Exponering av Aflatoxin B1 i enhögriskpopulation för ventrikelcancer isydöstra Nicaragua

36 

Full text

(1)

Örebro universitet Läkarutbildningen Medicinkurs C Kandidatuppsats, 15 hp Örebro, Maj 2014

Exponering av Aflatoxin B

1

i en

högriskpopulation för ventrikelcancer i

sydöstra Nicaragua

Författare: Victor Holmberg

Handledare: Kaisa Thorell, doktorand vid avdelningen för mikrobiologi och

immunologi, Sahlgrenska Akademin, Göteborgs Universitet. Samuel Lundin, Prof. Avdelningen för mikrobiologi och immunologi, Sahlgrenska Akademin, Göteborgs Universitet

(2)

SAMMANFATTNING

BAKGRUND

Ventrikelcancer är den näst vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken globalt, med 700 000 dödsfall årligen. En klar koppling mellan H. pylori-infektion och ventrikelcancer finns. Dock utvecklar endast 2-3 % av H. pylori-infekterade personer ventrikelcancer, vilket tyder på att carcinogenesen är multifaktoreriell. Aflatoxin är en grupp mögelsvampgifter som bildas av mögelsvampar ur släktet Aspergillus, främst A. flavus, A. parasiticus och A. nominus. Toxinet intas oralt via ett flertal olika medier, varav kontaminerad majs och jordnötter är vanligast. AFB1 är klassad av IARC som en grupp 1 karcinogen, genom sin omvandling till AFB1-8,9-epoxid som binder och skadar DNA. Det finns en tydlig koppling mellan AFB1-exponering och hepatocellulärt carcinom. Uppsatsens frågeställning är hur hög aflatoxinexponering studiepopulationen i Nueva Guinea, Nicaragua, har? Studien är en pilot som ska undersöka om vidare studier ska inledas kring frågeställningen huruvida förhöjd aflatoxinexponering kan vara en faktor i ventrikelkarcinogenesen.

METOD

Serumprover togs från 68 studiedeltagare vid Hospital Jacinto Hernandes i Nueva Guinea, Nicaragua, och analyserades för aflatoxin-albumin addukter med ELISA. Två kontrollgrupper, en från Sverige och en från Managua, Nicaragua jämfördes med resultatet från studiepopulationen. Ett socioekonomiskt frågeformulär samt en fråga om majs-konsumtion fylldes i av studiedeltagare, alternativt studieledare.

RESULTAT

3 av 68 prover visade ett positivt utslag för aflatoxin i serum bland studiedeltagarna. Bland kontrollerna var antalet positiva prov 11 och åtta för gruppen från Sverige respektive Managua, Nicaragua. 82 % uppgav att de konsumerar majs en eller flera gånger per dag och av de tre positiva proven från Nueva Guinea tillhörde två prover denna grupp. För att säkerställa resultatet behövs fler analyser göras med positiva kontroller samt andra metoder säkerställa att enbart ELISA är en tillförlitlig metod vid analys av aflatoxin i serum.

(3)

FÖRKORTNINGAR

AFB Aflatoxin B (B = Blue)

AFG Aflatoxin G (G= green)

AFM Aflatoxin M (M = Milk)

HCC Hepatocellulär cancer

CYP Cytokrom P450-enzymer

AFQ Aflatoxin Q AFP Aflatoxin P GST Glutation-S-transferas DNA Deoxyribonukleinsyra GSH Glutation HBV Hepatit B virus IL Interleukin

TNF-α Tumor Necrosis Factor alpha

sIgA Salivary Immunoglobulin A

HPLC High-permorfance Liquid Chromatography

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

WHO Världshälsoorganisationen

IARC International Agency for Research on Cancer

CagA Cytotoxinassociated gene A

VacA Vacuolating cytotoxin A

BabA Bloodgroup antigen binding adhesin

FGA Fibrinogen alpha chain

FGB Fibrinogen beta chain

ROS Syreradikaler

RPM Varv per minut

TBS-T Tris-buffered Saline med Tween-20

HSA Humant serum-antigen

TBM Tetrametylbenzidin

(4)

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

1. BAKGRUND……… ……... 1

1.1 Aflatoxin……….. 1

1.1.1 Historik………. 1

1.1.2 Vad är och hur indelas subgrupper av aflatoxin?... 1

1.1.3 Aflatoxins metabolism………... 2

1.1.4 Tillväxtmiljö och välfärdskoppling………... 4

1.1.5 Koppling till sjukdom……… 5

1.1.6 Analysmetoder………... 7

1.2 Ventrikelcancer……… 7

1.2.1 Indelning………... 7

1.2.2 Global och nicaraguansk epidemiologi……… 8

1.2.3 Etiologi, patogenes och patofysiologi………... 8

1.2.4 Koppling mellan aflatoxinexponering och ventrikelcancer……….. 10

1.3 Hypotes och mål med denna studie………. 11

2. MATERIAL OCH METOD………... 11

2.1 Studiepopulation……….. 11

2.2 Frågeformulär och samtycke……… 12

2.3 Analys av serum………... 12

2.3.1 Val av metod... 12

2.3.2 Provinsamling och transport……… 12

2.3.3 ELISA-analys av prover……… 13

2.3.4 Statistisk analys………. 14

2.4 Etiska överväganden………...…. 14

3. RESULTAT……….. 15

3.1 Socioekonimiskt frågeformulär………... 15

3.2 Majskonsumtion inom studiepopulationen i Nueva Guinea……… 16

3.3 Serumanalys för aflatoxin med ELISA……… 17

4. DISKUSSION………... 18

4.1 Frågeställning………... 18

(5)

4.3 Analys av serum………... 19

4.4 Transport……….. 20

4.5 Frågeformuläret……… 20

4.6 Skördetid och klimat…….………... 21

4.7 Slutsats………. 22

5. TILLKÄNNAGIVANDE……… 23

6. REFERENSER………. 23 7. APPENDIX………... i-iv

(6)

1. BAKGRUND

1.1 Aflatoxin

1.1.1 Historik

Under sent 50-tal och tidigt 60-tal utbröt en världsvid, letal epidemi bland hönsfåglar, framför allt kalkoner[1]. I Storbritannien beskrevs epidemin som Turkey X disease, då mer än 100 000 kalkoner och annan boskap dog i akut levernekros, utan känd etiologi [1]. Vid närmre undersökning fann forskare att foder med jordnötsmjöl från Brasilien var den gemensamma faktorn för utbrottet i Storbritannien. Analys av fodret visade att det kontaminerats med mögelsvampen Aspergillus flavus och vidare analys gav upphov till upptäckten av dess toxin, som kom att kallas aflatoxin[2].

1.1.2 Vad är och hur indelas subgrupper av aflatoxin?

Aflatoxin, med dess metaboliter, är en grupp mycket toxiska substanser som bildas av svampar inom det allestädes närvarande mögelsvampsläktet Aspergillus[3]. Släktet Aspergillus består av cirka 250 arter varav flera producerar fördelaktiga metaboliter så som antibiotikum och kolesterolsänkande substanser[4]. Namnet, aflatoxin, härrör helt enkelt från Aspergillus flavus. Toxinet bildas även av andra arter inom släktet Aspergíllus, men främst av A. Flavus, A. Parasiticus och A. Nominus[5]. Aflatoxin delas idag upp i 14 undergrupper, varav 4 är fritt förekommande i naturen (AFB1, AFB2, AFG1 och AFG2). Indelningen av aflatoxin B och G kommer av dess starka flourescens i UV-ljus vid odling på silikonplattor utvecklade i kloroform-metanol. Varianterna inom gruppen G gav en gröngul flourescens, medan de i grupp B gav blå flourescens. Förutom AFB och AFG upptäckte Allcroft och Carnaghan under tidigt 60-tal ännu en variant av aflatoxin. De visade att ankungar erhöll akut leverskada, liknande den vid exponering av AFB1, efter intag av mjölk från kor som exponerats för aflatoxinkontaminerat foder. Vid analys fann de dock inget AFB1 i mjölken. Vidare analys av mjölken resulterade i en ny variant, som kom att kallas Aflatoxin M, efter milk [6,7]. Skillnaden mellan de olika varianterna är minimal på bindningsnivå, men stor i toxicitet där AFB1 är giftigast [8]. AFB1 är dessutom vanligast förekommande [8]. De sjukdomar som har en väl studerad korrelation till aflatoxin är akut leverskada [9] och cancerutveckling [10]. AFB1 och AFG1 är förenade med både hepatocellulärt karcinom (HCC) och akut aflatoxikos, medan AFM1 endast inducerar akut aflatoxikos.

(7)

AFB1 och AFG1 har en omättad bindning i position 8,9 av sin terminala furanring, vilket är orsaken till deras, jämfört med andra aflatoxiner, förhöjda carcinogena effekt [11].

