Dentala kompositmaterials inverkan på närliggande celler

Dentala kompositmaterials inverkan

på närliggande celler.

Cytotoxiciteten och ytstrukturens påverkan på cellernas

adhesion till två kompositmaterial.

Emilia Nikolovska och Maria Rivera

Tandteknikerutbildningen K6 2011

Handledare:

Luis Chavez de Paz, Docent

Lars Olsson, Universitetsadjunkt

Odontologiska fakulteten

SAMMANFATTNING

Inledning

Implantatbehandlingar har blivit allt vanligare och material som associeras med implantat är oftast dentalt titan och dentala keramer. Även kompositmaterial förknippas ibland med implantat. Det är inte helt ovanligt att kompositmaterial förekommer vid submukösa implantatbehandlingar och få studier är hittills gjorda på kompositmaterials cytotoxiska påverkan på omkringliggande vävnad.

Material och metod

Sammanlagt tillverkades 24 stycken provkroppar till studien av två kompositmaterial (Crea.lign och SinfonyTM) och ett fältspatsporslin (Noritake). Tre provkroppar av varje material ytanalyserades med hjälp av optisk interferometri. En provkropp av varje material användes till pilotstudien och resterande provkroppar utsattes för två olika

cellodlingsmetoder: Live/dead-metod och FISH-fluorescence in situ hybridization. Orala bakterier som användes i studien var Streptococcus oralis, Fusobacterium nucleatum och Actinomyses naeslundii, vilka odlades i en respektive sju dagar. Samtliga provkroppar autoklaverades före cellodlingen. Cellerna analyserades i mikroskop och värdena som framkom omvandlades till diagram och 3D-bilder. Resultaten jämfördes genom en statistisk analys med hjälp av two-way ANOVA, där signifikansnivån sattes till p=0,05.

Resultat

Samtliga celler var vid liv på samtliga provkroppsytor efter en respektive sju dagars cellodling, och en signifikant skillnad förelåg i % yttäckning av celler på provkropparna. Fältspatsporslin uppvisade en signifikant lägre yttäckning av celler med FISH-metoden, i jämförelse med kompositmaterialen. Med avseende på biofilmen, kunde det konstateras att detachment (lossning av celler från ytan) förelåg på samtliga provkroppar efter sju dagars cellodling.

Syfte

Syftet med föreliggande studie var att undersöka (a) tre olika bakteriearters adhesion och koloniseringsförmåga (b) på fältspatsporslin och två olika kompositmaterial, materialens toxiska påverkan på de olika bakterierna samt (c) om materialens ytstruktur påverkar bakteriernas adhesion.

INNEHÅLLFÖRTECKNING

Inledning... 4

Syfte... 6

Material och metod... 7

Framställning av provkroppar... 7

Analys av provkroppsytor... 9

Cellodling... 10

Live/dead-metod... 10

Fish-metod... 11

Konfokalmikroskop och cellkalkylering... 11

Statistisk analys... 11 Resultat... 12 Interferometri... 12 Statistisk analys... 14 Biofilmstillväxt... 15 Livsduglighet... 16 Cellfördelning... 16 Diskussion... 19 Slutsats... 21 Materiallista... 22 Material... 22 Materiel... 22 Ordförklaringar... 23 Tack till ... 24 Referenser... 25

INLEDNING

Efter att osseointegration introducerades för över 30 år sedan, har implantatbehandlingar blivit en viktig del av tandvården. Över det osseointegrerade implantatet används ibland olika distansmaterial som måste uppfylla vissa kriterier som estetik, hållfasthet samt

biokompatibilitet16. Vanliga material som används till distansmaterial är bland annat titan, aluminiumoxid och zirkoniumdioxid6.

Helkeramiska ersättningar har blivit alltmer populära vid implantatbehandlingar6 _{tack vare}

sina goda egenskaper som biokompatibilitet, kemisk stabilitet och en termisk expansionskoefficient jämförbar med den naturliga tanden10,35.

Andra material som används vid implantatbehandlingar är polymerer. Vid polymerer i samband med implantatbehandlingar, finns det en risk att när materialet sätts in i vävnaden, uppstår det degradation av benvävnaden. Eftersom implantat är ämnade att sitta kvar i kroppen under en längre tidsperiod, är det viktigt att sådana komponenter inte framkallar någon ogynnsam reaktion på vävnaden1. Restmonomerer, eller opolymeriserade monomerer, som friges i små mängder har visat sig ha en cytotoxisk (se sidan 23) effekt på närliggande celler21,11. Restmonomerer finns även i dentala kompositmaterial, vilket har resulterat i cytotoxicitet gentemot vävnaden även vid låga mängder restmonomerer8,12, 21,22,28.Studier visar att när man avlägsnar restmonomerer i en komposit minskar effekten av celldöd med ca 90%11.

Dentala kompositmaterial utvecklades 1962 genom att man kombinerade dimetakrylat och kvartspulver36. Kvartspulver är oorganiska, hårda partiklar bundna i resinmatris.

Opolymeriserat resin består till största delen av en monomerblandning30.Under de senaste årtiondena har komposit utvecklats på flera olika sätt. Den viktigaste förändringen som har gjorts, var en förändring i fillersystemet, vilket har resulterat i minskad polymerisations-krympning14, förutsatt att fillerpartiklarna är väl bundna till matrisen2. Studier visar även att en ökning av fillerpartiklar leder till ett mindre vätskeupptag25.

