Utvärdering av tre olika metoder för Van Gieson Elastin färgning på Kolorektalcancer i syfte att identifiera venös invasion

(1)

Utvärdering av tre olika metoder för Van

Gieson Elastin färgning på Kolorektalcancer i

syfte att identifiera venös invasion

Evaluation of three different methods for Van

Gieson Elastin staining on Colorectal Cancer in

order to identify venous invasion

Författare: Behrouz Moradi

Vårterminen 2021

Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap

Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng

Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Handledare: Therese Lindsten, Biomedicinsk

analytiker med masterexamen, klinisk patologi Central Sjukhuset Karlstad Måns Alving, överläkare, klinisk patologi Central Sjukhuset Karlstad Examinator: Gabriella Lillsunde-Larsson, lektor, Örebro universitet

(2)

SAMMANFATTNING

Kolorektalcancer är den tredje vanligaste cancerformen hos både män och kvinnor i Sverige där storkärls invasion, venös invasion (VI), är en viktig prognostisk indikator. Noggrann bedömning av VI är särskilt viktigt för patienter med kolorektal cancer i stadium II eftersom det kan påverka beslutet att erbjuda adjuvant behandling. Histologisk bedömning av VI kan vara utmanande på rutinmässig Hematoxylin och Eosin färgning (H&E). Elastinfärgning med syfte att identifiera elastinfibrer i kärlväggen kan underlätta bedömning av VI. I dagsläget finns inte någon bra elastinfärgning som kan användas rutinmässigt hos klinisk patologi i Värmland, Centralsjukhuset Karlstad, prover måste skickas till annat laboratorium vilket är tidskrävande. Denna studie ska finna den optimala färgningsmetoden för elastin genom att utvärdera tre olika färgningsmetoder för elastin fibrer. Färgningens resultat bedömdes rent histokemiskt av överläkare enlig kriterierna, frånvaro av avsedda kärl (skala 0–1), specifik infärgning (skala 0–1), specifik infärgnings intensitet (skala 1–3) och ospecifik infärgning (skala 0–1) och data samlades för respektive metod. Resultatet tyder på att rent histokemiskt är den manuella elastinfärgning metoden från Region Jönköpings län konsekvent och visade signifikant skillnad. Därför metoden är potentiellt användbar för den större frågeställningen om storkärlsinväxt i kolorektal cancer samt rekommenderas starkt som en rutinmässig elastinfärgning till klinisk patologi i Värmland, Centralsjukhuset Karlstad.

Nyckelord: Elastinfärgning, kolorektalcancer, utvärdering, Wilcoxon -Mann-Whitneys

(3)

ABSTRACT

The third most common form of cancer in both men and women in Sweden is Colorectal cancer. Prognostic indicators of colorectal cancer include Large vessel invasion and venous invasion (VI). Careful assessment of VI is of particular interest especially with patients having stage II colorectal cancer. This is because it may influence decisions to offer adjuvant therapy. Accurate histological assessment of VI can be challenging on routine hematoxylin and eosin staining. But staining that can identify the elastin fibers in the vessel can enhance the assessment of VI. Currently, there is not any good Elastin staining that can be routinely used in clinical pathology in Värmland, Karlstad Central Hospital. Therefore, samples are required to be sent to other laboratories which in effect is time consuming. This study is aimed at finding an optimal elastin staining method through evaluations of three different staining methods for elastin fibers. Staining results were assessed histochemically by the chief physician according to the following criteria, absence of intended vessels (scale 0–1), specific staining (scale 0–1), specific staining intensity (scale 1–3) and nonspecific staining (scale 0–1), while different data were collected for each method. The results indicate that purely histochemically, elastin staining-manual method Region Jönköping County is consistent and significant. Therefore, the method is potentially useful for the detection of colorectal cancer and is strongly recommended as a routine elastin staining for clinical pathology in Värmland, Karlstad Central Hospital.

Keywords: Elastin staining, colorectal cancer, evaluation, Wilcoxon -Mann-Whitneys

(4)

Innehållsförteckning

INTRODUKTION ... 1

Cancer ... 1

Kolorektalcancer ... 1

Elastin ... 2

Typer av färgämne och dess egenskaper ... 3

Hematoxylin ... 3

Motfärgning ... 4

Metoder för Elastinfärgning ... 4

Syfte ... 5

MATERIAL OCH METOD ... 6

Etiska överväganden ... 6

Provmaterial och snittning ... 6

Manuell färgning av Elastiska fibrer ... 6

Miller's Elastic Van Gieson (EVG) Stain Kit (Atom Scientific, UK) ... 7

Utförande ... 7

Elastinfärgning-manuell metod Region Jönköpings län ... 7

Utförande ... 7

Weigert-Van Gieson elastin, Akademiska laboratoriet klinisk patologi Uppsala ... 8

Utförande ... 8

Dehydrering och montering ... 8

Bedömning ... 9

Statistisk metod ... 9

RESULTAT ... 10

Miller's Elastic Van Gieson (EVG) Stain Kit (kit protokoll) ... 10

Elastinfärgning-manuell metod Region Jönköpings län ... 10

(5)

DISKUSSION ... 14 Slutsats ... 16 TACK/ACKNOWLEDGEMENT ... 18 REFERENSER ... 19 Bilagor ... 21 Bilaga 1 ... 21 Bilaga 2 ... 24

(6)

