Optimering av immunhistokemisk infärgning för PAX8 med klon SP348

(1)

Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap Malmö Universitet

OPTIMERING AV

IMMUNHISTOKEMISK

INFÄRGNING FÖR PAX8 MED

KLON SP348

(2)

OPTIMERING AV

IMMUNHISTOKEMISK

INFÄRGNING FÖR PAX8 MED

KLON SP348

EMELIE EKSTRÖM

Ekström, E. Optimering av immunhistokemisk infärgning för PAX8 med klon SP348. Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö Universitet: Fakulteten för hälsa och samhälle, Institutionen för

Biomedicinsk vetenskap, 2020.

Paired box protein - 8 (PAX8) är ett protein kodat av PAX8-genen som

lokaliseras i kromosom 2. PAX8 reglerar transkriptionen för organogenesen av tyreoidea, placenta, njure samt innerörat. MRQ-50 är en klon mot PAX8 som används för klinisk patologisk diagnostik inom Region Skåne. Det har visat sig att MRQ-50 korsreagerar med lymfocyter och andra PAX-proteiner i vävnaden. Syftet med studien var att utveckla och optimera ett protokoll för maskinell immunhistokemisk färgning med en alternativ klon av PAX8 antikropp, klon SP348. Immunhistokemi (IHC) används för detektion av antigen i vävnadssnitt och används som komplement inom histopatologi. I denna studie undersöktes två olika varianter av samma klon SP348, Anti PAX8 antibody [SP348] –N- terminal (PAX8-N) samt Anti PAX8 antibody [SP348] - BSA and Azid free (PAX8-B). Flera olika förbehandlingsprotokoll testades i Roche Ventana Benchmark ultra. Förbehandlingsprotokollen hade olika tid och temperatur samt två olika

förbehandlingsbuffertar, CC1 och CC2. Två olika visualiserings kit användes, OptiView DAB IHC detektion kit och UltraView Universal DAB kit.

Protokollnummer 4818 med buffert CC1 ansågs som bäst där inkubationstiden var 48 minuter med temperaturen 100C. PAX8-N hade en betydligt renare

kontrastinfärgning och starkare intensitet jämfört med PAX8-B som hade måttlig till stark kontrast i majoriteten av vävnaderna som analyserades. Vid jämförelse med MRQ-50, klon som används kliniskt inom Region Skåne, visar PAX8-N en renare infärgning.

Nyckelord: Indirekt immunhistokemi, OptiView DAB IHC detektion kit, PAX8,

(3)

OPTIMIZATION OF

IMMUNOHISTOCHEMICAL

STAINING OF PAX8 WITH

CLONE SP348

EMELIE EKSTRÖM

Ekström, E. Optimization of immunohistochemical staining of PAX8 with clone SP348. Degree project in Biomedical science, 15 credit points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of Biomedical science, 2020.

Paired box protein - 8 (PAX8) is a protein encoded by the PAX8 gene located on chromosome 2. PAX8 regulates the transcription for organogenesis of thyroid, placenta, kidney and inner ear. MRQ-50 is a clone directed against PAX8 and used for clinical diagnostics within Region Skåne. MRQ-50 has been shown to cross-react with lymphocytes and other PAX genes in tissues. The purpose of the study was to optimize a protocol for automated immunohistochemical staining with an alternative antibody clone directed to PAX8, clone SP348.

Immunohistochemistry (IHC) is used to detect antigens in tissue sections and is used as a complement within histopathology. In this study, two different variants of the same clone SP348, Anti PAX8 antibody [SP348] -N terminal (PAX8-N) and Anti PAX8 antibody [SP348] - BSA and Azide free (PAX8-B) were

investigated. Several pre-treatment protocols were tested on Ventana Benchmark ultra from Roche. The pre-treatment protocols had different incubation time, temperature and two different pre-treatment buffers, CC1 and CC2. Two different detection kits were used, OptiView DAB IHC detection kit and UltraView

Universal DAB kit. The protocol number 4818 with buffer CC1, incubation time of 48 minutes and temperature of 100C was considered optimal. PAX8-N had a significantly clearer contrast staining och stronger intensity compared to PAX8-B which had a moderate to strong contrast in the majority of the tissues analyzed. When compared to MRQ-50, the currently used clone clinically in Region Skåne, PAX8-N shows a cleaner staining

Keywords: Indirect immunohistochemistry, OptiView DAB IHC detection kit,

(4)

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

BAKGRUND ... 4

Immunhistokemi (IHC) ... 4

Nuvarande immunhistokemisk infärgning av PAX8 ... 5

NordiQC ... 5

Syfte ... 5

METOD & MATERIAL ... 5

RESULTAT ... 7

Optimering av tid, förbehandlingsbuffert och visualiseringskit. ... 7

Optimering av förbehandlingstid ... 10

Optimering av koncentration av primärantikropp ... 11

Jämförelse mellan slutgiltigt optimerat protokoll och befintligt protokoll ... 14

DISKUSSION ... 14 ACKNOWLEDGEMENTS ... 17 REFERENSER... 18 BILAGA 1... 19 BILAGA 2... 20 BILAGA 3... 21

(5)

