Behov av surgörning av urin vid analys för kalcium, fosfat och magnesium
Need for acidification of urine when examining calcium, phosphate and
magnesium levels
Författare: Frida Joensuu
Vårterminen 2021
Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap
Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng
Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet.
Handledare: Martin Vink, ST-läkare, PhD, Universitetssjukhuset Örebro Ida Branzell, Biomedicinsk Analytiker, Universitetssjukhuset Örebro Examinator: Gabriella Lillsunde-Larsson, lektor, Örebro universitet
Sammanfattning
Studier har tidigare visat surgörning urinprover inför analys av kalcium, fosfat och
magnesium inte är nödvändigt. Dessa analyter är viktiga att analysera vid njursjukdomar och det görs med instrumentet Advia Chemistry XPT (Siemens AG, München, Tyskland) på Universitetssjukhuset Örebro. Syftet med arbetet var att se om samma resultat erhölls för kalcium, fosfat och magnesium beroende på om urinen var surgjord eller inte inför analys. Tre metoder utvärderades beträffande behov av surgörning av urin: Metod 1; den nuvarande metoden, urinen surgjordes till pH 3-4. Metod 2; utan surgörning, urinen rumstempererades i 30 min före mätning. Metod 3; utan surgörning, urinen värmdes till 36ºC före varje mätning för att lösa upp eventuella saltkristaller. Alla metoderna utfördes på 30 prover och testades efter 0h, 24h, 3 dagar och 7 dagar. Resultaten sammanställdes i ett linjärt regressionsdiagram och ett Bland Altmann-diagram. Ett förutbestämt acceptansmål var att de genomsnittliga analysresultaten inte skulle ha en större skillnad än 10% vid jämförelse mellan metod 1 och metod 2 respektive metod 1 och metod 3, samt att eventuella avvikande enskilda prover skulle undersökas närmare. Fem av proverna höll inte den förutbestämda 10%-gränsen och
mikroskoperades för att se om saltkristaller förekom och surgjordes för att se om provsvaren skulle förändras. I tre av fem prover kunde saltkristaller observeras. Detta gav slutsatsen att alla prover fortsatt måste surgöras eftersom det inte går att avgöra i förväg om provet måste surgöras eller inte eftersom ett tydligt samband inte kunde ses mellan proverna som inte höll 10%-gränsen och de som gjorde det.
Abstract
Studies have previously shown that acidification of urine samples before analysis for calcium, phosphate and magnesium may not be necessary. These analytes are important to monitor during kidney disease and are, at USÖ, detected using the instrument Advia Chemistry XPT (Siemens AG, München, Germany). The aim of this study was to examine whether the results from analyzing previously mentioned mineral levels would differ depending on whether the urine had been acidified prior to analysis or not. To examine this, three methods were used. Method 1; the current method, where urine is acidified to pH 3-4. Method 2; without
acidification, the urine was warmed at room temperature before analysis. Method 3; without acidification, the urine was heated to 36°C before analysis. All methods were assayed on 30 samples which were all examined after 0h, 24h, 3 days and 7 days. Results were compiled using a linear regression diagram and a Bland Altmann diagram. The predetermined acceptance criterion was a maximum 10% difference between mean analyte levels found using methods 2 or 3, in comparison to using method 1. Five samples deviated from the remainder by breaking the 10% limit and were therefore scrutinized under microscope to search for salt crystals, before acidification and reanalysis. Crystals were detected in three of the five samples. As there was no clear connection between the deviating samples, there is no way of knowing prior to analysis whether acidification will be necessary or not, and it is therefore deemed a necessity to acidify all urine samples.
Innehållsförteckning
Introduktion ... 1
Kalcium, fosfat och magnesium ... 1
Analys av urin för kalcium, fosfat och magnesium ... 2
Analysprincip ... 4
Syfte ... 5
Frågeställningar ... 6
Etiska aspekter ... 6
Material och metod ... 6
Provinsamling ... 6
Metod ... 7
Statistik ... 9
Resultat ... 10
pH-värde före och efter surgörning och utseende på urinen ... 10
Jämförelse metod 1 och 2 efter 0h ... 11
Sammanfattning jämförelse av metod 2 och 3 mot metod 1 ... 12
Prover som surgjordes på nytt ... 12
Diskussion ... 15
Slutsats ... 17
Referenser ... 18
Bilaga 1 ... 1
Jämförelse metod 1 och 3 efter 0h ... 1
Jämförelse metod 1 och 2 efter 24h ... 2
Jämförelse metod 1 och 3 efter 24h ... 3
Jämförelse metod 1 och 2 efter 3 dagar ... 4
Jämförelse metod 1 och 3 efter 3 dagar ... 5
Jämförelse metod 1 och 2 efter 7 dagar ... 6
1
Introduktion
Kalcium, fosfat och magnesium
Kalcium, fosfat och magnesium har viktiga funktioner i kroppen. Koncentrationerna regleras med ett komplext hormon-samspel mellan upptag i tarmen, utsöndring genom njurarna och utbyte i skelettet. Kalcium och fosfat är viktiga för att mineralisera skelettet. Kalcium och magnesium är viktiga intracellulära katjoner och regleras främst via njurarna. Magnesium ingår även i många enzymsystem (1).
Kalcium finns i kroppen som en tvåvärd katjon som har en hög laddningstäthet som binder sig till många olika kemiska grupper och anjoner och har betydelse för enzymreaktioner, cellpermeabilitet, sekretion, koagulationsförmåga, hormonsekretion, muskelkontraktion och cilie- och neuroaktivitet. Joniserat kalcium är den aktiva formen av kalcium men kalcium kan även vara bundet i komplex med till exempel albumin (1).
