Örebro Universitet Läkarprogrammet
Självständigt arbete, 15 högskolepoäng Vårtermin 2020
Preanalytisk påverkan av dubbelcentrifugering
på rutinkemiska analyser
Version 2
Författare: Gustav Forsner Handledare: Paul Pettersson Pablo Specialistläkare i Klinisk kemi Laboratoriemedicinska kliniken USÖ
Sammanfattning
Bakgrund
Rör för rutinkemiska analyser centrifugeras i primärvården innan de skickas till USÖ, Universitetssjukhuset Örebro, för analysering. Den gamla sanningen är att rör inte får
centrifugeras två gånger och därför behandlas dessa separat från övriga rör på USÖ vilka annars hanteras av automationen som centrifugerar rören före analys. Tidigare studier i ämnet har kommit fram till olika resultat huruvida dubbelcentrifugering påverkar analysvärdet. En del av förklaringen är kopplad till hur lång tid och i vilken temperatur de proverna har förvarats mellan centrifugeringarna, men också under vilka förhållanden som de är centrifugerade.
Syfte
Ett negativt resultat skulle kunna underlätta preanalytisk hantering av provmaterial genom att utesluta dubbelcentrifugering som felkälla, varför alla rör skulle kunna hanteras på ett enhetligt sätt oavsett deras ursprung.
Metod
Studien är en experimentell studie inom området preanalys. Litium-heparinrör har centrifugerats och analyserats, och sedan centrifugerats och analyserats igen. En statistisk analys har sedan gjorts för att jämföra skillnaden mellan enkelcentrifugerade och dubbelcentrifugerade prover. Resultat
För alla prover utom laktatdehydrogenas, LD låg medelavvikelsen under CV, coefficient of variation. Många av analyterna hade dock flera värden som översteg CV och maxvärden som långt översteg. Endast ett provresultat översteg dock RCV, reference change value. Parat T-test visar en statistisk signifikant medelvärdesskillnad för albumin, Tg (triglycerider), kalcium, bilirubin, och LD som alla får ett P-värde under 0,05.
Slutsats
Dubbelcentrifugering kan ge statistiskt signifikanta skillnader med såväl ökande som minskande koncentrationer av analyten, men dessa skillnader verkar i de flesta fall sakna klinisk betydelse.
Förkortningar
- ASAT aspartataminotransferas - CV coefficient of variation - CVA analytisk imprecision
- CVI inom-subjekt biologiska variationen
- EFML European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine
- GT glutamyltransferas
- LD laktatdehydrogenas
- RCV reference change value - TAE total allowable error
- TG triglycerider
Innehåll
Sammanfattning ... 2 Bakgrund ... 2 Syfte ... 2 Metod ... 2 Resultat ... 2 Slutsats ... 2 Förkortningar ... 3 Introduktion... 3 Kalium ... 4 Natrium... 4 Kalcium ... 5 Aspartataminotransferas – ASAT ... 5 Laktatdehydrogenas – LD ... 5 Bilirubin ... 5 Glutamyltransferas – GT ... 6 Kreatinin ... 6 Triglycerider ... 6 Albumin ... 6 CV och RCV ... 6 Syfte ... 7 Hypotes... 7 Frågeställning ... 7 Metod ... 7Material ... 8 Etik ... 8 Statistik ... 8 Resultat ... 9 Diskussion ... 12 Slutsats ... 13 Särskilt tack ... 14 Referenser ... 15
3
Introduktion
I svensk sjukvård används vanligtvis vakuumrör för att samla in serum eller plasma från patienter. Ett serumrör innehåller en koagulationsaktiverande rörtillsats medan ett plasmarör innehåller antikoagulantia. På Universitetssjukhuset Örebro är plasmarör med Litium-heparin som rörtillsats det mest använda av alla rörtyper och kallas i vardagligt tal ”kemirör” eftersom majoriteten av vårdens vanligaste analysmetoder utförs på sådana rör. Alla litium-heparinrör som kommer in till laboratoriet ska innan analys för rutinkemiska analyter centrifugeras för att skilja blodkroppar från serum. Under centrifugeringen kommer separationsgelen lägga sig mellan blodkroppar (underst) och plasma (överst) på grund av dess olika densiteter. (1) Detta är viktigt för att bevara en konstant nivåer av analyter i proverna, och tillåter förvaring upp till 48 timmar (2,3). Med anledning av detta är prover som kommer in från primärvården för analys i sjukhusets laboratorium redan centrifugerade. Den gamla sanningen är att ”röret ej får centrifugeras två gånger” vilket troligtvis har sin grund i tron om att förlängd eller för snabb centrifugering kan leda till hemolys varpå intracellulära komponenter läcker ut i plasman (4). Detta försvårar den preanalytiska hanteringen då de centrifugerade rören från primärvården inte kan blandas med den stora mängden rör som kommer från sjukhuset. Idag görs denna uppdelning manuellt innan transporten från primärvård samt visuellt och manuellt innan inmatning till den automatiska hanteringen i laboratoriet på USÖ.
