Use of Ultra Filtration for the Study of Phenol Red Binding to Serum Albumin

Use of Ultra Filtration for the Study of

Phenol Red Binding to Serum Albumin

Bo Nordström

School of Engineering, Jönköping University P.O. Box 1026, S 551 11 Jönköping, Sweden

Abstract

A fast ultrafiltration method is described for quantitative studying of protein-ligand interactions at equilibrium. This protocol is aimed for student studies in the laboratory. Bovine serum albumin is allowed to complex with phenol red dye at various concentration ratios in a series of tests. These equilibrium mixtures are then subject to quick ultrafiltration steps using centrifugal ultrafiltration filters. The dye concentrations in the filtrates are determined by spectrophotometry, thus establishing the concentrations of free dye in equilibrium with protein bound dye in each case. In combination with knowledge of the protein concentration and the total amount of dye in each case, it is possible to evaluate the number of bound phenol red molecules per protein molecule. In a typical experiment a saturation curve, and a Scatchard plot were constructed using results from 10 different equilibrium mixtures. The results typically show that a total of 13-14 phenol red molecules bind to serumalbumin by two interacting sites with different binding constants.

Keywords

Table of contents

Introduction ………...1

Experimental procedure ………...…2

Chemicals ………...2

Instruments ………...2

Results and discussion ………...4

Literature ………...9

Appendix: Student laboratory protocol ……….10

Introduction

Many courses in biochemistry include experiments using dyes for studying ligand-protein interactions quantitatively. Saturation curves as well as Scatchard plots are used to estimate the resulting number of ligands and their binding constants. Systems that have been described, include the interaction between Coomassie Blue dye and ovalbumin (1). Here the dye develops a colour change upon binding to the protein, which constitutes a means to estimate the amounts of bound and free dye at equilibrium. Other experiments use separation of the equilibrium mixture of protein-dye complex and free dye molecules followed by determination of free dye by spectrophotometry. Boyer (2) describes such an experiment using phenol red dye binding to bovine serum albumin, where the equilibrium mixture is treated by gel chromatography for separation of free dye from protein-dye complex. Slight improvements and corrections of Boyer´s experiment have recently been suggested by Silverstein (3).

This paper describes a method with a setup similar to Boyer´s, but using a fast ultrafiltration step to separate free dye from protein-dye complex at equilibrium. This is followed by spectrophotometric determination of free dye in the filtrate using its absorption maximum at 430 nm at pH 4.0. Parallel procedures are used for several different protein-dye concentration combinations. The experiments and the following calculations are readily finished in 4-5 h making the method suitable for a half-day student lab in biochemistry.

The resulting Scatchard plot shows a curved line with two distinct slopes, suggesting two interacting binding sites with different binding constants. The saturation curve and the Scatchard plot show binding of a total of 13-14 phenol red molecules to the protein molecule. This value is slightly uncertain and dependent upon how the information in the Scatchard plot is used. For the same reason, the two binding constants are somewhat uncertain. The multiple binding of phenol red to serum albumin, as found here, is however well within agreement with earlier results (2).

Experimental procedure

Chemicals

Bovine serum albumin A7906 SIGMA Lot 30K0932 Phenol red MERCK Lot 53902741 349

Sodium acetate pA Sodium hydroxide pA MilliQ water

Instruments

Amicon® Centriplus® centrifugal filters, cutoff 50K, MILLIPORE Perkin Elmer UV/VIS Spectrophotometer Lambda 16

Hettich Universal 30 RF Centrifuge

25 mg phenol red were dissolved in 20 mL of MilliQ water, slightly alkalized with NaOH, thus producing a 3.5x10-3 M solution (PhR). The 430 nm molar absorptivity for phenol red at pH 4 was estimated by spectrophotometry using this solution and a 0.20 M sodium acetate buffer pH 4 (NaAc). A 20 mg/mL, corresponding to 3.0x10-4 M, solution of bovine serum albumin (BSA) was also prepared in MilliQ water.

