IBMX (izobutylometyloksantyna; ang.

isobutylmethylxanthine) oraz indometacyny (Olkowska-Truchanowicz 2009). O zróżnicowaniu komórek w kierunku adipocytów świadczą powstające wakuole lipidowe, które można wybarwić fluorescencyjnie i obserwować pod mikroskopem, jak również zmierzyć intensywność fluorescencji (Meyer i in. 2015). Zhang X. i in. wykazali, iż czynnik wzrostu fibroblastów 10 (ang. fibroblast growth factor, FGF10) indukuje różnicowanie ADSC w kierunku dojrzałych adipocytów, co może zostać wykorzystane w kosmetologii w celu miejscowego zwiększenia tkanki tłuszczowej (Zhang i in. 2010). Zastosowanie antybiotyków takich jak amfoterycyna B wraz z jonami miedzi Cu2+oraz penicylina również prowadzi do indukcji różnicowania adipogenetycznego. Zostało to potwierdzone badaniem ekspresji markerów charakterystycznych dla adipocytów oraz barwieniem wakuoli lipidowych czerwienią oleistą O (Skubis i in. 2017). Proces różnicowania ADSC może być zależny od produktu białkowego genu Klotho (ang. secreted Klotho, SKL), odpowiedzialnego m.in. za hamowanie starzenia. Nadekspresja Klotho znacznie przyśpiesza adipogenezę. SKL również reguluje różnicowanie ADSC w kierunku osteocytów oraz miofibroblastów (Fan i Sun 2016).

3.3 Komórki nabłonkowe

Czynnik transkrypcyjny RUNX2 (ang. Runt-related transcription factor 2) nasila różnicowanie ADSC do adipocytów oraz osteocytów, jednakże Li Q. i in. wykazali, że odgrywa on również rolę w różnicowaniu tych komórek w kierunku komórek nabłonkowych. Sugeruje to możliwość zastosowania ADSC m.in. w regeneracji ran oparzeniowych (Li i in. 2017). W celu różnicowania ADSC w kierunku komórek naskórka wykorzystuje się olejek z Emu (EO; ang. Emu Oil) wraz ze skafoldami z nanowłókien, co skutkuje nasileniem proliferacji oraz potencjału dyferencyjnego. Proces różnicowania można potwierdzić za pomocą immunobarwienia oraz analizy ekspresji markerów specyficznych dla komórek naskórka. Wykorzystanie EO wraz ze skafoldami i ADSC może być skutecznym środkiem leczniczym w terapii głębokich ran, urazowych uszkodzeń skóry oraz ran oparzeniowych (Pilehvar-Soltanahmadi i in. 2017).

3.4 Chondrocyty

W celu różnicowania ADSC w kierunku chondrocytów niezbędne jest wzbogacenie pożywki DMEM (ang. Dulbecco's Modified Eagle Medium) lub OriCell w czynniki różnicujące tj: TGF-β (transformujący czynnik wzrostu β, ang. transforming growth factor β), FGF-2 (czynnik 2 wzrostu fibroblastów; ang. fibroblast growth factor 2), BMP-6 i 7, kwas askorbinowy, insulinę oraz deksametazon (Olkowska-Truchanowicz 2009; Meyer i in. 2015). Zastosowanie skafoldów i innych struktur trójwymiarowych naśladuje fizjologiczne środowisko i pozwala na wydajniejsze różnicowanie ADSC do chondrocytów. Najprostszą metodą oceny efektywności różnicowania jest wybarwienie charakterystycznej dla chondrocytów macierzy zewnątrzkomórkowej przy pomocy błękitu alciańskiego, błękitu toluidynowego lub safraniny. Różnicowanie ADSC w kierunku chondrocytów może znaleźć zastosowanie w regeneracji tkanki chrzęstnej, która in vivo posiada słabą zdolność do regeneracji (Stromps i in. 2014).