BAKGRUND

Paired box protein - 8 (PAX8) är ett protein kodat av PAX8-genen som

lokaliseras i kromosom 2. PAX8 reglerar transkriptionen för organogenesen av tyreoidea, placenta, njure samt innerörat. Det är främst i tyreoidea som PAX8 har störst inverkan. Där reglerar den förekomsten av de olika follikulära cellerna genom att bland annat påverka proteinerna tyreoglobulin och tyreoperoxidas (TPO). PAX8 är en specifik och sensitiv markör för carcinom i njure och icke- mucinöst carcinom i äggstockarna [1]. PAX8 uttrycks normalt i kärnor i njurens epitelceller i distala och proximala tubuli, Henles slynga samt runt Bowmans kapsel. I äggledare uttrycks det normalt i de cilierade epitelcellernas kärnor samt i de interkalerade sekretoriska epitelcellernas kärnor [2–3].

MRQ-50 är en antikroppklon mot PAX8 som används för klinisk diagnostik inom Region Skåne. Det har visat sig att MRQ-50 korsreagerar med lymfocyter och andra PAX-proteiner i vävnad [3]. Andra kloner mot PAX8 finns och används inom immunhistokemi (IHC) för histopatologisk diagnostik. I denna studie användes två varianter av samma klon SP348, Anti PAX8 antibody [SP348] –N- terminal (PAX8-N) samt Anti PAX8 antibody [SP348] - BSA and Azid free (PAX8-B). Båda antikropparna är monoklona, av IgG-typ och med kanin som värddjur och binder till den N-terminala delen av PAX8. Skillnaden är att BAX8-B är fri från bovint serumalbumin (BAX8-BSA) och natriumazid [4–5]. Natriumazid tillsätts för att bibehålla stabiliteten hos antikroppen och minska bakterieväxt [6]. BSA används som blockeringsreagens för att förhindra eventuell korsreaktion [7].

Immunhistokemi (IHC)

IHC utnyttjas för detektering av antigen i vävnadssnitt och används som komplement inom histopatologi. För att påvisa ett specifikt antigen inkuberas vävnadssnittet med en primär antikropp för ett specifikt protein. En sekundär antikropp tillsätts som binder in till primär antikropp. För identifiering av

sekundär antikropp binder en enzymbunden tertiär antikropp in. Tertiär antikropp visualiseras med 3,3'-diaminobensidintetrahydroklorid (DAB) samt

väteperoxidsubstrat som ger en brun utfällning vilket syns i ljusmikroskop [8]. Ospecifik bakgrund innebär infärgning som inte består av antikropp – antigen inbindning. Korsreaktion är en annan vanlig orsak som leder till ospecifik inbindning av antikropp i vävnad. Detta uppstår när flera olika antikroppar interagerar med flera antigen som har minst en epitop av samma typ [9-10]. Genom att välja en monoklonal antikropp och noggrant välja ut specifik klon av antikropp kan korsreaktion samt ospecifik bakgrund förebyggas [11].

Fixering av vävnad har även stor betydelse för hur bra en antikropp binder in och innan analys med IHC bör färsk vävnad fixeras. Fixeringen har som syfte att bevara vävnadens naturliga form och struktur samt att konservera cellorganeller. Formaldehyd är det vanligaste fixeringsmedlet som används kliniskt. Vid fixering med formaldehyd bildas kovalenta bindningar mellan aldehyd och

aminogrupperna i vävnaden. Bildning av kovalenta bindningar kan leda till denaturering av proteiner och försämra antigeniciteten. För att bryta de kovalenta bindningarna kan vävnadssnitten förbehandlas med specifika buffertar med olika pH kombinerat med värme. Detta kallas för Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) [12].

(6)

Efter fixering dehydreras materialet med syftet att ta bort vattnet så att paraffin i senare steg kan impregneras. Vattnet tas bort stegvis och ersätts först med 70%, sedan 95% och till sist 99,5% etanol. Eftersom paraffin är hydrofobt utförs klarning för att bli av med etanol i vävnad. Detta görs genom impregnering av vävnaden i xylen före paraffininfiltration och inbäddning [13]. För IHC är dehydrering och paraffininbäddning inte nödvändigt men det är det vanligaste hanteringen av ett vävnadsprov inom klinisk patologi.

Nuvarande immunhistokemisk infärgning av PAX8

Då klonen anti-PAX8 (MRQ-50) Mouse Monoclonal Primary Antibody, som används vid klinisk patologisk diagnostik inom Region Skåne, visat sig

korsreagera med lymfocyter kan diagnostisering av prover försvåras och ge falskt positiva värden. I det nuvarande MRQ-50 protokollet förbehandlas vävnaden med förbehandlingsbuffert ULTRAcell conditioning solution 1 i 64 minuter i 100C och signalintensiteten förstärks med Amplification Kit från Ventana (Tucson, USA). Primär antikroppen MRQ-50 inkuberas i 24 minuter i 37C och Hematoxylin I används som kontrasinfärgning. Genom att testa en ny klon tillsammans med optimerat protokoll kan framtida diagnostisering

förhoppningsvis förbättras.