Ten different assays (1-10) were set up, each with 150 µL BSA solution, 300 µL NaAc but with varying amounts of PhR, ranging from 3µL to 300 µL. MilliQ water was added to a final volume of 1000 µL in each tube. The tubes were then softly shaken to avoid foaming during incubation for 30 minutes at room temperature.

For comparison, ten other tubes (11-20) were also prepared with PhR solution and NaAc solution volumes as above, but with no protein added. These were also diluted to final volumes of 1000 µL in each case.

Meanwhile ten Centriplus® tubes were prepared by rinsing with MilliQ water followed by washing the filters by centrifugating MilliQ water at 4000xg for 5 minutes. All water was then carefully removed both from the filter units and the collecting tubes. Each tube was then filled with one of the respective equilibrium solutions. These tubes were centrifuged at 4000xg for 10 minutes, whereupon the filtrates were collected in the removable bottom tubes.

The 430 nm absorbancies of the filtrates were then read in the spectrophotometer as well as corresponding absorbancies for the solutions in the comparison tubes.

In each case, the equilibrium concentration of free phenol red (symbolized by [L]) could now be calculated, using the absorbancy of the filtrate and the molar absorptivity at 430 nm for phenol red. Using the absorbancies of the comparison tube and the equilibrium tube, the amount of protein bound phenol red at equilibrium could be calculated, as well as the number of bound phenol red molecules per molecule of bovine serum albumin (symbolized by ν) in each separate case.

The experimental values of [L] and ν were then used to construct a saturation curve of ν versus [L], as well as a Scatchard plot of ν / [L] versus ν.

Results and discussion

The resulting 430 nm apparent absorbancies of filtrates from tubes 1-10 are displayed in Table 1. below, whereas Table 2 shows the corresponding values from comparison tubes 11-20. When needed, the solutions were diluted directly in the cuvette with 0,3X NaAc in order to read the absorbancy. The read absorbancy values were then multiplied by the corresponding dilution factors in order to give "apparent absorbancies"

Table 1. Equilibrium mixtures 1-10 and 430 nm absorbancies of their filtrates

Tube nr Volume BSA / µL Volume NaAc /µL Volume PhR / µL Volume H2O / µL Apparent A430-value 1 150 300 300 250 6.48 2 150 300 200 350 2.71 3 150 300 100 450 0.914 4 150 300 75 475 0.674 5 150 300 50 500 0.314 6 150 300 25 525 0.102 7 150 300 15 535 0.063 8 150 300 10 540 0.033 9 150 300 5 545 0.015 10 150 300 3 547 0.010

Table 2. Comparison mixtures 11-20 and their 430 nm absorbancies Tube nr Volume1XNaAc / µL Volume PhR / µL Volume H2O / µL Apparent A430-values 11 300 300 400 20.82 12 300 200 500 13.88 13 300 100 600 7.25 14 300 75 625 5.30 15 300 50 650 3.58 16 300 25 675 1.79 17 300 15 685 1.10 18 300 10 690 0.695 19 300 5 695 0.364 20 300 3 697 0.224

The number of bound ligands to each protein molecule, ν, the corresponding equilibrium concentration of free ligand, [L], and ν/[L] were then calculated. These values are displayed in Table 3 below. The experimentally determined value (ε430 = 1.97x104

M-1cm-1) for the molar absorptivity of phenol red was used for the calculations. This ε430

-value is somewhat higher than was reported by Silverstein (3).

