Paper III – Identification of nonlinear feedback mechanisms
7.2 Modeling and methods
2.1.1. Introduction
Lors de l’étude en modèle murin conventionnel, nous avons montré que la surexposition chronique orale au BaP induisait une inflammation modérée de la muqueuse intestinale associée à des modifications de la composition et de l’abondance des communautés bactériennes intestinales. Si parmi les taxa bactériens influencés par le BaP, certains possèdent des fonctions déjà caractérisées, pour d’autres en revanche seules des corrélations entre un état inflammatoire et l’augmentation de leur abondance ont pu être montrées, comme pour les familles Porphyromonadaceae, Paraprevotellaceae, et Alcaligenaceae (Chen et al., 2012; Schwab et al., 2014; Walujkar et al., 2014). Le rôle du genre Allobaculum appartenant à la famille des Erysipelotrichaceae, n’a pas non plus pu être identifié dans notre étude puisque des résultats conflictuels ont mis en évidence à la fois son association avec un état inflammatoire (Wei et al., 2010) et son rôle bénéfique pour la santé de l’hôte (Everard et al., 2014). Ainsi, pour comprendre l’impact d’une molécule polluante, telle que le BaP, sur un environnement aussi complexe que le microbiote intestinal, il est nécessaire d’explorer les fonctions portées par ces communautés bactériennes, notamment car certains microorganismes, via leurs capacités métaboliques, pourraient être impliqués dans la métabolisation du BaP. Lors de la surexposition chronique orale au BaP, l’abondance des Alcaligenaceae, Bacillus, et Acinetobacter était en effet augmentée, or des membres appartenant à cette famille et à ces genres bactériens ont été identifiés comme des dégradeurs des HAP dans autres écosystèmes (sols, sédiments…) (Fernández-Luqueño et al., 2010). D’autre part, des membres du genre Clostridium, dont l’abondance est également augmentée au cours de l’exposition orale au BaP, pourraient tirer avantage de l’altération de l’épithélium intestinal pour synthétiser des métabolites potentiellement toxiques pour l’hôte (e.g. phénols et p-crésols) (De Angelis et al., 2013). Par conséquent, il est primordial de relier les populations microbiennes identifiées et leurs capacités métaboliques, et ce afin de prédire leurs rôles potentiels dans l’environnement étudié. Ce lien peut être établi par la reconstruction de génomes directement à partir des écosystèmes microbiens, en particulier pour des microorganismes non cultivés. L’importance d’acquérir des génomes pour révéler le fonctionnement du microbiote intestinal est notamment soulignée par
79 les projets du consortium HMP dont l’objectif initial était de séquencer au moins 3 000 génomes de référence (The Human Microbiome Project, 2012a). Pour atteindre cet objectif, le consortium HMP a établi et maintient à jour une liste de taxa du microbiote humain, qui sont actuellement sous-représentés dans les collections de génomes de référence, et dont le séquençage du génome complet est considéré comme hautement prioritaire (Fodor et al., 2012). L’avènement des outils moléculaires a révélé que les écosystèmes microbiens étaient dominés par une grande majorité d’organismes présents en faible abondance (<0,1%) (Pedrós- Alió, 2012). Ces organismes, constituant la biosphère rare, bien que peu abondants peuvent jouer un rôle crucial dans le fonctionnement des écosystèmes microbiens, en particulier car ils peuvent être recrutés et devenir abondants lorsque l’écosystème subit une perturbation (Lennon & Jones, 2011). L’application de ces outils moléculaires, notamment le séquençage des amplicons du gène codant l’ARNr 16S et la métagénomique à une grande variété d’environnements (sédimentaires, lacustres, marins…) a également révélé une diversité microbienne jusqu’alors insoupçonnée. Plus les environnements microbiens sont explorés grâce aux techniques de séquençage haut-débit, plus les estimations de la diversité microbienne totale augmentent. Il est ainsi estimé que la diversité des microorganismes peuplant les différents écosystèmes dépasserait le million d’espèces microbiennes (Pedrós-Alió, 2006). Ces microorganismes, dont la présence dans les écosystèmes n’est que supposée, constituent la « matière noire microbienne ». Ce terme est employé en référence au domaine de l’astrophysique où la matière noire désigne la matière indétectable, permettant d’expliquer des observations astrophysiques inattendues, notamment en ce qui concerne l’estimation de la masse des galaxies. Par ailleurs, les membres de la biosphère rare, en raison de leur faible abondance dans les écosystèmes et donc de leur accès difficile, peuvent constituer une part importante de cette « matière noire microbienne ». Il apparait donc primordial de mettre en évidence cette « matière noire microbienne » au travers de l’acquisition de génomes, car celle- ci permet à la fois d’identifier phylogénétiquement et de prédire les capacités métaboliques des microorganismes.
L’avènement et le constant développement des outils moléculaires ont permis la reconstruction d’un grand nombre de génomes complets ou partiels de microorganismes non cultivés à partir d’environnements complexes. L’approche de métagénomique, qui permet de suivre la diversité phylogénétique et fonctionnelle des microorganismes au sein d’un écosystème, a contribué à l’acquisition exponentielle de ces génomes grâce à l’amélioration des techniques de séquençage et au développement d’outils bioinformatiques dédiés (Nagarajan &
80 Pop, 2013; Sharon & Banfield, 2013). Une étude pionnière de métagénomique portant sur le biofilm rose d’un drainage minier acide et utilisant la technique de séquençage Sanger a ainsi permis la reconstruction de deux génomes de bactéries non cultivées (Leptospirillum groupe II et Ferroplasma groupe II) (Tyson et al., 2004). Mais l’acquisition des génomes à partir d’écosystèmes microbiens grâce à l’approche de métagénomique s’est principalement accélérée avec le développement des techniques de séquençage de nouvelle génération (pyroséquençage 454, Illumina, SOLiD, et Ion Torrent). Ces techniques dites à haut-débit ont facilité la reconstruction des génomes, notamment en augmentant la profondeur de séquençage des échantillons métagénomiques. Le consortium MetaHIT a ainsi pu reconstruire 238 génomes microbiens de haute qualité issus du microbiote intestinal en utilisant la technologie de séquençage Illumina (Nielsen et al., 2014). Complémentairement aux approches de métagénomique, de nouvelles stratégies, comme celle de la cellule isolée (SCG, Single-Cell Genomics), ont été développées pour reconstruire des génomes à partir d’environnement complexes. L’approche SCG consiste à isoler une cellule unique à partir d’un échantillon environnemental. L’ADN de cette cellule isolée est ensuite extrait, amplifié en utilisant une technique telle que l’amplification par déplacement multiple puis séquencé par des approches haut-débit comme les technologies Illumina, SOLiD ou encore PacBIO (Stepanauskas, 2012; Blainey, 2013). Jusqu’ici, l’approche de SCG a été peu utilisée pour étudier le microbiote humain. Néanmoins, à partir du microbiote de la cavité orale, certains génomes de bactéries affiliées aux phyla TM7 (Marcy et al., 2007), SR1 (Campbell et al., 2013b) et Proteobacteria (Campbell et al., 2013a) ont pu être assemblés. Une autre approche, la capture de gènes en solution, qui permet de réduire la complexité des échantillons métagénomiques, semble particulièrement prometteuse pour faciliter l’acquisition de génomes microbiens à partir d’environnements complexes (Denonfoux et al., 2013).
L’ensemble de ces approches permettant la reconstruction de génomes procaryotes à partir d’écosystèmes microbiens complexes et leurs apports en écologie microbienne, ont fait l’objet d’une revue scientifique, publiée dans le journal « Research in Microbiology ».
