• No results found

Utveckling av multiplex realtids-PCR för genogruppering av invasiva Neisseria meningitidis

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Utveckling av multiplex realtids-PCR för genogruppering av invasiva Neisseria meningitidis"

Copied!
19
0
0

Loading.... (view fulltext now)

Full text

(1)

Örebro Universitet

Institutionen för hälsovetenskap och medicin Enheten klinisk medicin

Biomedicinsk analytikerprogrammet BMLV C, Examensarbete BL1701 (15 hp) 2014-05-10

Utveckling av multiplex realtids-PCR för

genogruppering av invasiva Neisseria meningitidis

Författare: Maria Magnusson Handledare: Paula Mölling, Docent Sara Thulin Hedberg, PhD

Laboratoriemedicinska länskliniken, Molekylärdiagnostik & FOU

(2)

SAMMANFATTNING

Neisseria meningitidis (meningokocken) är en gramnegativ kapselförsedd diplokock som kan

orsaka blodförgiftning (sepsis) och hjärnhinneinflammation (meningit). Meningokocken delas in i 13 olika serogrupper baserat på uppbyggnaden av polysackaridkapseln. Meningokocksjukdom orsakas framför allt av de sex serogrupperna; A, B, C, Y, W och X. Syftet med projektet var att sätta upp en multiplex realtids-PCR för att gruppera de sex vanligaste invasiva serogrupperna. Materialet som användes var 60 stycken kliniska isolat samt sex referensstammar. Optimering utfördes på olika primer- och probe koncentrationer. Efter optimering jämfördes den nya metoden med den nurvarande metoden som fanns i rutin idag. Resultatet visade att multiplex realtids-PCR för att genogruppera N. meningitidis invasiva serogrupper var en känsligare och mer effektiv metod. En stor fördel med den nya metoden var att mindre mängd material gick åt eftersom genogrupperng utfördes i triplexreaktioner. Slutsatsen är att genogruppering av de sex invasiva N. meningitidis är möjlig med multiplex realtids-PCR.

(3)

Innehållsförteckning

1. BAKGRUND ... 4

1.1 Neisseria meningitidis ... 4

1.2 Virulensfaktor hos N. meningitidis ... 4

1.3 Epidemiologi ... 5

1.4 Multiplex realtids-PCR ... 6

1.5 Genogruppering av N. meningitidis på svenska referenslaboratoriet i Örebro ... 7

1.6 Syfte ... 7

2. MATERIAL OCH METOD ... 8

2.1 Etiskt övervägande ... 8

2.2 Odling... 8

2.3 DNA-preparation ... 8

2.4 Optimering av multiplex realtids-PCR ... 9

2.4.1 Val av PCR-kit ... 9

2.4.2 Primertitrering ... 10

2.4.3 Probetitrering ... 11

2.5 Viable count ... 11

2.6 Jämförelse med nuvarande metod i rutin ... 11

2.7 Validering av metod ... 11 3. RESULTAT ... 12 3.1 Optimering ... 12 3.2 Viable count ... 12 3.3 Validering ... 13 4. DISKUSSION ... 15 5. REFERENSER... 18

(4)

4

1. BAKGRUND

1.1 Neisseria meningitidis

Neisseria meningitidis (meningokocken) är en humanpatogen som tillhör bakteriefamiljen

Neisseriaceae [1]. Meningokocken är en kapselförsedd gramnegativ diplokock som orsakar sepsis (blodförgiftning) och meningit (hjärnhinneinflammation) runt om i världen. Det är när bakterien passerar den epitaliala barriären och hamnar i blodet som den kan orsaka sjukdom. Hos ungefär 10 % av befolkningen kan meningokocken påvisas i svalget hos helt friska personer utan att ge upphov till sjukdom [2]. Bakterien sprids via luftburen droppsmitta från person till person [1]. Nära kontakt, ålder samt rökning är riskfaktorer för utveckling av meningokocksjukdom. Risken för att insjukna i invasiv meningokocksjukdom är störst hos individer som lever tätt inpå varandra. Dessa individer kan vara t.ex. personer inom det militära [3]. Sjukdom orsakat av meningokocker kännetecknas av hudutslag, hög feber, illamående, nackstelhet m.m. Utmaningen ligger i att ställa en tidig diagnos då hudutslag och andra typiska tecken på meningokocksjukdom inte uppkommer förrän senare i

sjukdomsförloppet. De initiala symtomen kan påminna mycket om till exempel influensa [1]. Meningokocksjukdom kan ha ett mycket snabbt förlopp. Inom ett par timmar kan en tidigare fullt frisk person dö [4]. Ungefär 70-90 % av patienter som får meningokocksjukdom utan någon behandling har svårt att överleva [3]. Bland personer som får behandling så är det ungefär 10 % som avlider och bland överlevande får 10-20 % men för livet [5]. För att diagnostisera sjukdom som orsakats av meningokocker kan gramfärgning och bakterieodling av blod eller likvor utföras [1]. För snabbdiagnostik eller icke odlingsbara prover används även Polymerase Chain Reaction (PCR) teknik, där ctrA genen är den vanligaste diagnostiska markören. Genen ctrA kodar för ett protein som sitter i bakteriens yttermembranet och är delaktig i transporten av polysackaridkapseln [6,7].