Kompositmaterial levereras oftast till dentala laboratorier som pastaform och ett iniatorsystem behövs för att omvandla det opolymeriserade mjuka resinet till en fast och hållfast

konstruktion. Resinet består i huvudsak av en monomerblandning och de vanligaste monomerblandningarna som används är bl.a. TEGDMA (trietylenglykolmetakrylat) och UDMA (uretandimetakrylat) vilka skapar en sammanlänkad polymerstruktur2,29. Vid

polymerisering av kompositmaterial finns tre olika sätt att aktivera polymerisationsprocessen: värme, ljus eller kemisk aktivering.

Implantatunderstödda suprakonstruktioner har blivit allt vanligare som alternativ för

konventionell avtagbar protetik, med en hög klinisk överlevnads- och lyckandefrekvens15,27. Även om en hög lyckandefrekvens har visats, är det dokumenterat att komplikationer som till

Bild 1: Biofilm som uppstod

i en av cellodlingsplattorna. exempel infektionssjukdomar kan uppstå som i sin tur påverkar

omkringliggande mucosa och benvävnad. Tandfickor fungerar som en reservoar där mikroorganismerna lätt kan kolonisera det nyinsatta implantatet och utgör en viktig faktor för utvecklingen av infektioner runt implantatet27. Infektionerna orsakade av bakterier anses vara en av de vanligaste

komplikationerna knutet till implantatbehandlingar29. Sådana infektioner kan leda till att.implantatet går förlorat.

En bakteriart som ofta associeras med periimplantit är

Fusobacterium nucleatum, vilken är en tidig kolonisatör omkring implantat32, och har en förmåga att aggregera med andra bakterier17. Samverkan sker oftast mellan olika arter där Streptokocker, Actinomyses naeslundii och F. nucleatum utgör det största antalet

samarbetspartners i detta sammanhang33. F. nucleatum, spelar en viktig roll i samarbetet, då de bidrar till en anaerob, skyddande miljö18 och sammanbinder tidigare kolonisatörer på tandytan inför plackbildning genom aggregation och adhesion7. Streptokocker utgör ungefär hälften av de odlingsbara mikroorganismerna som finns i munhålan och omkring en fjärdedel av de odlingsbara mikroorganismerna som finns i tandplack. Nämnda bakterier är orörliga och växer karaktäristiskt i långa kedjor och bildar små vita kolonier på blodagarplattor19.

Samtliga bakterier är tidiga kolonisatörer av tandytan och samarbetet mellan dem gör att de kan bilda en biofilm på en ren tandyta18.En biofilm är en komprimering av mikroorganismer som fäster till en yta30 (bild 1), där bakterier samverkar för att skapa detta skikt på fasta ytor. Bakterierna kan definieras som fastsittande cellgrupper, oregelbundet fästa till en yta eller till varandra13.

Ett vanligt exempel på biofilmsbildning i munhålan är dentalt plack. I ostörd plack är det väl synligt att bakterierna attraheras till andra bakterier5,18,23. För att upprätthålla denna biofilm är det nödvändigt att de grundläggande byggstenarna, bakterierna, är fast förankrade till

varandra13. Bakteriers förmåga att fästa till andra organismer avgör den tid det tar att utveckla supragingival och subgingival plackbiofilm27. Näring är också en viktig faktor att ta hänsyn till under cellodlingen, då innehållet i omkringliggande medium kan orsaka detachment av celler20.

För att analysera cellviabiliteten samt biofilmstillväxten kan man genom en metod, Live/dead, färga in celler med en grön respektive röd fluorescerande färg. Friska celler syns i mikroskop som fluorescerande gröna och döda celler syns som fluorescerande röda3.

Med hjälp av en annan metod, FISH - fluorescence in situ hybridization, kan man se cellfördelningen av de olika bakteriearterna, men även var de ligger på till exempel provkroppsytor. Detta sker genom infärgning med olika fluorescenta färger, varefter analysering i ett konfokalmikroskop sker. Analysering med hjälp av konfokalmikroskopi innebär att flera olika optiska bilder kombineras och med hjälp av en mjukvara skapas en tredimensionell bild av till exempel celler24.

Många mikroorganismer i den orala miljön behöver fästa till fasta ytor för att kunna överleva. Därför är det viktigt att ta hänsyn till materials ytstruktur i detta sammanhang7. Ytstrukturen

har visat sig påverka cellernas adhesion till materialet4. Eftersom cellförnyelsen är beroende av förankring26, måste provkropparna bidra med en lämplig yta för cellnybildning34 men framförallt måste de vara biokompatibla och därmed icke-toxiska1.

Ytstrukturen hos ett material kan mätas genom en optisk teknik, interferometri. En optisk interferometer fungerar genom att två ljusvågor i samma frekvens reflekteras från en yta. När dessa två ljusvågor möts, sker en interferens. Antalet interferenslinjer räknas sedan för att skapa en datoriserad tredimensionell bild av ytan31

Syfte

Syftet med föreliggande studie var att undersöka (a) tre olika bakteriearters adhesion och koloniseringsförmåga (b) på fältspatsporslin och två olika kompositmaterial, materialens toxiska påverkan på de olika bakterierna samt (c) om materialens ytstruktur påverkar bakteriernas adhesion.