3.5 Tenocyty

Zróżnicowanie ADSC w kierunku komórek ścięgien (tenocytów) zostało uzyskane przez Madhurakkat Perikamana z wykorzystaniem immobilizowanego na skafoldzie PDGF-BB (płytkopochodny czynnik wzrostu BB; ang. platelet-derived growth factor BB). Zróżnicowane komórki eksprymowały charakterystyczne dla tenocytów markery. Dla potwierdzenia różnicowania zastosowano również barwienie immunofluorescencyjne. Zastosowanie odpowiedniego gradientu PDGF oraz dostosowanie warunków przestrzennych różnicowania pozwala na zaprojektowanie tkankowych połączeń kość-ścięgno (Madhurakkat Perikamana i in. 2018).

3.6 Miocyty i kardiomiocyty

ADSC wykazują potencjalną zdolność do regeneracji mięśni szkieletowych oraz mięśnia sercowego. Wzbogacenie medium hodowlanego o deksametazon i hydrokortyzon skutkuje różnicowaniem się ADSC w kierunku miocytów, natomiast zastosowanie w hodowli metylocelulozowej pożywki z dodatkiem IL-3, IL-6 (interleukina 3, 6; ang. interleukins 3, 6) oraz SCF (czynnik wzrostu komórek macierzystych; ang. stem cell factor) prowadzi do otrzymania kardiomiocytów (Olkowska-Truchanowicz 2009). Mechanizm różnicowania ADSC w kierunku miocytów oraz regeneracji mięśni badano z wykorzystaniem wszczepu komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej. Dzięki sekrecji IL-6 przez różnicujące się komórki dochodziło do aktywacji i napływu makrofagów M2 odpowiedzialnych za regenerację komórek mięśniowych. Możliwości różnicowania ADSC w kierunku miocytów i kardiomiocytów budzą nadzieje na wykorzystanie ich w leczeniu skutków niedokrwienia kończyn (Pilny i in. 2019).

3.7 Miofibroblasty

García-Honduvilla N. i in. przeprowadzili różnicowanie adipopochodnych komórek macierzystych w kierunku miofibroblastów. Źródłem czynników różnicujących był naturalny ekstrakt z jaj C.aspera (e-CAF). Doświadczenie to daje nadzieje na wykorzystanie ADSC w regeneracji skóry oraz zapobieganiu jej starzenia (García-Honduvilla 2017). Różnicowanie oraz odróżnicowywanie ADSC w kierunku miofibroblastów było celem badań Desai VD i in.

Zastosowanie TGF-β skutkowało powstaniem komórek eksprymujących charakterystyczne dla miofibroblastów markery, natomiast obecność bFGF skutkowała przeciwstawnym efektem – spadkiem ekspresji owych markerów, zmianą ścieżek sygnałowych jak i zmian morfologicznych oraz uzyskaniem komórek o fenotypie podobnym do fibroblastów. Odkrycie to potencjalnie umożliwia manipulowanie procesami naprawczymi w tkankach miękkich. Jest to o tyle znaczące, że niekontrolowana aktywność miofibroblastów może prowadzić do zwłóknienia tkanek. Zastosowanie ADSC może umożliwić kontrolę tych procesów (Desai i in. 2014).

3.8 Komórki śródbłonka naczyń

Różnicowanie ADSC w kierunku śródbłonka naczyń jest możliwe, gdyż wykazano, że posiadają one wspólne komórki progenitorowe z adipocytami. Preadipocyty pobudzają powstawanie komórek śródbłonka, a z kolei komórki śródbłonka pobudzają proliferację prekursorów adipocytów. Oba typy komórek wspierają angiogenezę i adipogenezę. Różnicowanie ADSC

w kierunku komórek śródbłonka jest możliwe w pożywce dla komórek śródbłonka z FBS (serum płodowe z cieląt; ang. fetal bovine serum) przy nieobecności czynników adipogennych. Ze względu na wydzielanie wielu czynników angiogennych, ADSC mogą być dobrą alternatywą dla mezenchymalnych komórek szpiku w medycynie regeneracyjnej oraz w terapii komórkowej chorób niedokrwiennych (Olkowska-Truchanowicz 2009). Sun Y. i in. wykazali, że Il-7 może zwiększać wydajność różnicowania ADSC w kierunku śródbłonka naczyń limfatycznych poprzez ścieżkę sygnalizacyjną AKT (Sun i in. 2019).