Table 3. The numbers of ligands per protein molecule, ν, the concentrations of free ligand, [L], and corresponding ν / [L] quota at different equilibria

No ν / (mol / mol) [L] / (mol / L) ν/[L] / (L / mol)

1 8.01 3.29 . 10-4 24300 2 6.24 1.38 . 10-4 45200 3 3.54 4.64 . 10-5 76300 4 2.74 3.42 . 10-5 80100 5 1.82 1.59 . 10-5 115000 6 0.94 5.19 . 10-6 181000 7 0.58 3.21 . 10-6 181000 8 0.37 1.69 . 10-6 218900 9 0.19 7.46 . 10-7 255000 10 0.12 5.18 . 10-7 232000

A Scatchard plot (Fig.1) as well as a saturation curve (Fig.2) were constructed using the values from Table 3.

0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 v (mol/mol) v /[ L ] ( 1 /M )

Fig. 1. Scatchard plot, ν/[L] as function of ν

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,00E+00 5,00E-05 1,00E-04 1,50E-04 2,00E-04 2,50E-04 3,00E-04 3,50E-04

[L] / M v / m o l/ m o l)

Fig. 2. Saturation curve, ν as function of [L] 7

As can be seen from the saturation curve, the maximum number of phenol red ligands to a serum albumin molecule is well above 8. The non-linear result of the Scatchard plot shown in Figure 1 clearly indicates non-similar, interacting binding sites for phenol red on the protein molecule.

Two straight lines were fitted to the data above, assuming two types of binding sites. One of the lines1, using points 1-4 in Table 3, corresponds to a binding site for approximately ten phenol red molecules with a binding constant of Kf =1x104. The other line2, using

points 4-10, shows binding of approximately 4 phenol red molecules with Kf = 6x104.

These results showing multiple binding, are well in agreement with other experiments (2) on the binding of dyes to bovine serum albumin.

In my biochemisty courses I have used methods from both protocols (1, 2) suggested by Boyer as foundations for lab protocols to study protein-ligand interactions. However, I have experienced drawbacks with both protocols. I feel that the Coomassie Blue dye binding lab has been theoretically too advanced for my beginners in biochemistry, thus making it less suitable. In the other, more theoretically straight-forward case, where the equilibrium mix is separated by gel filtration, I have had trouble with the gel filtration step due to partial binding of dye to the gel material. I, therefore, tried to membrane filtrate the equilibrium mixtures instead of using gel filtration to separate free dye from complexed dye. This turned out to be both a simple and quick method for the separation with the aid of Centriplus® tubes from AMICON. A few minutes centrifugation of the equilibria mixtures readily separates enough of free dye solution for analysis in the spectrophotometer. The recommendations of the manufacturer (4) include centrifuging the Centriplus® tubes upside down to collect the concentrated protein solution above the membrane. If this handling of the tubes is avoided, the centrifuge tubes may be reused for the described experiments a great number of times, if only care is taken not to damage the membrane on rinsing, filling or evacuating the tubes. I, therefore, highly recommend the procedure described above for studying ligand-protein interactions. The experimental

procedure is cheap, straight-forward, simple, reliable and fast, and the following treatment of data to achieve the results is also straight-forward and simple making the protocol ideal for a student experiment.

Literature

1. Boyer, R.F. Modern Experimental Biochemistry, 2nd ed.; Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. : Redwood City, CA, 1993; p 285

2. Boyer R.F. Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed. ; Benjamin/Cummings; San Francisco, CA, 2000; p 243

3. Silverstein, T. J. Chem. Ed. 81 (2004) 645

4. CENTRIPLUS® Concentrators Operating Manual, Publication I-430B; AMICON Inc., Beverly, MA, 1996

1(10)

Appendix: Student lab protocol

Bindning av färgämnet fenolrött till proteinet serum albumin -

en studie av protein-ligand bindning

Bakgrund

Proteinet serum albumin är ett transportprotein som finns i blod hos däggdjur. Proteinet har flera bindningsställen på sig för mindre molekyler och man vet att det är transportör i blodet av ämnen som inte har så god vattenlöslighet, exempelvis fettsyror. Man vet också att många läkemedel binder till serumalbumin och på så sätt fördelas i kroppen via blodbanan. Man har också funnit att färgämnen kan binda till serumalbumin.