NordiQC

Nordic immunohistochemical quality control (NordiQC) är en organisation vars mål är att främja kvaliteten för immunhistokemiska infärgningsprotokoll. NordiQC utför och rekommenderar infärgningsprotokoll, lämpliga

vävnadskontroller samt relevanta beskrivningar om exempelvis epitoper. Patologi-laboratorier över hela världen medverkar med syftet att standardisera och

optimera immunhistokemiska metoder [14].

Syfte

Syftet med studien var att utveckla och optimera ett protokoll för maskinell immunhistokemisk färgning med en PAX8 antikropp, klon SP348.

METOD & MATERIAL

Utifrån NordiQC och dess rekommendation valdes en bit appendix respektive tonsill ut som negativ kontroll samt en bit njure respektive äggledare som positiv kontroll. Materialet som användes i studien var avidentifierad normalvävnad samt fem patientprov som erhölls från befintlig biobank vid Klinisk patologi i Lund. Samtliga patientprov bestod av material med känd icke-mucinöst carcinom i äggstockarna. Vävnaden var formalinfixerad och förvarades paraffininbäddad i klossar. Ur paraffinklossar med kontrollmaterial skars bitar i lämplig storlek som bäddades om till en gemensam kloss för att underlätta vid snittning och färgning. För att säkerställa att kontrollvävnaden var representativ färgades ett snitt in med översiktsfärgen hematoxylin och eosininfärgning (H&E) i DAKO CoverStainer (Glostrup, Danmark). Vävnaden snittades på 3µm med mikrotomen LEICA RM2255 (Buffalo, USA), fästes på FLEX IHC Microscope slides (DAKO, Glostrup, Danmark) och inkuberades 50 minuter i 60C i värmeskåp för bättre vidhäftning.

(7)

Två olika varianter av PAX8-antikropp från samma klon SP348, Anti PAX8 antibody [SP348] –N- terminal (PAX8-N) samt Anti PAX8 antibody [SP348] - BSA and Azid free (PAX8-B) från Abcam (Amsterdam, Nederländerna) användes i studien. I ett första steg undersöktes sex olika grundprotokoll med olika

inkubationstider, temperaturer och buffertar vid förbehandling. Buffertarna ULTRAcell conditioning solution, ULTRA CC1 med pH 8.5 och ULTRA CC2 med pH 6 från Roche Ventana testades samt två olika visualiserings kit OptiView DAB IHC detection kit och UltraView Universal DAB kit från Roche Ventana (Tuscon, USA), se tabell 1 och 2. För kontrastinfärgning användes Hematoxylin II som är en modifierad Mayer´s hematoxylin. Hematoxylin (htx) kombinerat med Bluing Reagent från Ventana (Tuscon, USA) vilket ger en blå kontrastinfärgning i kärnor.

NordiQC rekommenderar en spädningsfaktor mellan 1:50 – 1:200 för

primärantikropp. I första omgången användes spädningsfaktor 1:100 för både PAX8-N med koncentrationen 0.412 mg/ml och PAX8-B med koncentrationen

1.028 mg/ml. Antikropparna späddes i Antibody Diluent från Ventana (Tucson, USA). Ett objektglas vardera med samtliga kontrollvävnader färgades utifrån varje grundprotokoll maskinellt i Roche Ventana Benchmark Ultra (Tucson, USA). Efter maskinell infärgning tvättades objektglasen med tvål för att avlägsna olja som tillsätts automatisk via ULTRA Liquid Coverslip (ULTRA LCS) i den maskinella infärgningsprocessen. ULTRA LCS används som barriär mellan luften och vattenbaserade reagens och förhindrade avdunstning från objektglasen under den maskinella infärgningsprocessen. Objektglasen torkades i värmeskåp i 30 minuter i 60C och innan maskinell montering i Sakura tissue tek film (Sakura Finetek, Kalifornien, USA) doppades samtliga objektglas i xylen för att den xylenbaserade filmen skall fästa.

Tabell 1: Redovisning av respektive grundprotokoll samt protokollnummer från Roche Ventana Benchmark ultra med visualiserings kit UltraView Universal DAB kit. Htx= Hematoxylin.

Protokollnr Visualiserings kit Förbehandling Antikropp-inkubering Htx/ blåning 4910 UltraView universal DAB kit CC1, 64min, 95C

32min, 36C 8min/ 4min

4920

UltraView Universal DAB kit

CC2, 44min, 91C

4930

UltraView Universal DAB kit

CC1, 36min, 95C

(8)

Tabell 2: Redovisning av respektive grundprotokoll samt protokollnummer från Roche Ventana Benchmark ultra med visualiserings kit OptiView DAB IHC detection kit. Htx= Hematoxylin.

Protokollnr Visualiserings kit Förbehandling Antikropp-inkubering Htx/ blåning 4810

OptiView DAB IHC detection kit

CC1, 64min, 100C

4820

CC2, 44min, 95C

4830

CC1, 36min, 100C

Utifrån resultaten som erhölls i de inledande försöken valdes det grundprotokoll som visade bäst resultat vad gäller val av buffert samt visualiserings kit. Vidare testades två ytterligare förbehandlingstider, 48 minuter och 52 minuter. Slutligen optimerades antikroppkoncentrationerna där antikroppspädning 1:50 och 1:200 testades för både PAX8-N och PAX8-B.