Rekommenderat intag av kalcium är 800-1000 mg/dag. En ökning av intaget krävs vid tillväxt, graviditet och laktation. Normalt inträffar en minskning av upptaget av kalcium hos kvinnor mellan 55-60 år och ungefär 10 år senare hos män (1).
Kalcium befinner sig både i det intra- och extracellulära rummet och utbyte mellan dessa rum utnyttjas för att reglera kalciumkoncentrationen. Parathormon (PTH) och
1,25-dihydroxivitamin D påverkar skelettet, njurarna och tarmen och reglerar på så sätt
kalciumkoncentrationen. Andra hormoner ingår även i processen som påverkar kalcium direkt eller indirekt genom att påverka PTH och 1,25-dihydroxivitamin D. Ett intag av joner som komplexbinder kalciumjoner bidrar också till att upptaget minskar (1).
Kalcium filtreras i glomeruli och reabsorberas främst i proximala tubuli men även i distala tubuli genom en aktiv transportmekanism. En normal reabsorbtion ligger på 98-99% av allt kalcium som har filtrerats. När serumkalciumnivån ligger på en låg nivå är reabsorptionen fullständig och nästan inget kalcium utsöndras. Reabsoptionen påverkas av många faktorer med PTH är den viktigaste regulatorn som ökar serumkoncentrationen av kalcium. Även en ökning av joniserat kalcium gör att mer kalcium utsöndras via njurarna, om en minskning av joniserat kalcium sker kommer reabsorptionen att öka (1).
2
Fosfat är viktigt för skelettmineraliseringen och är en viktig beståndsdel i DNA-, RNA- och ATP-molekylerna (1).
Kalcium- och fosfatkoncentrationen balanseras mot varandra. När kalciumkoncentrationen i serum sänks ger det hyperparatyreoidism med en ökat tubulär reabsorption av kalcium och detta gör att fosfatutsöndringen ökar. Vid en hypofosfatemi kommer en stigande
koncentration av serumkalcium göra att kalciumutsöndringen ökar och fosfatutsöndringen minskar (1).
Fosfatkoncentrationen i serum regleras av absorption i tarmen, utbyte i skelettet och en utsöndring via njurarna. Ett förhöjt värde av PTH bidrar till en ökad fosfatutsöndring.
Fibroblast growth factor 23 (FGF-23) är ett annat viktigt fosfatreglerande hormon. En ökning av FGF-23 ger en ökad fosfatutsöndring men FGF-23 bidrar och leder till en minskad
bildning av 1,25-dihydroxivitamin D som minskar upptaget av fosfat från tarmen (1). Magnesium är viktigt för många funktioner i kroppen men främst för intracellulär
signalering, kofaktor för protein- och DNA-syntes, oxidativ fosforylering och benbildning (1). Det har inte forskats lika mycket om vilka hormoner som påverkar magnesium som det har om kalcium och fosfat men det har visats att magnesiumkoncentrationen påverkas av
jonkanaler, transportsystem och multipla och komplexa samspel mellan tarmen, skelettet och njurarna (1).
Magnesium upptas främst i tunntarmen men även lite i tjocktarmen. I njurarna filtreras magnesium och 10-30% reabsorberas i proximala tubuli och 40-70% i distala tubuli (1). Analys av urin för kalcium, fosfat och magnesium
Vid analys av kalcium, fosfat och magnesium i urinen är frågeställningarna något annorlunda jämfört med blodanalys. Kalcium är viktigt att analysera vid undersökning av
njurstenssjukdomar samt vid utredning av hyper- eller hypocalcemi vilket kan vara relaterade till skelettet, njurarna och bisköldkörteln. Fosfat är bland annat viktigt att analysera vid njursjukdomar eftersom höga fosfatnivåer ofta hänger ihop med njursvikt (tubulära njursjukdomar). Fosfat kan också vara viktigt att analysera vid misstanke på
hyperparatyreodism. Magnesium i urinen analyseras till exempel vid oklara trötthetssyndrom och kramptillstånd eller vid binjurebarkssjukdomar samt vid långvariga tillstånd med diarré (1) (Tabell 1).
3
Tabell 1: Vanliga sjukdomar associerade till analyterna kalcium, fosfat och magnesium, där urinanalys kan vara av värde.
Analyt Vanliga sjukdomar
Kalcium Njurstenssjukdomar och hypercalcemi
Fosfat Njursjukdomar, njursvikt
Magnesium Trötthetssyndrom, kramptillstånd och binjurebarkssjukdomar
Insamling av urinprov för analys av kalcium, fosfat och magnesium görs det normalt under 24h. Referensintervallet för utsöndringen i urin för kalcium ligger på 2,5-8,0 mmol/dygn men det är beroende av kön och kost. Vid ett normalt kostintag är övre gränsen för kvinnor 6,5 mmol/dygn och för män 8,0mmol/dygn. Referensintervallet för magnesium ligger mellan 2,5-7,5 mmol/dygn men utsöndringen är extremt kostberoende. Referensintervallet för fosfat är 13-42 mmol/dygn och även det är kostberoende (1).
En svårighet vid urinanalys är att kalcium och magnesium har en tendens att bilda komplex med anjoner som till exempel fosfat. När dessa bildar komplex i form av salter som faller ut kan de uppmätta koncentrationerna av kalcium, fosfat och magnesium i urin bli falskt låga. Ofta använder man sig därför av kärl som innehåller syra vid insamling av urinen för att undvika att dessa salter ska uppstå. Används inte syra vid själva uppsamlingen surgörs urinen innan analysen. När syra tillsätts kommer anjonerna att protoneras vilket gör att
komplexbildning med de positivt laddade metalljonerna förhindras, eftersom de blir oladdade eller positivt laddade, vilket gör att de repellerar varandra (2).
