Ångsterilisering av morötter. Infekterade med Lactobacillus plantarum.

(1)

Examensarbetet omfattar 15 högskolepoäng och ingår som ett obligatoriskt moment i Högskoleingenjörsexamen i Kemiteknik inriktning bioteknik, 120p

Nr 2/2008

Ångsterilisering av morötter.

Infekterade med Lactobacillus plantarum.

Steam Sterilization of Carrots.

Infected with Lactobacillus plantarum.

Marcus Gjertz

(2)

Ångsterilisering av morötter, infekterade med Lactobacillus plantarum.

Steam Sterilization of Carrots, Infected with Lactobacillus plantarum.

Marcus Gjertz marcus.gjertz@gmail.com

Kandidatuppsats examensarbete Ämneskategori: Teknik Serie och nummer: Kemi 2/2008

Högskolan i Borås

Institutionen Ingenjörshögskolan 501 90 BORÅS

Telefon 033-435 4640

Examinator: Elisabeth Feuk-Lagerstedt, Högskolan i Borås Handledare: Elisabeth Feuk-Lagerstedt, Högskolan i Borås Uppdragsgivare: Brämhults Juice AB, Borås

Datum: 2008-05-22

Nyckelord: Lactobacillus plantarum, Brämhults Juice AB, morötter, ånga, sterilisering

(3)

Förord

Examensarbetet genomfördes våren 2008 vid Högskolan i Borås. Arbetets syfte var att undersöka möjligheterna för Brämhults Juice AB att använda ånga som steriliseringsmetod i produktionen av morotsjuice.

Under examensarbetets gång har jag fått stor hjälp från några personer som jag här vill tacka:

Ulf Tylestrand, kvalitetschef Brämhults Juice AB, för tapper jakt på ånggenerator.

Jonas Hansson, forskningsingenjör Högskolan i Borås, institutionen Ingenjörshögskolan, för en stor hjälp vid beställning av material (trots semester) och alternativa lösningar med ånggenerator.

Patrik Lennartsson, doktorand Högskolan i Borås, institutionen Ingenjörshögskolan, för hjälp med ånggenereringslösningar och skattjakt efter laborationsmaterial.

Ibrahim Ibrahim, språkpraktikant och livsmedelsingenjör, för två extra händer vid spädningsserier och bakteriesättning.

(4)

Abstract

The purpose of the project was to exam steams ability to sterilize carrots infected with Lactobacillus plantarum. The project was a cowork with Brämhults Juice AB. They had observed an increase of Lactobacillus in the production of carrot juice during the summer. To keep the flavour of fresh fruits, the juice is treated carefully with heat. This means that the juice only stays fresh for a few days, around two weeks for an unopened package and three days for an opened package.

In an attempt to remove the remaining Lactobacillus of the carrots, steam is tested as an extra step in the production of juice. During the project it was found that it is difficult to reach the wanted temperature of above 100°C, when the steam is generated under pressure. When the steam was released in normal pressure, a decrease in temperature occurred that were so large that the steam had a temperature of only 40°C. At the second treatment the steam was generated at 1,8 bar pressure and 130°C, the steam then decreased to 80°C.

At the third and last treatment the steam was generated under normal pressure and a

temperature of 90°C was reached. At this temperature an 96,5% sterilization occurred after 15 seconds of steam treatment. This is not enough for Brämhults Juice, since they need only a few percent surviving Lactobacills after 6 seconds.

(5)

Sammanfattning

Examensarbetets syfte var att undersöka ångas förmåga att avdöda Lactobacillus Plantarum på morötter. Arbetet utfördes för Brämhults Juice AB som, i sin produktion av nypressad morotsjuice, under sommarmånaderna observerat en för hög halt av lactobaciller som kan leda till att juicen blir dålig och jäser. Nypressad juice innebär att juicen skall drickas så snart som möjligt efter pressning. För att behålla smaken av nypressade frukter värmebehandlas juicen extra varsamt, vilket medför en mycket kort hållbarhetstid, endast två veckor i kyl för obruten förpackning och tre dagar för öppnad.

I ett försök att få bukt med överlevande lactobaciller testades ångning av morötterna, för att kunna utgöra ett extra försteg innan pressning av morötterna. Det visade sig under arbetes gång att det var svårt att få önskad temperatur, över 100°C, då ångan genererades vid ett övertryck. När ångan släpptes ut vid normalt tryck sjönk temperaturen så pass mycket att den vid första ångningen endast höll ca 40°C. När det vid andra ångningen användes en autoklav som genererade 130° ånga vid 1,8 bars övertryck erhölls temperaturer på ca 80°C.