1

INTRODUKTION

Cancer

Cancer är det samlingsnamn på en grupp sjukdomar där celler förvärvar en förmåga att dela sig okontrollerat och på så sätt bilda tumörer. Tumörer kan delas in i två olika kategorier; godartade (benigna) tumörer samt elakartade (maligna) tumörer. Ordet cancer riktar sig ofta mot maligna tumörer. Cancer är egentligen en genetisk störning som orsakas av mutation i DNA (Deoxyribonucleic acid) molekylen. Maligna tumörer har specifika egenskaper som skiljer sig från benigna, dessa egenskaper är ständig nybildning av celler, onormalt lång överlevnad, infiltrativ tillväxt och metastasbildning. Den ursprungliga tumören kallas för primärtumör och skiljs från dess dottertumörer (metastaser). En fortlöpande bildning av nya cancerceller ger upphov till en speciell stabiliserande bindväv kallad stroma, samt blodkärlbildning (Angiogenesis) för att tillföra syre och näringsämnen (1).

Cancer klassificeras i två huvudgrupper beroende på i vilken typ av vävnader cancertumörer har utvecklats, karcinom har sitt ursprung i vävnader såsom epitel, hudceller, slemhinne- och körtelceller. Sarkom uppstår i stödjevävnad eller muskelvävnad är den betydligt mindre vanliga gruppen av cancertyper (1).

Kolorektalcancer

Kolorektalcancer är den tredje vanligaste cancerformen hos båda män och kvinnor i Sverige. Det är en samlingsterm för elakartade tumörer i tjock- och ändtarm och primärtumören utgår från tarmslemhinnans celler (adenokarcinom) med slembildande egenskaper. Storkärl invasion eller venös invasion (VI) är en prognostisk indikator för kolorektal cancer. Trötthet (orsakad av järnbristanemi), oregelbundna avföringsvanor, blod och/eller slem i avföring är vanliga symtom. Kirurgisk behandling vid primär cancer är den viktigaste åtgärden för är bota patienten, cytostatikabehandling kompletterar kirurgisk behandling genom att förhindra mikrometastaser. Kolorektalcancer indelas i olika stadier; T-stadie, utbredning av primärtumör, N-stadie, vid regionala lymfkörtelmetastaser samt M-stadie, vid förekomst av fjärrmetastaser. När tumören är avgränsad till tarmen (T1-2, N0, M0) kallas det för stadium I. Stadium II innebär att tumören vuxit genom tarmväggen till närliggande organ (T3-4, N0, M0). I stadium III har tumören spridit sig till lymfkörtel (T1-4, N1-2, M0). Vid förekomst av fjärrmetastaser (T1-(T1-4, N0-2, M1) befinner sig patienten i stadium IV. Noggrann bedömning av VI är särskilt viktigt för patienter med kolorektal cancer i stadium II eftersom det kan påverka beslutet om att erbjuda adjuvant behandling.

(7)

2

Den histologiska bedömningen av VI kan vara utmanande på rutinmässig Hematoxylin och Eosin färgning (H&E). En specialfärgning för att identifiera elastinfibrer i kärl kan underlätta denna bedömning av kärlinvasion, se figur 1 (2–4).

Figur 1: Vävnadssnitt som visar en artär längst ner till vänster i en tumör. A) Rutinmässig Hematoxylin och Eosin färgning (H&E) kan vara utmanande för att identifiera kärlinväxt. B) Samma vävnadssnitt färgat med specialfärgning för elastin (elastin i kärlväggen ses tydligt) (4).

Elastin

Bindväv, brosk och ben är tre undergrupper som tillsammans bildar stödjevävnad. Bindväv har, beroende på dess uppgift, olika former och består av tre komponenter. Fibroblaster som är specifika celler i bindväv och tillverkar fibrer och grundsubstans. Det finns tre olika fibrer i bindväv; kollagena, retikulära samt elastiska fibrer. Kollagena och retikulära fibrer är uppbyggda av proteinet kollagen medan de elastiska fibrerna består av proteinet elastin. Elastiska fibrer består av två komponenter; mikrofibriller och en central amorf substans kallad elastin. Sammansättningen av aminosyror i dessa två komponenter varierar. Det mikrofibriller komponentet innehåller polära aminosyror och Cystein samt den har brist på Hydroxiprolin (En hydroxilerad form av aminosyran prolin), Hydroxilysin (En hydroxilerad form av aminosyran lysin) och desmosiner (En sällsynt aminosyra som finns i elastin). Elastinet i den centrala amorf substansen innehåller Hydroxiprolin och desmosiner men den har brist på Cystein i stället. Variation i färgnings egenskaper av elastiska vävnader i olika platser indikerar på inkonsekvens sammansättning av elastiska

(8)

3

vävnader. Elastiska fibrer förekommer överallt i kroppen där elasticitet krävs såsom i lunga, artärer, öra och epiglottis (5,6).

Typer av färgämne och dess egenskaper

Ett färgämne kan beroende på dess elektriska laddningar indelas i olika grupper: Anjoniska färgämnen (sura färgämnen) vilka bär på negativ laddning och har oftast låga molekylärvikter. Anjoniska grupper i färgämnen gör att dessa färgämnen är lösliga i vatten. Vävnader med positiva laddningar benämns syrofila och reagerar med sura färgämnen. Eosin är det mest kända anjoniska färgämnet (7).

De katjoniska färgämnena (basiska färgämnen) bär på positiv laddning och är ofta lösliga i etanol. Dessa basiska färgämnen reagerar med vävnader som har negativ laddning. Denna typ av vävnad kallas för basofil vävnad. Alcian Blue är en sådant färgämne (7).