Vaccination är effektivast för att kontrollera meningokocksjukdom [4]. De vaccinerna som finns idag är riktade mot serogrupperna A, C, Y och W [1]. Det finns även ett nytt vaccin mot grupp B [8]. Med hjälp av profylaktisk antibiotikabehandling och vaccin tros sekundärfallen av

meningokocksjukdom minskas [4]. Sjukdomen är anmälningspliktig [9].

1.2 Virulensfaktor hos N. meningitidis

Baserat på uppbyggnaden av polysackaridkapseln delas meningkocken in i 13 olika serogrupper. Polysackaridkapseln är den viktigaste virulensfaktor hos N. meningitidis och skyddar bakterien mot bland annat fagocytos [10]. Kapselns uppgift är också att underlätta kolonisering [1]. Virulensen

(5)

5 hos N. meningitidis är även kopplad till yttermembranprotein och endotoxin [1]. Majoriteten av alla fall av meningokocksjukdom är orsakade av de sex serogrupperna; A, B, C, Y, W och X [2]. Vaccin mot meningokocken är framförallt riktad mot kapseln [1].

1.3 Epidemiologi

Serogrupp A, B, C, W, Y och X är de sex invasiva serogrupperna av meningokocker som främst orsakar sjukdom runt om i världen (se figur 1) [4,11]. Stora epidemier har orsakats av serogrupp A framförallt i det så kallade meningitbältet i sub-Saharan, Afrika [2]. Serogrupperna C, W och X har också orsakat sjukdom i Afrika [10]. Serogrupp W associeras med Hajj (muslimernas pilgrimsfärd) då den orsakat utbrott under vallfärden till Mekka. Utbrott av serogrupp W har även skett i

meningitbältet [10]. År 2006 var det år då serogrupp X uppmärksammades och har sedan dess orsakat sjukdom framför allt i meningitbältet [12].

I Asien förekommer också främst serogrupp A [2]. I Kuba, Chile, Europa, Nya Zeeland samt Australien har serogrupp B orsakat sjukdom [2,3]. Utbrott i USA, Väst Europa samt Kanada har orsakats av serogrupp C [3]. Invasiv meningokocksjukdom orsakat av serogrupp Y har sedan mitten av 90-talet orsakat utbrott av sjukdomen i Israel och USA [3]. Under 2000-talets mitt noterades en ökning av serogrupp Y i Sverige och incidencen har fortsatt öka [2].

Fig 1. Fördelningen av de sex vanligaste invasiva N. meningitidis i världen. Bilden från artikeln Global epidemiology of invasive meningococcal disease (Bilden tillgänglig på

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19477562)

(6)

6

1.4 Multiplex realtids-PCR

Multiplex realtids-PCR bygger på konventionell PCR-teknik samt realtids-PCR. Metoden gör det möjligt att detektera flera olika målsekvenser. I samma reaktion som utförs basparar flera primerpar till olika templat vilket gör att flera målsekvenser kan detekteras. På detta sätt kan flera olika bakteriearter eller grupper detekteras med hjälp av flourescerande prober som avger ljus med olika våglängd [13]. För att spara tid och sänka kostnader samt arbetsbelastning används den multiplexa realtids-PCR metoden allt mer. Vid användning av tre primerpar i en PCR-reaktion kallas det för triplex. Vid användning av ett primerpar kallas det för en simplex reaktion [14].

I en multiplex realtids-PCR används bl.a. TaqMan prober som är en hydrolysprob och den vanligaste typen av prober. Precis som primern består proben av oligonukleotider. En reporter (fluorofor) är inmärkt i 5´-änden. I 3´-änden på oligonukleotiden är en quencher inmärkt.

Quencherns uppgift är att ta upp ljuset som avges av fluoroforen. Proben binder till målsekvensen vid amplifiering och under det tredje steget i PCR-reaktionen, kopieringen (elongeringen), bryts proben ner av Taq-polymerasets endonukleaser som gör att reportern skiljs från quenchern och kan avge ljus (se figur 2). Ljuset detekteras av realtidsinstrumentet och de olika proberna kan detekteras vid olika våglängd [15].