Salter som hindras från att bildas är bland annat kalciumoxalat, trippelfosfat, amorft urat och amorft fosfat. Kalciumoxalat kan uppstå vid olika pH-värden och hydreringsgrad varför morfologin för dessa kristaller kan skilja sig åt (3), men högst risk föreligger om det finns mycket kalcium och oxalat i urinen tillsammans med låga halter citrat och ett högt pH-värde. pH-värdet i urinen kan skilja sig beroende på till exempel födoämnesintag av animaliska proteiner. Vid mycket salter i urinen ökar även risken för att bilda njursten. Största risken att bilda njursten är att olika kristaller som ofta bygger på fosfat bildar större komplex
4
Ett alternativ till surgörning är möjligen värmebehandling av urinprover före analys för kalcium, fosfat och magnesium. Genom att värma urinen kan saltkristaller, som annars skulle påverka resultatet, lösas upp vilket gör att komponenterna från saltkomplexet släpps lös och blir fritt vilket bidrar till att analysresultatet blir mer pålitligt (5).
Analysprincip
Kalcium, fosfat och magnesium kvantifieras genom spektrofotometriska metoder på
instrumentet Advia Chemistry XPT System (Siemens AG, München, Tyskland) som finns på centrallaboratoriet på universitetssjukhuset Örebro (USÖ).
En spektrofotometer mäter ljusabsorption av kemiska ämnen i ett prov och används till exempel för att kunna få fram koncentrationen av ämnen eller för att identifiera ämnen. Alla molekyler har unika absorptionsspektrum beroende på deras struktur. Spektrofotometern har ett prisma som bryter ljuset vilket gör att det delas upp i olika våglängder. Prismat anpassar våglängderna till provet som ska analyseras. Ljuset tar sig genom kyvetten där provet befinner sig och sedan till en detektor som undersöker ljusintensiteten av ljuset som passerat genom provet. Genom att veta hur mycket ljus som sändes ut och hur mycket som detekterades kan mängden ljus som absorberas provet tas fram. Koncentrationen kan sedan räknas med hjälp av det undersökta ämnets specifika absorptionsegenskaper med hjälp av Lambert-Beers lag som kan skrivas som:
𝐴𝐴 = − log 𝑇𝑇 = log𝐼𝐼𝐼𝐼 = 𝜀𝜀 ∙ 𝑐𝑐 ∙ 𝑑𝑑0
där A är absorptionen, T är överföringstiden, I0 är intensiteten före passering av provet, I är
intensiteten efter passering av provet, ε är absorptionskoefficienten som är unik för en viss våglängd och ett visst ämne, c är koncentrationen och d är längden av kyvetten. Absorbansen och koncentrationen räknas fram med hjälp av dessa storheter och absorptionskoefficienter via en kalibreringskurva (6, 7).
Analysen i Advia Chemistry XPT Systems bygger på en spektrofotometri där olika våglängder mäter ett färgat komplex. För kalciumjoner bildas ett färgat komplex med
Arsenazo III som mäts vid 658nm som primär våglängd som mäter själva analyten och 694nm som sekundär våglängd som sorterar bort utslag i provet som inte är analyten som analyseras för. Mängden kalcium i provet är direkt proportionellt mot det bildade färgkomplexets intensitet enligt:
5
Oorganiskt fosfat reagerar med ammoniummolybdat i närvaro av svavelsyra för att bilda ett oreducerat fosfomolybdatkomplex vilket mäts som en endpointreaktion vid 340nm som primär våglängd och 685nm som sekundär våglängd, enligt:
Fosfat + molybdat + H+ → fosfomolybdatkomplex (9).
Magnesiumjoner reagerar men xylidylblått i alkaliskt medium och bildar ett vattenlösligt lilarött komplex. Den ökade optiska densiteten av xylidylblått vid 505nm som primär våglängd och 694nm som sekundär våglängd och är proportionellt mot koncentrationen av magnesium i provet, enligt:
Mg2+ + xylidylblått + OH- → xylidylblått (Mg)-komplex (10).
Syfte
Eftersom saltsyra är starkt frätande kan det ske skador på laboratoriepersonalen när
surgörning av urin utförs. Det har gjorts studier som visar att surgörning av urin kanske inte är nödvändigt inför analys utan att likvärdiga resultat kan fås även utan det steget (11, 12, 13). Syftet med studien är att se om det förekommer skillnader i koncentration hos urinprover när analys för kalcium, fosfat och magnesium utförs beroende på om provet är surgjort eller inte. Man vill se om man får likvärdiga resultat när proverna är surgjorda eller inte vid olika tidpunkter efter provinsamling och när de icke surgjorda är rumstempererade eller uppvärmda till 36ºC inför analys, för att på så sätt förenkla provhantering och minska arbetsmiljörisker.
6 Frågeställningar
• Erhålls falskt låga svar på kalcium, fosfat och magnesium om urinen inte surgörs innan analys?
• Påverkas provernas hållbarhet av surgörning?
• Kan värmebehandling fungera som ett alternativ till surgörning och förhindra kristallbildning?
Etiska aspekter
De 30 proverna som undersöktes avidentifierades genom att de tilldelades en siffra mellan 1-30. Vilken siffra de fick var slumpmässigt sekventiellt och den enda informationen som togs om provet var tiden för provtagningen. Eftersom ingen information behövdes om patienterna behövdes inte ett informerat samtycke samlas in.