MATERIAL OCH METOD

Framställning av provkroppar

Till studien användes två olika kompositmaterial; Crea.lign† _och

SinfonyTM*. Inför tillverkningen av provkropparna användes två glasplattor; en tunn och en lite tjockare. På den tunnare

glasplattan användes cyanoakrylatlimµ för att limma fast enkronor i varje hörn (bild. 2).

Den tjockare glasplattan isolerades±. En skopa Putty € blandades enligt fabrikantens anvisningar och placerades mitt på glasplattan med enkronorna. Med hjälp av den tjockare glasplattan, pressades puttymassan till ett jämntjockt lager. Glaset trycktes tills uppnådd kontakt med enkronorna (bild. 3a). Därefter avlägsnades det översta glaset.

Med hjälp av en porslinsmått (1 cm i diameter), gjordes åtta mallar för provkroppsformar, jämnt fördelade över ytan. Porslinsuppläggaren trycktes igenom puttyn, tills kontakt med underliggande glas (bild 3b och 3c). Puttyn fick stelna, och överskott avlägsnades samt enkronorna togs bort från glaset (bild. 3d).

Bild. 3. (a) Puttymassan mellan glasplattor (b) porslinsuppläggare (c) markerade hål i puttyn

(d) färdig form.

Bild 2: Glasplatta med

enkronor

Därefter trycktes komposit ut i puttyformarna (bild. 4) och ljushärdadesα enligt fabrikantens anvisningarπ. Provkropparna rengjordes från restmonomer¥, och vassa kanter slipades bortβ,

ζ_{,och provkropparna polerades enligt fabrikantens anvisningar.}

För fältspatsporslin, användes putty på samma sätt som ovan för att skapa nya

provkroppsformar. Puttyn avlägnades från glaset efter stelning och ett tunt servettlager penslades fast på glaset med destillerat vatten (bild. 5a). Puttyformarna isolerades¢ och placerades på glasbrickan, ovanpå servettlagret (bild. 5b).

Bild. 5: (a) Ett servettlager placerat på

glasplattan och (b) puttyförgjutningen placerad ovanpå.

Porslin÷ med tillhörande vätska§ blandades och applicerades i formarna, upp till kanten. Porslinsprovkropparna kondenserades med en servett och avlägnades genom lätt vibrering mot puttyn. Därefter placerades de på en glasfiberduk¬ och sintrades२. Porslinsuppläggningen upprepades tre gånger på vardera porslinspuck och sintrades mellan varje porslinspåläggning. Slutligen slipades porslinspuckarna plant med diamantfräs¤ i highspeed med vattenkylning६ och glansbrändes därefter i ett selfglaze program enligt fabrikantensanvisningar.

Till undersökningen tillverkades sammanlagt 24stycken provkroppar (Fig. 1). Av varje material användes 3st provkroppar till ytanalysering med hjälp av interferometri, en provkropp av varje material användes till pilotstudien och 2 provkroppar av varje material användes till FISH respektive Live/dead. Med dessa metoder analyserades därefter 1 provkropp av varje material efter 1 dags respektive 7 dagars cellodling.

Bild. 4: Komposit före polymerisering.

________________________________________________________________________________

Fig. 1: Totala antalet provkroppar var 24st, 8st av varje material (Crea.lign, Sinfony och

Noritake).

Analys av provkroppsytor

Ytstrukturen analyserades i en optisk interferometer९. Vid mätningarna användes tre provkroppar från varje grupp och tre mätpunkter togs på varje provkropp. Sammanlagt

avlästes nio mätpunkter inom varje materialgrupp en tredimensionell bild av ytorna togs fram. Strålkällan utsände ett vitt ljus och reflekterades mot provkroppsytan så att en mätbar

förskjutning kunde registreras utifrån hur yttopografin ser ut. Med den informationen som registrerades kunde sedan en datorgenererad bild av ytan produceras i både 2D och 3D. Datainformationen bearbetades med hjälp av mjukvaran MapVue. De vanligaste parametrarna som används för att beskriva en yta är Sa, Sdr och Sds* där Sa står för medelhöjdsavvikelse från en yta, det vill säga höjdskillnaden, Sds är antalet toppar och dalar per ytenhet och Sdr innebär ytarean eller ytförstoringen.

Cellodling

Inför det slutliga försöket, användes tre olika orala bakteriearter; S. oralis, A. naeslundii och F. nucleatum. De två förstnämnda bakteriearterna mognade på tre olika blodagarplattor (bild 6) med femprocentigt fårblod i en 5 % -ig CO2-berikad miljö. F. nucleatum förodlades

också på en blodagarplatta, men utsattes för en anaerob miljö i en Modular Atmosphere Controlled System. Bakterierna förodlades i 24 timmar i Todd-Hewitt

medium. Bakterier odlades i 1 dag resp 7 dagar där hälften av provkropparna behandlades

med Live/dead-metoden, resterande provkroppar behandlades med FISH. Samtliga provkroppar autoklaverades☺ i 30 min innan utsättning för experiment.