Interaktionen mellan albumin och färgämnen har utnyttjats som modell för interaktioner mellan makromolekyler och mindre molekyler - så även i denna laboration.

Kvantitativ behandling av ligandbindning

I biokemisk terminologi kallas en liten molekyl som binder till en makromolekyl för ligand till den stora molekylen.

Bindningsstyrkan mellan de två molekylerna uttrycks ofta som en jämviktskonstant, bildningskonstanten , Kf.

Om liganden betecknas med L och makromolekylen med M, kan komplexbildningen beskrivas med

L + M LM

Komplexkonstanten, Kf, är då helt enkelt lika med jämviktskonstanten för denna jämvikt:

[

]

[ ] [ ]

L M LM K_f ⋅ =

Ju högre Kf värde desto starkare är bindningen mellan ligand och makromolekyl. För att kunna bestämma Kf måste man då i princip kunna mäta koncentrationerna vid jämvikt av L, M och LM. Då dessa är svåra att mäta direkt måste man skriva om

2

För att kunna härleda ett sådant samband definierar vi följande:

[L] = jämviktskoncentrationen av fri (obunden) ligand

[M] = jämviktskoncentrationen av makromolekyl utan bunden L, eller koncentrationen av ickeockuperade bindningsställen

[LM] = jämviktskoncentrationen av ligand-makromolekylkomplex, eller koncentrationen av upptagna bindningsställen

[M]o = totalkoncentrationen av makromolekyl, eller totalkoncentrationen av tillgängliga bindningsställen

[L]o = ursprungskoncentrationen av ligand, eller sammanlagda koncentrationen av bunden och obunden ligand

ν = bråkdelen av makromolekylerna som bundit ligand = bråkdelen upptagna ligandbindningsställen dvs

[

]

[ ]

M ₀ LM = ν

Eftersom

[ ]

M ₀ =

[

LM

] [ ]

+ M , kan man skriva om detta uttryck till

[

]

[

LM

] [ ]

M LM + = ν Men

[

LM

]

=K_f ⋅

[ ] [ ]

L ⋅ M ⇒

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

L M M K M L K f f + ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ = ν Förenkling ger

[ ]

[ ]

+1 ⋅ ⋅ = L K L K f f ν

En graf av ν mot [L] ger därför en hyperbolisk mättnadskurva som närmar sig ett gränsvärde eller mättnadsvärde, där alla bindningsställen är upptagna. Eftersom det är svårt att avläsa ett exakt värde för mättnad används sällan denna typ av icke-linjär kurva för att bestämma Kf. Linjära samband är mer önskvärda så uttrycket konverteras därför

3

[ ]

1 1 1 1 + ⋅ = L K_f ν

Vi ska nu göra om slutekvationen ovan till en mer allmängiltig form där man tillåter flera olika bindningsställen på en och samma makromolekyl. Vi skall använda symbolen ν för att representera det genomsnittliga antalet bundna ligander per M-molekyl och n får betyda det möjliga totala antalet bindningsställen per M-molekyl.

Då blir ν /n bråkdelen upptagna ligandbindningsställen i detta fall. Om dessa är ekvivalenta så kan vi skriva om ekvationen till

Denna ekvation innehåller en term som ofta är svårbestämd, [L] - koncentrationen av fri ligand vid jämvikt, så man gör ofta om uttrycket till ett mer lättbestämt sådant.