Material och metod
ProvinsamlingSammanlagt undersöktes 30 urinprover där alla analyserades för kalcium, magnesium och fosfat. Eftersom antalet urinprov med beställning av kalcium, fosfat och magnesium kliniskt är relativt lågt beslutades det att proverna som skulle användas i denna studie skulle bestå av överblivna urinprover som ursprungligen analyserats med urinsticka, en snabbmetod för kontroll av bland annat diabetes, vid misstanke om urinvägsinfektion eller hematuri. Fokus lades på att samla in urin med olika färg, grumlighet och pH-värde. Detta gjordes för att öka sannolikheten att hitta avvikande prover och för att bättre spegla variationerna i en
provpopulation. Risken vid användning av prover för urinsticka och inte prover för kalcium, fosfat eller magnesium är att den kliniska frågeställningen vid de olika analystillfällena skiljer sig åt. Det är därför inte självklart att provmaterialet som erhålls vid frågeställningen
urinundersökning av kalcium, fosfat och magnesium har samma sammansättning i urinen som vid analys av urinsticka. Detta gör att till exempel kristaller kan falla ut på olika sätt eller inte alls. Genom att samla 30 prover med olika utseende och pH-värde bedömdes dock denna risk att minimeras.
7 Metod
pH-värdet mättes med pH-stickor (Siemens, Multistix 7, Tyskland) före och efter surgörning. Före surgörning användes pH-stickor från pH 0-14 och resultatet antecknades. Efter
surgörning användes pH-stickor från pH 0-6 och resultaten antecknades. Att användning av pH-stickor som bara mätte pH 0-6 efter surgörning berodde på att man ville uppnå pH 3-4 och med lägre intervall kunde en mer exakt mätning ske.
Varje urinprov delades i tre portioner med 1,5ml i varje rör. De tre rören hade olika metoder för förbehandlingar inför analys enligt nedan (Figur 1):
• Metod 1, den nuvarande metoden – alla 30 prover direkt surgjordes med saltsyra 6mmol/l till pH 3-4. pH-värdet mättes innan och efter surgörning. Proverna stod sedan i rumstemperatur i 30 min inför analys.
• Metod 2 – proverna stod i 30 min i rumstemperatur utan surgörning innan analys. • Metod 3 – proverna stod i värmeblock med 36ºC i 30 min utan surgörning innan
analys.
Figur 1: Flödesschema över de tre surgörningsmetodernas steg och tillvägagångssätt.
8
Alla prover centrifugerades (MPW-380R, Med. Instruments. Polen) på 2400g i 7 min efter rumstempereringen innan analyserna. Analyserna utfördes på Advia Chemistry XPT System. Proverna korkades och förvarades i kyl. Vid nästa analystillfälle. Vid nästa analystillfälle upprepades de sista stegen i inkubationen i rumstemperatur i 30 min för proverna till metod 1 och 2 och temperering i 36ºC för proverna till metod 3. Proverna centrifugerades sedan och analyserades. Resultaten skrevs ut och sammanställes i ett Exceldokument, version 2008, (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA) (Figur 1).
Analysresultaten för metod 2 och 3 vid de olika tidpunkterna jämfördes med analysresultaten för metod 1, den nuvarande metoden (se under statistik). En förutbestämd gräns på att
analysresultaten genomsnittligt för de 30 proverna inte skulle skilja mer än 10% mellan metoderna 2 och 3 jämfört med metod 1 sattes. Eventuella prover med avvikande beteende skulle analyseras närmare för att undersöka huruvida detta berodde på händelser (exempelvis kristallbildning) i provet.
Prover från metod 2 och 3 som inte höll 10%-gränsen för någon/några av analyterna vid varje/några analystillfällen undersöktes i mikroskop (Olympus, Bx45, Japan) med planpolariserande ljus vid 400x förstoring efter 7 dagar för att se om det eventuellt fanns utfällda saltkristaller som kunde förklara nivåskillnaden. Därefter surgjordes provet för att försäkra sig om att det var surgörningen som gav upphov till den stora nivåskillnaden. Detta gjordes även för att undersöka om eventuella utfällningar kan återfås i lösning och om analytkoncentrationen på det sättet skulle justeras för att bättre efterlikna resultatet från samma prov erhållet med metod 1. De fem proverna rumstempererades i 30 min,
centrifugerades i 7 min i 2400g, analyserades i Advia Chemistry XPT Systems för kalcium, fosfat och magnesium, varefter hälften av den icke surgjorda urinen överfördes till ett nytt rör. Surgörningen utfördes på samma sätt som för metod 1 i början av experimentet. De proverna som surgjorts analyserades sedan om efter 1h och resultaten för de tre analyserna jämfördes mot varandra före och efter surgörning, respektive mot metod 1.
9 Statistik
All sammanställning av data skedde i ett Exceldokument i en tabell efter vilken metod som testades, vilket prov det var och resultaten för de olika analyterna. Det skapades sedan ett linjärregressionsdiagram och ett Bland-Altmann-diagram för varje analyt vid samma tidpunkt där jämförelse mellan metod 1 och metod 2 respektive metod 1 och metod 3 skedde.
Det linjära regressionsdiagrammet visar hur bra de olika surgörningsmetoderna korrelerar med varandra. Desto närmare 1 korrelationskoefficienten (R2) befinner sig, desto bättre
korrelerar de jämförda variablerna med varandra (14).
Bland Altmann-diagrammet visar hur stor skillnaden är mellan metoderna i procent för varje enskilt prov, det vill säga den relativa skillnaden. Varje punkt erhölls genom att subtrahera analysresultatet från metod 2/metod 3 från resultatet av metod 1 och beräkna den relativa skillnaden i procent (för metod 2: (M1-M2)/M1*100). Diagrammet visualiserar om den ena metoden systematiskt generar resultat som skiljer sig från den andra metoden och om den procentuella skillnaden varierar vid olika analytkoncentrationer. En genomsnittlig skillnad (bias) mellan metoderna har beräknats och bedömning kan ske om den erhållna skillnaden mellan två metoder är medicinsk godtagbart eller inte. En rimlig tillåten avvikelse för metoderna 2 och 3 jämfört med metod 1, den nuvarande metoden, var att skillnaden i analysresultat i genomsnitt inte skulle överstiga 10% (15).