Då ångan under sista omgången genererades vid atmosfärstryck, och leddes fram till morötterna genom isolerade glasrör, erhölls en ångtemperatur på ca 89°C. Vid denna temperatur var avdödningen 96,5% efter 15 sekunder, vilket tyvärr inte räcker för produktionen hos Brämhults Juice. För att kunna använda ångan som försteg hade avdödningen behövt ske på maximalt 6 sekunder.

(6)

Innehåll

1. Inledning ... 1

2. Bakgrund ... 2

2.1 Brämhults Juice... 2

2.1.1 Nypressad juice... 2

2.1.2 Färskpressad juice... 2

2.1.3 Nypressad morotsjuice... 3

2.2 Tidigare arbete ... 3

2.3 Mjölksyrabakterier ... 3

2.3.1 Lactobacillus plantarum... 3

2.4 Värmesterilisering... 4

2.4.1 Autoklavering ... 4

2.4.2 Pasteurisering... 4

3. Syfte ... 4

4. Material ... 4

5. Metod... 5

5.1 Infektering av morötter ... 5

5.2 Ångning... 5

5.3 Strippning av bakterier från morötterna... 5

5.4 Viable count ... 5

5.4.1 Spread plate metoden... 6

5.4.2 Pour plate metoden ... 6

5.4.3 Felkällor vid viable count ... 6

6. Genomförande ... 6

6.1 Första omgången ... 6

6.1.1 Uppodling av Lactobacillus plantarum... 6

6.1.2 Tillredning av buljong ... 7

6.1.3 Förberedning av morötter ... 7

6.1.4 Ångning av morötter... 7

6.1.5 Strippning av bakterier ... 7

6.1.6 Uppodling av bakterier ... 7

6.2 Andra omgången ... 8

6.2.1 Ångning andra omgången... 8

6.3 Tredje omgången... 8

6.3.1 Ångning tredje omgången... 8

7. Resultat och diskussion... 9

7.1 Första analys omgången... 9

7.1.1 Råa referensprover... 9

7.1.2 Övriga morötter ... 9

7.2 Andra analys omgången... 9

7.3 Tredje analys omgången ... 10

8. Slutsats... 11

9. Referenser ... 11

Bilaga 1 Resultat första analysomgången

Bilaga 2 Resultat andra analysomgången

Bilaga 3 Resultat tredje analysomgången

(7)

Bilaga 4 Bilder från ångningen

Bilaga 5 Bilder av utvalda agarplattor

Bilaga 6 Bilder

(8)

1. Inledning

Brämhults Juice AB startade med morotsjuice hösten 1948. Morötterna pressades och

tappades på flaskor. Morötterna köps in från Gotland, där de växer sig saftiga och smakrika i den kalkrika jorden. Morotsjuicen är en färskvara som måste förvaras i kylskåp, trots kylda transporter och kylförvaring så håller inte juicen någon längre tid, då den inte har några tillsatser för hållbarhet. (Brämhults Juice, 2008).

Under sommaren finns en förhöjd risk för kontaminering av juicen framförallt av

lactobaciller. Morötterna har under denna tid på året en större mängd bakterier på sig som under transport och förvaring växer till sig och får juicen att jäsa. Under 2007 gjordes ett examensarbete vid Högskolan i Borås där försök gjordes med UV-strålning för att sänka halten lactobaciller, men avdödningen nådde inte tillräckligt höga nivåer. I detta

examensarbete genomfördes istället försök med ånga (Tylestrand, 2008). Genom praktiska försök studerades hur lång tid som krävdes för att nå önskad avdödning.

(9)

2. Bakgrund

2.1 Brämhults Juice

Grunden för Brämhults Juice lades 1948 när en man vid namn Sigvard Berggren bestämde sig för att ta vara på de ovanligt saftiga morötterna som var det året och pressa dem. Morotsjuicen blev snabbt populär då den inte bara är nyttig utan även mycket god. Många kunder önskade att det skulle pressas andra smaker och andra frukter började så småningom pressas. Idag levererar Brämhults Juice mellan 20 och 25 olika smaker och smakkombinationer.

Storsäljaren idag är apelsinjuicen och har så varit sedan olika smaker började pressas.

En del smaker provas fram och en del kommer, som så många av världens stora upptäckter, till genom misstag. Jordgubb-Lime är en av Brämhults Juice smakmissar. Det började med att en stor mängd lime pressades bara för att de skulle upptäcka att det blev så surt att den inte gick att dricka. För att inte behöva slänga ett par hundra liter prima limejuice fick den blandas med vad som fanns tillgängligt, vilket bland annat var krossade jordgubbar. Väl blandad visade det sig att blandningen var mer än god, och så var en ny smakblandning upptäckt.