1.1.3 Alfatoxins metabolism

Aflatoxin bildas via en komplicerad process i flera steg. Utgångsreaktionen är bildningen av hexansyra från acetat som i flera mellansteg omvandlas till sterigmatocystin och slutligen en av de fyra naturligt förekommande aflatoxinen [9]. För aflatoxin B1 sker sedan i kroppen omvandling till en mängd olika metaboliter, som uppvisar varierad toxicitet och carcinogen potens. De enzymer som katalyserar metabolismen är framför allt CYP3A4, men även CYP1A1, CYP2A6. Samtliga tillhör enzymgruppen cytokrom P450 [12,13]. Den vanligast förekommande omvandlingen är den av AFB1 till AFQ1, AFM1, AFP1 samt AFB2a, via hydroxylering [5]. Samtliga sägs vara detoxifieringsprodukter till AFB1, vilket dock inte utesluter att de är aktiva i viss mån. AFM1, AFP1 konjugeras med glukoronid för att på så vis kunna utsöndras med urinen[5]. Detta sker med hjälp av enzymer av gruppen Glutation-S-transferaser, varav GSTM1 är det viktigaste[13]. Den metabola väg med starkast koppling till sjukdom är omvandling av AFB1 till AFB1-8,9-epoxid under katalys av CYP 3A4 och, i mindre

Figur 1. Bilden visar bildning och bindning som ger aflatoxin B1 dess carcinogena effekt. Initialt genomgår

(8)

utsträckning, CYP 1A2 (Se figur 1) [13,14]. Beroende på vilken nomenklatur som används namnges ibland AFB1-8,9-epoxid istället AFB1-2,3-epoxid, men molekylen skiljer sig inte i struktur. AFB1-8,9-epoxid har både carcinogen och akut toxisk effekt[5,15]. Epoxiden bildas i två isomerer och det bör nämnas att det endast är AFB1 exo-8,9-epoxid som utövar skadlig effekt på människan. Förutom skillnad i skadeverkan är exo-epoxiden väldigt instabil, medan endo-epoxiden är ca 80 gånger stabilare. Karcinogenes induceras genom att exo-epoxiden binder DNA och bildar en aflatoxin-N7-guanin addukt (se figur 1). Detta sker till 98 %, trots exo-epoxidens instabilitet. Resultatet av adduktionen är depurination av guanin och instabilt DNA[13,15]. Detta verkar som en bidragande faktor i utlösandet av cancersjukdom. Epoxiderna har också proteinbindande förmåga, vilket gör dem direkt toxiska för cellerna [5].

Detoxifiering av AFB1 och dess metaboliter kan ske på flera sätt. Bland annat genom hydroxylering till exempelvis AFM1 som vidare konjugeras till glukoronid för att bilda en vattenlöslig utsöndringsprodukt. AFB1 exo-8,9-epoxid har en något annorlunda metabolism. Efter att epoxiden bildats finns två vägar att minska dess patogenicitet. Den ena är att via glutation, den antioxidant som under katalys av GST binder AFB1 exo-8,9-epoxid, så att komplexet kan utsöndras [5]. Den andra vägen är via hydrolys till dihydrodiol, vilket ger AFB1-8,9-dihydrodiol som sedan kan utsöndras. AFB1

-8,9-Figur 2. Översikt för potentiella metaboliter till AFB1. Blå text symboliserar utsöndringsprodukter. Röd text

symboliserar addukter där aflatoxin har skadande inverkan. Övrig text beskriver den mångfald av metaboliter som bildas ut aflatoxin B1. Figuren visar inte samtliga metabola steg.

(9)

dihydrodiol har viss förmåga att binda protein och därmed inducera akut cellskada, men är troligen mindre karcinogen än epoxiden [5]. Hos människan har studier visat att GSH, mer specifikt GSHM1, står bakom den huvudsakliga omvandlingen [13]. Det bör slutligen även nämnas att AFB2 och AFG2, som tillsammans med AFB1 och AFG1 tillhör de fyra fritt naturligt förekommande aflatoxinerna, inte har samma sjukdomsalstrande effekt. Detta beror troligen på att de saknar dubbelbindning i sin terminala furanring [5]. Figur 2 ger en översikt över de metaboliter som har sin utgångspunkt i AFB1, deras omvandling till utsöndringsprodukter samt förhållande till skadande inverkan genom adduktbildning.

1.1.4 Tillväxtmiljö och välfärdskoppling

Den huvudsakliga källan till aflatoxin, A. flavus, är en saprob och en av de vanligast förkommande mögelsvamparna. Eftersom A. flavus inte är värdspecifik så växer den i flera olika medier såsom djurfoder, bomull, jord, förvarade grödor, kadaver samt immunsupprimerade människor och djur [9,16]. Människan kommer främst i kontakt med aflatoxin via intag av jordnötter och majs [17]. A. flavus existerar i form av mycelium eller konidia, men kan under ofördelaktiga förhållanden omvandlas till så kallade sklerotia och på så vis överleva extrema förhållanden. I sklerotial form har dock svamparna nedsatt aflatoxinproduktion[18]. Vid fördelaktigare förhållanden återomvandlas därmed sklerotian till konidia och ökar sin produktion av aflatoxin [9]. A. flavus överlever, på grund av sin sklerotiala form, temperaturvariationer mellan 12 och 48 °C, men trivs bäst vid 28 till 37 °C. Vid optimal temperatur, fuktig miljö och insektsangrepp sprider sig sedan sporerna och svampen prolifererar [19].

Förutom att vara en hälsorisk, i och med dess produktion av aflatoxin, är den även en ekonomisk börda då mögelsvampen kontaminerar och förstör grödor både innan skörd och under förvaring[17]. Av dessa anledningar pågår idag aktiv forskning för att minska kontaminering innan skörd och under förvaring samt minska effekten av aflatoxin efter intag. Flera olika former av interventioner för att minska exponering har genomförts de senaste 20 åren. I Guinea beskriver Turner et al (2005) så kallade ”post-harvest interventions” där 20 byar observerades före och efter skörd. 10 byar genomgick interventioner i form av förbättrad förvaring av jordnötter, medan 10 kontrollbyar fortsatte likt tidigare. Interventionerna var exempelvis att rensa bort mögliga nötter, soltorka nötterna på fiberdukar istället för på bar mark och att förvara nötterna på lastpallar istället för direkt på marken. Interventionsbyarna minskade sin

(10)

exponering med ca 60 %, medan exponeringen i kontrollbyarna förblev oförändrad [19]. En annan metod att minska sjuklighet orsakad av aflatoxin är att binda aflatoxin till bärarmolekyler som tillsätts i djurfoder eller mat. Ett exempel som visats fungera väl är NovaSil, aluminiumsilikat förenat med natrium eller kalcium, som adsorberar aflatoxin och därmed gör aflatoxin biologiskt inaktivt i tarmen[20]. Utöver efterskördsinterventioner och aluminiumsilikat används idag klorofyllin, sulforafan och ditioletioner specifikt mot aflatoxins karcinogena effekter[15]. Det finns också studier som visat att polyfenoler från grönt te, inhiberar cancerutvecklingen hos försöksdjur [21].

Aflatoxinexponering är en välfärdsfråga. Inom EU, USA och länder tillhörande västvärlden finns tydliga reglementen över vilka exponeringshalter som tillåts i grödor, något flera u-länder inte kan upprätthålla. Från Europakommissionens slutrapport efter en revision under 2012 beslutades att export av jordnötter från Nicaragua till EU-länder, inte får överstiga 2 µg/kg gällande AFB1 eller 4 µg/kg gällande total aflatoxinmängd för jordnötter i direkt mänskligt bruk. Det finns idag ingen nationell aflatoxinkontroll i Nicaragua, men all gröda som skeppas till EU genomgår kontroll innan exporten genomförs[22]. De europeiska gränsvärdena bör jämföras med exponering i utvecklingsländer som vanligen överstiger 100 µg/kg gröda och har registrerats så högt som > 1000 µg/kg gröda[23].

1.1.5 Koppling till sjukdom

I enlighet med tidigare beskrivning är det alltså främst utvecklingsländer som drabbas av sjukdomar relaterade till aflatoxinexponering. Detta för att hantering av grödor är bristfällig, samt att fuktigt och varmt klimat bidrar till spridning och proliferation av mögelsvamp. Spännvidden av sjukdom går mellan aflatoxikos med akut leverpåverkan, nedsatt immunförsvar och primär HCC [5]. Dos och duration är de huvudsakliga faktorer vilka har inverkan på vilken sjukdom som uppstår. Översiktligt sett leder hög dos till akut leverskada och eventuell död, medan kronisk subletal dos ger påverkan på immunförsvaret. Samtliga doser och duration har ackumulerad effekt till cancerutveckling[24].

Redan 1976 beskrev Campbell of Stoloff vilken exponeringsmängd som krävdes för akut aflatoxikos. De fann att 1,7 ppm av AFB1 under en kortare tid gav upphov till allvarlig leverskada. En engångsdos på 75 µg/kg kunde vara direkt dödligt och att en daglig dos av 0,34 µg/kg inte hade någon skadlig effekt[25]. Vid ett utbrott i västra

(11)

Indien under oktober månad 1974, insjuknade totalt 397 personer, varav 106 dog. De gemensamma symtomen var ikterus, kräkningar och anorexi, följt av ascites. Den histopatologiska bilden post-mortem visade gallvägsproliferation och periduktal fibros. Källan till aflatoxikosen visade sig vara majs som i samband med en period av kraftiga regn möglat. De som insjuknat beräknades ha exponerats för nivåer kring 2-6 mg AFB1 dagligen under en månads tid[26].