Genomsnittskillnaden mellan de olika metoderna vid de fyra olika tidpunkterna, 0h, 24h, 3 dagar och 7 dagar beräknades. Därefter undersöktes huruvida enskilda prov i populationen betedde sig annorlunda jämfört med resten, det vill säga om deras analytkoncentration förändrades annorlunda jämfört med majoriteten av proverna.
Värden som var under eller över Advia XPTs detektionsgräns uteslöts för den anlayten från diagrammen. Mätområdet för kalcium var 0,25-8,00 mmol/l, fosfat 1,29-64,6 mmol/l och magnesium 0,37-10,28 mmol/l på instrumentet.
10
Resultat
pH-värde före och efter surgörning och utseende på urinen
pH-värdet för de 30 proverna varierade mellan pH 5-9 och de surgjordes sedan till ett pH mellan 3-4. Utseendena på urinproverna varierade mellan ljusgula och helt utan grumligheter till mörkbruna med mycket grumligheter (Tabell 2).
Tabell 2: Utseende och pH-värde för urinproverna innan och efter surgörning. Fin innebär att urinprovet var ljusgult och saknade grumligheter. pH före är innan surgörning och pH efter är efter surgörning.
Prov Utseende pH före pH efter
1 Fin 7 3,0
2 Fin 7 3,0
3 Grumlig 6 3,5
4 Fin 5 3,5
5 Grumlig + korn 5 3,5
6 Brunröd + storklump + luktar mycket och illa 9 4,0
7 Fin 5 4,0 8 Fin 5 3,5 9 Mörkgul + klar 5 3,5 10 Lite grumlig 7 3,5 11 Fin 5 4,0 12 Fin 6 4,0 13 Fin 5 3,5 14 Lite grumlig 5 3,0 15 Grumlig 6 3,5 16 Fin 5 3,0 17 Fin 6 3,5 18 Homogent grumlig 6 3,0 19 Fin 5 3,5 20 Lite grumlig 6 3,5 21 Fin 5 3,5 22 Fin 5 4,0
23 Mycket lite grumlig 6 3,5
24 Fin 5 3,5 25 Fin 5 3,5 26 Fin 5 4,0 27 Fin 5 3,5 28 Fin 5 3,5 29 Fin 5 3,5 30 Fin 7 4,0
11 Jämförelse metod 1 och 2 efter 0h
Jämförelse efter 0h mellan metod 1 och metod 2 hamnade tre prover utanför mätintervallet för kalcium och exkluderades. Två prover hade en skillnad på mer än 10% mellan metoderna och av dessa skilde ett prov på kalcium och fosfat och ett på fosfat och magnesium (Figur 2). Medelbias för kalcium var 1,7%, fosfat 2,2% och magnesium 3,9% (Tabell 3).
För övriga jämförelser och tider hänvisas till bilaga 1. De sammanfattande resultaten redovisas i tabell 3.
Figur 2: Linjärregressionsanalys och Bland Altmann-analys för kalcium (a), fosfat (b) och magnesium (c) efter 0h där jämförelse mellan metod 1 och 2 visas. För kalcium uteslöts tre prover som inte presenteras i tabellerna.
12
Tabell 3. Jämförelse mellan metod 1 och 2 respektive 3. Medelbias mellan metoderna redovisas i tabellen (M1-M2 respektive M1-M3) vid de olika analystidpunkterna. Vid varje analystillfälle redovisas även antalet enskilda prov (n avvikande prov) som föll utanför den förutbestämda 10%-gränsen som sattes som genomsnittligt acceptanskriterium. Notera att det vid flertalet tillfällen rör sig om samma prov.
Ca Fosfat Mg Medelbias (%) n avvikande prov Medelbias (%) n avvikande prov Medelbias (%) n avvikande prov Tid (dagar) M1-M2 M1-M3 M1-M2 M1-M3 M1-M2 M1-M3 M1-M2 M1-M3 M1-M2 M1-M3 M1-M2 M1-M3 0 1,7 1,8 1 2 2,2 2,7 2 2 3,9 3,1 1 1 1 0,8 1,4 1 2 3,6 3,8 2 2 1,7 1,8 1 1 3 1,7 3,4 2 4 3,9 4,5 3 3 3,0 2,8 2 3 7 1,6 3,3 3 3 3,5 3,4 2 2 4,8 4,7 2 3
Sammanfattning jämförelse av metod 2 och 3 mot metod 1
Generellt korrelerar metod 2 och 3 fint mot metod 1 och oftast ses inga större skillnader eller avvikelser mellan metoderna. Genomsnittskillnaden (bias) mellan metod 2 och 3 jämfört med metod 1 hamnar innanför den förutbestämda 10%-gränsen vid alla tidpunkter. Dock finns det enskilda prov som sticker ut och inte stämmer överens utan där avvikelsen är större än 10% i någon/några av tidpunkterna. Dessa prov utgör ett observandum som bör undersökas närmare. Prover som surgjordes på nytt
Fem av de prover som skiljde mer än 10% mellan metoderna undersöktes i mikroskop. I tre av dessa prover kunde saltkristaller ses i ljusmikroskop med polariserande ljus. Kristallernas utseende jämfördes med bilderna i bok (16) för att försöka utröna deras sammansättning. I prov 1 sågs saltkristaller som sannolikt har sitt ursprung i magnesium, i prov 6 sågs fosfatkristaller och prov 30 sågs kalciumoxalatkristaller (Figur 3-6).