Neutrala färgämnen innehåller både sura- och basiska färgämnen. I en vattenlösning genomgår sura och basiska färgämnen en elektronöverföringsprocess och kombineras tillsammans för att fälla ut i vävnaden. Romanowsky-Giemsa färgningen är det bästa exemplet på ett sådant färgämne (7).

Ligand färgämnen är komplexa föreningar som innehåller färgämne och en metaljon. Dessa är svaga syror. Metall-jon komplexet har överskottladdning som ökar färgämnens löslighet i vatten samt gör att den blir olösligt i etanol, därför förekommer inte dehydrering i etanol under färgningen (7).

Hematoxylin

Den naturliga produkten Hematoxylin extraheras från trädet Haematoxylum campechianum genom en utfällning med urea. Den färglösa hematoxylinen har ingen kromofor. När hematoxylin oxideras förlorar den två väteatomer och bildar hematein. Oxidation av hematoxylin kan ske naturligt med hjälp av syre i luften vilket tar flera veckor eller genom tillsats av oxidationsmedel. I det senare fallet är lösningen användbar genast. För detta ändamål kan olika oxidationsmedel väljas såsom kaliumpermanganat, kaliumklorat eller kaliumjodat. En ny-arrangering av bindningarna i hematein leder till att en kininoid-ringstruktur bildas vilket ger hematein den svaga sura färgen och fungerar som kromofor. Med hjälp av ett lämpligt betmedel kan den svaga färgen förstärkas. Aluminium-hematein (Al+3_{-hematein) och järn-hematein (Fe}+2_{-hematein) är två exempel på ligand färgämne.}

(9)

4

erhålls med blandning av järnsalter och hematoxylin. Järnet binder till hematoxylinmolekylen och oxiderar den till hematein. Hematoxylin färgar cellkärnan blå-svart och kan användas för att demonstrera bindväv såsom elastiska fibrer och muciner. Vid färgning av myelin och elastin fibrer används järn-hematein till exempel enligt Weigert hematoxylin. Järn hematoxylin har förmågan att demonstrera ett bredare antal strukturer i en vävnad jämfört med alum hematoxylin. Däremot processen är mer tidskrävande och behöver differentieringssteg som kräver mikroskopisk kontroll (8–10).

Motfärgning

Bindväv kan visualiseras genom att använda Van Gieson färgning som motfärg. Van Gieson-färgning används som cytoplasmafärgning och differentiering av kollagen- och muskelvävnad. Denna färgning använder två sura färgämnen, syrafuchsin och pikrinsyra för att skilja mellan syrofila material. Färgämnena har olika molekylärstorlek och färg som gör att dem tränger in olika i olika vävnader. Varje färgämne kan själv färga hela cytoplasman och bindväv. När de båda färgämnena används i en färglösning har de högmolekylära färgämnena (syrafuchsin med röd färg) dominerande påverkan. Till exempel kollagen bindväv som är mindre tät låter båda färgämnena tränga in och färgas röd medan de mindre färgämnena (pikrinsyra med gul färg) kan tränga sig in i tätare vävnader såsom muskelvävnad och erytrocyter vilket leder till en gul färgning (8,9).

Metoder för Elastinfärgning

Det finns olika metoder som kan visa elastiska fibrer selektivt varav ingen detekterar specifikt. Bland annat finns det en modifierad variant av Weigert's Resorcin-fuchsin som är den mest känsliga metoden. Det finns Miller´s tekniken som är lätt användbar och selektivt färgar elastinet. Färgning av elastiska fibrer kan delas i fyra grupper vilket är en modifieringar av nedanstående metoder:

1) Verhoeff hematoxylin; Den mest användbara metoden inom klinisk laboratoriet för identifiering av elastiska fibrer och den är snabb att utföra. Verhoeff hematoxylin är en blandning av alkohol hematoxylin, järnklorid och jod. Järnklorid och jod fungerar som både betmedel och oxideringsmedel. Det oxiderings förmåga hos dessa ämne skapar det svarta färglösningen som har katjonisk egenskaper. Det är förmodligen jod som fördröjer att hematein lossnar från elastiska fibrer under differentiering steget. Eftersom färgningen har ingen definierat slutpunkt, kräver den viktiga steget en viss erfarenhet och noggrannhet för att uppnå det bästa resultatet. Elastiska fibrer färgas blåsvart till svart med denna metod.

(10)

5

2) Orcein: Det är enklaste metoden bland alla som selektivt färgar elastiska fibrer. Färglösning innehåller 1% syntetisk Orcein blandas i varm 70% etanol och koncentrerad saltsyra. Denna enkla lösning visar effektfull affinitet för elastisk fibrer och färgar dem mörkbrun. Mekanismen för infärgning av elastiska fibrer med denna metod är inte känd men det tros att van der waals-bindningar är inblandade.

3) Weigert’s Resorcin-fuchsin: Denna metod verkar vara långsamt även lösningsberedningen är tidskrävande. Men resultatet visar en anmärkningsvärd selektivitet för elastiska fibrer. Resorcin-fuchsin lösningen är en komplex av basisk fuchsian och resorcin färglösning blandat med järnklorid. Det är denna komplex som binder till elastiska fibrer och färgar dem blåsvart-svart. Färgnings mekanismen är inte helt klart men förmodligen vätebindning mellan elastin och fenolgruppen i Resorcin-fuchsin som ansvarar för färgning av Elastiska fibrer.