Flera studier visar på en klar koppling mellan primär HCC och kronisk aflatoxikos. Framför allt har studier visat en linjär koppling mellan exponering och primär HCC i Afrika söder om Sahara, Indien och Sydostasien [5,27-30]. Kopplingen gäller framför allt AFB1 som klassas av International Agency for Research on Cancer (IARC) som en grupp 1 karcinogen. Som tidigare beskrivet omvandlas AFB1 till sin AFB1-8,9-epoxid av leverenzym tillhörande gruppen cytokrom P450. Epoxiden binder främst guaninrester på DNA och en addukt bildas. Den mekanism som tros stå bakom initiering av HCC är en G-T transversion i tredje basparet i kodon 249, tillhörande genen för p53[31,32]. Ännu en faktor som väger in i ekvationen till levercancer är kronisk hepatit B-infektion (se figur 3). 1979 konstaterade Lutwick att det kan finnas en koppling mellan AFB1, HBV-infektion och primär HCC. Teorin bygger på att AFB1 verkar synergistiskt med HBV genom att sänka kroppens cellmedierade försvar, vilket normalt motverkar HBV-infektion[33]. Det har nu uppskattats att enbart aflatoxikos ökar risken 3 gånger, enbart HBV-infektion ökar risken 7 gånger men att kombination av dessa ökar risken 60 gånger att insjukna i HCC[32].    

Att aflatoxin påverkar människans immunförsvar är klarlagt. Men i vilken utsträckning är ännu oklart. De flesta studier är gjorda på djur av olika slag och skillnaden i immunrespons för specifika doser och durationer har varit olika beroende på vilken art som studerats[24]. Av den anledningen är det är det svårt att säkerställa aflatoxins immunmodulerande effekt på människan. Men på djurmodeller råder konsensus i att AFB1 ger aplasi av thymus, minskar makrofagernas funktion, förhindrar komplementaktivering och inhiberar cell-medierad immunrespons[24]. De studier som genomförts på människor är epidemiologiska eller in vitro-studier. Det har konstaterats att monocyter redan vid extremt låga doser AFB1 tappar sin fagocytära och cytotoxiska förmåga. Redan vid låga doser minskar också frisättning av akuta cytokiner såsom IL-1, IL-6 och TNF-α. En studie av Turner et al 2002 visar att sex till nio-åringar i Gambia, bosatta i en miljö med kronisk aflatoxinexponering, hade sänkt koncentration av sIgA. Den bakomliggande mekanismen är inte klarlagd, men oavsett mekanism tros

(12)

minskningen vara en bidragande faktor till landets höga incidens av infektionssjukdomar[34]. Flera studier kring aflatoxins inverkan på vaccination har genomförts. Dock med varierat resultat. Majoriteten av studierna har visat koppling mellan aflatoxikos och sänkta immuniseringstitrar, men ännu finns ingen säkrad koppling[34-36].

1.1.6 Analysmetoder

Aflatoxin kan mätas i flera kroppsvätskor, såsom bröstmjölk, serum och urin[37]. Studier har visat god koppling mellan intag av aflatoxin och utsöndring av dess metaboliter i urinen[38,39]. Dock varierar resultaten vid upprepade mätningar. Detta speglar de utsöndrade metaboliternas korta t½. Av den anledningen är mätning av urin en bra metod på nytillkommen exponering över senaste dygn, men inte en tillförlitlig metod över flera dygn[24]. Sedan upptäckten att albumin bildar en stark addukt med aflatoxin, har metoder utvecklats för att mäta aflatoxinexponering via analys av serum [40]. Eftersom addukten är permanent fram till albumin bryts ner (albumins t ½ är ca 20 dagar), speglar denna metod exponering över någon till ett par månader och ger därmed möjlighet att undersöka kronisk exponering[37].

Idag används framför allt avancerad teknik såsom HPLC tillsammans med ELISA för att mäta serumhalter av aflatoxin-albumin addukten.

1.2 Ventrikelcancer

1.2.1 Indelning

Den vanligaste histologiska formen av ventrikelcancer är adenocarcinom (90 %). Vidare delas tumörerna in i diffus och intestinal typ. Den senare är både vanligare globalt och mer välstuderad avseende patogenes. Förloppet från frisk vävnad till invasiv cancer går via atrofisk gastrit, intestinal metaplasi och dysplasi [41,42]. Diffus ventrikelcancer växer vanligen intramuralt och är därmed mer svårdiagnosticerad jämfört med den intestinala typens exofytiska eller ulcererande tillväxt. Förutom adenocarcinom kan cancerutveckling inledas i Cajals celler och utvecklingen sker då intramuralt. Även maligna lymfom kan växa intramuralt och står för ca 5 % av cancerfallen[42].

(13)

1.2.2 Global och Nicaraguansk epidemiologi

Ventrikelcancer är den näst vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken globalt med ca 700 000 dödsfall årligen[41,43]. Tidigare har ventrikelcancer haft koppling till välfärdsländer, men studier visar ett epidemiologiskt skifte med sjunkande incidens i västvärlden samtidigt som incidensen stiger i utvecklingsländer. 1930 var ventrikelcancer den vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken i USA. Idag står den endast för ca 2,5 % av cancerrelaterad dödlighet i USA. Enligt WHO beräknas idag ca 70 % av alla fall drabba utvecklingsländerna[44]. Förbättrad hygien och matstandard samt minskad utbredning av kronisk infektion av H. pylori i befolkningen tros ligga bakom minskningen av sjukdomsfall i västvärden. Bakomliggande faktorer till ökad incidens i utvecklingsländerna tros vara ökad medellivslängd, att befolkningen antar dåliga kostvanor från väst samt att man på grund av hälsovårdsbrister upptäcker ventrikelcancer i sent stadie. I Sverige är prevalensen ca 25/100 000 invånare.

Nicaragua har ingen officiell cancerstatistik. De uppgifter som finns är uppskattade av WHO och bygger på statistik från angränsande länder. Ventrikelcancer uppskattas vara den tredje vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken bland kvinnor (efter bröst- och cervixcancer) och den näst vanligaste cancerrelaterade dödsorsaken bland män (efter prostatacancer). Eftersom socioekonomi verkar vara en viktig faktor i nuvarande globala incidens, torde även ventrikelcancer i Nicaragua drabba den ekonomiskt utsatta befolkningen hårdare än höginkomsttagarna. Detta bekräftas av Dr. Sergio Lopez, onkologikirurg med inriktning på ventrikelcancer och HCC i Nicaragua. Dr. Lopez uppskattar att incidensen är högre i distriktet Chontales än i Managua.

1.2.3 Etiologi, Patogenes och Patofysiologi

Ventrikelcancer anses tillhöra de så kallade infektionsrelaterade cancerformerna, tillsammans med cervix- och levercancer. En fastställt koppling till kronisk infektion med H. pylori föreligger. Eftersom ca 50 % av världsbefolkningen beräknas vara kroniskt infekterad och endast 1-3 % beräknas utveckla ventrikelcancer under sin livstid, är även denna cancerform, likt andra, multifaktoriell. Dock föreligger en 12 gånger ökad risk för ventrikelcancer vid infektion med H. pylori (Samuel Lundin, personlig kommunikation). H. pylori är en gramnegativ spiroket med populationsmässigt stor genetisk diversitet. Bakterien klassas som en klass 1 carcinogen av IARC. Även inom en och samma individ varierar H. Pylori, vilket försvårar kartläggning och förståelsen för dess patogenicitet. De virulensfaktorer som

(14)

dock är likvärdiga bland många stammar är CagA, VacA och BabA. CagA injiceras via typ IV sekretionssystem från bakterien. Via aktivering av intracellulära kaskader kopplade till Ras-ERK-systemet induceras inflammation, infiltration av neutrofiler samt karcinogenes[41]. VacA är ett cytotoxin som vacuoliserar epitelcellerna samt stör dess mitokondriella funktion[46]. BabA är en adhesin som binder LewisB/ABO-blodgruppsantigen på magsäckslemhinnan[47]. Förutom dessa är bakterien försedd med ureas för att motverka destruktionskraften i magsaftens låga pH samt flageller som för dem i riktning mot slemhinnan. Det har visat sig att eradikering av H. pylori i vissa populationer minskat incidensen av utvecklad ventrikelcancer. Dock har det också påvisats att eradikeringen har tveksam effekt i senare skeden av karcinogenesen[41]. Det verkar som att H. pylori inleder ventrikelkarcinogenesen, medan andra faktorer spelar större roll i det senare skedet. Dessa upptäckter har lett till frågan om var en eventuell point of no return skulle ligga utvecklingsmässigt. Studier visar att all preneoplastisk förändring ökar risken till insjuknande, men om det finns en exakt utvecklingspunkt och var denna är placerad i patogenesen är ännu inte klarlagt[41].

Som tidigare nämnt är patogenesen komplex och ännu inte fullständigt känd. Men gällande intestinal typ inleds patogenesen med atrofisk gastrit. Atrofin som framför allt sker i corpus leder till minskad produktion av HCl. Under denna fas har hos vissa individer ett minskat uttryck av FGA och FGB konstaterats, vilket innebär minskad firbrinogenproduktion och eventuellt till försämrad möjlighet att bilda skyddande fibrinpluggar vid ytlig slemhinneskada (Samuel Lundin, personlig kommunikation). Corpus byter så småningom skepnad i den så kallade antralisationen för att efterliknar antrum. Andra steget i cancerutvecklingen är intestinal metaplasi där epitelet byts ut mot tarmliknande epitel. Ett multifaktoriellt slutskede med mutationer, inflammation, frisättning av ROS från neutrofiler leder till dysplasi och slutligen invasiv cancer (Samuel Lundin, personlig kommunikation).