Hemolys, när erytrocyter går sönder, kan påverka provresultat genom tre mekanismer – det kan antingen höja värdet på analyter som är i högre koncentration inuti cellerna än i plasma, det kan sänka värde genom att späda plasman och cellkomponenter kan påverka varandra (5). Lätt hemolys tros ha liten påverkan på analysvärden medan medel till hög hemolys har påvisats kunna öka värdena av flera analyter och sänka värdena av andra (6). Tidigare studier har även visat att ASAT, aspartataminotransferas, och LD påverkas redan vid lätt hemolys och att kalium var den känsligaste elektrolyten (5).
Källor till hemolys är främst in vitro men kan också uppstå in vivo (7). När hemolys uppstår in vitro kan det bero på hur blodprovet är taget, hanterat och centrifugerat (5). Även utan synlig hemolys läcker cellulärt innehåll till plasma (8), och det finns flera studier som har påvisat
4 förändrade analysvärden vid upprepad centrifugering (1,4,9,10). En annan studie som undersökte påverkan av recentrifugering av prover upp till 8 timmar efter första centrifugeringen fann att ingen analyt föll utanför TAE, Total Allowable Error, för respektive prov när man centrifugerade under 3000g i 8 minuter (11).
Kalium
Kalium finns i 20-40 gånger högre koncentration inuti erytrocyter jämfört med serum eller plasma. En fysiologiskt snäv reglering gör kalium till ett besvärligt prov handhavande- och analysmässigt. Referensintervallet är litet och svårigheterna med att upprätta ett rättvisande intervall exemplifieras av att analysen tillhör det fåtal där referensintervallen skiljer sig för plasma respektive serum. Även lätt hemolys (0,5g/l hemoglobin) påverkar därför mätvärden av kalium (8,12). Andra har visat att blod som får stå höll sig inom referensvärdet i 0,5 timmar, men ej 3 timmar på grund av ett visst läckage även över intakta cellmembran. Provmaterialet måste därför skyndsamt hanteras och avskiljas från blodceller för att inte resultera i en falskt förhöjd kaliumkoncentration (13). Tidigare har man också funnit att nivåerna av kalium ökar ju längre man förvarar proverna i 4 °C innan recentrifugering (fyra till 22 timmar undersöktes). Detta tros kunna bero på att all plasma inte separeras från blodkropparna under den första centrifugeringen och att det sedan sker ett läckage av kalium till den lilla mäng plasma som ligger under gelen tillsammans med blodkropparna. När provet sedan recentrifugeras kommer mängden plasma att flyttas ovan gelen och koncentrationen natrium i den totala mängden plasma stiger signifikant (1,9). Sambandet försvann om den initiala centrifugeringen istället skedde under 25 minuter istället för 15 minuter (9). Forskning som undersökte förvaring i upp till 8 timmar i
rumstemperatur såg inget samband med ökade kaliumvärden efter en andra centrifugering. (11) Natrium
Koncentrationen natrium är tvärt emot kalium 8-12 gånger lägre intracellulärt än extracellulärt (12) och man har funnit att natrium i motsats till kalium sjunker ju längre man förvarar proverna i 4 °C innan recentrifugering. Kortaste tiden för som testades var dock 24 timmar (1), och annan forskning som testade förvaring i upp till 8h i rumstemperatur såg inget samband med sjunkande natriumkoncentrationer (11).