Efter mikroskopering surgjordes proverna, i enlighet med protokoll för metod 1. I tabell 4 redovisas mätresultaten för de tre olika analyterna före och efter surgörning och i jämförelse med metod 1.
13
Tabell 4: Surgörning av fem prover som inte klarade 10% skillnaden mellan surgjord och icke surgjord eller som ändrade resultat över tiden. M1 är värdet för provet surgjort enligt metod 1, (-) är provet utan surgörning och (+) betyder att provet har surgjorts i slutet av experimentet och analyserats om efter en timme efter surgörning.
Prov Kalcium Fosfat Magnesium
M1 (-) (+) M1 (-) (+) M1 (-) (+) 1 1,765 1,686 1,814 42,081 37,937 39,483 4,1 0,59 1,069 6 0,53 0,639 0,709 4,78 1,713 3,449 2,914 <0,37 1,605 10 7,524 2,717 5,26 8,055 4,495 6,321 3,426 2,845 3,27 18 1,312 1,167 1,167 28,861 28,311 29,514 3,448 3,221 3,388 30 5,09 4,137 5,03 23,94 18,744 20,154 6,871 3,449 3,635
14
Figur 4: Mikroskopibilder av prov 1 som inte surgjordes. Tydliga och stora saltkristaller kan ses. Saltkristallerna har troligen sitt ursprung i magnesium.
Figur 5: Mikroskopibilder av prov 6 som inte surgjordes. Fosfatkristaller av olika färg och storlek kan ses.
Figur 6: Mikroskopibild av prov 30 som inte surgjordes. Små och få kalciumoxalatkristaller kan ses.
15
Diskussion
Undersökning av surgörning av urin vid analys för kalcium, fosfat och magnesium är ett ämne där studier säger olika om behovet av surgörning finns eller inte. Vid Kemlab USÖ där arbetet har utförts har diskussioner uppkommit om behovet av surgörning eftersom
analysinstrumentets metoddokument inte är tydligt formulerat och således inte betonat att surgörning av urin ska göras men inte heller avskrivit det kravet. Därför ville man undersöka om surgörningen påverkar analysresultatet för kalcium, fosfat och magnesium.
För de flesta analyserade prov erhålls ett värde på kalcium, fosfat och magnesium som är jämförbart mellan surgjorda och inte surgjorda prover vid samtliga tidpunkter (Tabell 3) och genomsnittsdifferensen mellan metod 2 och 3 jämfört metod 1 är klart inom 10%, vilket som satts som förutbestämt acceptansmål. Dock erhålls signifikant avvikande provresultat (>10% skillnad) för kalcium, fosfat och magnesium för ett fåtal prov som inte är surgjorda jämfört med de surgjorda proverna. Värmebehandling av proverna verkar inte vara ett fungerande alternativ till surgörning baserat på att vid jämförelse mellan prover från metod 1 och 3 avviker lika många prover från 10%-gränsen som vid jämförelse för prover från metod 1 och 2. Detta betyder alltså att värmebehandling av prover inte har någon effekt vid analys för kalcium, fosfat och magnesium.
Resultaten visar att hållbarheten på urinen förändras över tiden för prover som inte är surgjorda. Det är fler prover som inte håller 10%-gränsen efter 7 dagar och färre som inte håller gränsen efter 0h. Detta indikerar en långsamt fortlöpande och progressiv
förändringsprocess i dessa prover.
I de proverna som inte hade surgjorts var det något av en tillfällighet att saltkristaller
observerades. Proverna som användes för studien var från färdiganalyserade urinstickor och skulle annars kasseras. Därför kunde de lätt användas för studien utan att det påverkade patientens eventuella behandling eller diagnos, men nackdelen med sådana urvalskriterier är att givarpersonernas sjukdomsbild inte är känd och därför kan det vara lätt att missa personer som har en avvikande koncentration av kalcium, fosfat och/eller magnesium.
16
För att utöka variationen i provunderlaget beslutades att urin av olika utseende skulle
användas (grumlighet, färgnyans, etc.). Att urinprover är grumliga beror ofta på en infektion och det är sällan helt transparenta prover visar att provgivaren har en infektion och att infektiöst material eller blod finns i provet. Grumligheter kan ibland lösas upp genom att tillsätta syra eller att värma upp provet. Skillnaden är att en syratillsats påverkar prover permanent medan en uppvärmning gör att grumligheterna oftare tillfälligt går tillbaka och att grumligheten åter ökar när provet kylts ner igen. Bland de 30 proverna som inkluderades i denna studie, kunde man se att desto fler dagar som gick från surgörning kommer alltmer slaggprodukterna att lägga sig på botten och ibland låg den kvar vid vaggning och vissa gånger åkte den runt i urinen som en skiva. I proverna som inte hade surgjorts åkte eventuella slaggprodukter omkring i urinen som små korn. En färgförändring över tid mellan det
surgjorda provet och det icke surgjorda provet kunde observeras. Prov som var grumliga i färgen och inte helt transparenta blev mer transparenta med surgörning och uppvärmning medan provet som inte gjorts någonting med behöll sin grumlighet. Detta gav en visuell visning av att surgörningen påverkade provet på något sätt och påverkade färg, grumlighet och slaggprodukter som fanns i provet. Emellertid tycks inte finns något tydligt samband mellan urinens makroskopiska utseende och dess koncentration av kalcium, fosfat och magnesium, eller med dess benägenhet att fällas ut med tiden i icke surgjorda prov (17). Bland de prover som överskred 10%-gränsen och fick surgöras på nytt sågs inget tydligt samband. Proverna hade varierande värde, även om de tillhörde de prov med högst pH-värde före surgörning och ett varierande utseende och saltkristaller kunde observeras hos vissa av dem men inte hos alla. De kristaller som bedömdes förekomma i några av de icke surgjorda proverna (Figur 4-6), de tillhör de kristaller som vanligen bildas i urin. Dit hör den vanligaste kristallen kalciumoxalat (3), och även i detta fall kunde dessa kristaller observeras i mikroskop i prov nummer 30 (Figur 6).