I 50 % av fallen har tumören metastaserat vid diagnos och av den anledningen är den generella 5 årsöverlevnaden 30 %. Tidiga symtom är dyspepsi, dysfagi och illamående, men ofrivillig viktnedgång och andra symtom associerade med avancerad cancer är vanligen de första symtomen som patienten söker vård för[42]. Avancerad cancer med spridning har en 1 årsöverlevnad på cirka 20 %. Vid tidig upptäckt, så kallad early gastric cancer, är dock 5 årsöverlevnaden 90 %[42]. Eftersom tidsfaktorn spelar stor roll i överlevnaden, söker forskare efter tidiga markörer och riskfaktorer för

(15)

att utveckla screening-program i högriskområden och därmed bota cancersjuka i tidigt stadie. Spridning sker framför allt lymfogent till lymfkörtelstationer kring ventrikeln och vidare till blodbanan via ductus thoracicus. Hematogen spridning sker via portablodet till lever, lungor och skelett. Direkt överväxt på kolon, pankreas och lever är inte ovanligt och i värsta fall kan cellkolonier metastasera fritt i bukhålan [48].

1.2.4 Koppling mellan aflatoxinexponering och ventrikelcancer.

Ventrikelcancer har likt många andra cancerformer en multifaktoriell etiologi och patogenes. Kopplingar mellan aflatoxins carcinogena och H. pyloris inflammation-inducerande effekt tros finnas. Den huvudsakliga aktivatorn av aflatoxin till AFB1 -8,9-epoxid är enzymet CYP3A4. Studier har visat att denna är uppreglerad ca 1200 gånger i magsäcksvävnad med intestinal metaplasi[49,50]. Ett annat mycket viktigt enzym i reglering och detoxifiering av aflatoxin är GSTM1. Genenuttrycket för GSTM1 har betydande variation i uttryck hos människan i vissa studier har så mycket som 50 % av populationen inget mRNA för GSTM1 över huvud taget (Samuel Lundin, personlig kommunikation).

En av hypoteserna kring aflatoxikos och ventrikelcancer är att H. pylori, i karcinogenesens inledning, skadar slemhinnan. Hos en individ där uttrycket för bl.a. CYP3A4 är uppreglerat, samtidigt som uttrycket av GSTM1 är nedreglerat alternativt helt frånvarande, kan en miljö bildas som tillåter aflatoxins karcinogena metaboliter att omvandla intestinal metaplasi till invasiv cancer (Samuel Lundin, personlig kommunikation).

Fram till idag finns endast en publicerad studie (Eom et al, 2013) som behandlar kopplingen mellan ventrikelcancer och hög exponering av aflatoxin hos människa. Gruppen jämförde, via frågeformulär över kostvanor, 477 ventrikelcancerpatienter i Korea med 477 friska kontroller. Slutsatsen som drogs var att patienter med ventrikelcancer hade ett högre uppskattat intag av aflatoxin[12], vilket skulle kunna vara en bidragande orsak i ventrikelkarcinogenesen. På mongolisk ökenråtta har Ma et al[51] samt Kusunoki et al[52] konstaterat att sterigmatocystin (en föregångare i aflatoxinsyntesen) bidrar till intestinal metaplasi i ventrikelslemhinnan.

(16)

1.3 Hypotes och mål med denna studie

Nicaragua är ett av de länder i världen som har högst uppskattad incidens av ventrikelcancer. Landet tillhör dessutom ett högendemiskt område för kronisk infektion med H. pylori. Aflatoxinexponeringen tros vara hög på landsbygden och skulle därmed kunna vara en bidragande faktor i utvecklingen av ventrikelcancer. Målet med denna studie är att jämföra nivåerna av aflatoxin i serum hos en högriskpopulation för ventrikelcancer i distriktet Chontales, med tidigare tagna serumprover från Managua samt från Sverige. Syftet är att genomföra en pilotstudie för att undersöka om aflatoxinexponering skulle kunna vara en intressant faktor att studera vidare. Om serumnivåerna av aflatoxin från populationen i Chontales är förhöjda talar detta för att aflatoxin kan vara en bidragande faktor i utvecklingen av ventrikelcancer. Eftersom relativt enkla åtgärder i hantering av grödor skulle kunna genomföras för att minska tillväxten av aflatoxin, skulle detta resultat framöver kunna bidra till minskad sjuklighet i området, men också globalt.

2. METOD OCH MATERIAL

2.1 Studiepopulation

Helblod togs från 68 personer som befann sig på Hospital Jacinto Hernandez, Nueva Guinea, i regionen Chontales i sydöstra Nicaragua. Populationen bestod av patienter vid planerat mottagningsbesök, anhöriga till patienter samt sjukhuspersonal. Åldersspannet på studiedeltagarna var mellan 15 och 74 år. Fördelningen mellan kvinnor och män var ungefär 4:1 (exakt 55:13). I samband med provtagningen ställdes frågan ”Hur ofta konsumerar du måltider innehållande majs”, med följande svarsalternativ: 1) Mer sällan än, eller en gång per vecka, 2) två till sex gånger per vecka, 3) en eller flera gånger per dag.

(17)

2.2 Frågeformulär och samtycke

Frågeformulär rörande socioekonomisk status (bilaga 1) samt samtycke till studien (bilaga 2) fylldes i av studiedeltagarna i mån av skriv- och läskunnighet, alternativt av testledare i samband med provtagningen.

2.3 Analys av serum

2.3.1 Val av metod

I studien valdes att analysera serum. Detta av två anledningar. Det alternativ som kunde övervägas var urin, då det varit mindre invasivt än venprov. Eftersom insamlingen av prover genomfördes i Nicaragua och sedan analyserades i Göteborg, innebar frakten en fördröjning mellan provtagning och analys. Fördröjningen hade inneburit ett osäkert resultat eftersom aflatoxinhalten i urin endast speglar exponering över närmst föregående dagar. Det andra skälet till att välja serum var att långtidsexponering skulle undersökas.

Eftersom kandidatarbetets tidsram samt tillgång till utrustning begränsade möjligheten att använda HPLC, använde vi oss av en metod som enbart bygger på ELISA (se figur 3). Analysen bygger på en tidigare metod för att mäta addukter av albumin och polycykliska kolväten, utvecklad av Chang et al[53]. Inga kommersiella kit fanns tillgängliga för analys av aflatoxin-albuminaddukter i serum, varför Prof. Lundin, inspirerad av Chang et al, sammanfogade den metod som beskrivs nedan.

2.3.2 Provinsamling och transport

Via venprov samlades 9 ml helblod i Serum Clot Activator Vacuette-rör (Greiner Bio-One, Österrike). Serumrören stod i rumstemperatur i 30-60 minuter, varefter de förvarades i kylbox med is i 8-11 timmar under transport till laboratoriet på Hospital Salud Integral i Managua. I Managua centrifugerades serumrören i 1500 RPM under 10 minuter. Därefter aliquoterdades serum från Vacuetterören till eppendorffrör (ca 0,5-1 ml/rör) varefter rören frystes till -63°C, i väntan på transport till Sverige. Proverna packades i påsar omgärdade av frusna gelpacks och skickades via flygfrakt till institutionen för immunologi och mikrobiologi vid Sahlgrenska Akademin, Göteborgs Universitet, för vidare analys.

(18)

2.3.3 ELISA-analys av prover

Halten aflatoxin i serum mättes med ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Nunc 96F (flatbottnade 96-hålsplattor, Thermo Scientific, Roskilde, Danmark) coatades med 1 µg/ml Rabbit-X-Mouse IgG-FC (Bethyl Laboratories, Montgomery, Texas) utspätt i 0,1 M karbonatbuffert. Plattorna förvarades över natten i 4°C. Dagen efter användes Superblock blocking buffer (Thermo Scientific, Roskilde, Danmark) för att blockera fria ytor i brunnarna, med efterföljande inkubation på en timma. Därefter tvättades brunnarna fyra gånger med 100 µl TBS-T TBS-T (Trisbuffrad saltlösning med 0,05% Tween-20). Till vardera brunn tillsattes 50 µl monoklonal Anti-aflatoxin B1-antikropp från mus (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri). Denna fungerar som länk mellan coatingantikroppen och aflatoxin. En timmas inkubation i rumstemperatur och 4 x 100 µl tvätt i TBS-T följde tillsatsen. Från varje studiedeltagare, tillsattes serum utspätt till 1:4 med TBS-T till vardera tre brunnar. Utöver proverna från studiedeltagare i Nueva Guinea användes som kontroller, 23 prover från dyspepsipatienter vid Sahlgrenska sjukhuset mellan 2006 och 2008[54], samt 39 prover från 2010, tagna i Managua för en studie på Helicobacter pylori och dess inverkan på ventrikelkarcinogenesen[55]. Plattorna inkuberades en timma i rumstemperatur, varefter brunnarna återigen tvättades med 4 x 100 µl TBS-T. 50 µl Anti-HSA med biotin (1 µg/ml, Rockland antibodies and assays, Gilbertsville, Pennsylvania) tillsattes till vardera brunn, då Anti-HSA binder albumin och biotin bildar en mycket stabil bindning med Avidin. Plattorna inkuberades en timma i rumstemperatur och tvättades åter igen i 4 x 100 µl TBS-T per brunn. 50 µl Avidin-Biotin Complex reagens (Thermo Scientific, Roskilde, Danmark) tillsattes i varje brunn. Komplexet består av Avidin och peroxidas. Plattorna inkuberades i 30 minuter i rumstemperatur och tvättades med 4 x 100 µl TBS-T per brunn. 50 µl TMB-lösning innehållande TMB-buffert, Tetrametylbenzidin (Sigma Aldrich, St. Louis Missouri) samt H2O2 tillsattes i varje brunn. TMB fungerar som vätedonator i omvandlingen av H2O2 till vatten. I samband med reaktionen katalyserad av peroxidas sker en färgomvandling i brunnarna från transparent till blått. Slutligen tillsattes 12,5 µl 1M svavelsyra i varje brunn för att terminera ovanstående process. I figur 3 presenteras en schematisk bild över metodens byggstenar. Beroende på hur mycket aflatoxin studiedeltagaren hade i sitt serum, gav färgomvandlingen olika svar. Genom spektrofotometri vid 450 nm (Biotek ELx800), mättes mängden färgomvandling i proverna som därmed angav relativa halter av aflatoxin i proverna. Ingen positiv

(19)

serumkontroll fanns att tillgå, varför en standardkurva inte kunde upprättas. Av den anledningen blev resultatet relativa värden inom studiepopulationen.