3.9 Neurony i astrocyty

Dyferencjacja adipopochodnych komórek macierzystych w kierunku neuronów jest możliwa dzięki zastosowaniu pożywki wzbogaconej w insulinę, hydroksykortyzol, hydroksyanizol, EGF (czynnik wzrostu naskórka; ang. epidermal growth factor), FGF i kwas walproinowy. ADSC mogą być potencjalnie wykorzystane w leczeniu skutków urazu mózgowia i nerwów obwodowych a także udaru mózgu (Olkowska-Truchanowicz 2009). Shi F. wykazali indukcję różnicowania ADSC w kierunku neuronów poprzez białko prionowe PrPC (ang. cellular prion protein). PrPCwpływa na profil ekspresji miRNA-124, który z kolei prowadzi do wyciszenia ekspresji małej C-końcowej domeny fosfatazy 1 (Shi i in. 2016). ADSC mogą zostać zróżnicowane również w kierunku astrocytów, jednakże wydajność tego procesu jest niska, a uzyskane komórki charakteryzują się krótkotrwałą przeżywalnością. Jedną z przyczyn tych zjawisk mogą być procesy apoptozy i autofagii zachodzące w zróżnicowanych komórkach, jednakże wymaga to dalszych badań (Yuan i in. 2016).

Skutecznego różnicowania ADSC w kierunku astrocytów dokonanli Cheng i in. z wykorzystaniem pożywki, w której głównym czynnikiem różnicującym był IBMX. Proces różnicowania został potwierdzony z zastosowaniem metod immunohistochemicznych, techniki Western blott oraz na podstawie kolorymetrycznych pomiarów glutaminianu w supernatancie (po wcześniejszym odwirowaniu pożywki). Możliwość zróżnicowania ADSC do dojrzałych astrocytów budzi nadzieje na wykorzystanie ich w celu regeneracji centralnego układu nerwowego po różnych urazach (Cheng i in. 2018).

3.10 Komórki endokrynne trzustki

Różnicowanie ADSC w kierunku komórek endokrynnych trzustki jest osiągane w obecności pentagastryny, HGF, eksedyny 4 oraz aktywiny A. Można również zastosować dużą ilość glukozy w pożywce lub witaminę B3 (Olkowska-Truchanowicz J 2009). Komórki macierzyste tkanki tłuszczowej mogą ulec różnicowaniu w kierunku komórek wysp trzustkowych dzięki hodowaniu ich wraz z komórkami macierzystymi trzustki (kokultura). Różnicowanie zostało potwierdzone immunohistochemicznie oraz z zastosowaniem metody PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy; ang.

polymerase chain reaction) i Western blott. Komórki po różnicowaniu wykazywały wzrost ekspresji genu kodującego insulinę zarówno na poziomie mRNA jak i białkowym. Pomimo, iż eksperyment różnicowania przeprowadzony był na komórkach szczurzych, istnieje realna szansa, iż w przyszłości ludzkie ADSC znajdą zastosowanie w celach regeneracyjnych wysp trzustkowych oraz w terapii cukrzycy (Hefei i in. 2015).

3.11 Hepatocyty

ADSC mogą różnicować się w kierunku komórek wątroby dzięki zastosowaniu czynnika wzrostu hepatocytów HGF (czynnik wzrostu hepatocytów; ang. hepatocyte growth factor), dimetylosulfotlenku (DMSO; ang. dimethyl sulfoxide) oraz onkostatyny M (Olkowska-Truchanowicz J 2009). Nhung T. i in. porównali wydajność różnicowania ADSC w kierunku hepatocytów w obecności różnych induktorów. Zastosowano HGF, FGF, onkostatynę M oraz ekstrakt z wątroby.