Fig 2. Bilden förklarar en Taqman probe där en reporter är inmärkt i 5´-änden av oligonukleotiden och i 3´-änden är en quencher inmärkt. Proben binder målsekvensen vid amplifieringen. Quenchern hämmar reporten från att avge ljus. Under amplifieringen bryter polymerasets endonukleaser ner proben samtidigt som

reporten skiljs från quenchern och avger fluorescerande ljus som kan detekteras. Bilden från Gene-quantification hemsida (bilden tillgänglig på http://www.gene-Gene-quantification.de/chemistry.html)

(7)

7 I realtids-PCR kan även SYBR Green I användas som detektionsmetod. Till skillnad från TaqMan prob är SYBR Green en fluorescerande färgmolekyl som binder ospecifikt till minor groove på allt dubbelsträngat DNA. Det är endast när SYBR Green är inbundet som energi avges. Då SYBR Green binder till allt dubbelsträngat i DNA-molekylen kan det binda även till biprodukter om metoden inte är helt optimerad. Biprodukter kan vara till exempel primer-dimer och därför måste en smältpunktsanalys göras för att säkerhetställa att rätt produkt bildats [15].

För att få en fungerande multiplex realtids-PCR krävs det optimering av bl.a. primers och probers koncentration [13]. Vid analys av realtids-PCR ses en amplifieringskurva vid positiva reaktioner. För att analysera om ett prov blivit positivt bestäms ett tröskelvärde (threshold, cut-off-värde). Tröskelvärdet ska ligga strax ovanför bakgrundsfluorescensen. När amplifieringskurvan passerar det bestämda tröskelvärdet tolkas provet positivt och ett s.k. Cycle threshold (Ct) värde också kallat Crossing point (Cp), erhålls. Ett lågt Ct-värde tyder på mycket DNA i provet och ett högt Ct-värde lite DNA. För en effektiv PCR ska det vara 3,3 cykler mellan varje amplifieringskurva i en 10-spädning [15].

1.5 Genogruppering av N. meningitidis på svenska referenslaboratoriet i Örebro

Universitetssjukhuset i Örebro är referenslaboratorium för patogena Neisseria meningitidis. Odlade

N, meningitidis grupperas idag framförallt serologiskt genom s.k. co-agglutinering [16]. Genetisk

gruppering, s.k. genogruppering är framförallt för odlingsnegativa prover som kommer direkt från likvor. Idag kan genetisk gruppering av A, B, C, Y och W av meningokocken ske i så kallade simplexreaktioner, där en grupp per reaktion identifieras på realtids-PCR:n Light Cycler 2.0 Metod för att kunna identifiera serogrupp X saknas i dagens rutinmetod där det även går åt stor mängd material (5 x 5 µl) då simplexreaktioner utförs. Sensitivitet för metoden är inte heller optimal. Metoden använder sig utav SYBR Green som detektionsmetod istället för TaqMan probe [17].

1.6 Syfte

Syftet med projektet var att sätta upp en multiplex realtids-PCR för att gruppera de sex vanligaste invasiva serogrupperna av meningokocker; A, B, C, Y, W och X för att effektivisera metoden.

(8)

8

2 MATERIAL OCH METOD

2.1 Etiskt övervägande

Ingen etisk ansökan behövdes eftersom det var bakterieprover som användes.

2.2 Odling

Totalt 60 stycken frysta isolat samt sex referensstammar, en för varje grupp; A, B, C, Y, W och X av

N. meningitidis (Referenslaboratoriumet för patogena Neisseria i Örebro) odlades ut på ospecifik

GC agarplatta [3,6 % Difco GC Medium Base (Becton, Dickinson and Company, Sparks USA), 1 % hemoglobin (Becton, Dickinson and Company, Sparks USA) och 10 % hästserum (Statens veterinärmedicinska anstalt, Uppsala Sverige)] och inkuberades över natten i 37 °C med 5 % koldioxid. Isolaten var serogrupperna A (n=10), B (n=10), C (n=10), Y (n=10), W (n=10) och X (n=10) samt referensstammarna A (CCUG 3269), B (CCUG 3270), C (CCUG 3271), Y (CCUG 38303), W (CCUG 27650) och X (CCUG 27645). Från respektive platta slammades två kolonier i 200 µl 0,9 % NaCl. Proverna förvarades i 4 °C tills DNA-preparation på MagNA Pure Compact utfördes.