2.3.4 Statistisk analys

För att säkerställa inom hur många SD 95 % de negativa kontrollerna befann sig användes Chebyshev’s teorem. Utifrån antal standardavvikelser beräknades sedan det gränsvärde för vilka prover som kunde antas vara positiva. De prover som var över gränsvärdet för 4,47 SD ansågs vara tillförlitliga i resultatet.

Grafer som producerats i studien är gjorda i Prism 6 (GraphPad Software Inc.) och Microsoft Excel (Microsoft Corporation).

2.4 Etiska överväganden

Insamling av helblod till denna studie är godkänd av regionala etikprövningsnämnden i Göteborg(diarienummer T290-14).

Figur 3. Till de 96 brunnarna tillsattes först Mouse-x-Rabbit IgG för coating. Efter blockad av brunnsytan (steg

illustreras ej i figuren) tillsattes en Anti-aflatoxin B1-Ak som vid efterföljande tillsats av serum band upp

eventuellt aflatoxin-albumin-addukter. För att binda addukterna tillsattes sedan Anti humant serum antigen sammankopplat med biotin. Biotin binder sedan avidin i Avidin-Biotin Complex. Till ABC är peroxidas kopplat som vid tillsats av en lösning med TMB och H2O2, katalyserar omvandling av TMB, vilket leder till ett färgskifte

(20)

3. RESULTAT

3.1 Socioekonomiskt frågeformulär  

Utifrån det frågeformulär (bilaga 1) som studiedeltagarna fyllde i, i samband med provtagning, har följande socioekonomisk profil sammanställts (se figur 4). Bland de

68 studiedeltagarna fann vi att strax under en tredjedel levde i ett hem med jordgolv. 57 % hade inga glasfönster och nästan 40 % hade icke-konstruerade håligheter i väggarna på sin bostad. Ungefär halva studiepopulationen lagade inte sin mat på elspis, medan ingen uppgav att de hade skorsten i bostaden. 31 % svarade att de åt grönsaker dagligen. 82 % angav att de hade diskbänk och nästan hälften att de inte hade kylskåp. 82 % hade tillgång till elektricitet och cirka två av tre hade toalett. Majoriteten hade tillgång till rent vatten, men 13 % uppgav att de inte hade det.

Figur 4. Diagram som beskriver den procentuella fördelningen mellan svaren ja, nej samt de som ej svarat, på

de 11 socioekonomiska faktorer som efterfrågats i samband med studien.

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Socioekonomiska faktorer

Ej svarat Nej Ja

(21)

3.2 Konsumtion av majs inom studiepopulationen i Nueva Guinea

På frågan om konsumtion av majs svarade majoriteten (82 %) att de äter majs en gång eller flera per dag. 6 % svarade att de äter majs 2-6 gånger per vecka och 1,5 % att de äter majs färre än eller en gång i veckan. 10,5 % svarade inte på frågan. Figur 5 beskriver förhållandena mellan konsumtionsgrupperna i studiepopulationen.

0   10   20   30   40   50   60  

<1 gång/vecka 1 gång/vecka 1 eller flera

gånger/dag inget svar A n tal in d ivi d er

Majskonsumption

Figur 5. I samband med provtagningen ställdes frågan om studiedeltagarnas konsumtion av majs. 82 %

uppgav att de åt majs en eller flera gånger per dag. 10,5 % svarade inte på frågan. 6 % angav att de äter majs två till sex gånger per vecka och 1,5 % en eller mer sällan än en gång i veckan.

Figur 6. Figuren visar sambandet mellan den relativa halten av aflatoxin i serum och majskonsumtion inom

studiepopulationen. Av de tre värden som överstiger vårt beräknade gränsvärde för sant positiva prover tillhör två (lila trianglar) gruppen som konsumerar majs en eller flera gånger per dag.

(22)

I figur 6 beskrivs relationen mellan var studiedeltagares relativa aflatoxinhalt i serum och hur ofta han eller hon konsumerar majs. Två av de tre värden som beräknats vara över gränsvärdet för ett positivt resultat, konsumerade majs en eller flera gånger per dag. Den tredje personen ovan gränsvärdet uppgav inte sin majs-konsumtion. Av de två värden precis under gränsvärdet för positivt resultat, anger en studiedeltagare sin konsumtion av majs till två till 6 gånger i veckan och en studiedeltagare en eller flera gånger per dag. Den studiedeltagare som angett att han eller hon äter majs färre än eller 1 gång per vecka är bland de tio prov med lägst aflatoxinhalt.

3.3 Serumanalys för aflatoxin med ELISA

Beräkning av gränsvärdet för positiva resultat med hjälp av Chebyshev’s teorem gav ett gränsvärde på 0,484. Samtliga värden under denna gräns kan inte antas vara skiljbara från negativ bakgrund och räknas därmed som negativa. Figur 8 illustrerar studiedeltagarnas och kontrollgruppernas relativa aflatoxinhalt i serum. Efter gränsvärdet beräknades att tre av 68 prover från Nueva Guinea var positiva. Proverna

Figur 7. Figuren beskriver den relativa koncentrationen av aflatoxin i serumprover från studiepopulationen i

Nueva Guinea, samt två kontrollgrupper från Sverige och Managua. I studiepopulationen beräknas tre värden vara sant positiva, två vara angränsande till positiva men beräknat negativa samt 63 negativa. Kontrollgrupperna har högre median än studiepopulationen. I kontrollgrupperna beräknas 11 (Sverige) respektive åtta (Managua) prover vara positiva.

(23)

uppdelade sig på ett sådant vis att det kan urskiljas tre grupper, varav det serumprov med högst aflatoxinhalt bildar en egen grupp med ett värde av 0,851. Fyra prover placerar sig i gränslandet, varav två är positiva (0,511 och 0,539) och två inte med säkerhet kan antas vara positiva (0,461 och 0,456). Övriga prover (63 stycken) bildar en grupp som placerar sig klart under gränsvärdet.

Gällande kontrollgruppen från Sverige beräknas 12 prover vara negativa och 11 prover positiva. Allra högst värde bland samtliga prover får två prover i kontrollgruppen från Managua. (0,953 och 0,923). I denna grupp befinner sig 8 prover över gränsvärdet och 31 prover under gränsvärdet.

Bland de tre studiepopulationerna har gruppen från Sverige högst medianvärde, följt av gruppen från Managua. Lägst medianvärde har gruppen från Nueva Guinea.

4. DISKUSSION

4.1 Frågeställning

Syftet med denna studie har varit att undersöka alfatoxinhalten i serum hos en högriskpopulation för ventrikelcancer i Nicaragua. Detta då högt intag av aflatoxinkontaminerade produkter eventuellt kan vara en bidragande orsak till utvecklingen av ventrikelcancer. Resultatet av serumanalysen visade att tre studiedeltagare troligen hade mätbara mängder aflatoxin i blodet, vilket tyder på att populationen lever i en miljö där de kan exponeras för aflatoxin. Vad som dock är intressant är att kontrollgrupperna från Sverige och Managua, som förväntades ha väldigt låg respektive lägre halt av aflatoxin i serum än studiegruppen från Nueva Guinea, istället hade högre serumnivåer av aflatoxin.

4.2 Populationsurval

Urvalet av studiepopulationen är bristfällig av flera anledningar. Med anledning av svårigheter i förberedande kommunikation med handledare i Nicaragua, hade vi ingen möjlighet att i förväg strukturera upp en ordnad studiepopulation. De brister jag funnit som möjligen skulle kunna påverkat vårt resultat är följande. Proverna togs på ett sjukhus. Avsikten var att studera friska personer och att exkludera personer som diagnosticerats med ventrikelcancer. Eftersom diagnosen vanligen ges sent i förloppet,

(24)

går det inte att helt utesluta att studiepopulationen innehåller personer med ventrikelcancer. Det går heller inte att utesluta att personerna var sjuka i någon annan sjukdom som skulle kunna påverka resultatet. Gällande könsfördelning vore önskvärt med en balanserad population. I denna studie var det inte möjligt, då vi hade tidsbrist och fick nöja oss med de personer som var närvarande vid tidpunkten. Åldersfördelningen är inte heller jämnt fördelad. Detta av samma anledning som könsfördelningen.