5 Kalcium
Koncentrationen kalcium intracellulärt är mindre än 0,2 mikromolar vilket är minst tusen gånger lägre än i blod (12). Van Balveren fann att kalcium föll utanför deras TAE med 0,85
procentenheter vid centrifugering under 1650g i 10 minuter, men detta tillskrevs deras analytiska variation för kalcium (3%) som översteg den biologiska variationen (2,55%) utifrån vilken TAE (2,55%) är beräknad (11). Tidigare forskning har även funnit att variationen efter en upprepad centrifugering inte översteg 1% (10).
Aspartataminotransferas – ASAT
Den enzymatiska koncentration av ASAT är i erytrocyter 40 gånger högre än i plasma. Det finns motstridiga resultat om detta innebär att den katalytiska koncentrationen ökar när helblod
förvaras i 1-2 timmar innan centrifugering, eller om detta inte innebär en signifikant förändring vid förvaring upp till 48 timmar. (8) Van Balveren har visat att recentrifugering efter 4 och 8 timmar ökade medelvärdena av ASAT i prov med högst 2,73% (11).
Laktatdehydrogenas – LD
LD har en katalytisk koncentration som är ungefär 160 gånger högre i erytrocyter än i plasma och är känt som ett av de mest hemolyskänsliga av alla rutinkemiska analyser. Även lätt hemolys påverkar provvärdena (5,8). Om helblod får stå sker också en signifikant ökning av den
enzymatiska aktiviteten i plasma. Ono et al. beskriver en ökning på 6% vid förvaring i 4 °C över 48 timmar, 5% vid förvaring i 23 °C över 8 timmar och 8% vid förvaring i 30 °C i 2h (14). Hira et al beskriver förändring endast inom normala gränser för prover som recentrifugeras efter förvaring i 4 °C i 24, 48 och 72 timmar (1).
Bilirubin
Bilirubin är en metabolit av hem och 80% av allt bilirubin i kroppen kommer från hemoglobin. Nedbrytningen av hem till bilirubin är enzymatiskt katalyserad och sker primärt i mjälten (15). Tidigare studier har visat att ett prov mäter lägre bilirubin desto mer fritt hemoglobin som finns (8,16). Värdet blir felaktigt redan från 0,8g/l (8). Förvaring under varierande tid och temperatur hade dock inte någon statistiskt signifikant påverkan på bilirubinvärdet i ett prov (14).
6 Glutamyltransferas – GT
Glutamyltransferas, GT, är ett leverenzym som vid alkoholmissbruk och många leversjukdomar, särskilt de som drabbar gallvägar, ökar i plasma (17). Proteinet finns inte i erytrocyter men dess katalytiska koncentration sjunker vid hemoglobinkoncentrationer från 3,0 g/l på grund av ämnet glycin vilket fungerar som en inhibitor av enzymet finns i erytrocyter och leukocyter (18). Kreatinin
Kreatinin fördelar sig fritt i kroppens vattenfas och diffunderar i hög grad passivt över
cellmembran. Analysens robusthet varierar med analysmetod, men kreatinin betraktas som en analysmetod som har liten känslighet för hemolys (19). Hira et al beskriver att vid
recentrifugering av prover som förvarats i 4 °C under 24, 48 och 72 timmar fås ingen förändring utanför normala gränser i kreatininkoncentrationen jämfört med kontrollprover (1).
Triglycerider
Tg är en analys med hög biologisk variation. Tg förekommer primärt i VLDL-partiklar och inte intracellulärt varför den inte betraktas som särskilt hemolyskänslig. Van Balveren et al har visat att recentrifugering efter 4 och 8 timmar ökade medelvärdena av Tg i prov med högst 1,76% (11).
Albumin
Albumin är det vanligaste förekommande proteinet i plasma och förekommer i koncentrationer om 35-50 g/L (20). Van Balveren et al har visat att recentrifugering efter 4 och 8 timmar gav en medelvärdeökning på högst 2,70% (11), och Ono et al har visat att förvaring i 4, 23 eller 30 °C under 0, 2, 4, 6, 8, 24 och 48 timmar innan centrifugering inte gav någon förändring i
plasmakoncentration av albumin (14). CV och RCV
Formeln för att räkna ut CV är standarddeviationen dividerat med medelvärdet och multiplicerat med 100. Det är ett således ett mått på den analytiska imprecisionen (21). RCV tar sedan med den inom-subjekt biologiska variationen (CVI) i kalkylen såväl som den analytiska
7 imprecisionen (CVA), varpå ekvationen blir RCV = 21/2 · Z · (CVA2 + CVI2)1/2, där Z är antalet
standarddeviationer lämpliga för sannolikheten (22). Detta är en komplicerad ekvation, men man kan sammanfatta RCV som ett mått på den inneboende variationen. Användningen av RCV som referens för när en skillnad i upprepad provtagning av samma individ blir signifikant är därför passande (23).