Live/dead-metod

I studien användes Live/dead BacLight Bacterial Viability kit for microscopy som förbereddes genom att blanda ihop två lika stora delar av BacLight fluorescenta färger (A+B). En provkropp av varje material med cellkultur på, limmades fast på enskilda glasskivor (bild 7) med cyanoakrylatlimµ och 500µl Live/dead blandning påfördes på varje glasplatta och inkuberades i 15 min i mörker i rumstemperatur (25°C). Provkropparna rengjordes därefter med etanol och immersionolja påfördes på

mikroskopobjektivet varefter provkropparna analyserades i

mikroskop. Proportionerna av friska celler (fluorescerande gröna) och skadade celler (fluorescerande röda) uppskattades från 10 stycken slumpmässigt valda områden på varje

provkropps biofilm. Bilder på biofilmsmassan togs genom användning av Konfokalmikroskop med en konfokaldiameter på 30µm (Fig. 2).

Bild 7: Provkroppar fastklistrade

på glasskivor.

Fig. 2: 10 stycken slumpmässigt

valda områden av varje yta togs med en yttäckning av 0.05 mm².

FISH-metod

Provkropparna med cellkultur låg i cellodlingsplattor i ett medium. Bakteriekulturvätskan avlägsnades och 100µl 4 % -ig Paraformaldehyd tillsattes varefter provkropparna inkuberades i 4°C i ett dygn. Paraformaldehydvätskan avlägsnades därefter med en pipett och

provkropparna sköjdes i 99,9%-ig etanol varefter de lämnades kvar på en servett i 5 min för torkning. Enzym lysozym hälldes på provkroppsytorna efter att de åter placerats på sina repektive plattor där det låg kvar i 30min i 37°C. Provkropparna sköljdes därefter med 120µl destillerat vatten. 99,9%-ig etanol tillsattes ännu en gång, tills provkroppsytorna täcktes. Detta lämnades kvar i 5 min och etanolen hälldes därefter av. Provkropparna lufttorkades på en servett. En primer (som behövs vid uppbyggnaden av nytt DNA) blandades ut; 1µl för varje 30µl hybridization buffer proteinlösning): 50µl Fusall 307(F. nucleatum), 7µl JF201 (A. naeslundii) och 7µl STR 405 (S. oralis). 50µl av lösningen hälldes på respektive

cellodlingsplatta tills provkroppsytorna täcktes och inkuberades därefter i 48°C i 30min. Mediumet sögs ut med hjälp av en pipett och 100µl av Washing solution FISH hälldes över provkropparna för att få bort lösa celler som inte fäst på provkroppsytorna. Därefter

inkuberades de i en humid chamber i 48°C i 30min. Mediumet sögs åter igen ut och provkropparna sköljdes med 100µl destillerat vatten.

Konfokalmikroskop och cellkalkylering

Allt mikroskopiskt arbete utfördes genom användning av Eclipse TE2000 Inverted Confocal Scanning Laser Microscope (Nikon) (bild 8). Bilderna som togs från varje provkroppsbiofilm analyserades med mjukvaran BioImage_L. Med hjälp av mjukvaran, räknades antalet levande och döda celler och cellfördelningen av de olika bakteriearterna. Numerisk data bearbetades i Excel,varefter diagram skapades

med SigmaPlot v.12.0.

Bild 8: Confocal mikroskop;

avläser en provkropp.

Statistisk analys

Experimentet genomfördes endast en gång per testmetod (Live/dead och FISH) efter en dags respektive sju dagars cellodling. För att påvisa eventuella signifikanta skillnader mellan mängden friska bakterier, variationer hos de olika biofilmerna samt för att se vilket material som bakterierna mest respektive minst adherar till, gjordes en statistisk analys genom two-way ANOVA (p=0,05). Även standardavvikelser kalkylerades. Numerisk data bearbetades med hjälp av programmet Prism v.5.0.

RESULTAT

Interferometri

Resultaten från interferometern uppvisade att de båda kompositmaterialen, CreaLign och SinfonyTM, hade en slät yta med långa mikrospår som ett resultat av poleringen medan

porslinsprovkropparna, Noritake, uppvisade en slät yta med upphöjningar av kristallkorn (bild 9).

Bild 9: Resultatet från mätningarna på

provkroppsytorna i interferometern visar medelvärdesytor på (a) SinfonyTM, (b) Noritake och (c) CreaLign.

(c)

Tabell. 1: Värdena från interferometern visade att porslinsytorna hade högst

ytråhetsvärden.Värden från nio mätpunkter på tre provkroppar, medelvärdes beräkning samt standardavvikelse redovisas nedan. Sa visar provkroppsytornas höjdskillnad i µm, Sds anger medelvärdet av antalet toppar och dalar på ytan i mm och Sdr visar ett medelvärde av ytarean i %. Siffrorna inom parantes visar standardavvikelser.

Material Sa (µm) Sds (/mm) Sdr (%) Komposit SinfonyTM 0,045(0,014) 188644,104 (11877,052) 1,140 (0,417) CreaLign 0,070 (0,047) 213154,369 (24138,879) 3,057 (2,817) Fältspatsporslin Noritake 0,212(0,039) 102628,960 (10067,040) 8,604 (2,490)

Statistisk analys

Resultaten visade signifikanta skillnader i båda metoderna, Live/dead och FISH, efter en dags respektive sju dagars cellodling. Numerisk data är baserad på ett medelvärde av antalet friska celler i % (Live/dead) och % yttäckning av celler (FISH) där det inkluderar det totala

resultatet av tio slumpmässigt valda punkter (Fig. 2).