Brämhults Juice pressar frukter fem dagar i veckan, totalt ca 300 ton i veckan. Juicen tappas på flaskor som i obruten kylkedja fraktas till butikerna. Detta för att nypressad juice är en färskvara som måste förvaras i kyl. Av 300 ton pressad frukt blir det kvar närmare 150 ton skal. Största delen av dessa blir till djurfoder som bönderna i omgivningen föder sina djur på.

De skal som inte går till djurfoder används som jordförbättringsmedel (Brämhults Juice, 2008).

2.1.1 Nypressad juice

Nypressad juice är juice med så kort tid som möjligt från det att den pressas tills att den dricks. Detta uppnås genom att frakta frukten till det land som juicen skall pressas i, vilket ger upphov till att frukten köps från olika leverantörer och länder beroende på vilken årstid det är.

Detta medför vissa smakskillnader under året samt att vissa smaker inte kan produceras året runt. För att ge så lite smakförändringar som möjligt och behålla vitaminvärdet i juicen behandlas juice med så varsamma temperaturbehandlingar som möjligt (Brämhults Juice, 2008). Man pastöriserar vid bara 74°C för att behålla smaken av färsk frukt (Tylestrand, 2008). Detta innebär att nypressad juice enbart håller ca 2 veckor i kyl vid obruten

förpackning. Vid för varm förvaring finns risk för jäsning i juicen (Brämhults Juice, 2008).

2.1.2 Färskpressad juice

Färskpressad juice är juice som pressas direkt efter skörden i de länder där frukterna växer.

Juicen sparas och blandas från olika pressningar över året för att erhålla en så stabil smak som möjligt. Den pressade juicen pastöriseras och kyls eller fryses för transport till

tappningsanläggningen där den pastöriseras igen. Aromer och fruktkött som avlägsnats från juicen tillsätts igen innan den förpackas. Färskpressad juice är en kylvara som klarar sig ca 1 månad oöppnad i kyl (Brämhults Juice, 2008).

(10)

2.1.3 Nypressad morotsjuice

Brämhults nypressade morotsjuice var deras första produkt, och har producerats sedan 1948.

Morötterna som Brämhults Juice använder kommer från Ryftes på Gotland. (Brämhults Juice, 2008). Morötterna som växer på Gotland blir extra hållbara och söta tack vare den kalkrika jorden. Moroten är en tvåårig växt som skördars redan första året, efter att den vuxit till sig i två till tre månader (Ryftes Grönsaker AB, 2008). Morötter är populära grönsaker just för att de är lätta att lagra och kan konsumeras färska året om. De har odlats i Medelhavsområdet sedan innan Kristi födelse och kom troligen till Sverige genom klostren

(Nationalencyklopedin, 2008).

2.2 Tidigare arbete

Brämhults Juice har via AK Lab bekräftat att Lactobacillus är det bakteriesläkte som kontaminerar morotsjuicen. Under våren 2007 genomfördes vid Institutionen

Ingenjörshögskolan i Borås ett examensarbete på uppdrag av Brämhults Juice på

kandidatnivå. Examensarbetes syfte var att se över UV-ljusets påverkan på Lactobacillus plantarum och avgöra dess effektivitet som steriliseringsmetod i produktionen av Brämhults Juice nypressade morotsjuice (Azarmehr, N, Majlesi, M, 2007).

2.3 Mjölksyrabakterier

Mjölksyrabakterier är ett samlingsnamn för icke sporbildande bakterier som jäser olika sockerarter till mjölksyra. Mjölksyrabakterierna delas in i tre olika grupper beroende på deras ämnesomsättning. Dessa tre grupper är Homofermentativa, Hetrofermentiva och Fakulativa.

De homofermentiva bildar enbart mjölksyra, som till exempel Lactobacillus acidophilus som ofta används inom mejeriprodukter så som A-fil. De hetrofermentiva stammarna bildar förutom mjölksyra etanol, ättiksyra och koldioxid. De fakultativa stammarna kan vara både homofermentiva och hetrofermentiva vilket varierar med olika miljöfaktorer. Exempel på fakulativa stammar är Lactobacillus plantarum som finns både i charkprodukter och på grönsaker.

Vissa av stammarna av mjölksyrabakterierna är probiotika, vilket innebär att det har dokumenterats att de är gynnsamma för den naturliga bakteriefloran i kroppen. Dessa stammar används ofta i livsmedel för att kunna sälja produkter ur hälsosynpunkt (Nationalencyklopedin, 2008).