Syfte
I detta projekt undersöker vi hur plasmavärdena av albumin, bilirubin, Tg, kalium, natrium, kreatinin, kalcium, ASAT, LD och GT påverkas av att centrifugeras två gånger jämfört med en gång. Projektet genomförs på Laboratoriemedicinska kliniken Klinisk
kemi på sjukhusen USÖ och Lindesberg med den utrustning som används vid den kliniska rutindriften av laboratorierna. Ett negativt resultat skulle kunna underlätta den preanalytiska hanteringen av provmaterial genom att utesluta dubbelcentrifugering som en felkälla.
Hypotes
Att recentrifugering kommer att pressa ut joner och andra metaboliter ur erytrocyter, och att vissa kommer hemolyseras alternativt att
cellmembranens permeabilitet påverkas, varför analyter med höga
intracellulära koncentrationer kommer att öka efter andra centrifugeringen. Frågeställning
Påverkas resultatet på rutinkemiska analyser av att provröret centrifugeras två gånger istället för en?
Metod
Studien är en experimentell studie inom området preanalys. Blodprover har tagits i Litium-heparinrör (BD Vacutainer; BD AB, Stockholm, Sweden) vilka sedan har centrifugerats i Hettich Rotanta 460 (HETTICH Instruments LP, Beverly, MS, USA) inställd på 2000 g under 7 minuter. Provrören har sen analyserats i Vitros 5.1 (Ortho Clinical Chemistry Instruments, Raritan, NJ)
Figur 1. Flödesschema för studiens metod vid centrifugering och analysering.
8 och därefter centrifugerats och analyserats igen (figur 1). En statistisk analys har gjorts på
resultaten för att jämföra skillnaden mellan enkelcentrifugerade och dubbelcentrifugerade prover. Resultaten kommer att utvärderas såväl statistiskt, med parade t-test, för att utröna huruvida en statistiskt signifikant skillnad i koncentrationer föreligger före och efter centrifugering, samt kliniskt i relation till analysmetodens precision (uttryckt i CV%) och den biologiska variationen för analyten i fråga. Det sistnämnde värderas genom att jämföra skillnaden vi observerat med RCV som tar hänsyn till både biologisk variation och analytisk precision.
CV är taget från bilaga 1, och RCV är kalkylerat utifrån EFML, European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (24) för alla analyter utom kalcium och bilirubin då
biologisk variation för dessa analyter saknades. RCV för dessa är istället taget från en studie av Bugdayci, G et al (25).
Material
Provmaterialet är totalt 64 rör från Lindesbergs Lasaretts dagliga verksamhet, och i studien undersöks tio olika analyser. Alla analyter undersöktes inte i varje rör, utan datan är byggd på 30 värden för alla prover utom kalium och kalcium (31) samt kreatinin (33). Totalt har 304 värden analyserats.
Etik
Studiens data är insamlat från prover beställda av sjukvårdspersonal på patienter inom ramen för rutinsjukvården. Efter att de beställda analyserna utförts och resultaten rapporterats till
beställaren togs återstoden av rören till vara för att analyseras för detta projekt. Inga extra stick har gjorts för att samla provmaterialet och inga personuppgifter som gör provmaterialet spårbart till patienten har sparats. Venös provtagning är ett rutiningrepp behäftat med låg risk, då
framförallt för lätt hematom. Varje patient har lämnat samtycke för provtagning för rutinsjukvård.