4) Aldehyd fuchsin: Metoden presenterades av Gomori (1950). Det är mindre selektivt jämfört med andra metoder. Färglösning innehåller saltsyra och ny paraldehyd blandat med basisk fuchsin i en etanol lösning. Aldehyd och fuchsin bildar schiffska baser som har hög affinitet för elastiska fibrer och färgar de intensivt lilla (9,10,12).

Syfte

I dagsläget finns det inte någon bra elastinfärgning som kan användas rutinmässigt vid klinisk patologi i Värmland, Centralsjukhuset Karlstad. Prover måste därför skickas till annat laboratorium vilket är tidskrävande. Syftet med detta arbete är därför att finna den optimala metoden för att färga elastin bland tre olika valmöjligheter.

(11)

6

MATERIAL OCH METOD

Etiska överväganden

Samtliga prover var anonymiserade och endast märkta med löpnummer (1–10). De kunde således inte kopplas tillbaka till en enskild individ och ingen etikansökan eller information till patienterna var därför nödvändig.

Provmaterial och snittning

För detta arbete användes 10 patientprover från kolon hos individer med diagnosen kolorektal cancer. Överläkare (M, A) markerade på Eosin glaset (storsnitt) ett specifikt område som innehöll stora artärer och vener där det ska finnas elastin-lager. Dessa område sedan snittades ut på vanliga objektglas FLEX IHC Microscope Slides (Dako, Copenhagen, Danmark). På detta sätt är materialet i sig en internkontroll och därför behövdes ingen separat, positiv kontroll. De markerade områdena i storsnitten snittades med en snittjocklek på 4 µm med Microtom HM355S (Thermo scientific, Kalamazoo, USA) för två av de tre Elastinfärgning metoderna. Den tredje Elastinfärgnings-metoden krävde i stället en snittjocklek på 5 µm. Objektglasen markerades med siffror 1 till 10. Det snittades tre snitt från varje vävnadsprov (2×4 µm och ett på 5 µm).

Avparaffinering och rehydrering

För avparaffinering och rehydrering av samtliga preparat innan färgningen följdes Manuell avparaffinering, hydrering och dehydrering enligt klinisk patologi centralsjukhuset i Karlstad. Kortfattat avparaffinerades preparatet genom att sänka ner i tre Xylen (Solveco, Sverige) bad (3×2 minuter). Rehydrering av vävnadssnitten utfördes i sjunkande koncentration av etanol, 99,5 % etanol (3× 2 minuter), sedan 95 % etanol (3× 1 minut) och därefter 70 % etanol (2×1 minut). Slutligen sänktes vävnadssnitten ner i avjoniserat vatten för cirka en minut.

Manuell färgning av Elastiska fibrer

Till denna studie användes tre olika metoder för Elastinfärgning; Miller's Elastic Van Gieson (EVG) Stain Kit (Atom Scientific, UK) förkortas Kit protokoll, Elastinfärgning-manuell metod Region Jönköpings län, förkortades Jönköping protokoll och Weigert-Van Gieson elastin, Akademiska laboratoriet klinisk patologi Uppsala nämndes Uppsala protokoll.

(12)

7

Miller's Elastic Van Gieson (EVG) Stain Kit (Atom Scientific, UK)

I kitet finns Kaliumpermanganat 0,5 % lösning (2×100 ml), Svavelsyra 3 % lösning (1×100 ml), Oxalsyra 1 % lösning (1×100 ml), Miller's Elastin färg (1×100 ml) samt Van Gieson extrafärg (1×100 ml) redo för användning.

Utförande

Inledningsvis blandades 9,5 ml Kaliumpermanganat 0,5 % lösning med 0,5 ml svavelsyra 3% lösning för att förbereda surt kaliumpermanganat 0,1%. Denna lösning har en lila färg och är hållbar i 3–4 veckor, den skall dock kasseras efter fem gångers användning eller när den lila färgen omvandlats till brun. För färgningen användes en uppsättning objektglas med vävnadssnitt från alla tio patienter med en tjocklek på 5 μm. Efter avparaffineringen behandlades objektglasen med surt kaliumpermanganat 0,1% i fem minuter, sedan tvättades objektglasen ordentligt med kranvatten och blektes i en minut med oxalsyra. Därefter tvättades objektglasen ordentligt med kranvatten och sköljdes sedan med 95 % etanol. Objektglasen placerades i en fuktig kammare som förberetts i förväg genom att blöta ner ett papper med 95 % etanol som placerats i kammaren. Vävnadssnitten på objektglasen täcktes med Miller's elastin färg tre timmar i rumstemperatur. Sedan sköljes de i 95 % etanol tills ingen mer färg lossnade från objektglasen. Därefter tvättades objektglasen ordentligt med kranvatten och motfärgades med Van Gieson extrafärg i två minuter enligt tillverkaren. Sedan torkades objektglaset varsamt med hjälp av ett filterpapper. Slutligen snabb dehydrering och montering. För snabb dehydrering räckte det med att doppa objektglasen några gånger i stigande etanol serie (70 %, 95 % och 99,5 % etanol).