Det slutgiltiga protokollet med mest fördelaktigt resultat testades på fem patientprov (fall 1 – 5) med känd icke-mucinöst carcinom i äggstockarna och resultatet jämfördes med infärgning enligt befintligt protokoll med MRQ-50-antikropp (Cell Marque a Sigma - Aldrich company,Rocklin, USA), av personal på klinisk patologi för klinisk diagnostik.

Objektglasen granskades i ljusmikroskop och intensitet av positiv inmärkning graderades från 0 – 3 där 0 = neg, 1 = svag, 2 = måttlig och 3 = stark infärgning i kärnorna. Kontrast och bakgrund graderades även där 0 = rent och 1 – 3 hade samma parametrar som ovanstående. Andel infärgade epitelcellkärnor som färgats in i positiv kontrollvävnad samt tumörcellkärnor i tumörvävnad uppskattades i procent. För negativ kontrollvävnad bedömdes endast bakgrund. Uppskattningen var en egenbedömning och granskades med patolog.

Etiska aspekter

Provmaterialet som användes i försöken var taget från befintliga paraffinklossar som sparats enligt biobankslagen vid Lunds biobank för Klinisk patologi.

Eftersom provmaterialet användes avidentifierat och i utbildningssyfte ansågs en etisk prövning inte nödvändig.

RESULTAT

Flera olika faktorer optimerades i olika omgångar. Nedan presenteras resultaten för respektive optimering.

Optimering av tid, förbehandlingsbuffert och visualiserings kit.

Bilder från samtliga resultat på positiv kontrollvävnad redovisas i bilaga 1 och 2. Intensiteten för PAX8-N och PAX8-B ansågs som stark för protokoll 4810 med förbehandlingsbuffert CC1 och inkuberingstid 64 minuter i 100C. Bakgrunden för PAX8-N var renast i protokoll 4810 medan för PAX8-B ansågs protokoll 4820

(9)

som renast. För PAX8-B ses fokalt brun infärgning i negativ kontrollvävnad, se bilaga 3. Kontrasten med htx för PAX8-N och PAX8-B ansågs stark för protokoll 4910, 4930 och 4810. Andelen infärgade cellkärnor för PAX8-N var högst med protokoll 4810 och protokoll 4830 för PAX8-B, se tabell 3 och 4. Buffertlösning CC1 samt OptiView DAB detection kit är att föredra för både PAX8-N och PAX8-B. Protokoll 4810 samt 4830 anses som de mest lovande alternativen för vidare optimering av förbehandlingstid, se figur 1.

Tabell 3: Redovisning av resultat för positiv kontrollvävnad med PAX8-N där intensiteten, bakgrunden och kontrasten graderas 0 – 3. 0 = negativ, 1 = svag, 2 = måttlig och 3 = stark. För bakgrund anses 0 = rent. Andelen infärgade cellkärnor i positiv kontrollvävnad redovisas i procent.

Protokollnr.

Visualiserings kit

För-behandling

Intensitet Bakgrund Kontrast

Htx

Andel

%

4910

UltraView universal DAB kit

CC1, 64min, 95C

1 - 2 1 3 80 – 90

4920

CC2, 44min, 91C

1 1 2 80

4930

CC1, 36min, 95C

1 - 2 1 3 70

4810

CC1 64min, 100C 3 0 3 90 – 100 4820 OptiView DAB IHC detection kit

CC2 40min, 95C

2 - 3 1 1 90

4830

CC1 32min, 100C

(10)

Tabell 4: Redovisning av resultat för positiv kontrollvävnad med PAX8-B där intensiteten, bakgrunden och kontrasten graderas 0 – 3. 0 = negativ, 1= svag, 2 = måttlig och 3 = stark. För bakgrund anses 0 = rent. Andelen infärgade cellkärnor i positiv kontrollvävnad redovisas i procent.

Protokollnr.

Visualiserings kit

För-behandling

Htx

Andel

%

4910

CC1, 64min, 95C

2 2* 3 80 – 90

4920

CC2, 44min, 91C

1 1 2 80

4930

CC1, 36min, 95C

1 - 2 2* 3 70 – 80

4810

CC1 64min, 100C

3 1 3 90

4820

CC2 40min, 95C 2 - 3 0 1 90 – 100 4830 OptiView DAB IHC detection kit

CC1 32min, 100C

2 - 3 1 2 100

*områden i tonsill är fokalt brunt infärgat, se bilaga 3.

Figur 1: Redovisning av positiv kontrollvävnad med protokoll 4810 respektive 4830 där A och B visar positivt i njurens distala och proximala tubuli, Henles slynga samt runt Bowmans kapsel. I bild C och D ses infärgning av cellkärnor i de cilierade och i de interkalerade sekretoriska epitelcellerna i tuba. Infärgning för PAX8-B med protokoll 4830 redovisas i bild A och C. Infärgning för PAX8-N med protokoll 4810 ses i bild B och D.