Wyniki wykazały, że ekstrakt z wątroby promuje różnicowanie adipopochodnych komórek macierzystych w kierunku adipocytów w stopniu znacznie większym niż pozostałe czynniki (Nhung i in. 2015). Apostolou KG i in. określili wpływ transplantacji ADSC na zdolności regeneracyjne wątroby. Komórki wszczepiono w miąższ wątrobowy szczurów. Zaobserwowano zmniejszenie uszkodzeń wątroby oraz wzrost ekspresji HGF i innych markerów wątrobowych. Transplantacja ADSC znacznie przyspieszyła proces regeneracji wątroby, co może być przydatne w leczeniu ostrej

niewydolności wątroby jak i innych schorzeń prowadzących do uszkodzenia tego organu (Apostolou i in. 2018).

Adipopopochodne komórki macierzyste mimo braku nieograniczonej zdolności do rozwoju w kierunku komórek krwi, posiadają zdolność do wspomagania szpiku kostnego w procesie hematopoezy (Olkowska-Truchanowicz 2009)

W poniższej tabeli przedstawiono przykładowe czynniki indukujące różnicowanie adipopochodnych komórek macierzystych w kierunku komórek różnych tkanek (Tab. 1).

Tab. 1. Czynniki indukujące różnicowanie ADSC w kierunku różnych komórek.

Kierunek różnicowania ADSC

Czynniki różnicujące

Adipocyty deksametazon, insulina, rozyglitazon, IBMX, indometacyna, FGF10, TAZ, SKL, RUNX2

Osteocyty witamina C, witamina D, deksametazon, kwas walproinowy, BMP-2, glicerofosforan, TAZ, SKL, RUNX2

Komórki nabłonka RUNX2, EO

Chondrocyty TGF-β, FGF-2, BMP-6 i 7, kwas askorbinowy, insulina, deksametazon

Miocyty deksametazon, hydrokortyzon, IL-6 Miofibroblasty e-CAF, SKL, TGF-β

Kardiomiocyty IL-3, IL-6, SCF Komórki śródbłonka FBS, IL-7

Neurony insulina, hydroksykortyzol, hydroksyanizol, EGF, FGF, kwas walproinowy, PrPC

Komórki endokrynne trzustki

pentagastryna, HGF, eksedyna 4, aktywina A, duża ilość glukozy, witamina B3.

Hepatocyty HGF, DMSO, onkostatyna M, ekstrakt z wątroby

Astrocyty IBMX

Tenocyty PDGF-BB

4. Podsumowanie

Powszechność występowania tkanki tłuszczowej oraz nieskomplikowana procedura izolacji ADSC powodują, że komórki te zyskują coraz większą popularność w świecie nauki. Wysoka żywotność w hodowli, jak również intensywny wzrost i namnażanie się in vitro sprawiają, że warto przyjrzeć się możliwościom wykorzystania adipopochodnych komórek macierzystych w medycynie.

Zdolność ADSC do różnicowania się w komórki wywodzące się ze wszystkich trzech listków zarodkowych umożliwia poszukiwanie coraz to nowszych zastosowań dla tych komórek. ADSC mogą być szeroko wykorzystywane w medycynie regeneracyjnej, terapii komórkowej oraz potencjalnie w przemyśle kosmetologicznym. Być może w przyszłości z zastosowaniem komórek macierzystych wywodzących się z tkanki tłuszczowej będzie można leczyć urazy mózgu, regenerować uszkodzoną tkankę chrzestną czy też narządy takie jak trzustka i wątroba. Wciąż jednak potrzeba dalszych badań nad opracowaniem optymalnych procedur różnicowania tych komórek, zapewniających wysoką żywotność oraz efektywność, tak aby mogły być one zastosowane w terapii.

5. Literatura

Apostolou KG, Papanikolaou IG, Katselis C i in. (2018) Undifferentiated Adipose Tissue Stem Cell Transplantation Promotes Hepatic Regeneration, Ameliorates Histopathologic Damage of the Liver, and Upregulates the Expression of Liver Regeneration- and Liver-Specific Genes in a Rat Model of Partial Hepatectomy. Stem Cells Int. 2018:1393607.

Cheng Z, Ou Y, Zhang L i in. (2018) The glutamate clearance function of adipose stromal cells-derived astrocytes. .Neurosci Lett. 677: 94-102.