Elastinfärgning-manuell metod Region Jönköpings län Utförande

En uppsättning objektglas med vävnadssnitt från alla tio patienter med en snittjocklek på 4 μm användes. Efter avparaffinering och rehydrering placerades objektglasen i en kyvett med Bouin’s lösning (9) som förvärmdes 15 minuter och ställdes sedan i värmeskåp 60°C ytterligare 10 minuter. Objektglasen sköljdes sedan noggrant med kranvatten följt av en sköljning med avjoniserat vatten. En nygjord elastin arbetslösning som innehåller tre delar stamlösning A, innehåller hematoxylin (Sigma H3136, USA), två delar stamlösning B, järnklorid lösning, och en del stamlösning C, jod lösning. Objektglasen placerades i ett kyvett med elastin arbetslösning i 45 minuter. Därefter sköljdes objektglasen kort med

(13)

8

kranvatten följt av en noggrann sköljning med avjoniserat vatten. I nästa steg behandlades vävnadssnitten med natriumtiosulfat 5% lösning i två minuter. Objektglasen sköljdes sedan noggrant med kranvatten följt av en kort sköljning med avjoniserat vatten. För motfärgning placerades objektglasen i en kyvett med nygjord Van Gieson (9) i en minut. Därefter sköljdes objektglasen kort med avjoniserat vatten följt av snabb dehydrering och montering (bilaga 1).

Weigert-Van Gieson elastin, Akademiska laboratoriet klinisk patologi Uppsala Utförande

Objektglasen sköljes i 70 % etanol (Solveco, Sverige) och färgades sedan med Resorcin-fuchsin enligt Weigert (Histolab, Sverige), 60°C värmeskåp i cirka 30 minuter. Därefter sköljdes objektglasen snabbt i avjoniserat vatten och sedan differentierades överflödig färg bort i 1 % Saltsur sprit (1 ml saltsyra 37% (Merck VWR, Germany) i 100 ml 95 % etanol (Solveco, Sverige). I nästa steg sköljdes objektglasen i rinnande kranvatten och därefter 99,5 % etanol cirka 10 minuter. I nästa steg sköljdes objektglasen i kranvatten cirka två minuter och behandlades därefter med Weigert hematoxylin (9), (lika delar Weigert A-lösning (Histolab, Sverige) och Weigert B-A-lösning (Histolab, Sverige), i cirka fyra minuter. Därefter placerades objektglasen i en kyvett med litiumlösningen i cirka en minut (lös litiumkarbonatpulver i avjoniserat vatten till minst 0,5 cm sedimenterat litiumpulver, mättad litiumkarbonatstamlösning därefter tillsattes 10–15 droppar mättad litiumkarbonatstamlösning (supernatanten) i en kyvett med cirka 40–50 ml avjoniserat vatten) och återigen skölja i kranvatten cirka två minuter. Slutligen motfärgades objektglasen med nygjord Van Gieson färg i cirka två minuter (bilaga 2).

Dehydrering och montering

För dehydrering av samtliga preparat efter färgningen följdes Manuell avparaffinering, hydrering och dehydrering enligt klinisk patologi centralsjukhuset i Karlstad om inte något annat angives. Dehydrering av pereparater utfördes i stigande koncentration av etanol, 70 % etanol (2× 1 minut), 95 % etanol (3× 1 minut), 99,5 % etanol (3×2 minuter) och Xylen (3×2 minuter). Montering av samtliga objektglas utfördes maskinellt med hjälp av Tissue-Tek Film Coverslipper (Sakura, Nagano, Japan).

(14)

9

Bedömning

Alla objektglas med vävnadssnitt som färgats med tre olika Elastinfärgningsprotokoll bedömdes av en överläkare (M, A) på klinisk patologi regionvärmland, centralsjukhuset Karlstad. De tre olika infärgningsmetoderna för elastin utvärderades rent histokemiskt, semikvantitativt utifrån fyra olika parametrar. Den första parametern som det har tagits hänsyn till var det om det fanns avsedda kärl (normala kärl, inte med tumör), stora artärer och vener i snittet och detta bedömdes med en skala från 0 till 1 där 0 står för inget kärl, 1 för närvaro av kärl. I de fall som saknade avsedda kärl exkluderades snittet och ersattes ett annat snitt som innehöll kärl. I nästa parameter bedömdes snittet med avseende på att om det fanns specifik infärgning med en skala från 0 till 1 där 0 står för ingen specifik infärgning och 1 för specifik infärgning av snittet. Den tredje parametern bedömdes den specifika infärgningens intensitet enligt en tregradig skala utifrån om preparatet var 1) svag infärgat, 2) måttlig infärgat eller 3) starkt infärgat. Slutligen bedömdes preparatet enligt en tvågradig skala utifrån om preparatet var 0) ospecifikt infärgat eller 1) ingen ospecifik infärgning (normalt). Det som anses som specifik infärgning var att skilja lamina elastica i kärlväggen samt möjliga fibriller positivitet i bindväven. Med ospecifik infärgning anses allt annat som inte är specifikt.

Statistisk metod

Rådata för enskilda metoder samlades och sedan behandlades metoderna parvis för varje parameter med hjälp av SPSS version 25 (IBM, New York, USA) där utfördes Wilcoxon -Mann-Whitneys U-test (Wilcoxons rangsummetest). Ett p-värde <0,05 betraktades som statistiskt signifikant.

(15)

10

RESULTAT

Totalt 30 vävnadssnitt från patienter med diagnosen kolorektalcancer färgades med tre olika metoder för Elastinfärgning. Färgningresultatet bedömdes rent histokemiskt av överläkare enlig kriterierna, närvaro av avsedda kärl (skala 0–1), specifik infärgning (skala 0–1), specifik infärgnings intensitet (skala 1–3) och ospecifik infärgning (skala 0–1) och data samlades för respektive metod. Alla objektglas skannades med hjälp av NanoZoomer S360 digital slide scanner (HAMAMATSU, Hamamatsu, Japan).