C

A

C

D

A

B

C

(11)

Optimering av förbehandlingstid

Förbehandlingstiderna 52 och 48 minuter testades och jämfördes med protokoll 4810 och 4830. Intensiteten för PAX8-N respektive PAX8-B ansågs som stark för protokoll 4818 med inkuberingstiden 48 minuter. Bakgrunden för PAX8-N och PAX8-B var renast i protokoll 4818. För PAX8-B ses fokalt brun infärgning i negativ kontrollvävnad, se bilaga 3. Kontrasten med htx för PAX8-N ansågs måttlig i 4817 och 4818 medan för PAX8-B ansågs som stark för protokoll 4818. Andelen infärgade cellkärnor för PAX8-N och PAX8-B var högst med protokoll 4818, se tabell 5 och 6. Protokoll 4818 med förbehandlingstiden 48 minuter samt måttlig kontrast anses som det mest lovande alternativet att arbeta vidare med. PAX8-N tenderar även att vara ett bättre alternativ än PAX8-B, se figur 2.

Tabell 5: Redovisning av resultat för positiv kontrollvävnad med PAX8-N där intensiteten, bakgrunden och kontrasten graderas 0 – 3. 0 = negativ, 1 = svag, 2 = måttlig och 3 = stark. För bakgrund anses 0 = rent. Andelen infärgade cellkärnor i positiv kontrollvävnad redovisas i procent. Kontrasten visualiseras med OptiView DAB IHC detection kit.

Antikropp

Protokollnr.

Förbehandling Intensitet Bakgrund Kontrast

Htx Andel % PAX8-N 4817 CC1, 52min, 100C 2 - 3 1 - 2 2 70 - 80 PAX8-N 4818 CC1, 48min, 100C 3 0 - 1 2 90

Tabell 6: Redovisning av resultat för positiv kontrollvävnad med PAX8-B där intensiteten, bakgrunden och kontrasten graderas 0 – 3. 0 = negativ, 1 = svag, 2 = måttlig och 3 = stark. För bakgrund anses 0 = rent. Andelen infärgade cellkärnor i positiv kontrollvävnad redovisas i procent. Kontrasten visualiseras med OptiView DAB IHC detection kit.

Antikropp

Protokollnr.

Förbehandling Intensitet Bakgrund Kontrast

Htx Andel % PAX8-B 4817 CC1, 52min, 100C 2 - 3 1 – 2* 2 80 - 90 PAX8-B 4818 CC1, 48min, 100C 3 0 – 1* 3 90

(12)

Figur 2: Redovisning av positiv kontrollvävnad med protokoll 4818 där A och B visar positivt i njurens distala och proximala tubuli, henles slynga samt runt Bowmans kapsel. I bild C och D ses infärgning av cellkärnor i de cilierade och i de interkalerade sekretoriska epitelcellerna i tuba. Infärgning med PAX8-B redovisas i bild A och C. Infärgning med PAX8-N ses i bild B och D. Optimering av koncentration av primärantikropp

Intensiteten för PAX8-N bedömdes som måttlig till stark vid spädning 1:50 och stark vid spädning 1:200. För PAX8-B ansågs intensiteten vara måttlig till stark vid både spädning 1:50 och 1:200. Bakgrund för PAX8-N bedömdes som ren vid spädning 1:50 och måttlig vid spädning 1:200 medan för PAX8-B visade en stark bakgrund vid spädning 1:50 och måttlig vid spädning 1:200. För PAX8-B ses fokalt brun infärgning i negativ kontrollvävnad för spädning 1:50, se bilaga 3. Kontrastinfärgning med htx visade samma resultat för PAX8-N och PAX8-B, måttlig kontrast vid spädning 1:50 och stark vid spädning 1:200. I PAX8-B, oberoende av spädningsfaktor, noterades en trolig korsreaktion med lymfocyter i negativ kontrollvävnad (tonsill) som illustreras i bilaga 3. Andel infärgade cellkärnor för PAX8-N visade 90 – 100% för båda spädningarna. För PAX8-B ansågs andelen infärgade cellkärnor vara 90 – 100% för spädning 1:50 och 80 – 90% för spädning 1:200, se tabell 7 och 8 samt figur 3 och 4.

A

B

(13)

Tabell 7: Redovisning av resultat för positiv kontrollvävnad med PAX8-N i testomgång 3 med förbehandlingsprotokoll 4818 där bakgrunden och kontrasten graderas 0 – 3. 0 = negativ, 1 = svag, 2 = måttlig och 3 = stark. För bakgrund anses 0 = rent. Andelen infärgade cellkärnor i positiv kontrollvävnad redovisas i procent.

Antikropp

Spf.

Förbehandling

4818

Htx Andel % PAX8-N 1:50 CC1, 48min, 100C 2 - 3 0 2 90 – 100 PAX8-N 1:200 CC1, 48min, 100C 3 2 3 90 – 100

Tabell 8: Redovisning av resultat för positiv kontrollvävnad med PAX8-B i testomgång 3 med förbehandlingsprotokoll 4818 där bakgrunden och kontrasten graderas 0 – 3. 0 = negativ, 1 = svag, 2 = måttlig och 3 = stark. För bakgrund anses 0 = rent. Andelen infärgade cellkärnor i positiv kontrollvävnad redovisas i procent.

Antikropp

Spf.