Statistik
Statistisk bearbetning gjordes med Microsoft Excel (version 2003) Redmound, WA och SPSS (version 25) Armonk, NY. Medan det är känt att många klinisk kemiska variabler är positivt
9 snedfördelade förväntade vi oss att arbeta med normalfördelade differenser mellan enkel- och dubbelcentrifugerade analysresultat varför vi valde ett parametriskt hypotestest. Vi kontrollerade detta med Kolmogorov-Smirnoffs test och Shapiro-Wilks test. I händelse av att dessa tester indikerade att variabeln inte var normalfördelad gjordes också en visualisering av differenserna i histogram och i lådagram och genom att värdera skillnaden mellan medelvärde och median för de respektive variablerna (Figur 2, lådagrammens mittstreck motsvarar medianen och krysset medelvärde). Vi undersökte parade prover och valde därför parat T-test. Normalfördelning hos de parade differensernas residualer kontrollerades i ett histogram. Att vår data, det vill säga differensen, är normalfördelad och där med möter kravet för T-test visualiseras i Figur 2. Resultaten utvärderades med RCV och CV.
Resultat
Tg, kalium, kreatinin, bilirubin och GT underkänns i antingen Kolomogorv-Smirnov eller i Shapiro-Wilks tester för normalfördelning av differenserna mellan enkel och
dubbelcentrifugerade prover. Dessa visualiserades i histogram och samtliga bedömdes i dessa motsvara en normalfördelning, varför de analyserades statistiskt med parat t-test.
Analyt Medelvärde C1 Medelvärde C2 Medelavvikelse (%) Maxavvikelse (%) CV% RCV% Antal utanför CV% Antal utanför RCV%
Albumin (g/L) 39.26 39.58 0.86 4.25 3.00 8.80 3 0 Tg (mmol/L) 1.87 1.86 -0.38 -2.43 5.00 54.50 0 0 Kalium (mmol/L) 4.23 4.28 1.15 11.22 2.00 12.40 9 0 Natrium (mmol/L) 141.70 141.86 0.12 2.40 2.00 5.50 3 0 Kreatinin (μmol/L) 87.95 88.28 0.28 -6.91 4.00 45.70 3 0 Kalcium (mmol/L) 2.34 2.36 0.79 3.98 3.00 6.40 3 0 Bilirubin (μmol/L) 17.37 16.87 -3.01 -14.64 8.00 51.10 0 0 ASAT (U/L) 0.77 0.74 -5.84 -37.38 6.00 25.00 13 1 LD (U/L) 4.06 4.25 5.95 15.66 5.00 19.60 15 0
10
Tabell 1 Medelvärdet efter första (C1) och andra (C2) centrifugeringen, medelavvikelsen av C2 jämfört med C1, maxavvikelse, CV och RCV räknat på 95% sannolikhet.
Tabell ett visar att för alla prover utom LD låg medelavvikelsen under CV%, måttet på
laboratoriets precision. Många av analyterna hade dock flera värden som översteg CV%, vilket illustreras i kolumnen för antal utanför CV%, och den med mest variation var LD där 15 av 30 värden översteg. LD, kalium, bilirubin, ASAT och GT hade alla maxvärden som långt översteg CV%. Endast ett provresultat översteg dock RCV som även tar hänsyn till den biologiska variationen, och således blir ett mått på när skillnaden i resultat från klinisk-laboratorisk betydelse. (Tabell 1)
I figur två kan vi se att differensen mellan centrifugering ett och två förefaller vara
normalfördelad baserad på en liten skillnad mellan median och medelvärde. Vi kan också se att ASAT var den analyt som varierade mest följt av LD och GT. Elektrolyterna samt albumin och Tg hade en mindre spridning (figur 2).
GT (U/L) 0.94 0.93 -2.70 -20.00 8.00 32.40 7 0
11
Tabell 2: Den statistiska analysen av medelvärdesskillnaden av de parade proverna mellan första och andra centrifugeringen.