4.3 Analys av serum

Vårt resultat var inte som förväntat. Rimligen bör serumhalten av aflatoxin vara högre i Nueva Guinea än i Sverige. Detta då exponering framför allt sker via medium såsom majs och jordnötter, vilka är baslivsmedel i Nueva Guinea och inte i Sverige samt att import av dessa varor till EU är hårt reglerat med avseende på aflatoxinhalt. Kopplingen till socioekonomiska förhållanden som jordgolv och kylskåp bör även det medföra en högre exponering i Nueva Guinea än i Sverige. Klimatet bör också vara en faktor som gett högre exponering i Nueva Guinea än i Sverige.

Med nuvarande resultat, utan misstankar om felkällor, är det inte möjligt att utesluta att 3 positiva prov är ett sanningsenligt resultat för populationen i Nueva Guinea. Eftersom det inte, mig veterligen, har gjorts mer än en studie på kopplingen mellan aflatoxinexponering och magsäckscancer på människa[12], är inte sambandet säkerställt. Därmed skulle den höga incidensen av ventrikelcancer i Nicaragua kunna vara helt frånkopplad från aflatoxinexponering.

Möjliga felkällor i analysen av provet är många och därmed behöver metoden förfinas med upprepade analyser. Metoden skulle även behöva matchas med resultat från andra metoder, för att säkerställa att resultaten inte är beroende av metodval, utan jämförbara oavsett vilken metod som används. En möjlig felkälla i metoden är den bakgrundsstörning som syns i de negativa kontrollerna. Orsakerna till denna felkälla skulle kunna vara flera på grund av att metoden är under utveckling, till exempel att Anti-aflatoxin-antikroppen inte är specifik nog för aflatoxin, utan också binder albumin till viss del. Därmed skulle andra faktorer än halten aflatoxin i serum, såsom mutationer i albumin, kunna vara orsaken till det positiva resultatet. På grund av att ett kommersiellt metod-kit inte fanns tillgänglig, hade vi ingen standardkurva att förhålla

(25)

oss till. Vid upprepade tester av ovan beskriven metod, bör en positiv kontroll finnas med. Detta skulle medföra att absoluta värden kan beräknas.

Det är rimligt att ställa frågan om huruvida kontrollproverna från Managua och Sverige är en felande länk i jämförelsen med prover från Nueva Guinea. Möjliga parametrar skulle kunna vara upprepade temperaturskiftningar från fruset till flytande tillstånd vid användning av proverna i andra studier. En annan möjlig orsak är det faktum att proverna från Managua och Sverige är fyra till åtta år gamla. I en studie av Scholl et al bekräftas dock att aflatoxin-albumin addukten är stabil under minst 20 år i -80 °C förvaring[56]. Jag har inte kunnat hitta någon studie som undersöker eventuella förändringar i addukten vid upprepade temperaturväxlingar.

4.4 Transport

Beslutet att undersöka en population på landsbygden togs då incidensen av ventrikelcancer uppskattas vara högre på landsbygden än i Managua. En möjlig felkälla i resultatet skulle därmed kunna vara att vi inte lyckats behålla provernas kvalitet under transporten mellan Nueva Guinea och Managua. Under provtagningen fanns inte möjlighet att organisera så att samtliga prover förvarades lika lång tid i rumstemperatur innan de kyldes i kylväska.

Enligt Clark et al kan inte albumins sanna koncentration säkerställas för prover där serum varit i kontakt med koagel i mer än 6 timmar. Tiden mellan första provtagning i Nueva Guinea till första aliquotering var ca 11 timmar.

Gällande temperaturskiftningar har temperaturen kring proverna varierat vid flera tillfällen. Vid minst tre tillfällen har proverna tinats från fruset till flytande tillstånd.

4.5 Frågeformuläret

Eftersom incidenstrenden för ventrikelcancer är ökande i utvecklingsländer och minskande i västvärlden, är socioekonomisk status en intressant parameter att ta hänsyn till i denna studie. Av de 11 frågor kring levnadsstandard vi ställde, är framför allt frågan om jordgolv och kylskåp intressanta med avseende på aflatoxinexponering. Utomhustemperaturen i Nueva Guinea under februari till maj är i genomsnitt på 28 °C, vilket är inom A. flavus preferensområde för tillväxt och bildning av aflatoxin. Att förvara sin mat i kylskåp (8 °C) minskar därmed risken för tillväxt av mögelsvampen och bör leda till minskad exponering. 28 personer (41 %) i studiepopulationen anger

(26)

att de inte har kylskåp. Att 19 personer (28 %) har jordgolv i hemmet bör rimligen innebära en ökad risk till förhöjd exponering eftersom jord är ett av de medium A. flavus växer i.

Även i frågeformuläret finns utrymme till förbättring. I efterhand insåg vi att vi bör ha använt alternativfrågor istället för ja/nej-frågor rörande socioekonomiska parametrar. Språkliga och kulturella skillnader mellan Nicaragua och Sverige, gjorde att våra frågor ibland var för enfaldiga. Som exempel finns på spanska flera ord för vatten: vatten från flod, vatten köpt på flaska, vatten från brunn och kommunalt kranvatten. En variation i vad som uppfattas som rent kan ha gjort att resultatet inte överensstämmer med vår definition av rent vatten.

För att kunna hitta ett eventuellt samband mellan aflatoxin-halten i proverna och konsumtion av majs, sammanställde vi två grafer. En för att jämföra studiedeltagarnas svar på frågan om konsumtion av majs (se figur 5). Hela 82 % angav att de åt maträtter innehållande majs en eller flera gånger per dag. Eftersom majs, tillsammans med jordnötter, är det vanligaste livsmedel associerade med aflatoxin-intag, och att klimatet i och omkring Nueva Guinea generellt är fördelaktigt för A. flavus, bör exponeringen vara hög. Den andra grafen beskriver aflatoxinhalten i studiedeltagarnas blod kopplat till hur ofta de konsumerar majs (se figur 6). Trots att vårt gränsvärde tvingades ligga högt över majoriteten av provernas värde, kan en blyg trend anas i att hög exponering relaterar till en hög koncentration av aflatoxin i serum.

4.6 Skördetid och klimat

Skördetiden för majs i Nicaragua är huvudsakligen i augusti och september, med två mindre skördar kring november respektive mars. Eftersom albumin har t ½ på ca 20 dagar, innebär det att våra resultat speglar exponeringen kring mars och april månad. En möjlighet till vårt låga resultat skulle kunna vara att studiedeltagarna då konsumerat färsk majs istället för lagrad, där A. flavus ännu inte hunnit proliferera och bilda aflatoxin i större mängd. En annan möjlig förklaring till vårt resultat skulle kunna vara det relativt torra klimatet under mars och april. Vi vet, från tidigare rapporter, att aflatoxin produceras i högre mängd under nedbördrika månader. Exempelvis var det utbrott i Indien 1974, som tidigare beskrivits, i direkt anslutning till en kraftig regnperiod. Nicaragua går in i regnperioden från och med maj månad. En provinsamling i juli och augusti, kanske skulle ge fler prover med hög aflatoxinhalt.

(27)

4.7 Slutsats

I jakten på att utveckla ett kostnadseffektivt screening-program för upptäckt av tidig ventrikelcancer behövs enkla metoder att upptäcka riskfaktorer. Om det i fler framtida studier visar sig att aflatoxin har en klar koppling till ventrikelcancer, skulle urval av högriskpopulationer till screening underlättas och därmed fler tidiga fall upptäckas. Eftersom en tidig diagnos ger goda förutsättningar att bota insjuknade patienter, bör arbetet med att hitta tidiga markörer och utveckling av kostnadseffektiva screening-program fortsätta.

Slutsatsen av denna studie är att:

• Studiedeltagarnas svar på frågan om majs-konsumtion tyder på att det finns en betydande risk till ett högt intag av aflatoxin. Detta medan endast 3 av 68 prover hamnar över gränsvärdet för positiva värden.

• Metoden behöver upprepas med samma prover, för att säkerställa huruvida de värden vi hittills fått fram är sanningsenliga eller inte. I samband med framtida analyser bör en positiv kontroll finnas med, för att kunna generera absoluta värden av proverna.

• Proverna från studiepopulationen i Nueva Guinea behöver analyseras med en annan metod än enbart ELISA. Detta för att säkerställa att analys med enbart ELISA är en pålitlig och användbar metod vid analys av aflatoxin-albumin addukten i serum.

(28)

5. TILLKÄNNAGIVANDE

Först och främst vill jag tacka min handledare, doktorand Kaisa Thorell, för möjligheten att skriva min kandidatuppsats på avdelningen för mikrobiologi och immunologi på Sahlgrenska akademin. Jag vill också tacka för all stöttning och inspiration till att genomföra denna resa. Jag vill tacka Prof. Samuel Lundin och Hanna Al-Alam för att ni arbetat fram en metod och bistod mig med kunskap och vägledning under dagarna i labbet. Tack Samuel för din hjälp i efterföljande skrivprocess. Jag vill jag rikta ett tack till Dra. Reyna Palacios för din hjälp med frakten av proverna över Atlanten och Erick Fonseca för din villighet att ställa upp för oss trots tidsbrist. Ett stort tack till Carl Erik Levins stiftelse, Rotaryklubben i Anderstorp, Equmenia i Anderstorp, Olaus Petri församling i Örebro samt Torwald och Gun Johansson i Björklinge för ert ekonomiska bidrag. Utan det hade projektet inte varit möjligt. Slutligen vill jag rikta ett stort tack till Dr. Pablo Moreno, som kört mig och Maja över de flesta områden i Nicaragua, guidat oss genom Nicaraguansk sjukvård samt använt alla möjliga kontakter för att hjälpa oss att få ett resultat.