2.3 DNA-preparation

DNA-preparation av referensstammarna och de kliniska isolaten utfördes på MagNA Pure Compact (Roche Diagnostic, Mannheim, Tyskland) med kitet MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I (Roche Diagnostic) enligt tillverkarens instruktioner. Bakterierna förlyserades genom att 180 µl MagNA Pure Bacteria Lysis Buffer (Roche Diagnostic) tillsattes till varje bakteriesuspensionen till en totalvolym på 380 µl. Därefter tillsattes 20 µl Proteinase K (Roche Diagnostic) till respektive prov. Provet vortexades och centrifugerades. Inkubation av proven utfördes i 65 °C i 10 min

(lyseringssteg) och sedan i 95 °C i 10 min (avdödning av cellväggen) på värmeblock. Hela volymen (rumstemperatur) överfördes i roboten och DNA-preparerades med hjälp av färdiga reagensstrip, elueringsrör samt pipettspetsar. Elueringsvolymen för varje prov var 50 µl. Proverna förvarades i 4 °C till multiplex realtids-PCR utfördes.

(9)

9

2.4 Optimering av multiplex realtids-PCR

2.4.1 Val av PCR-kit

De sex referensstammarna användes för att optimera den multiplexa realtids-PCR metoden. Initialt testades två kit för att se vilket kit som var optimalast att använda i multiplexa realtids-PCR;

Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Life technologies, Sverige) innehållande (Taq DNA polymerase, Tris-HCl, KCl, 6 mM MgCl2, 400 μM dGTP, 400 μM dATP, 400 μM dCTP, 800 μM dUTP, uracil DNA glycosylase (UDG) samt stabiliserande ämne) och Rotor-Gene

Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) innehållande HotStarTaq® plus DNA Polymerase, Rotor-Gene Multiplex PCR buffert och dNTP mix; dATP, dCTP, dGTP samt dTTP).

DNA-preparationen av referensstammarna späddes 1/1000, 1/10,000, 1/100.000 och 1/1000.0000. En negativ kontroll innehållande sterilt vatten fanns med i varje reaktion. En mastermix bereddes för vardera kit innehållande 1x Platinum® Quantitative PCR-SuperMix-UDG, Bovin serum albumin (BSA, 80 ng/µl), Prober Aldrich, St. Louis, USA), Forward och Reverse Primer (Sigma-Aldrich) (se tabell 1) samt vatten (PCR Grade). I det andra kitet användes Rotor-Gene PCR mix istället för Platinum® Quantitative PCR-SuperMix-UDG. Till PCR-rör (72-rotorgene) tillsattes 20 µl mastermix och 5 µl templat. PCR:n utfördes i 2 triplexreaktioner; B, C och Y i en triplex och A, W och X i en triplex. Därefter utfördes en multiplex realtids-PCR på rotorGene Q (Qiagen) där programmet för RotorGene var 95 °C i 5 min föjlt av 50 cykler av 95 °C i 15 s, 60 °C i 15 s. Programmets längd var 89 min. Programmet för Platinum ® var 50 °C i 2 min, 95 °C i 5 min föjlt av 50 cykler av 95 °C i 15 s och 60 °C i 1 min. Programmet tog 128 min.

Tabel 1 Primer och probe sekvenser i metoden

Målgen Primer/probea (färginmärkning) Nukleotidsekvens 5´-3´ Amplikon (baspar) A F2531b R2624c Pb259d (Hex)e AAAATTCAATGGGTATATCACGAAGA ATATGGTGCAAGCTGGTTTCAATAG [Hex]CTAAAAGAGGAAGGGCACTTTGTGGCATAAT[BH Q1]f 92 W F857 R964 Pb907 (FAM)g TATTTATGGAAGGCATGGTGTATG TTGCCATTCCAGAAATATCACC [FAM]AAATATGGAGCGAAGATTACAGTAACTATAA[BH Q1] 129 X F173 R237 TGTCCCCAACCGTTTATTGG TGCTGCTATCATAGCCGCC 66

(10)

10 Pb196 (Cy5)h [Cy5]TGTTTGCCCACAGAATGGCGG[BHQ1] B F737 R882 Pb839 (Cy5) GCTACCCCATTTCAGATGATTTGT ACCAGCCGAGGGTTTATTTCTAC [Cy5]AAGAGATGGGYAACAACATGTAATGTCTTTATTT[ BHQ1] 169 C F478 R551 Pb495 (FAM) CCCTGAGTATGCGAAAAAAATT TGCTAATCCCGCCTGAATG [FAM]TTTCAATGCAATGAATACCACCGTTTTTTTGC[BH Q1] 77 Y F787 R929 Pb1099 (Hex) TCCGAGCAGGAAATTTATGAGAATAC TTGCTAAAATCATTCGCTCCATAT [Hex]TATGGTGACGATATCCCTATCCTTGCCTATAAT[BH Q1] 146 a