_________________________

Fig. 2: Boxplot visar 25%-75% samt median och spridning. De svarta respektive vita boxarna

(a) representerar mängden friska/levande celler i % efter en dags respektive sju dagars cellodling på från vänster CreaLign, SinfonyTM och Noritake. De gråa respektive vita boxarna (b) visar yttäckning av celler i % på provkroppsytorna efter en respektive sju dagars odling på CreaLign, SinfonyTM och Noritake. Spridningen syns som morrhår över och under boxarna. På figur 2 (a) påvisas en signifikant skillnad i mängden friska celler på Sinfony efter en dags cellodling, där 100 % av cellerna är friska och har ett p-värde på 0,0001. Efter sju dagars cellodling (a), påvisas en signifikant skillnad på levande celler på Noritake, p=0,0475. Även i figur (b) påvisas en signifikant skillnad på Noritake efter en och sju dagars cellodling jämfört med SinfonyTM och Crea.lign.

(a)

Biofilmstillväxt

Biofilmstillväxten analyserades genom mikroskopi och cellkalkylering. I resultatet nedan kan det utläsas att det är detachment av celler på alla ytor med avseende på biovolym efter sju dagars cellodling (Fig.3).

B iov o ly m m m ³ x 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 B iov ol u m e m m ³ x 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 B io vo lym m m ³ x 1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 7 1 7 1 7 Antal dagar

Fig. 3: Diagrammen visar biovolymen i mm3 x 106 efter en respektive sju dagars cellodling.

CreaLign (a) SinfonyTM (b) och Noritake (c) uppvisar synliga detachment efter sju dagar (inringat i rött). _______________________________________________________________________ 6   6   6   (a) (b) (c)

Livsduglighet

Livsdugligheten analyserades med hjälp av Live/dead-metoden. Genom infärgning av celler med fluorescenta färger framgår ett resultat av mängden friska celler respektive döda celler. Diagrammen nedan (fig. 4) visar hur många % av den totala cellmängden som är friska. Resultaten visar en liten förändring efter en respektive sju dagars cellodling.

(a) (b) (c)        % V iabi lit y 0 20 40 60 80 100 % v ia b ilit y 0 20 40 60 80 100 % v iabi lit y 0 20 40 60 80 100   1 7 1 7 1 7                    Antal dagar   

Fig. 4: Cellernas viabilitet/livsduglighet efter en respektive sju dagars cellodling där (a) är

CreaLign, (b) SinfonyTM och (c) är Noritake. De grå staplarna representerar, friska celler av den totala mängden celler i procent och svarta morrhåren representerar standardavvikelsen. Kalkyleringar gjordes på tio provkroppsbilder med en total area av 0,5mm². På CreaLign ökade cellernas livsduglighet med 8 %, medan det på SinfonyTM minskade med 10 % efter sju dagars cellodling. Noritake uppvisade nästan samma resultat efter sju dagars cellodling som vid dag ett.  

Cellfördelning

Med hjälp av Fish-metoden, färgades de tre

bakteriearterna in med olika fluorescenta färger. (Bild 10) är en konfokalmikroskopisk bild som visar

cellfördelningen av de olika bakteriearterna på en av provkroppsytorna. Cellfördelningen på alla

provkroppsytorna beskrivs på (Fig. 5), som

stapeldiagram med tillhörande konfokalbild undertill.

Bild 10: S. oralis (fluorescerande grön),

F. nucleatum (fluorescerande röd) och A. naeslundii (fluorescerande blå)

_________________________________________________________________________________ (a) dag 1 dag 7

B iom as s a u m 2 0 5000 10000 15000 20000 25000 Bio m a s s a u m 2 0 5000 10000 15000 20000 25000                                           (b) dag 1 dag 7               Bio m a s s a u m 2 0 5000 10000 15000 20000 25000 B io m a ssa u m 2 0 5000 10000 15000 20000 25000 Crea.Lign Sinfony TM

       (c) dag 1 dag 7      

Fig. 5: Diagrammen ovan visar den totala cellfördelningen på (a) CreaLign. (b) SinfonyTM (c)

Noritake efter en respektive sju dagars cellodling där blå färg = A. naeslundii, grön färg = S. oralis och röd färg = F. nucleatum. Till varje stapeldiagram finns tillhörande tredimensionell bild som visar hur det såg ut i konfokalmikroskopet.

B iom as s a u m 2 0 5000 10000 15000 20000 25000 Noritake

DISKUSSION

Valet av kompositmaterial beror på att dessa används allt mer på dentala laboratorier, submuköst vid implantatbehandlingar. Problem som uppstod vid provkroppsframställningen var att porslinsprovkropparna inte kunde göras lika parallella som kompositprovkropparna. Detta på grund av den ojämna krympningen under sintringen.