6. REFERENSER

1. Blount WP. Turkey "X" disease. J Br Turkey Fed 1961;9:55 - 58.

2. Lancaster MC, Jenkins FP, Philip JM. Toxicity associated with certain samples of groundnuts. Nature 1961;192:1095-096.

3. Eaton DL, Groopman JD. The toxicology of aflatoxins: human health, veterinary, and agricultural significance. Academic Press, San Diego, California 1994.

4. Brakhage AA, Schuemann J, Bergmann S, Scherlach K, Schroeckh V, Hertweck C.

Activation of fungal silent gene clusters: a new avenue to drug discovery. Prog Drug Res 2008;66:1, 3-12.

5. Deshpande SS. Handbook of food toxicology. New York: Marcel Dekker; 2002. p. 390 - 411.

6. CARNAGHAN RB, HARTLEY RD, O'KELLY J. Toxicity and Fluorescence Properties of the Aflatoxins. Nature 1963 Dec 14;200:1101.

7. DE IONGH H, VLES RO, VAN PELTJ. Milk of Mammals Fed an Aflatoxin-Containing Diet. Nature 1964 May 2;202:466-467.

(29)

8. Van Egmond HP. Current situation on regulations for mycotoxins. Overview of tolerances and status of standard methods of sampling and analysis. Food Addit Contam 1989 Apr-Jun;6(2):139-188.

9. Yu J. Current understanding on aflatoxin biosynthesis and future perspective in reducing aflatoxin contamination. Toxins (Basel) 2012 Oct 25;4(11):1024-1057.

10. Bosch FX, Munoz N. Prospects for epidemiological studies on hepatocellular cancer as a model for assessing viral and chemical interactions. IARC Sci Publ 1988;(89)(89):427-438.

11. Groopman JD, Kensler TW. Role of metabolism and viruses in aflatoxin-induced liver cancer. Toxicol Appl Pharmacol 2005 Aug 7;206(2):131-137.

12. Eom SY, Yim DH, Zhang Y, Yun JK, Moon SI, Yun HY, et al. Dietary aflatoxin B1 intake, genetic polymorphisms of CYP1A2, CYP2E1, EPHX1, GSTM1, and GSTT1, and gastric cancer risk in Korean. Cancer Causes Control 2013 Nov;24(11):1963-1972. 13. Guengerich FP, Johnson WW, Shimada T, Ueng YF, Yamazaki H, Langouet S. Activation

and detoxication of aflatoxin B1. Mutat Res 1998 Jun 18;402(1-2):121-128.

14. Bennett RA, Essigmann JM, Wogan GN. Excretion of an aflatoxin-guanine adduct in the urine of aflatoxin B1-treated rats. Cancer Res 1981 Feb;41(2):650-654.

15. Kensler TW, Roebuck BD, Wogan GN, Groopman JD. Aflatoxin: a 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology. Toxicol Sci 2011 Mar;120 Suppl 1:S28-48. 16. Klich MA. Soil fungi of some low-altitude desert cotton fields and ability of their extracts

to inhibit Aspergillus flavus. Mycopathologia 1998;142(2):97-100.

17. Khlangwiset P, Wu F. Costs and efficacy of public health interventions to reduce aflatoxin-induced human disease. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess 2010 Jul;27(7):998-1014.

18. Chang PK, Bennett JW, Cotty PJ. Association of aflatoxin biosynthesis and sclerotial development in Aspergillus parasiticus. Mycopathologia 2002;153(1):41-48. 19. Turner PC, Sylla A, Gong YY, Diallo MS, Sutcliffe AE, Hall AJ, et al. Reduction in

exposure to carcinogenic aflatoxins by postharvest intervention measures in west Africa: a community-based intervention study. Lancet 2005 Jun 4-10;365(9475):1950-1956. 20. Afriyie-Gyawu E, Ankrah NA, Huebner HJ, Ofosuhene M, Kumi J, Johnson NM, et al.

NovaSil clay intervention in Ghanaians at high risk for aflatoxicosis. I. Study design and clinical outcomes. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess 2008 Jan;25(1):76-87.

21. Moyers SB, Kumar NB. Green tea polyphenols and cancer chemoprevention: multiple mechanisms and endpoints for phase II trials. Nutr Rev 2004 May;62(5):204-211. 22. EUROPEAN COMMISSION HEALTH AND CONSUMERS

DIRECTORATE-GENERAL. Final report of an audit carried out in Nicaragua from 19 to 27 September 2012 in order to assess the controls of Aflatoxin contamination in peanuts intended for

(30)

export into the European Union. 2013 25 Feb 2013;DG(SANCO) 2012-6291 - MR FINAL.

23. Wild CP. Aflatoxin exposure in developing countries: The critical interface of agriculture and health. Food and Nutrition Bulletin 2007;28(2):372-80.

24. Williams JH, Phillips TD, Jolly PE, Stiles JK, Jolly CM, Aggarwal D. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. Am J Clin Nutr 2004 Nov;80(5):1106-1122.

25. Campbell TC, Stoloff L. Implication of mycotoxins for human health. J Agric Food Chem 1974 Nov-Dec;22(6):1006-1015.

26. Krishnamachari KA, Bhat RV, Nagarajan V, Tilak TB. Hepatitis due to aflatoxicosis. An outbreak in Western India. Lancet 1975 May 10;1(7915):1061-1063.

27. Alpert ME, Hutt MS, Wogan GN, Davidson CS. Association between aflatoxin content of food and hepatoma frequency in Uganda. Cancer 1971 Jul;28(1):253-260.

28. Bulatao-Jayme J, Almero EM, Castro MC, Jardeleza MT, Salamat LA. A case-control dietary study of primary liver cancer risk from aflatoxin exposure. Int J Epidemiol 1982 Jun;11(2):112-119.

29. Shank RC. Metabolic activation of mycotoxins by animals and humans: an overview. J Toxicol Environ Health 1977 Jul;2(6):1229-1244.

30. Van Rensburg SJ, van der Watt JJ, Purchase IF, Pereira Coutinho L, Markham R. Primary liver cancer rate and aflatoxin intake in a high cancer area. S Afr Med J 1974 Dec 11;48(60):2508A-2508D.

31. Ozturk M. P53 Mutation in Hepatocellular Carcinoma After Aflatoxin Exposure. Lancet 1991 Nov 30;338(8779):1356-1359.

32. Smela ME, Currier SS, Bailey EA, Essigmann JM. The chemistry and biology of aflatoxin B(1): from mutational spectrometry to carcinogenesis. Carcinogenesis 2001

Apr;22(4):535-545.

33. Lutwick LI. Relation between aflatoxin, hepatitis-B virus, and hepatocellular carcinoma. Lancet 1979 Apr 7;1(8119):755-757.

34. Turner PC, Moore SE, Hall AJ, Prentice AM, Wild CP. Modification of immune function through exposure to dietary aflatoxin in Gambian children. Environ Health Perspect 2003 Feb;111(2):217-220.

35. Azzam AH, Gabal MA. Interaction of aflatoxin in the feed and immunization against selected infectious diseases. I. Infectious bursal disease. Avian Pathol 1997;26(2):317 <last_page> 325.

36. Fernandez A, Hernandez M, Verde MT, Sanz M. Effect of aflatoxin on performance, hematology, and clinical immunology in lambs. Can J Vet Res 2000 Jan;64(1):53-58.

(31)

37. Leong YH, Latiff AA, Ahmad NI, Rosma A. Exposure measurement of aflatoxins and aflatoxin metabolites in human body fluids. A short review. Mycotoxin Res 2012 May;28(2):79-87.

38. Zhu JQ, Zhang LS, Hu X, Xiao Y, Chen JS, Xu YC, et al. Correlation of dietary aflatoxin B1 levels with excretion of aflatoxin M1 in human urine. Cancer Res 1987 Apr

1;47(7):1848-1852.

39. Groopman JD, Zhu JQ, Donahue PR, Pikul A, Zhang LS, Chen JS, et al. Molecular dosimetry of urinary aflatoxin-DNA adducts in people living in Guangxi Autonomous Region, People's Republic of China. Cancer Res 1992 Jan 1;52(1):45-52.

40. Sabbioni G, Skipper PL, Buchi G, Tannenbaum SR. Isolation and characterization of the major serum albumin adduct formed by aflatoxin B1 in vivo in rats. Carcinogenesis 1987 Jun;8(6):819-824.

41. Bornschein J, Kandulski A, Selgrad M, Malfertheiner P. From gastric inflammation to gastric cancer. Dig Dis 2010;28(4-5):609-614.

42. Kumar, V. & Robbins, S.L. (red.) editor. Robbins and Cotran Pathologic basis of

disease.. 8th ed. Philadelphia, Pa.: Saunders; 2009.