Wang et al 2012 b Forward primer c Reverse primer d Probe e Gul f Black Hole Quencher g Grön h

Röd

2.4.2 Primertitrering

All vidare optimering utfördes med kitet Platinum® Quantitative PCR-SuperMix-UDG. En korsvis primertitrering i koncentrationerna 0,3 µM, 0,6 µM och 0,9 µM utfördes på forward och reverse primer för en serogrupp i taget för att få en känsligare metod (se tabell 2). Templatet späddes 1/1000 och 1/10.000 och sattes i duplikat. En primer/prob mix blandades innehållande de primrar som ingick i triplexen som inte titrerades samt alla tre prober. För blandning av mastermix med de olika primerkoncentrationerna användes pipetteringsroboten QIAgility (Qiagen). QIAgility pytsade sedan även de färdiga mastermixarna och proverna till PCR-rören. Därefter sattes en realtids-PCR på RotorGene Q.

Tabell 2. Korsvis primertitrering till koncentrationerna 0,3 µM, 0,6 µM och 0,9 µM för respektive primrar F: 0,3 µM F: 0,6 µM F: 0,9 µM R: 0,3 µM 0,3/0,3 0,3/0,6 0,3/0,9 R: 0,6 µM 0,6/0,3 0,6/0,6 0,6/0,9 R: 0,9 µM 0,9/0,3 0,9/0,6 0,9/0,9 F =Forward primer. R = reverse primer

(11)

11 2.4.3 Probetitrering

Efter primertitrering på varje serogrupp utfördes probetitrering till koncentrationerna 0,1 µM, 0,2 µM, 0,3 µM och 0,4 µM i varje triplex. Alla primers för respektive triplex tillsattes och de två prober som inte titrerades. Templat späddes 1/1000 och 1/10.000. Multiplex realtids-PCR utfördes på RotorGene Q.

2.5 Viable count

För att bestämma metodernas känslighet utfördes viable count på de sex referenstammarna. Viable count räknade ut koncentrationen av antalet levande bakterier i lösningen. Referensstammarna odlades ut på ospecifik GC-agarplatta och inkuberades i 37 °C 5 % koldioxid över natten. Fem kolonier slammades sedan i 2 ml NaCl i varsitt glasrör. En spädningsserie i NaCl utfördes, 1/100, 1/10.000 och 1/100.000. Spädningarna odlades ut på ospecifik GC-agarplattor med 100 µl av respektive bakterielösning. Plattorna inkuberades i 37 °C 5 % koldioxid över natten. Antalet kolonier räknades på plattorna nästa dag för att beräkna antalet bakteriekolonier/ml och därefter räkna ut antalet bakterier/PCR. Volymen 200 µl av spädning 1/100 och 1/10.000 DNA-extraherades enligt 2.3 DNA-preparation ovan.

2.6 Jämförelse med nuvarande metod i rutin

Spädning 1/100 och 1/10.000 av DNA-preparationerna av referensstammarna jämfördes mellan nurvarande rutinmetod som utfördes i fem simplex reaktioner för grupp A, B, C, Y och W [18] och de optimerade multiplex-PCR:erna B, C, Y samt A, W, X. DNA-preparationerna späddes 1/100, 1/1000, 1/10.000 samt 1/100.000. För serogrupp W späddes det även till 1/1000.000. Dessa

spädningar, med 1/10.000, 1/100.000 samt 1/1000.000 för W i triplikat, kördes tillsammans med en positiv- respektive negativ kontroll för respektive metod.

2.7 Validering av metod

För att validera den nya metoden och säkerställa att ingen korsreaktion skedde analyserades de 60 kliniska isolaten som DNA-extraherats, tio av varje grupp. Som positiva kontroller inkluderades de sex referensstammarna (spädning 1/100) samt sterilt vatten som negativ kontroll. Alla isolat

(12)

12 analyserades i båda triplex-reaktionerna (B, C, Y respektive A, W, X)

3. RESULTAT

3.1 Optimering

Efter jämförelsen av de två olika kiten valdes Platinum Quantitative PCR Supermix – UDG och all vidare optimering utfördes med det kitet och PCR-programmet.

Primertitreringen utfördes till koncentrationerna 0,3, 0,6 och 0,9 µM på forward och reverse av respektive primer för alla serogrupper för att undersöka vilken koncentration som gav mest

känslighet. Resultatet visade optimalast koncentration mellan 0,3-0,9 µM för varje grupp. Proberna titrerades till koncentrationerna 0,1 µM, 0,2 µM, 0,3 µM samt 0,4 µM. Resultatet från

probetitreringen som utfördes för att få en bättre signal på alla de sex serogrupperna resulterade i att alla sex prober hade optimalast probekoncentration vid 0,1 µM. För exakta koncentration av primrar och prober som gav den optimala PCR-reaktionen, se tabell 3.