2.3.1 Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum är en vitt spridd mjölksyrabakterie, som vanligtvis finns på växter och även i saliv, ur vilket den först isolerades. Den har det störst kända genomet bland mjölksyrabakterierna. Precis som de andra stammarna av mjölksyrabakterier så klarar den närvaron av syre. Den till och med använder syret för att producera peroxider som troligen används som vapen mot andra bakterier för att få födan för sig själv (Wikipedia, 2008).

(11)

2.4 Värmesterilisering

Sterilisering med hjälp av värme är den vanligaste formen av sterilisering. Värmesterilisering bygger på att proteinmolekyler denaturerar vid höga temperaturer. Ju högre temperatur desto snabbare dör bakterierna. För att snabba på processen används ofta ånga för att den tränger in i skrymslen och vrår och ger en bättre och snabbare effekt än bara torr värme. (Madigan, M, Martinko, J M, & Parker, J, 2003).

2.4.1 Autoklavering

En autoklav är egentligen bara en lite mer avancerad tryckkokare, som används för att nå höga ångtemperaturer och korta steriliseringstider. En autoklav arbetar vanligen vid ett övertryck på 100 kPa och 121°C. Under 15 min hålls dessa specifikationer och steriliseringen sker. Arbetet tar längre tid då autoklaven först måste nå över trycket och sedan tyckutjämna (Nationalencyklopedin, 2008).

2.4.2 Pasteurisering

Pasteurisering är en variant av värmesterilisering som används inom livsmedelsindustrin.

Pasteurisering är egentligen ingen sterilisering då inte alla bakterier och mikroorganismer avdödas, utan bara en sådan stor del att produkten kan förvaras och ätas utan att det medför hälsorisker.

Livsmedlet som pasteuriseras hettas under ett kort ögonblick upp till en hög temperatur. Detta för att produkten inte skall ändra konsistens eller få smakändringar. Exempelvis så hettas mjölk upp till 75°C i 15 sekunder.

3. Syfte

Syftet med examensarbetet är att undersöka ångas förmåga att avdöda mjölksyrabakterier på morötter för att Brämhults Juice ska ha möjlighet att producera Nypressad morotsjuice under hela året.

4. Material

3 halsad 250 ml rundkolv Automatpipett 100 µl Automatpipett 1000 µl Blodagarplattor

Bägare 1500 ml Desinfektionsmedel Desytol 70%

Degeltång

E-kolv bredhalsad 250 ml Frystorkad Lactobacillus plantarum stam CCUG 30503 batch 021107 Gasolbrännare Glasfiberull Kabelkanalskorg Klämmor

Handskar Morötter 180st Muffar

Mätglas 100 ml Peptonvatten 7578 ml Plastfolie

Pipettspets 100 µl Pipettspetsar 1 ml

(12)

Plastburk 250 ml, Fischer artnr. 116-103650

Plastpåsar Toppits Zipper 3 liter

Platinöser Racklor

Skakinkubator Signal Blood Culture System Incubator Shaker Spädningsrör Stativ

Steril täckplast

Termometer Torkrör

Värmeskåp Termaks Ångaggregat 10kW, Technovap Steam tech 12000

5. Metod

Metoden som används för infektering och strippning av bakterier är samma metod som användes vid examensarbetet ”UV-ljusets effekter på Lactobacillus plantarum vid kortvarig bestrålning på morötter” som genomfördes våren 2007 vid Högskolan i Borås institutionen Ingenjörshögskolan (Azarmehr, N, Majlesi, M, 2007).

5.1 Infektering av morötter

Morötterna placeras i ett kar innehållande en buljong med Lactobacillus plantarum, där de får ligga och infekteras i 24 timmar. Detta för att morötterna ska mättas med Lactobacillus plantarum. Morötterna flyttas sedan till plastpåsar i vilka de inkuberas i 24 timmar (Azarmehr, N, Majlesi, M, 2007).

5.2 Ångning

Morötterna placeras på ett galler ca 50 cm från munstycket på ånggeneratorn. Ångans temperatur bör ligga över 100°C för att ge en tillräckligt snabb avdödning. Munstycket hålls stilla ovanför morötterna och ångan sprutas över, under den utsatta tiden. Munstycket flyttas sedan under morötterna och en ny ångbehandling med samma tid genomförs underifrån.

5.3 Strippning av bakterier från morötterna

Morötterna placeras i peptonvatten under 2 timmar för att de bakterier som finns kvar på ska släppa från morötterna. Bakterierna bildar tillsammans med peptonvattnet en buljong som fungerar som stamlösning, som späds ut för att kunna odlas upp och räkna bakterier (Azarmehr, N, Majlesi, M, 2007).