Man vet sedan tidigare att restmonomer kan orsaka cytotoxiska responser i munhålan, och enligt Ferracane et al11 _{kan man genom avlägsning av restmonomerer minska cytotoxiciteten}

med ca 90 %. Provkropparna framställdes med målet att avlägsna restmonomerer. De tillverkades i en storlek anpassad för; ca 10mm2 med en tjocklek på ca 1-1,5mm. Porslin användes som en kontrollgrupp på grund av materialets kända biokompatibilitet, men även för att detta material används alltmer som ytmaterial vid submukösa implantatbehandlingar. Även om kompositmaterialens provkroppar behandlades på samma sätt, uppvisade

provkropparna stora skillnader i ytstruktur vid analysering med interferometer. Tunna och olika långa spår uppkom av poleringen. Före ytbehandling visade provkropparna en slät yta för ögat, men eftersom dessa material inte lämnas obehandlade på laboratorier, var det av intresse att ytbehandla dem enligt fabrikantens anvisningar. Porslinsprovkropparna uppvisade en helt annan ytstruktur på mikroskopisk nivå; en väldigt slät yta med upphöjningar av kristallkorn. Trots att porslinet har en generellt slätare yta än kompositmaterialen, visade resultatet högre ytråhetsvärden i parametrarna Sa och Sdr, medan paramertern Sds visade lägst värden för porslinet. Detta kan bero på att kornen är så pass upphöjda, att resultatet blir missvisande. Skillnaden i ytstruktur har förmodlingen påverkat resultatet av cellernas

vidhäftningsförmåga på de olika provkropparna. Maria Bachle et al4 skriver att ytstrukturen hos materialet har en stor påverkan på interaktionen mellan celler och material. Orsaken till skillnaden i resultat mellan porslinet och de båda kompositerna kan bero på denna skillnad i ytstruktur. Antagligen kunde inte cellerna fästa eller hålla sig kvar på de släta ytorna. Detta kan ha resulterat i det detachment som alla provkroppsytorna uppvisade efter sju dagars cellodling.

Detachment kan även ha en koppling till att cellerna exponerades för samma medium under samtliga 7 dagar, vilket troligtvis inneburit att näringen i mediumet tagit slut. I en liknande studie har Justin et al30 också kultiverat celler, men har bytt cellkulturernas medium efter varje dygn då detta skulle vara nödvändigt för biofilmsbildningen. Chavez de Paz et al9, däremot, menar att även om näringsvärdet i mediumet är lågt, så finns det ingen signifikant skillnad på överlevnadsfrekvensen i jämförelse med celler i ett mer näringsrikt medium. I pilotstudien odlades endast en bakterieart, S. oralis, eftersom de är tidiga kolonisatörer i munhålan. Bakterierna odlades i ett dygn i en 37°C fuktig miljö som motsvarar en intraoral miljö, vilket gör det gynnsamt för celler att bilda kolonier.24 Celltillväxten kontrollerades varje timme, men bakteriekulturen uppvisade väldigt låga tillväxtvärden och därför valdes en

annan odlingmetod i den slutliga studien.

För att analysera cellviabiliteten på de olika provkropparna, användes Live/dead-metoden som genom fluorescenta färger (röd och grön) visar friska respektive döda celler. Resultaten visade att nästan alla cellerna var friska efter en respektive sju dagars cellodling. Förmodligen beror cellviabiliteten på att restmonomerer avlägsnades från kompositmaterialen för att minska toxiciteten och att därmed efterlikna porslinets egenskaper som är ett biokompatibelt material. Det hade varit av intresse att följa upp cellodlingen under en längre tid för att se om resultatet hade varit annorlunda. Detta hade blivit mer relevant eftersom man i verkligheten planerar att ha ett implantat i munnen under en längre tid.

F. nucleatum, A. naeslundii och S. oralis är tidiga kolonisatörer vilka alla delar på en gemensam egenskap att aggregera med andra bakterier17,24 och för att se cellfördelningen användes FISH, en metod där man färgar in cellerna med olika fluorecenta färger för att se hur mycket av varje bakterieart som finns på provkroppsytorna. Eftersom de olika bakterierna samspelar med varandra vid plackbildning kan det vara viktigt att att se hur mycket av varje bakterieart som lever. Metoden innebär att provkropparna behandlas med olika vätskor. Paraformaldehyd, som används för att ”klistra fast” cellerna på provkroppsytan så att de inte spolas bort vid rengöring med alkohol. Enzym Lysozym öppnar upp cellmembranet hos de olika cellarterna för att tillåta infärgning.

Under cellfördelningen var noritake en intressant grupp (c), då resultatet visar en markant minskning av A. naeslundii. Anledningen till detta kan vara att de inte kan hålla sig kvar på det släta materialet. Troligtvis är de mer känsliga än de andra bakteriearterna. En statistisk analys gjordes med hjälp av two-way ANOVA, där man tydligt kunde avläsa en signifikant lägre % yttäckning av celler på porslinsprovkropparna i Fish-metoden; efter en och sju dagars cellodling.

Bakterierna som användes i studien kommer från kliniskt renodlat plack, det vill säga direkt från munnen på en person. Resultatet hade kunnat vara annorlunda om samma studie hade gjorts med bakterier från flera olika personer. Även om vi alla har dessa bakteriearter i munnen, kan de bete sig olika hos olika personer.

En svårighet har varit att beräkna materialåtgången, då metoden ändrades under studiens gång. Varken provkroppar eller tid fanns för att upprepa studien flera gånger, vilket hade varit relevant för att få fram ett mer tillförlitligt resultat.

SLUTSATS

Med reservationer för studiens begränsningar, uppvisar varken kompositmaterialen eller porslinet någon cytotoxisk påverkan på omkringliggande celler. Vad gäller ytstrukturen, ger ett mer slätt material minskad bakterieadhesion. Vissa bakterier är känsligare än andra vad gäller ytsrukturen med avseende på adhesion. Näring påverkar cellernas överlevnad och otillräcklig näring leder till detachment av celler. Vidare studier behövs för att säkerställa resultaten som framkom i föreliggandestudie.