Tabell 3. Resultat av primer- och probe-titrering för varje serogrupp Serogrupp Forward primer

(µM) Reverse primer (µM) Probekoncentration (µM) Thresholda B 0,6 0,3 0,1 0.020 C 0,9 0,3 0,1 0.020 Y 0,3 0,9 0,1 0.020 A 0,3 0,9 0,1 0.030 W 0,9 0,6 0,1 0.020 X 0,3 0,3 0,1 0.020 a

Tröskelvärde för varje serogrupp

3.2 Viable count

Resultaten av viable count, där metodernas känslighet bestämdes, kan ses i tabell 4 för alla sex grupper. Målet var att hitta så få bakterier som möjligt. Resultatet visade antal bakterier/PCR

(13)

13 reaktion. För grupp B, C och W var den multiplexa realtids-PCR metoden känsligare än dagens rutinarbete. För grupp A och Y var känsligheten jämförbar mellan de båda metoderna. Grupp X visade en hög känslighet för multiplex realtids-PCR men inget resultat kunde tas fram från dagens rutinarbete.

Tabell 4. Jämförelse mellan dagens rutin-metod på Light Cycler 2.0 och multiplex realtids-PCR på RotorGene baserat på viable count.

Serogrupp Rutin

(antal bakterier/PCR reaktion)

Multiplex

(antal bakterier/PCR reaktion)

B 520 52 C 180 18 Y 80 80 A 32 32 W 56 <5 X - <60 3.3 Validering

Resultatet av de 60 kliniska isolaten av N.meningitidis, tio av varje serogrupp, som testats i båda triplex PCR:erna kan ses i figur 3 och 4. Alla isolaten av varje serogrupp blev positiva i den

förväntade serogrupperingen och den positiva kontrollstammen för varje stam blev positiv. Den ena triplexen resulterade i att grupp B-isolaten hade ett Ct-värde mellan intervallen 13.0-14.7 med en positiv kontroll vid 27.4. Grupp C resulterade i Ct-värde mellan 13.7-16.5 för de kliniska isolaten med en positiv kontroll vid 27.5. För grupp Y hade de kliniska isolaten ett Ct-värde i intervall mellan 14.7-16.6 och den positiva referensstammen hade ett Ct-värde på 26.2. För den andra

triplexen visade grupp A ett Ct-värdet mellan 14.7-18.1 mellan första och sista kliniska isolatet. Den positiva referensstammen hade ett Ct-värde på 28.8. Grupp W hade ett Ct-värde i intervallen 15.4-18.7 för de kliniska isolaten där även en serogrupp Y blev svagt positivt med Ct-värde 41.5. Positiva referensstammen hade ett värde på 30.0. För sista gruppen i triplexen, grupp X hade de kliniska isolaten ett Ct-värde på 10.7-13.5. Positiva referenskontrollen hade ett Ct-värde på 22.6.

(14)

14 Fig 3. B, C, Y triplex resultat för de 60 stycken kliniska isolaten med tio stammar av respektive serogrupp där först figuren visar grupp B. I andra figuren visas grupp C och i sista figuren visas grupp Y. De tre figurerna visar tio positiva resultat efter tio kliniska isolat av respektive stam tillsammans med referensstam som positiv kontroll för varje serogrupp.

Grupp B

Grupp Y Grupp C

(15)

15 Fig 4. A, W, X triplex resultat för de 60 stycken isolaten med tio stammar av respektive serogrupp där första figuren visar grupp A. Den andra figuren visar grupp W där ytterliggare ett svagt positivt prov kom fram under cykel 41.5 och i den sista figuren kan grupp X ses. Figurerna visar tio positiva resultat efter att tio kliniska isolat testats av respektive stam samt referenstam som positiv kontroll för varje serogrupp.

4. DISKUSSION

Multiplex realtids-PCR för att genogruppera N. meningitidis serogrupp A, B, C, Y, W och X visade sig vara en känsligare och effektiv metod. Den nya metoden utfördes i triplex-reaktioner på

Grupp A

Grupp W

(16)

16 Rotorgene Q med TaqMan prober istället för simplex-reaktioner med SYBR Green. Syftet med projektet var att få fram en lika bra eller ännu känsligare metod än nuvarande rutin på Light Cycler 2.0 vilket resultatet visade.