Parat T-test Parade skillnader t df P-värde Medelvärde SD SEM 95% Konfidensintervall av skillnaden Lägre Övre Pair 1 Albumin - Albumin2 -0.32 0.58 0.11 -0.54 -0.11 -3.07 29.00 0.00 Pair 2 Tg - Tg2 0.01 0.03 0.00 0.00 0.02 2.20 29.00 0.04 Pair 3 Kalium - Kalium2 -0.05 0.10 0.02 -0.08 -0.01 -2.66 30.00 0.01 Pair 4 Natrium - Natrium2 -0.15 1.39 0.25 -0.67 0.37 -0.60 29.00 0.55 Pair 5 Kreatinin - Kreatinin2 -0.33 1.47 0.26 -0.85 0.19 -1.28 32.00 0.21 Pair 6 Kalcium – Kalcium2 -0.02 0.03 0.01 -0.03 -0.01 -2.99 30.00 0.01 Pair 7 Bilirubin - Bilirubin2 0.50 0.70 0.13 0.24 0.76 3.89 29.00 0.00 Pair 8 ASAT - ASAT2 0.02 0.08 0.01 0.00 0.05 1.73 29.00 0.10 Pair 9 LD - LD2 -0.19 0.18 0.03 -0.26 -0.12 -5.91 29.00 0.00 Pair 10 GT - GT2 0.01 0.03 0.01 0.00 0.02 2.09 29.00 0.05
Vi valde att testa statistisk signifikans genom ett parat T-test då våra resultat var parade och även normalfördelade enligt minst ett test för normalfördelning. Resultatet visar en statistisk
signifikant medelvärdesskillnad för albumin, Tg, kalium, kalcium, bilirubin och LD som alla får ett P-värde under 0,05. Detta innebär att det förekommer en skillnad mellan att centrifugera en gång och två gånger. Resterande fyra analyter har dock ett 95% konfidensintervall som sträcker sig över noll vilket betyder att den sanna medelvärdesdifferensen skulle kunna vara noll. De får då ett P-värde över 0,05 som inte påvisar en statistiskt signifikant skillnad mellan att centrifugera en eller två gånger (tabell 2).
Tabell 3: Index för hemolys efter en respektive två centrifugeringar, samt medelavvikelsen i procent och P-värde erhållet genom parat T-test.
Index för hemolys (g/l)
Medelvärde C1 Medelvärde C2 Medelavvikelse (%) P-värde
12 Index för hemolys steg enbart med 0,76% efter andra centrifugeringen jämfört med efter första. Parat T-test ger ett P-värde på 0,75 vilket ej visar på en statistiskt signifikant skillnad – en recentrifugering ger alltså inte ökad hemolys jämfört med endast den initiala centrifugeringen.
Diskussion
I det här projektet undersökte vi effekten av en recentrifugering på vanliga klinisk kemiska analyser. Medan vi observerade signifikanta skillnader mellan uppmätta koncentrationer före och efter centrifugering framkom också att dessa skillnader oftast understeg en kliniskt betydelsefull nivå.
Medeldifferensen för LD låg 0,95 procentenheter högre än CV medan resterande medelvärden låg under CV; precisionsmålet för Region Örebro läns laboratorier. Åtta av tio analyter
uppvisade maxvärden vilka översteg detta mått (Tabell 1). För att avgöra huruvida en statistisk signifikant medelvärdesskillnad förekom gjordes ett parat T-test med 95% konfidensintervall. För ungefär hälften av analyterna (natrium, kreatinin, ASAT och GT) översteg p-värdet 0,05, vilket visar att ingen statistiskt signifikant medelvärdesskillnad förelåg och att recentrifugering inte har någon påverkan på koncentrationerna av analyten (tabell 2).
I vår frågeställning ämnade vi dock inte endast värdera huruvida en medelvärdesdifferens förekom, utan också om resultaten är tillräckligt betydelsefulla för att påverkade den kliniska bedömningen av proverna. Därför tog vi även med RCV i tabellen. RCV är ett mått på när variationen får klinisk betydelse enligt laboratoriestandard och man får fram det genom att ta med den biologiska variationen (variation som kan uppstå hos en och samma individ under olika förhållanden så som fasta, kroppsposition etcetera) in i ekvationen, liksom CV%,
analysmetodens precision. Enbart ett värde av alla analyter översteg denna gräns (Tabell 1). Det här säger oss att dubbelcentrifugering och analysering av 304 analyter endast avvek utanför laboratorieklinisk betydelsen i ett fall.
Ytterligare en nivå på om resultatens betydelse förändras är den praktiskt kliniska betydelse – hur läkaren som läser provsvaren väljer att tolka en förändring. Detta är individuellt, varierar
13 med bedömare och med frågeställning och går tyvärr inte att mäta, samt att det beror på om resultatet ligger nära en gräns för normalvärde eller inte. Min personliga bedömning är dock att detta värde i många fall är större än RCV.