Alla metoder konstaterade närvaro av avsedda kärl och en specifik infärgning av elastin fibrer. Därför medverkade dessa två parametrar inte i den statistiska bedömningen.

Miller's Elastic Van Gieson (EVG) Stain Kit (kit protokoll)

Alla tio preparat med en snitttjoklek på 5 μm färgades enligt tillverkarens protokoll. Objektglaset färgades med Millers elastin färgen i en fuktigtkammare. Färgningsresultatet visade att elastiska fibrer blev svagt blå/svarta för de flesta preparater, kollagenet röd och andra vävnader såsom muskler och erytrocyter en gul färg. Alla tio objektglas som färgades med denna metod bedömdes av överläkaren (M, A) enligt kriterierna (tabell 1), (figur 2B).

Elastinfärgning-manuell metod Region Jönköpings län

En uppsättning glas av vävnadssnitt från tio patientprover med en snittjocklek på 4 μm färgades enligt jönköpings protokoll. Saltsyrakoncentrationen som användes i elstinarbetslösningen och gav det bästa resultatet i denna metod var saltsyra 5M (17 %). Resultatet för infärgningen visade en distinkt svarta och skarpt markerade elastiska fibrer, brun-svarta kärnor, röd bindväv (Van Gieson som motfärg) och gula muskler och erytrocyter. Bedömningen av alla tio objektglas som färgades med denna metod enligt kriterierna visas i (tabell 1), (figur 2A).

(16)

11

Figur 2: A) Patientprov färgades enligt Jönköpings protokoll med en intensitet skala på 3 (stark infärgning), Förstorning 6,18X. B) Samma patinetprov färgat enligt Kit protokollet med en intensitet skala på 1 (svag infärgning), Förstorning 8,12X.

Weigert-Van Gieson elastin, Akademiska laboratoriet klinisk patologi Uppsala

Vävnadssnitt från tio patientprover med en snittjocklek på 4 μm färgades enligt Uppsala protokoll. Resultatet visade en måttligt (för det flesta objektglas) blåsvarta färgning av elastiska trådar, brunsvarta cellkärnor och röd bindväv. Bedömningen av alla tio objektglas som färgades med denna metod enligt kriterierna konstaterades i (tabell 1), (figur 3).

Figur 3: Vävnadssnitt från patientprov 4 färgat med Weigert-Van Gieson elastin, Akademiska laboratoriet klinisk patologi Uppsala, Förstorning 7,49X. Blåsvarta elastiska trådar, brunsvarta cellkärnor och röd bindväv.

Ospecifik infärgning i form av bakgrundsfärgning förekom i fyra vävnadssnitt enligt följande. Vävnadssnitt från patientprov nummer 3 och 10 färgades enligt Kit protokollet, vävnadssnitt från patientprov nummer 9 färgades enligt både Uppsala protokollet och Jönköpings protokollet, (figur 4).

(17)

12

Figur 4: Patientprov nummer 9 färgades enligt Weigert-Van Gieson elastin, Akademiska laboratoriet klinisk patologi Uppsala . En ospecifik infärgning i form av bakgrundfärg detekterades i snittet (svarta pilen), Förstorning 6,9X.

Bedömningen av alla objektglas färgade med tre olika metoder för Elastinfärgning enligt kriterierna specifik infärgnings intensitet (skala 1–3) och ospecifik infärgning (skala 0–1) för respektive metod (tabell 1).

(18)

13

Tabell 1: Bedömningsresultatet för respektive färgningsmetod enligt kriterierna, specifik infärgningsintensitet (skala 1–3) och ospecifik infärgning (skala 0–1).

Fall Infärgnings metod

enligt Specifik infärgning intensitet (1–3)

Ospecifik infärgning

(0–1)

Kit protokoll 2 0

Prov 1 Jönköping protokoll 3 0

Uppsala protokoll 2 0

Kit protokoll 1 0

Kit protokoll 1 1

Kit protokoll 1 0

Kit protokoll 2 0

Kit protokoll 1 0

Kit protokoll 1 1

Prov10 Jönköping protokoll 2 0

Mann-Whitneys U-test (Wilcoxons rangsummetest) resultatet avseende specifik infärgningsintensitet tydde på en signifikant skillnad medan resultatet för resterande parametrar inte visade någon signifikant skillnad.

(19)

14

DISKUSSION

Denna studie utvärderade tre olika metoder för Elastinfärgning för att finna den optimal Elastinfärgningsmetod till klinisk patologi, centralsjukhuset i Karlstad som en rutinmässigt metod. Elastinfärgning används bland annat för att konstatera VI (venös invasion) i kolorektalcancer, en enkel teknik för en viktig prognostisk faktor.

VI är tumörer i ett hålrum utklätt av endotelceller med erytrocyter omgivande av muskelstråk. En immunhistokemisk färgning som riktar sig mot endotelceller (CD34) eller Elastinfärgning kan underlätta bedömningen av VI. För nuvarande finns det ingen immunhistokemisk färgning som kan direkt färga elastiska fibrer (3).

Verhoeff Elastinfärgning, modifierad (VER-EL) metoden som användes av klinisk patologi centralsjukhuset Karlstad gav inte en klar och tydlig positiv färgning på elastin fibrer med oerhört dåligt bakgrundsfärgning. Orsaken till denna resultat kunde inte konstateras och därför en ny Elastinfärgning metod behövdes.