Det är utifrån denna studie svårt att dra några slutsatser om varför vissa prover överskrider gränsen medan andra inte gör det. Två prover kan ha samma pH-värde före surgörning och utseende men ändå håller ena provet gränsen och det andra inte. Detta ger att man i förväg inte kan se på utseende och pH-värdet om provet kommer att överskrida gränsen eller inte. Inte heller mikroskopering av saltkristaller är ett sätt att urskilja prover som behöver surgöras och inte surgöras eftersom alla prover inte hade saltkristaller som kunde ses i mikroskop även fast de överskred 10%-gränsen. Detta är inte heller något alternativ i klinisk rutindrift
17
En laborativ felkälla i denna studie var att tiderna ibland var svåra att hålla på grund av köer till centrifugen och instrumentet vilket gjorde att det ibland gick mer än 30 min vid
rumstemperering. Detta gjorde även att det i vissa fall tog längre tid för proverna i metod 3 från värmeblocket tills analysen utfördes. En annan felkälla var svårigheter att läsa av pH-stickorna eftersom färgskillnaden inte var speciellt stora mellan de olika stegen och det var då svårt att avgöra exakt vilket pH-värde som provet hade. Det var även svårt att vara objektiv och ta samma pH-värde när stickorna låg mellan två steg. Dock har inte pH-värdet jättestor betydelse för resultatet vilket gör att felmarginalerna inte påverkar resultatet nämnvärt.
Slutsats
Resultat visar att surgörning av urin fortsatt är nödvändigt vid analys av kalcium, fosfat och magnesium. Även om den stora majoriteten av prover, liksom medelförändringen mellan metod 1 och 2 respektive metod 1 och 3 håller sig inom 10% faller ett fåtal prov ut på ett icke förutsägbart sätt. Eftersom det i förväg inte kan avgöra vilka prover som bildar salter och vilka som inte gör det behöver man fortsatt surgöra alla prover för att inte få falskt låga värden. Stabiliteten för surgjorda prover var mycket bra upp till 7 dagar efter insamling.
18
Referenser
1. Theodorsson E, Berggren Söderlund M. Laurells klinisk kemi. Upplaga 10:1. Lund, Studentlitteratur AB, 2018.
2. Pratumvinit B, Reesukumal K, Wongkrajang P, Khejonnit V, Klinbua C,
Dangneawnoi W. Should acidification of urine be performed before the analysis of calcium, phosphate and magnesium in the presence of crystals?. Clinica Chimica Acta; 2013; 426:46-50.
3. Foley K.F. Boccuzzi L. Urine Calcium: Laboratory Measurement and Clinical Utility. Laboratory Medicine; 2010; 41:683-686.
4. Tisulius H.G. Lindbäck B. Fornander A.M. Nilsson M.A. Studies on the role of calcium phosphate in the process of calcium oxalate crystal formation. Urol Res; 2009; 37:181-192.
5. Ng R.H. Menon M. Ladeson J.H. Collection and handling of 24-hour urine specimens for measurement of analytes related to renal calculi. Clin Chem; 1984; 3:461-471. 6. Swinehart D.F. The Beer-Lambert Law. Journal of Chemical Education. 1962; 39:7. 7. Sodi R, Bailey L.B, Glaysher J, Allars L, Roberts N.B, Marks E.M, m.fl. Acidification
and urine calcium: is it a preanalytical necessity?. Annals of Clinical Biochemistry; 2009; 46:484-487.
8. Insert för Kalcium_2 (Ca_2) på Advia Chemistry XPT; 10699608_Sv Rev. F, 2016-06.
9. Insert för Oorganisk fosfor (IP) på Advia Chemistry XPT; 10699642_Sv Rev. G, 2015-06.
10. Insert för Magnesium (MG) på Advia Chemistry XPT; 10699654_Sv Rev. G, 2014-06.
11. Mäntele W, Deniz E. UV-VIS absorption spectroscopy: Lambert-Beer reloaded. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy; 2017; 173:965-968.
12. Sodi R. Bailey L.B. Glaysher J. Allars L. Roberts N.B. Marks E.M. Mfl. Acidification and urine calcium: is it a preanalytical necessity?. Annals of Clinical Biochemistry: Journal of Laboratory Medicine; 2009; 46:484-487.
13. Petit M. Beaudeux J.L. Majoux S. Hennequin C. Is a pre-analytical process for urinalysis required?. Annales de Biologie Clinique; 2017; 75:519-524.
19
14. Ejlertsson G. Statistik för hälsovetenskaperna. Upplaga 2. Lund, Studentlitteratur AB, 2016.
15. Myles P.S. Cui J. I. Using the Bland-Altman method to measure agreement with repeated measures. BJA: British Journal of Anaesthesia; 2007; 99:309-311.