Förbehandling

4818

Htx Andel PAX8-B 1:50 CC1, 48min, 100C 2 - 3 3* 2 90 – 100 PAX8-B 1:200 CC1, 48min, 100C 2 - 3 2 3 80 - 90

*områden i tonsill är fokalt brunt infärgat, se bilaga 3.

PAX8-N är att föredra framför PAX8-B eftersom alla tidigare infärgningar med PAX8-B visat en korsreaktion i negativ kontrollvävnad. För PAX8-N jämfördes resultaten med spädning 1:100 med protokoll 4818 i tidigare testomgång. Spädning 1:100 visar likartade resultat vad gäller kontrast och andel infärgade celler men en starkare intensitet jämfört med spädning 1:50. PAX8-N med spädning 1:100 och protokoll 4818 anses som det mest lovande alternativet.

(14)

Figur 4: Redovisning av positiv kontrollvävnad vid koncentrationen 1:50 där A och B visar positivt i njurens distala och proximala tubuli, henles slynga samt runt Bowmans kapsel. I bild C och D ses infärgning av cellkärnor i de cilierade och i de interkalerade sekretoriska epitelcellerna i tuba. Infärgning med PAX8-B redovisas i bild A och C. Infärgning med PAX8-N ses i bild B och D.

Figur 5: Redovisning av positiv kontrollvävnad vid koncentrationen 1:200 där A och B visar positivt i njurens distala och proximala tubuli, henles slynga samt runt Bowmans kapsel. I bild C och D ses infärgning av cellkärnor i de cilierade och i de interkalerade sekretoriska epitelcellerna i tuba Infärgning med PAX8-B redovisas i bild A och C. Infärgning med PAX8-N ses i bild B och D.

A

B

C

D

A

B

C

D

A

(15)

Jämförelse mellan slutgiltigt optimerat protokoll och befintligt protokoll

Resultat för patientprov infärgade med PAX8-N och optimerat protokoll 4818 med inkuberingstid 48 min i 100C tillsammans med PAX8-N [1:100] respektive MRQ-50 jämfördes och graderades enligt samma parametrar som tidigare, se tabell 9. Fall 1 – 5 visade måttlig till stark intensitet, ren till svag bakgrund samt en måttlig kontrast för PAX8-N. För MRQ-50 var resultatet detsamma förutom bakgrunden som var måttlig till stark. Andelen infärgade tumörcellkärnor var 90 – 100% i patientproverna för PAX8-N och 80 – 90% för MRQ-50. Positiv

kontrollvävnad var representativt infärgad för PAX8-N och MRQ-50. Negativ kontroll var representativ för PAX8-N medan MRQ-50 visade kraftig infärgning i lymfocyter. PAX8-N anses som ett bättre alternativ än MRQ-50 eftersom

bakgrund och andel positiva tumörceller i patientprov visar ett bättre resultat.

Tabell 9: Redovisning av resultat för positiv kontrollvävnad med PAX8-N samt MRQ-50 med fem patientfall i testomgång 4 med förbehandlingsprotokoll 4818 där intensiteten, bakgrunden och kontrasten graderas 0 – 3. 0 = negativ, 1 = svag, 2 = måttlig och 3 = stark. För bakgrund anses 0 = rent. Andelen infärgade cellkärnor för positiv kontrollvävnad samt tumörceller i patientprov redovisas i procent.

Fall Antikropp Intensitet Bakgrund Kontrast

Htx Andel % kontroll Andel % Pat.prov 1 PAX8-N 2 – 3 0 – 1 2 90 – 100 90 – 100 MRQ-50 2 – 3 2 – 3 2 90 – 100 80 – 90 2 PAX8-N 2 – 3 0 – 1 2 90 – 100 90 – 100 MRQ-50 2 – 3 2 – 3 2 90 – 100 80 – 90 3 PAX8-N 2 – 3 0 – 1 2 90 – 100 90 – 100 MRQ-50 2 – 3 2 – 3 2 90 – 100 80 – 90 4 PAX8-N 2 – 3 0 – 1 2 90 – 100 90 – 100 MRQ-50 2 – 3 2 – 3 2 90 – 100 80 – 90 5 PAX8-N 2 – 3 0 – 1 2 90 – 100 90 – 100 MRQ-50 2 – 3 2 – 3 2 90 – 100 80 – 90

DISKUSSION

När en ny antikropp ska införas vid klinisk patologi måste den optimeras och valideras innan den får användas kliniskt. Det första steget är val av

förbehandlingsprotokoll. Roche Ventana Benchmark Ultra ger möjlighet att använda förbehandlingsbuffertarna CC1 och CC2. NordiQC rekommenderar CC1 i sina protokoll vilket stämmer överens med det resultat som erhölls i dessa försök [3]. Det är viktigt att varje laboratorium själv optimerar och provar ut

förbehandlingsprotokoll eftersom det kan variera vilket förbehandlingsprotokoll som föredras. På så sätt kan det mest optimala hittas och optimeras ytterligare med till exempel ändring av inkuberingstid. Kliniskt utförs IHC endast maskinellt inom Region Skåne. Vid utprovning av en ny antikropp är det därför viktigt att det utförs maskinellt och inte manuellt för att kunna försäkra sig om att det är samma förutsättningar vid infärgning av ett patientprov. Påverkan från den mänskliga faktorn att exempelvis vävnaden inkuberas för kort eller för länge minskar även.