Det finns begränsningar att ha i åtanke vid tolkningen av resultatet av detta projekt. Något som gör att vårt resultat tyvärr inte är helt applicerbart i praktiken är att vi inte tog med tidsaspekten mellan centrifugeringarna, och då inte heller temperaturen. Projektet genomfördes under
rutinarbetesförhållanden på Lindesbergs lasarett och provinsamlingen ägde rum efter att man var färdig med den analys beställaren efterfrågat. Arbetssättet medgav inte vid tillfället en rigorös monitorering av tidsaspekten. Om man vill verifiera våra resultat är detta något man bör undersöka framledes. Vår hypotes var att det var den upprepade centrifugeringen som skulle orsaka eventuella skillnader, medan tidigare studier har visat att det snarare beror på diffusion till en liten mängd plasma på fel sida av separationsgelen. Ju längre detta får pågå, desto större skillnad kommer att uppstå efter centrifugeringen som följer då plasman förflyttas över gelen
(1,2,11). Som ses i tabell 3 kan vi också dra slutsatsen att det inte är hemolys orsakad av upprepad centrifugering som förklarar skillnaden i analysvärde efter andra centrifugeringen. En annan faktor som påverkar resultatet är tid och kraft på den initiala centrifugeringen. Vi centrifugerade alla prover i 7 minuter under 2000g. En tidigare studie har visat fler avvikande värden vid dubbelcentrifugering om den första centrifugeringen var under 10 minuter á 1650g jämfört med 8 minuter á 3000g (11). Ytterligare en studie har visat att en initial centrifugering på 25 minuter á 2800g behövs för att en andra centrifugering inte ska ge ökade värden av kalium, vilket härleds till att ingen residualplasma då finns kvar på fel sida separationsgelen (9). Studien analyserade dock inte övriga analyter, och våra resultat är normalfördelade samt bara väldigt lätt skiftade åt ökade kaliumvärden efter andra centrifugeringen (figur 2, tabell 1).
Slutsats
Medan recentrifugering kan ge statistiskt signifikanta skillnader i koncentration av vissa analyter, förefaller två på varandra följande centrifugeringar av ett Litium-heparinrör inte leda till
påverkan på den kliniska bedömningen av analysvärdet, jämfört med en enkel centrifugering med den instrumentering som används på Kliniskt kemi på USÖ. Dessa resultat medger att man
14 ändrar rutinerna vad gäller hantering av redan centrifugerade rör vid laboratoriet på USÖ för de analyter där ingen kliniskt betydelsefull skillnad kunde observeras. För att ytterligare fördjupa sig i mekanismen bakom de ökande och minskade koncentrationerna och undersöka tidsaspekten behövs dock ytterligare studier.
Särskilt tack
Ett särskilt tack vill jag rikta till min handledare Paul Petterson Pablo som från start till slut har handlett mig med konstruktiv kritik, kunskap, diskussion och uppmuntran, samt alltid funnits tillgänglig för frågor.
15
Referenser
1. Pseudohyperkalaemia caused by recentrifugation of blood samples after storage in gel separator tubes. Ann Clin Biochem. 01 juli 2001;38(4):386–90.
2. van Balveren JA, Huijskens MJ, Gemen EF, Péquériaux NC, Kusters R. Effects of time and temperature on 48 routine chemistry, haematology and coagulation analytes in whole blood samples. Ann Clin Biochem. 01 juli 2017;54(4):448–62.
3. Nationell användarmanual för medicinsk biokemi [Internet]. [citerad 16 januari 2020]. Tillgänglig vid:
https://brukerhandboken.no/index.php?action=showtopic&topic=9c375df49fef5dcc1cbf 4. Cadamuro J, Mrazek C, Leichtle AB, Kipman U, Felder TK, Wiedemann H, m.fl. Influence
of centrifugation conditions on the results of 77 routine clinical chemistry analytes using standard vacuum blood collection tubes and the new BD-Barricor tubes. Biochem Medica [Internet]. 15 februari 2018 [citerad 10 januari 2020];28(1). Tillgänglig vid:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5701775/
5. Koseoglu M, Hur A, Atay A, Cuhadar S. Effects of hemolysis interferences on routine biochemistry parameters. Biochem Medica. 2011;21(1):79–85.