Det kit som valdes för vidare optimering var Platinum ® Quantitative PCR SuperMix-UDG då bättre amplifieringskurva erhölls från det kitet. För att få fram en så effektiv PCR som möjligt, som även kan detektera svaga odlingsnegativa prover t.ex. från blod eller likvor måste en noggrann optimering göras. Optimeringen bestod av att utföra titrering av primer och prober för att se vilken koncentration som var optimalast att använda för att få en känslig metod. Koncentrationerna valdes ut genom att jämföra amplifieringskurvorna från varje stam efter realtids-PCR. De kurvor som hade ett lägre Ct-värde och en tydlig brant amplifieringskurva valdes, då detta indikerar en högre

effektivitet. Efter optimering utfördes viable count för att bestämma metodens känslighet. Proverna späddes för att komma ner till detektionsnivån, vilket visade att den multiplexa PCR:n hade en bättre känslighet för grupp B, C samt Y och var jämförbar för grupp A och Y. Även för grupp X hade metoden en mycket bra känslighet men en jämförelse mellan den nya metoden och rutinens metod gick inte att utföra eftersom genogruppering av grupp X tidigare inte funnits uppsatt på laboratoriet.

En stor fördel med den nya metoden är att mindre mängd material åtgår eftersom en triplexreaktion utförs. Den nya metoden kräver endast två mastermix för att identitifera de sex mest invasiva serogrupperna av meningokocken jämfört med tidigare fem mixar för fem serogrupper. Detta gör den nya metoden är mer ekonomisk och mindre arbetskrävande. Trots att själva realtids-PCR:en tar längre tid (drygt två timmar jämfört med en timme) är den nya metoden mer effektiv då fler prover kan analyseras samtidigt då RotorGene har plats för 72 prover, jämfört med LightCyclers 32 prover. Den multiplexa metoden är även mer specifik då det används prober istället för SYBR Green. Grupperna B, C, och Y användes i en triplex eftersom dem är den största orsaken till

meningokocksjukdom i Sverige och Västvärlden. En nackdel med den nya metoden var att

fluorescensen för W var en aning låg vilket kan bero på batch variationer i tillverkningen men även att fluorescensen för de olika proberna är olika starka.

Genom att kunna gruppera positiva patientprover direkt från likvor eller blod där bakterierna inte odlats fram krävs det en känslig metod varav en ordentlig optimering av metoden behövs. Att få information om serogrupp även i dessa prover är viktigt för att vaccinationsbeslut ska kunna fattas.

(17)

17 För att se att den nya metoden fungerade bra och att ingen korsreaktivitet mellan de olika grupperna förekom, analyserades tio isolat av varje serogrupp. För varje grupp erhölls de förväntade tio

positiva resultaten, förutom för grupp W där ytterliggare ett svagt positivt prov identifierades, en grupp Y-stam. En co-agglutination utfördes för att säkerhetsställa gruppen som bekräftade att det var serogrupp Y. Isolatet analyserades även i dagens rutinmetod för genogruppering av grupp Y och W där resultatet bekräftade att det var en grupp Y. Då isolatet i multiplex-analysen blev mycket svagt och sent positivt för grupp W, jämfört med grupp Y tyder detta på en ospecifik reaktion. Vad detta beror på är under utredning då hela genomet för detta isolat har sekvenserats.

Wang et al (2012) utförde en multiplex realtids-PCR i sin studie samt en simplex realtids-PCR. Primer och probe-sekvensenrna samt kitet i projektet togs fram från studien för att utföra den nya multiplexa realtids-PCR metoden. Enligt artiklen fanns det ingen skillnad i specificitet och sensitivitet mellan simplex realtids-PCR och en multiplex realtids-PCR. Projektets

slutkoncentration för primrarna skilde sig lite från artikelns slutkoncentrationer. Likheten var att samma primer- och probekoncentration var jämförbart med grupp A och C. Det som skiljdes mellan de projekten var att olika realtids-intrument användes som kan vara orsaken till mellan resultaten av koncentrationerna [14].

Sammanfattningsvis är den nya multiplexa metoden en effektiv och känslig metod för genogruppering av de sex vanligaste serogrupperna av invasiva N.meningitidis,

(18)

18

5. REFERENSER

[1] Stephens DS, Greenwood B, Brandtzaeg P. Epidemic meningitis, meningococcaemia, and

Neisseria meningitidis. Lancet. 2007 30;369(9580):2196–210.

[2] Hedberg ST, Törös B, Fredlund H, Olcén P, Mölling P. Genetic characterisation of the emerging invasive Neisseria meningitidis serogroup Y in Sweden, 2000 to 2010. Euro Surveill. 2011;16(23): 1-7.

[3] Stephens DS. Conquering the meningococcus. FEMS Microbiol Rev. 2007 ;31(1):3–14.