(16)

Det positiva med maskinell infärgning, förutom att det är extremt effektivt, är att samma förutsättningar uppnås varje omgång för parametrarna tid, temperatur och utförandet av till exempel sköljning av objektglas [15]. Det kan dock vara en nackdel att utföra det maskinellt eftersom tillverkarens utbud av reagens och antikroppar begränsar valmöjligheterna till vilka reagens som kan användas. Företagen själva har många ”ready to use”- kit som exempelvis OpitView DAB IHC detection kit och olika antikropp-dispensrar som måste användas när inget annat finns eller fungerar ihop med maskinens utrustning. Det ger även en begränsad tillgång till val av antikroppar som används dagligen och framförallt val av koncentration. Färdiga antikropp-dispensrar kan vara till en fördel eftersom exakt samma koncentration på alla objektglas alltid erhålles. Titreringsantikroppar som blandas manuellt har större risk att få fel koncentration där påverkan av den mänskliga faktorn att till exempel blanda fel finns. I denna studie titrerades PAX8-antikropp på objektglasen manuellt. Detta gav möjlighet att kunna testa olika koncentrationer och på så sätt optimera ytterligare.

Vid en immunhistokemisk infärgning strävas det efter att få så lite ospecifik bakgrund som möjligt [15]. PAX8-B hade starkare bakgrund, där rester från DAB-infärgning ses, jämfört med PAX8-N på majoriteten av vävnaderna.

Korsreaktion mellan PAX8-B och lymfocyter uppstod i tonsillen, som skulle vara helt negativ för PAX8, vilket tyder på att det inte är säkert om det är rätt

cellkärnor som färgats in i positiv kontroll. För att undvika risken för korsreaktion är PAX8-N ett bättre val då det inte sågs någon ospecifik inbindning i tonsill. PAX8-N innehåller det hälsofarliga ämnet natriumazid. Natriumazid tillsätts för att bibehålla stabiliteten hos antikroppen och minska bakterieväxt. Det är viktigt att det inte innehåller för höga koncentrationer av natriumazid eftersom den i stor mängd är toxisk [6]. En hög koncentration av natriumazid kan försämra

infärgningen genom att störa den väteperoxid-baserade reaktionen [7]. En stor diskussionspunkt är därför om PAX8-N bör uteslutas redan från början eftersom den innehåller natriumazid trots att den visar ett betydligt bättre resultat med renare infärgning. Lagringsbufferten innehåller 0,1% av natriumazid och resterande beståndsdelar av PBS varav 1% är BSA [8]. Det är alltså inte en stor mängd av natriumazid i antikropplösningen men bör ändå hanteras med

försiktighet. Vid genomgång av färgningarna med patologer anser de oberoende av varandra att PAX8-N är att rekommendera då kärninfärgningen är klarare och bakgrunden är renast vid jämförelse.

Samtliga MRQ-50 infärgningar visade tydlig positivitet i negativ kontroll (tonsill). Enligt NordiQC skall ingen infärgning ses i tonsillvävnad [3]. En teori är att det sker en korsreaktion med lymfocyter som finns rikligt i tonsill. En korsreaktion uppstår när en primär antikropp interagerar med flera antigen som har minst en epitop av samma typ gemensamt [9–10]. En eventuell korsreaktion med

lymfocyter vid infärgning av patientprover leder till en försvårad diagnostik och risk för feltolkning. Vanligtvis förhindras detta med hjälp av blockeringsreagens, som exempelvis BSA, som finns inkluderat i ”ready to use”- kit. För hög

koncentration av primärantikropp kan också leda till falsk positivitet [15]. Positiv kontroll (njure och äggledare) infärgad med MRQ-50 visade samma resultat vad gäller intensitet, kontrast och andel positiva tumörcellkärnor som för PAX8-N men med betydligt smutsigare bakgrund. För samtliga vävnader med icke-mucinöst carcinom i äggstocken sågs infärgning för både PAX8-N och

(17)

MRQ-50 men även där betydligt smutsigare bakgrund med MRQ-50. En smutsig bakgrund gör det svårare att diagnosticera samt ger en indikation på en mindre specifik antikropp [13].

Överlag visades ett bättre resultat på tuba än för njuren med PAX8-N som var vävnaderna för positiv kontroll. Detta kan ha med själva materialet i sig att göra. PAX8 är fixeringskänslig vilket kan vara en anledning till att njuren har en sämre infärgning. Njure är enzymrikt vilket medför att autolys, celler bryts ner av kroppsegna enzymer, uppstår snabbare än för andra organ. Det är därför extremt viktigt att fixering sker inom en viss tid för att försäkra sig om att

cellkomponenten som efterfrågas förblir intakt. För alla IHC infärgningar krävs det att cellkomponenten är intakt. I detta fall binder PAX8 in till kärnorna i cellen. Har fixering och dehydrering utförts under för kort tid eller för lång tid kan

cellkomponenterna och dess antigen av intresse förstöras [15]. Fixeringstid är i de flesta fall spårbart men kan variera inom en viss tidsram. Riktlinjer för hantering av olika typer av prov och vävnader finns även på patologilaboratoriet. Innan vävnaden ankommer till patologilaboratoriet omhändertas det av till exempel vårdcentral eller operationssjuksköterskor och läkare. Där finns en hel del felkällor som också bör tas hänsyn till som exempelvis hur den transporteras till patologilaboratoriet, i fixeringslösning eller utan fixeringslösning samt

transporttid. Det är som nämnts ovan svårt att veta om det uppstått någon

komplikation men det bör ändå hållas i åtanke att det finns flera felkällor som inte alltid går att påverka. Tuba skulle dock enligt NordiQC ha en starkare intensitet i infärgning än njure vilket stämmer överens med resultatet så det är ett godtagbart resultat som erhållits [3].