Om ν är medelvärdet av antalet bundna ligander per M-molekyl, så är n - ν medelvärdet av antalet ickeockuperade bindningsställen per M-molekyl

[ ]

[ ]

+1 ⋅ ⋅ ⋅ − = − L K L K n n n f f ν

Om man förenklar detta får man

)

(

[ ]

)

(

[ ]

)

[ ]

(

n−ν ⋅ K_f ⋅ L +1 =n⋅ K_f ⋅ L +1 −n⋅K_f ⋅ L och

[ ]

+1 ⋅ = − L K n n f ν

För att förenkla ytterligare kan man låta termen

ν ν

−

n få betyda kvoten mellan ockuperade och ickeockuperade bindningsställen på M och då får man

[ ]

 ⋅

[ ]

+      n⋅K_f ⋅ L K_f L 1 ν

]

[

]

[

+1 ⋅ ⋅ ⋅ = L K L K n f f ν

4

[ ]

L K n−ν = f ⋅

ν

En mer önskvärd form för grafisk behandling är "Scatchard"-sambandet

[ ]

(

ν

)

ν − ⋅ =K n L f = Kf ⋅n−Kf⋅⋅ν = −Kf ⋅ν +Kf ⋅n

En s.k. Scatchard plot fås därför om man i ett diagram avsätter ν / [L] mot ν . Om man då finner en rät linje enligt figuren nedan, så tyder detta på att alla

bindningsställena är identiska och oberoende. Kf och n avläses som visas i figuren.

Figur1. Scatchardplotter.

Övre linjen representerar ligandbindningen till en makromolekyl med icke interagerande bindningsställen. Linjen har extrapolerats så att skärningarna med axlarna kan avläsas. Den undre, streckade kurvan visar ligandbindning till bindningsställen som interagerar. Den streckade upplöses till två räta linjer med olika lutningar som vardera kan evalueras för n och Kf,.

I härledningen av "Scatchardsambandet" antar man att Kf är identisk för alla

bindningsställen, dvs att bindning av en ligandmolekyl inte påverkar bindningen av de andra ligandmolekylerna då de binder till M. Emellertid är det mycket vanligt vid ligand-makromolekyl interaktioner med sådan påverkan. Bindningen av en L molekyl kan därför ofta antingen förenkla eller försvåra bindningen av nästa ligandmolekyl till M.

5

I figuren ovan illustreras ett sådant fall - att bindningen är kooperativ. Man får då ett ickelinjärt samband såsom visas av den streckade linjen i figuren nedan. Ur den streckade linjens förlopp kan man utläsa antalet typer av bindningsställen. I detta fall när den streckade linjen kan lösas upp i två räta linjer indikerar detta att två typer av

bindningsställen finns på M-molekylen. Antalet bindningsställen av vardera sorten (respektive n-värde) och de tillhörande bindningskonstanterna (respektive Kf värde) kan

uppskattas ur Scatchardplotten genom att extrapolera de två räta linjerna till axlarna, så som framgår av figuren.

Översikt av experimentet

I experimentet används serum albumin från nötkreatur och färgämnet fenolrött.

6

Albumin och fenolrött får bilda komplex vid ett antal olika molförhållanden. Då jämvikt uppnåtts i varje delförsök separeras snabbt komplexet bort från fritt färgämne genom en kort filtrering genom ett ultrafilter. Detta tillåter vatten, buffertsubstanser och fritt färgämne passera genom filtret men inte makromolekylen eller makromolekylen med bundet färgämne. Koncentrationen av fritt färgämne i filtratet kan sedan lätt bestämmas med spektrofotometern. Med kännedom om ursprungsmängderna av färgämne och protein kan man därför lätt räkna fram andelen bunden färg i de olika delförsöken - och därmed antalet färgämnesmolekyler per proteinmolekyl. Härur kan sedan n och Kf

bestämmas som beskrivs ovan.

Experiment

Kemikalier Fenolrött, vattenlösning 25 mg/20 ml, 3,5 . 10-3 M (FR) Bovint serumalbumin Acetatbuffert, O,60 M, pH = 4,0 Utrustning

Amicon Centriplus rör, cutoff 50 K Spektrofotometer

Halvmikro- och mikrokyvetter Centrifug

Utförande

A. Att bereda och koncentrationsbestämma en serumalbuminlösning, 40 mg/ml. Väg in 80 mg av serumalbuminet på vaxpapper med analysvågen. Överför pulvret till ett provrör och till sätt 2,0 ml MilliQ-vatten. Låt albuminet lösa sig. Skaka inte lösningen utan vagga den i provröret i stället - om du skakar skummar lösningen kraftigt.