Desai VD, Hsia HC, Schwarzbauer JE (2014) Reversible modulation of myofibroblast differentiation in adipose-derived mesenchymal stem cells. PLoS One. 9(1).

Fan J, Sun Z (2016) The Antiaging Gene Klotho Regulates Proliferation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells. Stem Cells. 34(6): 1615-1625.

García-Honduvilla N, Cifuentes A, Ortega M.A. i in. (2017) High sensitivity of human adipose stem cells to differentiate into myofibroblasts in the presence of C. aspersa egg extract. Stem Cells Int.

Hefei W, Yu R, Haiqing W i in. (2015) Morphological characteristics and identification of islet-like cells derived from rat adipose-derived stem cells cocultured with pancreas adult stem cells. Cell Biol Int. 39(3): 253-263.

Li Q, Zhao H, Xia S i in (2017) RUNX2 promotes epithelial differentiation of ADSCs and burn wound healing via targeting E-cadherin. Oncotarget. 9(2): 2646-2659.

Madhurakkat Perikamana SK, Lee J, Ahmad T i in. (2018) Harnessing biochemical and structural cues for tenogenic differentiation of adipose derived stem cells (ADSCs) and development of an in vitro tissue interface mimicking tendon-bone insertion graft. Biomaterials. 165: 79-93.

Meyer J, Salamon A, Herzmann N i in. (2015) Isolation and Differentiation Potential of Human Mesenchymal Stem Cells From Adipose Tissue Harvested by Water Jet-Assisted Liposuction.

Aesthetic Surgery Journal 35(8): 1030-1039.

Nhung TH, Nam NH, Nguyen NT i in. (2015) A comparison of the chemical and liver extract-induced hepatic differentiation of adipose derived stem cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim.

51(1): 1085-1092.

Olkowska-Truchanowicz J (2009) Różnicowanie komórek prekursorowych izolowanych z tkanki tłuszczowej – nowe możliwości dla inżynierii tkankowej i terapii komórkowej. Postępy biologii komórki 36(2): 217-231.

Patel SC, Alam O, Sitharaman B (2018) Osteogenic differentiation of human adipose derived stem cells on chemically crosslinked carbon nanomaterial coatings. 106(5): 1189-1199.

Pilehvar-Soltanahmadi Y, Nouri M, Martino MM i in. (2017) Cytoprotection, proliferation and epidermal differentiation of adipose tissue-derived stem cells on emu oil based electrospun nanofibrous mat. Exp Cell Res. 357(2): 192-201.

Pilny E, Smolarczyk R, Jarosz-Biej M i in (2019) Human ADSC xenograft through IL-6 secretion activates M2 macrophages responsible for the repair of damaged muscle tissue. Stem Cell Res Ther. 10(1): 93.

Shi F, Yang Y, Wang T i in. (2016) Cellular Prion Protein Promotes Neuronal Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells by Upregulating miRNA-124. J Mol Neurosci. 59(1): 48-55.

Skubis A, Gola J, Sikora B i in. (2017) Impact of Antibiotics on the Proliferation and Differentiation of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 18(12).

Stromps JP, Paul NE, Rath B i in. (2014) Chondrogenic Differentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells: A New Path in Articular Cartilage Defect Management? Biomed Res Int.

Sun Y, Lu B, Deng J i in. (2019) IL-7 enhances the differentiation of adipose-derived stem cells toward lymphatic endothelial cells through AKT signaling. Cell Biol Int. 43(4): 394-401.

Yuan X, Zhang L, Wang S i in. (2016) Mitochondrial apoptosis and autophagy in the process of adipose-derived stromal cell differentiation into astrocytes. Cell Biol Int. 40(2): 156-165.

Zhang X, Wu M, Zhang W i in. (2010) Differentiation of human adipose-derived stem cells induced by recombinantly expressed fibroblast growth factor 10 in vitro and in vivo. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46(1): 60-71.

I dokument Internationella makars rätt att välja tillämplig rättsordning - särskilt vid bodelning (sidor 36-39)