Miller's Elastic Van Gieson (EVG) Stain Kit metoden använder en kombinerad teknik för att demonstrera elastiska fibrer, kollagen och muskelvävnad. Metoden är egentligen ett resultat av flera modifieringar av den ursprungliga Weigert's Resorcin-fuchsin metoden (1898). Elastiska fibrer, särskild fina fibrer färgades intensivt blå/svart av Millers elastin färgen. Lösningen hade en flyttig egenskap och avdunstades snabbt och objektglaset torkades ofta. För att undvika dessa problem fuktades kammaren med etanol 95 % i stället vatten. Infärgningen av millers elasin färgen kontrollerades under mikroskopet efter 90 minuter. Vävnadssnitten behandlades med surt kaliupermanganat och oxalsyra och denna behandling gjorde att färgämnet trängde in genom vävnaden och förbättrade detekteringen av elastiska fibrer. Intensiteten för specifik infärgning av elastiska fibrer är mycket svagare än de andra metoder trots att bedömningen baserades på den bästa special infärgningen i varje snitt.

Elastinfärgning-manuell metod Region Jönköpings län, denna metod motsvarar till stora delar Verhoeff elastic-stain metoden som är den aktuella metoden vid Klinisk Patologi i Karlstad idag. I Verhoeff-metoden ingår inte saltsyra i färglösningen och differentieringen sker efter färgningen i 2 % järnklorid. Jönköpings protokollet färgade hela elastiska systemet svart och skarpt markerade. Bouin’s lösning som används i protokollet är egentligen ett fixeringsmedel med bra hållbarhet, som tränger genom vävnaden snabbt och jämnt och orsakar lite krympning i vävnaden. Samma principer användes för bedömning av

(20)

15

intensitetsgraden, det vill säga den bästa specifika infärgningen valdes. I snittet markerats olika grader av specifik infärgning i elastiska fibrer som beror på olika differentieringstider som i sin tur beror på mängden elastiska vävnader (8,10,11).

I Weigert-Van Gieson elastin, Akademiska laboratoriet klinisk patologi Uppsala metoden binder den positiv laddade färgen Resorcin- fuchsian (basisk fuchsian och resorcin färglösning och järnklorid) till elastinet och färgar den blåsvart. Färgningsmekanismen är fortfarande oklar men förmodligen vätebindningar mellan elastin och fenolgruppen i Resorcin-fuchsin är ansvarigt för infärgningen. Weigert’s hematoxylin färgar cellkärnorna blåsvart. Järnjoner i lösningen fungerar som betmedel men de har också en oxiderande funktion som hjälper till med konverteringen av hematoxylin till hematein (6,12).

Både Jönköping -och Uppsala protokollet visade goda resultat gällande elastinfärgning. I den först nämnda metoden är lösningsberedningen tidskrävande men resultatet för elastin fibrer är starkt skarpt svart markerad. Hållbarheten för lösningarna är ett år vilket minskar antal gånger som krävs för beredning av lösningar. Den andra metoden kräver inte många lösningsberedningar men den färgar elastinet blåsvart vilket gör att bedömningen är något svårare (Personlig kommunikation med överläkaren, M A, maj, 2021). Å andra sidan i denna metod krävdes att Resorcin-fuchsin lösningen inkuberas tillsammans med objektglaset som ska färgas i värmeskåp i 60°C. Detta medföljer en viss risk eftersom lösningen innehåller en stor mängd etanol 70% som är en brandfarlig produkt och ska undvikas att värmas upp enligt tillverkaren (Histolab, Sverige).

Trots att Kit-metoden färgar selektivt elastiska fibrer, en snittjocklek på 5 μm i stället för den rutinmässiga snittjockleken (4 μm) som utfördes på de andra metoder är en avvikelse från den rutin arbetet vilket leder till mer arbete och inställningar på instrumentet. Resultatet från en snittjocklek på 4 μm, färgade med denna metod visade mycket svagare resultat gällande specifik infärgnings intensitet. Tiden för elastinfärgning med Millers elastin färgen är långt (cirka tre timmar) samt kräver mikroskopisk kontroll under färgningens gång för att säkerställa det optimala färgningresultatet. Allt detta och särskilt färgningskvalitén på elastinfibrer (svagt intensitet) ger metoden den lägsta betyget.

Materialet för denna studie valdes på så sätt att minimera felkällor, samtliga preparat innehöll avsedda kärl där det förmodas att det ska finnas elastiska trådar. Detta medger en specifik infärgning av elastinet i alla undersökta vävnadssnitt. Allmänt som gäller nästan alla färgningstekniker är val av fixeringsmetod samt utförandet, snittkvalité (ojämna snitt

(21)

16

ger ojämn förekomst av elastin fibrer i snittet), noggrann utförd avparaffinering, dehydrering samt färgningens praktiska utförande har en stor roll för en god resultat. (Noteras här att dessa parametrar inte studerats i detta examensarbete).

Resultatet tyder rent histokemiskt på att Elastinfärgning-manuell metod Region Jönköpings län är konsekvent och signifikant och metoden är potentiellt användbar för den större frågeställningen om kärlinväxt i kolorektalcancer. Trots att detta inte har studerats i denna studie. Enligt resultatet finns skillnader mellan olika metoder vad det gäller elastin färgningen vilket tyder på att elastinfärgning är inte likvärdiga.