6. Hemolysis - an overview | ScienceDirect Topics [Internet]. [citerad 30 mars 2020]. Tillgänglig vid: https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/hemolysis
7. Carraro P, Servidio G, Plebani M. Hemolyzed specimens: a reason for rejection or a clinical challenge? Clin Chem. februari 2000;46(2):306–7.
8. Sonntag O. Haemolysis as an Interference Factor In Clinical Chemistry. J Clin Chem Clin Biochem Z Für Klin Chem Klin Biochem. 01 mars 1986;24:127–39.
9. Hue DP, Culank LS, Toase PD, Maguire GA. Observed Changes in Serum Potassium Concentration following Repeat Centrifugation of Sarstedt Serum Gel Safety Monovettes after Storage. Ann Clin Biochem. 01 mars 1991;28(3):309–10.
10. Shafi H, Sadrzadeh H. The Effect of Recentrifugation of Serum Separator Tubes on Concentration of Serum Analytes. Ann Clin Lab Sci. 20 juni 2012;42(3):318–9. 11. van Balveren JA, Gemen EFA, Kusters R. Recentrifugation of Lithium Heparin Gel
Separator Tubes up to 8 h after Blood Collection Has No Relevant Influence on the Stability of 30 Routine Biochemical Analytes. J Appl Lab Med. 01 mars 2019;3(5):864–9.
12. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Intracellular Ion Environment and Membrane Electric Potential. Mol Cell Biol 4th Ed [Internet]. 2000 [citerad 02 april 2020]; Tillgänglig vid: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21627/
16 13. Laessig RH, Indriksons AA, Hassemer DJ, Paskey TA, Schwartz TH. Changes in serum
chemical values as a result of prolonged contact with the clot. Am J Clin Pathol. september 1976;66(3):598–604.
14. Ono T, Kitaguchi K, Takehara M, Shiiba M, Hayami K. Serum-constituents analyses: effect of duration and temperature of storage of clotted blood. Clin Chem. januari 1981;27(1):35–8. 15. Kalakonda A, John S. Physiology, Bilirubin. I: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL):
StatPearls Publishing; 2020 [citerad 20 april 2020]. Tillgänglig vid: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK470290/
16. van der Woerd-de Lange JA, Guder WG, Schleicher E, Paetzke I, Schleithoff M, Wieland OH. Studies on the interference by haemoglobin in the determination of bilirubin. J Clin Chem Clin Biochem Z Klin Chem Klin Biochem. juli 1983;21(7):437–43.
17. Plasma [Internet]. Sahlgrenska Universitetssjukhuset. 2019 [citerad 02 april 2020]. Tillgänglig vid:
https://www.sahlgrenska.se/for-dig-som-ar/vardgivare/laboratoriemedicin/analyslista/gamma-gt/17025.html/
18. Persijn JP, van der Slik W. A New Method for the Determination of γ-Glutamyltransferase in Serum. Clin Chem Lab Med [Internet]. 1976 [citerad 02 april 2020];14(1–12). Tillgänglig vid:
https://www.degruyter.com/view/j/cclm.1976.14.issue-1-12/cclm.1976.14.1-12.421/cclm.1976.14.1-12.421.xml
19. Olof A, Blennow K, Blom A, Carlson J, Christensson A, Dahlbäck B, m.fl. Laurells klinisk kemi i praktisk medicin. 9:e uppl. Lund: Studentlitteratur; 2012. 733 s.
20. Moman RN, Varacallo M. Physiology, Albumin. I: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 [citerad 20 april 2020]. Tillgänglig vid:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK459198/
21. Laboratory Medicine Curriculum [Internet]. [citerad 04 juni 2020]. Tillgänglig vid: https://webpath.med.utah.edu/EXAM/LabMedCurric/LabMed01_03.html
22. Fraser CG. Reference change values. Clin Chem Lab Med CCLM. 01 maj 2012;50(5):807– 12.
23. Fraser CG. Reference change values: the way forward in monitoring. Ann Clin Biochem. 01 maj 2009;46(3):264–5.
24. EFLM Biological Variation [Internet]. [citerad 20 maj 2020]. Tillgänglig vid: https://biologicalvariation.eu/
25. Bugdayci G, Oguzman H, Arattan HY, Sasmaz G. The use of reference change values in clinical laboratories. Clin Lab. 2015;61(3–4):251–7.