[4] Rebelo MC, Boente RF, Matos J de A, Hofer CB, Barroso DE. Assessment of a two-step nucleic acid amplification assay for detection of Neisseria meningitidis followed by capsular genogrouping. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006 ;101(7):809–13.

[5] Van Deuren M, Brandtzaeg P, van der Meer JW. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clin Microbiol Rev. 2000 13(1):144–166.

[6] Frosch M, Müller D, Bousset K, Müller A. Conserved outer membrane protein of Neisseria

meningitidis involved in capsule expression. Infect Immun. 1992 Mar;60(3):798–803.

[7] Hedberg ST, Olcén P, Fredlund H, Mölling P. Real-time PCR detection of five prevalent bacteria causing acute meningitis. APMIS. 2009 Nov;117(11):856–60.

[8] Acevedo R, Fernández S, Zayas C, Acosta A, Sarmiento ME, Ferro VA, et al. Bacterial Outer Membrane Vesicles and Vaccine Applications. Front Immunol. 2014;5:121.

Vaccin mot B

[9] Neisseria meningitidis (diagnostik) [Internet]. Stockholm: Folkhälsomyndigheten; [uppdaterad 2012 mars; citerad 2014-03-31]. Tillgänglig

från: http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/w/Neisseria_meningitidis_(diagnostik)

[10] Tzeng Y-L, Noble C, Stephens DS. Genetic basis for biosynthesis of the (alpha 1-->4)-linked N-acetyl-D-glucosamine 1-phosphate capsule of Neisseria meningitidis serogroup X. Infect Immun. 2003 ;71(12):6712–20.

(19)

19 [11] Jafri RZ, Ali A, Messonnier NE, Tevi-Benissan C, Durrheim D, Eskola J, et al. Global

epidemiology of invasive meningococcal disease. Popul Health Metr. 2013;11(1):17.

[12] Boisier P, Nicolas P, Djibo S, Taha M-K, Jeanne I, Maïnassara HB, et al. Meningococcal meningitis: unprecedented incidence of serogroup X-related cases in 2006 in Niger. Clin Infect Dis. 2007 1;44(5):657–63.

[13] Dai J, Peng H, Chen W, Cheng J, Wu Y. Development of multiplex real-time PCR for

simultaneous detection of three Potyviruses in tobacco plants. J Appl Microbiol. 2012 ;114(2):502– 8.

[14] Wang X, Theodore MJ, Mair R, Trujillo-Lopez E, du Plessis M, Wolter N, et al. Clinical validation of multiplex real-time PCR assays for detection of bacterial meningitis pathogens. J Clin Microbiol. 2012, 50(3):702–8.

[15] Realtids-PCR [Internet]. Stockholm: Folkhälsomyndigheten; [uppdaterad 2012 mars; citerad 2014-03-31]. Tillgänglig från: http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/w/Realtids-PCR

[16] Olcén P, Danielsson D, Kjellander J. The use of protein A-containing staphylococci sensitized with anti-meningococcal antibodies for grouping Neisseria meningitidis and demonstration of meningococcal antigen in cerebrospinal fluid. Acta Pathol Microbiol Scand B. 1975 ;83(4):387–96.

[17] Mölling P, Jacobsson S, Bäckman A, Olcén P. Direct and rapid identification and

genogrouping of meningococci and porA amplification by LightCycler PCR. J Clin Microbiol. 2002; 40(12):4531–5.

References

Related documents

Det är som sagt inte den här studiens sak att besluta huruvida det är ”rättvist” eller ej – men en typ av begräsning är alltså den eventuella beskattningsavgift som

[r]

Så undersökningen som genomfördes mäter alltså det den skall mäta, det vill säga hur elever värderar kunskaperna som de har fått i undervisningen och om eleverna kan

Eftersom upplevelsen av något bidrar till att skapa ett värde så är denna punkt främst ämnad att beskriva hur konsumenter respektive företag upplever konsumentens roll

koncernernas resultat. SCA höjde sitt resultat år 2007 på grund av högre försäljningspriser och en bättre produktmix och sänkte sitt resultat året efter på grund av

Värdekedjan är användbar för att identifiera värdeskapande- samt icke-värdeskapande aktiviteter samt analysera hur dessa skapar kundvärde (Bengtsson &amp; Skärvad,

Upplupet anskaffningsvärde för en finansiell tillgång eller en finansiell skuld är det belopp till vilket den finansiella tillgången eller den finansiella skulden

Kravet om ”a true and fair view” syftar enligt Nilsson (2005) och Soderstrom och Sun (2008) bland annat till att främja kapitalmarknadens informationsbehov framför andra funktioner