Koncentrationsbestäm sedan lösningen i spektrofotometern vid 280 nm i halvmikrokyvett (kvarts) mot 0,06 M acetatbuffert som referens: Pipettera ned 1000 µl 0,06 M

acetatbuffert i kyvetten och sedan 50 µl av proteinlösningen. Vänd lösningen ett par gånger i kyvetten och avläs vid 280 nm.

Serumalbumin har ε280 = 4,0 . 104 M-1cm-1 . Beräkna koncentrationen av

serumalbuminlösningen i mol/dm3 utgående från detta värde och sedan i mg/ml ur detta värde och med kännedom om molmassan 66 000 g/mol för serumalbuminet. Detta bör ge svaret cirka 40 mg/ml.

B. Bestämning av ε430 för fenolröttlösning

Mät absorbansen för fenolröttlösningen på samma sätt med 0,06 M acetatbuffert som referens men nu vid 430 nm: Pipettera 1000 µl 0,06 M acetatbuffert ned i kyvetten och

7

därefter 15 µl fenolröttlösning. Vänd så det blandas ordentligt och avläs sedan A430.

Beräkna sedan ε430 för fenolrött med kännedom om att lösningen innehåller 25 mg/20 ml

och att molmassan för fenolrött är 354 g/mol. Du bör få värdet cirka 20 000 M-1cm-1. C. Jämviktsförsök

Gör nu i ordning en serie jämviktsförsök i 10 st provrör, 1 - 10:

Börja med att till varje rör sätta 150 µl av serumalbuminlösningen samt 300 µl av 0,20 M acetatbuffert pH=4,0.

Sätt därefter till fenolröttlösning till respektive rör enligt:

1: 300 µl 2: 200 µl 3: 100 µl 4: 75 µl

5: 50 µl 6: 25 µl 7: 15 µl 8: 10 µl

9: 5 µl 10: 3 µl

Komplettera i varje rör med MilliQ-vatten till volymen 1000 µl. Blanda varje rör försiktigt utan att låta det skumma. Låt inkuberas medan du fortsätter med försöken nedan.

För jämförelse prepareras 10 st andra rör, 11 - 20, enligt: Till varje rör pipetteras 300 µl 0,20 M acetatbuffert pH= 4,0. Pipettera sedan ned fenolröttlösning i rören enligt samma schema som för jämviktsrören ovan. Tillsätt sedan MilliQ-vatten i varje rör så att totalvolymerna blir 1000 µl. Blanda lösningarna.

D. Ultrafiltrering av jämviktsblandningarna

Skölj 10 stycken Centriplus-rör noggrant med MilliQ-vatten. Fyll därefter vatten ovan filtret och skölj filtren genom att centrifugera vatten under 5 minuter vid 5000 rpm. Töm därefter rören helt och torka dem torra. Torka membranfiltren genom att försiktigt pressa en Kleenex-sudd mot membranets ovansida och mot undersidan. Fyll därefter rören med varsin jämviktslösning och centrifugera vid 5000 rpm 5 minuter.

Filtraten som skall analyseras samlas i Centriplus-rörens underdel.