16. Fogazzi G, Ponticelli C, Ritz E (1999) The Urinary Sediment - An Integrated View, Second Edition, Oxford University Press, Oxford, UK
17. Cuthbert E, Dukes M.D. Infected Urine. Clinical pathology in general prectice; 195: 1262-1264.
1
Bilaga 1
Jämförelse metod 1 och 3 efter 0h
Jämförelse efter 0h mellan metod 1 och 3 hamnade två prover för kalcium utanför referensintervallet och exkluderades. Tre prover hade en skillnad på mer 10% mellan
metoderna och av dessa skilde ett prov på kalcium, ett på kalcium och fosfat och ett på fosfat och magnesium (Figur 1). Medelbias för kalcium var 1,8%, fosfat 2,7% och magnesium 3,l% (Tabell 3).
Figur 1: Linjärregressionsanalys och Bland Altmann-analys för kalcium (a), fosfat (b) och magnesium (c) efter 0h där jämförelse mellan metod 1 och 3 visas. För kalcium uteslöts tre prover som inte presenteras i tabellerna.
2 Jämförelse metod 1 och 2 efter 24h
Jämförelse efter 24h mellan metod 1 och 2 hamnade två prov för kalcium utanför
referensområdet och två prov för magnesium som därmed exkluderades. Tre prover hade en skillnad på mer än 10% mellan metoderna och av dessa skilde ett prov på fosfat, ett på magnesium och ett på kalcium och fosfat (Figur 2). Medelbias för kalcium var 0,8%, fosfat 3,6% och magnesium 1,7% (Tabell 3).
Figur 2: Linjärregressionsanalys och Bland Altmann-analys för kalcium (a), fosfat (b) och magnesium (c) efter 24h där jämförelse mellan metod 1 och 2 visas. För kalcium uteslöts två prover och för magnesium uteslöts två prover som inte presenteras i tabellerna.
3 Jämförelse metod 1 och 3 efter 24h
Jämförelse efter 24h mellan metod 1 och 3 hamnade två prover utanför referensintervallet för kalcium och två för magnesium som därmed exkluderades. Fyra prover hade en större
skillnad än 10% mellan metoderna och av dessa skilde ett prov på kalcium, ett på fosfat, ett på magnesium och ett på kalcium och fosfat (Figur 3). Medelbias för kalcium var 1,4%, fosfat 3,8% och magnesium 1,8% (Tabell 3).
Figur 3: Linjärregressionsanalys och Bland Altmann-analys för kalcium (a), fosfat (b) och magnesium (c) efter 24h där jämförelse mellan metod 1 och 3 visas. För kalcium uteslöts två prover och för magnesium uteslöts två prover som inte presenteras i tabellerna.
4 Jämförelse metod 1 och 2 efter 3 dagar
Jämförelse efter 3 dagar mellan metod 1 och 2 hamnade två prover utanför referensintervallet som kan mätas för kalcium och ett prov för magnesium som därmed exkluderades. Fem prover hade en skillnad på mer än 10% mellan metoderna och av dessa skilde ett prov på fosfat, två på magnesium och två på kalcium och fosfat (Figur 4). Medelbias för kalcium var 1,7%, fosfat 3,9% och magnesium 3,0% (Tabell 3).
Figur 4: Linjärregressionsanalys och Bland Altmann-analys för kalcium (a), fosfat (b) och magnesium (c) efter 3 dagar där jämförelse mellan metod 1 och 2 visas. För kalcium uteslöts två prover och för magnesium uteslöts ett prov som inte presenteras i tabellerna.
5 Jämförelse metod 1 och 3 efter 3 dagar
Jämförelse efter 3 dagar mellan metod 1 och 3 hamnade två prov utanför referensintervallet för kalcium och två prover för magnesium som därmed exkluderades. Sju prover hade en större skillnad än 10% mellan metoderna och av dessa skilde två prover på kalcium, ett på fosfat, två på magnesium, ett på kalcium och fosfat och ett på kalcium, fosfat och magnesium (Figur 5). Medelbias för kalcium var 3,4%, fosfat 4,5% och magnesium 2,8% (Tabell 3).
Figur 5: Linjärregressionsanalys och Bland Altmann-analys för kalcium (a), fosfat (b) och magnesium (c) efter 3 dagar där jämförelse mellan metod 1 och 3 visas. För kalcium uteslöts två prover och för magnesium uteslöts två prover som inte presenteras i tabellerna.
6 Jämförelse metod 1 och 2 efter 7 dagar
Jämförelse efter 7 dagar mellan metod 1 och 2 hamnade två prover utanför referensintervallet för kalcium och ett prov för magnesium som därmed exkluderades. Sex prover hade en större skillnad än 10% mellan metoderna och av dessa skilde två prover på kalcium, ett på fosfat, två på magnesium och ett på kalcium och fosfat (Figur 6). Medelbias för kalcium var 1,6%, fosfat 3,5% och magnesium 4,8% (Tabell 3).
Figur 6: Linjärregressionsanalys och Bland Altmann-analys för kalcium (a), fosfat (b) och magnesium (c) efter 7 dagar där jämförelse mellan metod 1 och 2 visas. För kalcium uteslöts tre prover och för magnesium ett prov som inte presenteras i tabellerna.
7 Jämförelse metod 1 och 3 efter 7 dagar
Jämförelse efter 7 dagar mellan metod 1 och 3 hamnade två prover utanför för kalcium och ett prov för magnesium som därmed exkluderades. Sex prover hade en skillnad på mer än 10% mellan metoderna och av dessa skilde två prover på kalcium, ett på fosfat, två på magnesium och ett på kalcium, fosfat och magnesium (Figur 7). Medelbias för kalcium var 3,3%, fosfat 3,4% och magnesium 4,7% (Tabell 3).
Figur 7: Linjärregressionsanalys och Bland Altmann-analys för kalcium (a), fosfat (b) och magnesium (c) efter 7 dagar där jämförelse mellan metod 1 och 3 visas. För kalcium uteslöts två prover och för magnesium uteslöts ett prov som inte presenteras i tabellerna.