Elastinfärgning utförs inte enbart på paraffininbäddade sektioner utan kan även användas för andra typ av inbäddningsmetoder såsom resin (Harts). I en studie förklaras en variant av Weigert’s Resorcin-fuchsin metod där vävnadsbitar förbehandlas i resin med kaliumpermanganat som skapar fria aldehyd radikaler. Aldehydgrupper reagerar positivt med Schiff reagens i Resorcin-fuchsin och är ansvarigt för färgningen av elastiska fibrer (13).

Det finns studier som har lagt fokus på kemistruktur och färgnings mekanismen för Weigert Resorcin-fuchsin och dess varianter. I denna studie visades att färgningskomponenterna i alla beredningar är katjoniska (basiska) färgämnen samt att järn finns i färgningslösningarna som tetraklorferratanjon (FeCl

-4) och inte som Fe3+ eller som en färg- kelaʹt, det vill säga i

en ringstruktur tillsammans med färgämne (14).

Elastinfärgning kan vara till hjälp i andra typer av cancer förutom kolorektalcancer. I en studie har elastinfärgning använts för färgning av lamina elastica hos patienter med ventrikel cancer i T3N0M0 stadiet. En viktig fördel med elastisk färgning i detta sammanhang är att det enkelt kan avgöras om tumörceller har invaderat genom lamina elastica som ligger intill bukhinnas mesotelialceller. Detta hjälper till att undersöka omfattningen av bukhinna invasion, och därigenom särskilja pT3- och pT4-stadierna hos patienter med ventrikel cancer (15).

Slutsats

Utifrån detta arbete kunde konstateras att den optimala färgningsmetoden för elastinfibrer är elastinfärgning-manuell metod Region Jönköpings län. Färgningresultatet visade en stark intensitet av elastiska fibrer samt signifikant skillnad. Metoden kan därför rekommenderas

(22)

17

som rutinmässig Elastinfärgning på klinisk patologi region Värmland, centralsjukhuset Karlstad.

(23)

18

TACK/ACKNOWLEDGEMENT

Jag vill rikta ett stort tack till mina handledare Therése Lindsten, biomedicinsk analytiker med masterexamen och Måns Alving, överläkare för allt stöd och hjälp. Jag vill även tacka alla personal samt enhets chef vid klinisk patologi centralsjukhuset Karlstad för deras gott bemötande och tålamod under den praktiska delen av examensarbetet. Till sist vill jag tacka min familj för deras tålamod och stöd under hela programmet. TACK!

(24)

19

REFERENSER

1. Kumar V, Abbas AK, Aster JC. Robbin's Basic Pathology. 10th ed. Philadelphia, Pennsylvania: Elsevier; 2018.

2. Glimelius B. Multidisciplinary treatment of patients with rectal cancer: Development during the past decades and plans for the future. Ups J Med Sci. 2012 May;117(2):225-36.

3. Nationella vårdprogrammet Tjock- och ändtarmscancer, kunskapsbanken. [Internet] Regionala cancercentrum Mellansverige [uppdaterad 2020-03-25]. Hämtad från:

https://kunskapsbanken.cancercentrum.se/diagnoser/tjock-och-andtarmscancer/ 4. Vass DG, Ainsworth R, Anderson JH, Murray D, Foulis AK. The value of an

elastic tissue stain in detecting venous invasion in colorectal cancer. J Clin Pathol. 2004 Jul;57(7):769–72.

5. Aldskogius H, Rydqvist B. Den friska människan: Anatomi och fysiologi.1 uppl. Stockholm: Liber AB; 2018.

6. Lambert C, Futch HN. An evaluation of elastic tissue staining. Am J Med Technol. 1976 Sep;42(9):305-9.

7. Dey P. Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology. First ed. India: Springer Nature Singapore Pte Ltd; 2018.

8. Suvarna SK, Layton C, Bancroft JD. Bancroft’s THEORY and PRACTICE of HISTOLOGICAL TECHNIQUES. Eighth ed. China: Elsevier; 2019.

9. Cook D. J, Warren P.J. I: Cook D.J, red. Cellular pathology. 3rd ed. Banbury: Scion publishing limited; 2014.

10. Allison RT, Barr WT, Culling CFA. Cellular pathology techniques. 4th ed. UK:Butterworth & Co. (Publishers) Ltd; 1985.

11. Kazlouskaya V, Malhotra S, Lambe J, Idriss MH, Elston D, Andres C. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. J Cutan Pathol. 2013 Feb;40(2):211-25.

12. Brown RW. Histologic Preparations, Common Problems and Their Solutions. 1 ed. Illinois, USA: College of American Pathologists (CAP); 2009.

13. Santos FCA, Santos D, Corradi LS, Leite RP, Goes R, Taboga SR. A modified method for the selective staining of elastic system fibers in methacrylate tissue sections. Braz. J. morphol. Sci. 2004 Jan;21(3):135–8.

(25)

20

14. Proctor GB, Horobin RW. Chemical structures and staining mechanisms of Weigert's resorcin-fuchsin and related elastic fiber stains. Stain Technol. 1988 Mar;63(2):101-11.

15. Lei G, Yang H, Hong T, Zhang X, Yang N, Zhang Y. Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue. J Vis Exp. 2019 May 1;(147).

(26)

21

Bilagor

Bilaga 1

(27)

(28)

(29)

24

Bilaga 2

Weigert-Van Gieson elastin, Akademiska laboratoriet klinisk patologi Uppsala metodbeskrivning:

(30)

(31)

(32)

27