E. Mätning av absorbans vid 430 nm i rör 11 - 20 och i filtrat från rör 1 - 10

Flera av dessa lösningar har för hög absorbans för att man ska kunna mäta den direkt - de behöver spädas i 0,06 M acetatbuffert direkt i kyvetten. Vissa lösningar har tillräcklig volym för semimikrokyvett medan vissa kräver mikrokyvett. Förslag till kyvettstorlek och spädningar syns i nedan:

8 1: 100 µl → 1100 µl

2: 300 µl → 1000 µl 3 - 10: osp

Rörserie 11 - 20:

Samtliga mätningar i halvmikrokyvett med följande spädningari 0,05 M acetatbuffert. 11: 50 µl → 1050 µl 12: 100 µl → 1100 µl 13: 100 µl → 1100 µl 14: 200 µl → 1200 µl 15: 200 µl → 1200 µl 16: 500 µl → 1000 µl 17: osp 18: osp 19: osp 20: osp

9

Analys av mätdata

A. Beräkningar av

[ ]

L , ν och

_{[ ]}

L

ν

För varje jämviktsdelförsök görs nu med hjälp av dina data beräkningar av proteinmängd (mol) i röret, bråkdelen av färgämnet som bundit till protein, jämviktskoncentrationen av fritt färgämne [L] (mol/dm3) samt antalet färgämnesmolekyler som bundit per

proteinmolekyl, ν .

Dessutom skall för varje delförsök kvoten L

ν _beräknas.

Här följer ett exempel på hur beräkningarna kan se ut i rör 1:

Antag att du fått följande värden på A430 i rör 1 respektive rör 11: 0,5895 respektive

0,9916. Antag dessutom att du har fått serumalbuminkoncentrationen till 6,06 . 10-4M och att du erhållit ε430 = 19700 M-1cm-1 för fenolrött.

Skenbar absorbans3 från total mängd färgämne i röret: 0,9916 20,82 50

1050

=

⋅

Skenbar absorbans från fritt färgämne vid jämvikt: 0,5895 6,48 100

1100

= ⋅

Andel bundet färgämne: 0,689

82 , 20 48 , 6 82 , 20 = −

Vid jämvikt är koncentrationen fritt färgämne:

[ ]

3,29 10 4 19700 48 , 6 − ⋅ = = L mol/dm3

Mängden albuminbundet färgämne: 1 10 3 7,28 10 7

19700 82 , 20 689 , 0 − − ⋅ = ⋅ ⋅ ⋅ mol

Mängd serumalbumin i delförsöket: 150⋅10−6⋅6,06⋅10−4 =9,09⋅10−8mol

Antal bundna fenolröttmolekyler/albuminmolekyl: 8,01

10 09 , 9 10 28 , 7 8 7 = ⋅ ⋅ = ₋ − ν Man får då

[ ]

3,29 10 24300 01 , 8 4 = ⋅ = ₋ L ν .

10

B. Grafisk behandling: mättnadskurva och Scatchardplot

Avsätt i diagram ν som funktion av

[ ]

L så att en mättningskurva fås . Uppskatta ur figuren det maximala värdet på ν vid hög ligandkoncentration.

Gör ytterligare ett diagram där

_{[ ]}

L

ν _{avsätts som funktion av ν . Analysera kurvans}

förlopp i detta Scatchard diagram enligt beskrivningen bakgrunden ovan. Beräkna Kf- och

n-värden.

Efterarbete med membranfilterrören

Så snart alla mätningar har gjorts på filtraten kan rören rengöras. Skölj noga med MilliQ-vatten både inuti och utanpå rören. Centrifugera genom lite MilliQ-MilliQ-vatten för att rengöra filtren. Skölj därefter på nytt och fyll rören till sist med MilliQ-vatten innehållande 15-20 % (v/v) etanol. Sätt på locken och ställ därefter rören i kylskåp för förvaring.

Referenser

Boyer, R.F. Modern Experimental Biochemistry, 2nd ed.; Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. : Redwood City, CA, 1993; p 285

Boyer R.F. Modern Experimental Biochemistry, 3rd ed.; Benjamin/Cummings; San Francisco, CA, 2000; p 243

Silverstein, T. J. Chem. Ed. 81 (2004) 645

CENTRIPLUS® Concentrators Operating Manual, Publication I-430B; AMICON Inc., Beverly, MA, 1996