MATERIALLISTA

Material

† Kompositmaterial: Crea lign dentin A1 094346

* Kompositmaterial: 3MTM _ESPETM _SinfonyTM _{(Dc3 Lot 311805)}

± Isoleringsmedel: Stumpfisolierung Die Release

€ Putty: Labputty, Coltène Whaledent, lot nr 0215185, Hard Coltène (aktivator) 0187649. Per cirkel mått: en diameterssträng och 40s blandning.

π Polymerisering SinfonyTM: 6 min, polymerisering Crea lign: 180s x 2 ¥ Rengöring SinfonyTM_{: Buffalo ROBINSON’S BRISTLE BRUSHES}

Rengöring Crea.lign: Bredent Isopropylalkohol 2542252 β Hårdmetallfräs: Edenta Cross Cut Superfine 5730.045 HP

¢ Isoleringsmedel: 10830IvoclarVivadent Ceramic separating liquid H36331 ÷ Fältspatsporslin: Noritake superporcelain EX-3 (E3) 024699

§ Forming liquid: Noritake forming liquid BJWPM

¬ Glasfiberduk: Fibrous Pad Firing Supports +J017B01701

¤ Diamantfräs: Two Striper, Taper round end vf04/09 toolnr 777.8 µ Lim: Sekundenkleben Renfert 1733-0100

Materiel

α Ljushärdare SinfonyTM: 3MTM ESPETM Beta Vario Light Unit, 3MTM ESPETM Visio Vario

N2879F Typ 919022

Ljuhärdare Crea.lign: Dentacolor XS Kulzer. ζ Handsycke: KaVo EWL 4941

२ Sintringsugn: KaVo TOUCH&PRESS ६ High speed: Turbinmotor KaVo K-Air Plus

९ Optisk interferometer: Micro XAM Surface Mapping Microscope ☺ Autoklav: Getinge Costech model A12B23LTB

ORDFÖRKLARINGAR

Aggregegation Sammanklumpa sig.

Anaeroba bakterier Bakterier som lever utan syre.

Blodagarplattor Plattor av agargel som innehåller blod och andra näringsämnen.

Plattorna framställs genom att den varma agargelen hälls i flata plastskålar där den får stelna. Blodagarplattor används i stor utsträckning för odling av bakterier.

Cytotoxisk Toxicitet som orsakar celldöd.

Detachment Avlossning, i detta sammanhang: avlossning av bakterier från en yta.

Immersion En droppe olja placeras mellan mikroskopobjektivet och

täckglaset/objektet i ett vanligt ljusmikroskop. Immersionsoljan, som

skall ha samma brytningsindex som glas, ökar mikroskopets

upplösning och skärpa.

Medium Inom mikro- och cellbiologin näringslösning eller näringsgel för

TACK TILL

• Lars Olsson, Universitetsadjunkt, Odontologiska fakulteten. • Gunnel Svensäter, Professor, Odontologiska fakulteten. • Ryo Jimbo, Post doc, forskare vid Odontologiska fakulteten. • Bertil Kinnby, för hjälp med statistisk analys.

• Teknodont, för utlåning av utrustning.

REFERENSER

1. Ali SA, Doherty PJ, Williams DF. Mechanisms of polymer degradation in implantable devices. 2. Poly(DL-lactic acid). J Biomed Mater Res 1993;27:1409–18.

2. Anusavice Kenneth J., Phillips Ralph W, Phillips’ science of dental materials. St Louis: Mo: Saunders, 2003.

3. Auty M. A., Gardiner G. E., McBrearty S.J., O’Sullivan E. O., Mulvihill D. M., Collins J. K., et al. Direct in situ viability assessment of bacteria in probiotic dairy products using viability staining in conjunction of confocal scanning laser microscopy. Appl Environ Microbiol. 2001;67:420-5.

4. Bachle M., Kohal R. J. A systematic review of the influence of different titanium surfaces on proliferation, differentiation and protein synthesis of osteoblast-like MG63 cells. Clin.Oral Implants Res 2004;15:683-92.

5. Bowden G. H., Hamilton I. R. Survival of oral bacteria. Crit.Rev.Oral Biol.Med. 1998;9:54-85.

6. Bressan E., Paniz G., Lops D., Corazza B., Romeo E., Favero G. Influence of abutment material on the gingival color of implant-supported all-ceramic restorations: a prospective multicenter study. Clin Oral Implants Res 2010.

7. Capopreso S , Bacterial Adhesion to Dental Alloys. The Role of the Surface and Composition. Minerva Stomatol 1999; 48: 509-23.

8. Caughman W. F., Caughman G. B., Shiflett R. A., Rueggeberg F., Schuster G. S.

Correlation of cytotoxicity, filler loading and curing time of dental composites. Biomaterials 1991;12:737-40.

9. Chavez de Paz L. E., Hamilton I. R., Svensater G. Oral bacteria in biofilms exhibit slow reactivation from nutrient deprivation. Microbiology 2008;154:1927-38.