43. Torres J, Correa P, Ferreccio C, Hernandez-Suarez G, Herrero R, Cavazza-Porro M, et al. Gastric cancer incidence and mortality is associated with altitude in the mountainous regions of Pacific Latin America. Cancer Causes Control 2013 Feb;24(2):249-256. 44. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global Cancer Statistics, 2002. CA: A Cancer

Journal for Clinicians 2005;55(2):74 <last_page> 108. 45. Lundin S. samuel.lundin@microbio.gu.se, 031-7862906.

46. Palframan SL, Kwok T, Gabriel K. Vacuolating cytotoxin A (VacA), a key toxin for Helicobacter pylori pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol 2012 Jul 12;2:92. 47. Ishijima N, Suzuki M, Ashida H, Ichikawa Y, Kanegae Y, Saito I, et al. BabA-mediated

adherence is a potentiator of the Helicobacter pylori type IV secretion system activity. J Biol Chem 2011 Jul 15;286(28):25256-25264.

48. Bergqvist D, Hamberger B, Haglund U. editor. Kirurgi. 8th ed. Stockholm: Liber; 2013; 2013.

49. Nookaew I, Thorell K, Worah K, Wang S, Hibberd ML, Sjovall H, et al. Transcriptome signatures in Helicobacter pylori-infected mucosa identifies acidic mammalian chitinase loss as a corpus atrophy marker. BMC Med Genomics 2013 Oct 11;6:41-8794-6-41. 50. Darazy M, Balbaa M, Mugharbil A, Saeed H, Sidani H, Abdel-Razzak Z. CYP1A1,

CYP2E1, and GSTM1 Gene Polymorphisms and Susceptibility to Colorectal and Gastric Cancer Among Lebanese. Genetic Testing and Molecular Biomarkers 2011;15(6):423 <last_page> 429.

51. Ma F, Misumi J, Zhao W, Aoki K, Kudo M. Long-term treatment with sterigmatocystin, a fungus toxin, enhances the development of intestinal metaplasia of gastric mucosa in

(32)

Helicobacter pylori-infected Mongolian gerbils. Scand J Gastroenterol 2003 Apr;38(4):360-369.

52. Kusunoki M, Misumi J, Shimada T, Aoki K, Matsuo N, Sumiyoshi H, et al. Long-term administration of the fungus toxin, sterigmatocystin, induces intestinal metaplasia and increases the proliferative activity of PCNA, p53, and MDM2 in the gastric mucosa of aged Mongolian gerbils. Environ Health Prev Med 2011 Jul;16(4):224-231.

53. Chung MK, Riby J, Li H, Iavarone AT, Williams ER, Zheng Y, et al. A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for adducts of polycyclic aromatic hydrocarbons with human serum albumin. Anal Biochem 2010 May 1;400(1):123-129.

54. Adamsson J, Lundin SB, Hansson LE, Sjövall H, Svennerholm AM. Immune responses

against Helicobacter pylori in gastric cancer patients and in riskgroups for gastric cancer.. Helicobacter 2013;18(1):73-82.

55. Thorell K. Identification of a Latin American specific babA variant through whole genome sequencing of Helicobacter pylori patient isolates from Nicaragua.

56. Scholl PF, Groopman JD. Long-term stability of human aflatoxin B1 albumin adducts assessed by isotope dilution mass spectrometry and high-performance liquid

chromatography-fluorescence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2008 Jun;17(6):1436-1439.

(33)

7. APPENDIX

7.1 Bilaga 1: Frågeformulär

!"#$%$&'(&)*+%,-.*/0#1*&

! "#$%&'(!)*++',!-##!$(%',./)-!,&.)0-)#*,',!0/,!$#1'2)3&(4!-1!+-4.52).2-(2',6! 7/38-(%'!9',.*(3&4-!$994&0#',!)*++',!'(%-.#!-##!-(15(%-.!#&33!.#$%&'(6!!! && !"#$%&$' ()**+%*,$%&$' -$.#%'$%&$' ' ' /0+1#$%&$' /0+1#$%&$'0#2$'0%.1#' /0+1#$%&$'0#2$'&3.1#' ' ' 4"$' ' !".1*,13#+' ' !".1*,1.%+5&' ' ' 6#718'99999999999999999999999999999999999999999999999999999999999' ' :3,+%.,3#+8999999999999999999999999999999999999999999999999999999' ' -$+%*'&1.*1&&%#')'0%&)*;1$89999999999999999999999999999999999999999' ' <%#'.5'$2=3$,)$'>*)?)+'.)%=$3,+),1#%.'&1.'<1*)@3>%@+1#'AB*3#)C''''' D%'E'F1;' ' <%#'.5'02++'>1G%$.*)$='0"#'<1*)@3>%@+1#'AB*3#)C''' ' ' D%'E'F1;' ' <%#'.5H'1**1#'G%#'.5'G%0+'.B,A1A,)C''' ' ' ' ' D%'E'F1;' !

(34)

!"#$%&&%"$'("$)*$+(",-$"./("%0$$ $ $ $ $ $ 1($$2$3%4$ $ 56-(&$7"$89:$"./("%;$<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<$ $ =("#$%&&%"$'("$)*267>96$,$),6$?(:,&4$'(?-$67>96$@(6@%"84*/)9:0$A,&/%6$-BC$(+$ @(6@%"84*/)9:0$$ <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<$ $ $ 56-(&$C%"896%"2"*:$,$),6$D98-()$;<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<$ $ E(@/$87$:B@/%-$?."$),6$:%)+%"/(6F$ ! G%+6()88-(6)(")$ $$$$$$$$$$1($ $$$$$3%4$ 19")>9&+$ $ $ H&(8?.68-%"$$ $ $ I4$?."8&*-D("($.CC6,6>("2'7&$,$+J>>%6$ $ $ I&%/-",8/$8C,8$ $ $ K/9"8-%6$ $ $ L(>&,>-$,6-(>$(+$?"*/-$9@'$>".68(/%"$ $ $ L,8/DJ6/$ $ $ E9(&%--$$ $ $ M%6-$+(--%6$$ $ $ I&%/-",@,-%-$ $ $ NB&8/7C$ $ $

(35)

7.2 Bilaga 2: Informerat samtycke

Samtycke för studiedeltagare till studien gällande riskfaktorer för magsäckscancer

Introduktion:

! För att delta i studien krävs att du inte har någon sjukdom kopplad till magsäcken. Inte heller några tecken på sjukdom eller symptom från magsäcken.

! Om du deltar i studien kommer en medicinstudent att ta ett blodprov på dig a´20 ml.

! Provet tar ca 10 minuter. Direkt efter provtagningen kan du fortsätta med din dag som planerat utan några restriktioner.

Studiens syfte

Befolkningen i Nicaragua har stora problem med sjukdomar som är kopplade till magsäcken. En bakomliggande orsak till detta är den stora mängden nicaraguaner som är infekterade med bakterien Helicbacter pylori. Helicobacter pylori orsakar lokal inflammation i magsäcken och 2-3 % av de som är infekterade av bakterien drabbas av magsäckscancer. Människor som bor i de centrala delarna av Nicaragua är värst drabbade av magsäckscancer.

Studiens syfte är att undersöka vilka riskfaktorer som spelar roll i utvecklingen av magsäckscancer. Följande riskfaktorer kommer att analyseras i blod; H. Pylori, hepatit B, blodgruppstillhörighet och ett mögeltoxin vid namn aflatoxin. För att kunna genomföra studien på ett korrekt sätt krävs det att både blod från friska individer respektive blod från individer med magsäckscancer analyseras

Deltagandet i studien är frivilligt

Om du beslutar dig för att inte deltaga i studien kommer varken din relation med ditt sjukhus/vårdcentral eller din relation till din läkare att påverkas. Om du beslutar dig för att deltaga i studien kommer du få ett antal frågor om ditt nuvarande, samt tidigare hälsotillstånd, din familjs hälsotillstånd och frågor gällande dina bostadsförhållanden. All din personliga information kommer att behandlas konfidentiellt och kommer endast att vara tillgängliga för de personer som arbetar med studien.

Blodet som vi tar från dig kommer att frysas in i form av serum. Serum är resultatet som uppstår då man låtit blod koagulera och sedan avlägsnar blodkroppar och koagulationsproteiner från det. Det frysta serumet kommer sedan att skickas till ett laboratorium vid Göteborgs Universitet i Sverige för vidare analys.

(36)

Studiedeltagarens nummer _________

Ditt medverkande är helt frivilligt och du kan ändra ditt beslut när som helst under studien.

Om du beslutar dig för att inte vara med i studien har du alltid rätt att be om att alla dina prover samt all insamlad infromation om dig destrueras.

Jag ____________________________________ vill delta i studien gällande

riskfaktorer för utveckling av magsäckscancer i Nicaragua. Jag är införstådd med att mitt deltagande innebär att jag både ska svara på ett frågeformulär samt att ta ett blodprov. Jag är också införstådd med att jag när som helst under studien kan välja att avbryta och få informationen om mig, samt mina biologiska prover destruerade. Om jag väljer att avbryta kommer varken min personliga vård på sjukhus/vårdcentral eller min relation till min läkare att påverkas.

Underskrift ____________________________ Datum __________________________

En underskriven kopia behålls av studieansvarig. Den andra kopian behålls av studiedeltagaren själv.

Tack för din medverkan!

Om du behöver komma i kontakt med personer som är ansvariga för studien, kontakta Kaisa Thorell, Göteborgs Universitet, Svreige. Telefon: 0046 31 786 62 33

! !

Figur

Updating...

Referenser

Updating...

Relaterade ämnen :