Samtliga resultat är egenbedömda och granskades med patolog. Detta i sig kan vara svårt då olika personer kan bedöma och se olika. Det är även svårt att bedöma intensiteten om exempelvis kontrasten är stark, då upplevs oftast

intensiteten som starkare. Kontrasten är dock viktig att behålla då den behövs för att kunna lokalisera sig i vävnaden samt härleda olika celler. Det är även en fin balansgång gällande hur många som ska bedöma innan det ska anses som en pålitlig infärgning. I detta fall bedömde två patologer oberoende av varandra tillsammans med mig och laboratoriehandledaren. Det som väger tyngst bör dock vara att rätt komponenter och celler färgas in samt hur ren infärgningen är.

KONKLUSIONER

PAX8 är att föredra för vidare undersökning på patientprov då den ser mer ren ut i infärgningen än PAX8-B. Vidare förslag är att ersätta MRQ-50 som används kliniskt mot PAX8-N. Viktigt att ha i åtanke är att en del tumörer kräver fler infärgningar som komplement för att säkerställa att rätt diagnos ställs.

(18)

ACKNOWLEDGEMENTS

Jag vill framföra ett stort tack till samtliga som hjälpt mig under detta

examensarbete. Till handledaren Lena Tran som hjälpte med introduktion till IHC samt hjälpte mig med övriga frågor och problem längs vägen. Till Annette

Persson för värdefull feedback gällande skrivandet. Till övrig personal på Klinisk Patologi, Immunhistokemi laboratoriet i Lund för vänligt bemötandet och bra hjälp.

(19)

REFERENSER

1. NordiQC (2020), PAX8 (paired box gene-8 protein). >www.nordiqc.com< HTML (2020-01-28)

2. Tacha, D., L. Cheng, D. Zhou, and R. L. Henshall-Powell. (2010). Expression of PAX8 in Normal and Neoplastic Tissues: A Comprehensive IHC

Analysis, Laboratory investigation. 90, 222A

3. NordiQC (2019), Assessment Run 56 2019 PAX8. >www.nordiqc.com< PDF (2020-02-04)

4. Abcam (2020). Anti-PAX8 antibody [SP348] - N-terminal ab227707 >www.abcam.com< PDF (2020-02-10)

5. Abcam (2020). Anti-PAX8 antibody [SP348] - BSA and Azide free ab242429 >www.abcam.com< PDF (2020-02-10)

6. Chemicalbook (2020). Soidum azide CAS n: 26628-22-8

>www.chemicalbook.com/< HTML (2020-03-05)

7. Abcam (2020), Carrier-free formulations for recombinant RabMAb®

antibodies. >www.abcam.com< HTML (2020-03-02)

8. Ventana (2011). OptiView DAB IHC Detection Kit >www.productlibrary.ventana.com< PDF (2020-01-29)

9. Marc, K. (2006). Pathology Education guide: Immunohistochemical Staining

methods, fourth edition. California, USA: DAKO.

10. Dabbs, D (2006). Diagnostic immunohistochemistry. Philadelphia, USA: Elsevier inc, Churchill livingstonde Elsevier

11. Allen M. Gown. (2016). Diagnostic Immunohistochemistry: What Can Go Wrong and How to Prevent It. Archives of Pathology & Laboratory

Medicine: Volume 140, No. 9, pp. 893-89

12. Boenisch, T. (2006) Heat-induced Antigen Retrieval: What Are We

Retrieving? The Journal of Histochemistry & Cytochemistry. Volume 54(9): 961–964

13. Carson, F L. (2015). Histotechnology, a self -instructional text. Chicago, USA: ASCP Press, American Society of Clinical Pathologists.

14. NordiQC (2020), About NordiQC. >www.nordiqc.com< HTML (2020-01-29)

15. Brown, R. (2009). Histologic preparations common problems and their

(20)

BILAGA 1

Redovisning av PAX8-N översta raden visar förbehandlingsprotokollen 4810 - 4830 och nedre raden visar 4910 - 4930. Njure högst upp i bild och tuba nere.

(21)

BILAGA 2

Redovisning av PAX8-B översta raden visar förbehandlingsprotokollen 4810 - 4830 och nedre raden visar 4910 - 4930. Njure högst upp i bild och tuba nere.

(22)

BILAGA 3

Exempel på fokalt brun infärgning med PAX8-B där trolig korsreaktion med lymfocyter ses på den negativa kontrollen tonsill.