10. Fabianelli A., Pollington S., Papacchini F., Goracci C., Cantoro A., Ferrari M., et al. The effect of different surface treatments on bond strength between leucite reinforced feldspathic ceramic and composite resin. J Dent 2010;38:39-43.

11. Ferracane J. L., Condon J. R. Rate of elution of leachable components from composite. Dent Mater 1990 ;6:282-7.

12. Ferracane J. L. Elution of leachable components from composites. J.Oral Rehabil. 1994;21:441-52.

13. Gibbons R. J., Nygaard M. Interbacterial aggregation of plaque bacteria. Arch.Oral Biol. 1970 ;15:1397-400, (IN39.)

14. Ilie N., Hickel R. Investigations on mechanical behaviour of dental composites. Clin.Oral Investig. 2009;13:427-38.

15. Karoussis I. K., Salvi G. E., Heitz-Mayfield L.J., Bragger U., Hammerle C. H., Lang N. P. Long-term implant prognosis in patients with and without a history of chronic periodontitis: a 10-year prospective cohort study of the ITI Dental Implant System. Clin.Oral Implants Res. 2003 ;14:329-39

16. Kim D. J., Lee M. H., Lee D. Y., Han J. S. Mechanical properties, phase stability, and biocompatibility of (Y, Nb)-TZP/Al(2)O(3) composite abutments for dental implant. J.Biomed Mate Res. 2000;53:438-43.

17. Kolenbrander Paul E., Andersen Roxanna N., Kazmerzak Karen, Wu Rosemary, Palmer Jr. Robert J. [24] Spatial organization of oral bacteria in biofilms. Ingår i: Ron J. Doyle, red. Methods in Enzymology: Academic Press; 1999. 322-32.

18. Kolenbrander P. E. Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems. Annu.Rev.Microbiol. 2000;54:413-37.

19. Kuramitsu Howard K., Ellen Richard P. Oral bacterial ecology: the molecular basis. Wymondham: Horizon Scientific, 2000

20. Lappin-Scott Hilary M., Costerton J.W, Microbial biofilms. Cambridge: Cambridge Unic. Pr., 1995

21. Lefebvre C. A., Schuster G. S. Biocompatibility of visible light-cured resin systems in prosthodontics. J Prosthet Dent 1994;71:178-85.

22. Lin N. J., Lin-Gibson S. Osteoblast response to dimethacrylate composites varying in composition, conversion and roughness using a combinatorial approach. Biomaterials 2009 ;30:4480-87.

23. Listgarten M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J Periodontol 1976;47:1-18.

24. Marsh Phillip, Martin Michael V, Oral microbiology. Edinburgh: Churchill Livingstone Elsevier, 2009

25. Oysaed H., Ruyter I. E. Water sorption and filler characteristics of composites for use in posterior teeth. J Dent Res 1986;65:1315-8.

26. Prokop A, Rosenberg MZ. Bioreactor for mammalian cell culture.Adv Biochem Eng Biotechnol 1989;39:29–37

27. Renvert S., Persson G. R. Periodontitis as a potential risk factor for peri-implantitis. J Clin Periodontol 2009;36 Suppl 10:9-14.

28. Schweikl Helmut, Altmannberger Inge, Hanser Nico, Hiller Karl-Anton, Bolay Carola, Brockhoff Gero, et al. The effect of triethylene glycol dimethacrylate on the cell cycle of mammalian cells. Biomaterials 2005 7;26:4111-8.

29. Seil J. T., Webster T. J. Reduced Staphylococcus aureus proliferation and biofilm formation on zinc oxide nanoparticle PVC composite surfaces. Acta Biomater. 2011 21. 30. Svensäter G, Bergenholtz G (2004) Biofilms in endodontic infection. Endod Topics 9: 27 31. Vadgama P, Surfaces and Interfaces for Bio-Materials. Woodhead Publishing, Limited, 2005. Cambridge, Storbritannien.

32. van Winkelhoff A. J., Goene R. J., Benschop C., Folmer T. Early colonization of dental implants by putative periodontal pathogens in partially edentulous patients. Clin.Oral Implants Res 2000;11:511-20.

33. Whittaker C. J., Klier C. M., Kolenbrander P. E. Mechanisms of adhesion by oral bacteria. Annu Rev Microbiol 1996;50:513-52.

34. Williams DF. Biomaterials and biocompatibility. Med Prog Technol1976;20:31–42 35. Yadav S., Upadhyay M., Borges G. A., Roberts W. E. Influence of ceramic (feldspathic) surface treatments on the micro-shear bond strength of composite resin. Angle Orthod. 2010 ;80:577-82.

36. Zimmeli B., Strub M., Jeger F., Stadler O., Lussi A. Composite materials: Composition, properties and clinical applications. Schweiz Monatsschr Zahnmed 2010;120:972-9.

Övriga referenser

37 Socialstyrelsen, Kunskapscenter för Dentala Material; Dentala kompositmaterial. 2006 38 Michigan Metrology: http://www.michmet.com/3d_s_height_parameters.htm

TACK TILL

• Lars Olsson, Universitetsadjunkt, Odontologiska fakulteten. • Gunnel Svensäter, Professor, Odontologiska fakulteten. • Ryo Jimbo, Post doc, forskare vid Odontologiska fakulteten. • Bertil Kinnby, för hjälp med statistisk analys.

• Teknodont, för utlåning av utrustning.

• , för tillhandahållande av material.