5.4 Viable count

När viable count används så räknas bara levande celler till skillnad från total count där det inte går att skilja på levande och döda celler. Metoden fungerar genom att en lösning med okänd mängd bakterier späds till olika koncentrationer. Lösningen späds olika många gånger beroende på hur koncentrerad stamlösningen är. Vanligtvis så späds lösningen fler gånger vid spread plate gentemot pour plate.

Det vanligaste är att lösningen späds 1 ml bakterielösning + 9 ml spädningsmedium. Första spädningen sker med 1 ml stamlösning medan andra spädningen utgår från spädningnummer

(13)

1. Spädning nummer tre utgår från andra steget i spädningsserien och så fortgår det, med så många spädningar som krävs. Detta resulterar i att varje spädning ökar med en tiopotens (10¹, 10², 10³ osv). Spädningen odlas sedan upp på en agarplatta. Principen är att en bakterie skall ge upphov till en koloni på plattan. Efter inkubering räknas antalet kolonier och multipliceras med 10ⁿ, där n är numret på spädningen i serien. Detta ger antalet bakterier i volymen som applicerats på agarplattan. (Madigan, M, Martiko, J M, & Parker, J, 2003).

5.4.1 Spread plate metoden

Vid spread plate metoden appliceras en liten volym, vanligtvis 100 µl eller mindre, på en agarplatta. Lösningen sprids på plattan med hjälp av en rackla så att det bildas en jämn film över hela plattan. Agarplattan inkuberas sedan, tills kolonier bildas av bakterierna. Tanken är att varje bakterie ska ge upphov till en koloni och att räkning av kolonier motsvarar antalet bakterier per milliliter av lösningen (Madigan, M, Martinko, J M, & Parker, J, 2003).

5.4.2 Pour plate metoden

Pour plate skiljer sig mot spread plate genom att den klarar större volymer, max 1 ml.

Provvolymen av spädningen hälls i en tom steril platta. Agarlösning hälls sedan på och plattan snurras för att blanda provet med agar. Agarn får sedan stelna innan den inkuberas och

bakteriekolonierna kan räknas. Plattan kommer att innehålla kolonier både på ytan och inne i agarn. Kravet för denna metod är att bakterierna klarar de temperaturer som smält agar innebär. (Madigan, M, Martinko, J M, & Parker, J, 2003).

5.4.3 Felkällor vid viable count

En inte alltför ovanlig felfaktor med denna metod är att bakterierna inte ligger en och en eller ligger så pass nära varandra att när kolonier börjar växa så ger två eller flera bakterier upphov till enbart en koloni. Resultatet blir att antalet bakterier blir lägre vid framräkning än vad det egentliga antalet är. Skulle agarplattan inte inkuberas tillräckligt länge finns även en risk att alla bakterier inte hinner utveckla kolonier stora nog för att bli räknade (Madigan, M, Martinko, J M, & Parker, J, 2003).

6. Genomförande

Genomförandet av det praktiska arbetet skedde i tre omgångar.

Under den första omgången besprutades morötterna under 5, 10, 15, 20 och 25 sekunder med ånga, för att se bakteriens värmeresistens. Då det uppstod problem med ångans temperatur under första ångningen, den låg endast på 40°C, genomfördes andra ångningen med samma exponerings tider. Då endast 78°C uppnåddes vid andra ångningen genomfördes även tredje omgången med samma exponeringstider.

6.1 Första omgången

6.1.1 Uppodling av Lactobacillus plantarum

100 µl buffrat peptonvatten tillsattes till ampullen med den frystorkade bakteriekulturen. Den upplösta bakteriekulturen hälldes över en blodagarplatta, och racklades ut. Plattan placerades sedan i inkubatorn med 37°C i 48 timmar.

(14)

6.1.2 Tillredning av buljong

Två stycken autoklaverade 1500 ml-bägare fylldes med vardera 1000 ml buffrat peptonvatten.

Bakteriekolonier flyttades från en inkuberad blodagarplatta med hjälp av platinös till de båda bägarna som sedan täcktes med plastfolie och placerades i en skakinkubator vid 37°C och ca 60 skakningar/min. En ny strykning av bakterien gjordes på en ny blodagarplatta för framtida behov.

6.1.3 Förberedning av morötter

68 stycken jämstora morötter hämtades från Brämhults Juice AB. Morötterna plockades av från transportbandet direkt efter tvätt och skrubbning. Morötterna plockades med

desinfekterade handskar och lades i plastpåsar som förslöts.

Morötterna fraktades till laboratoriet på Högskolan där 21 stycken som var så lika som

möjligt valdes ut. 3 av morötterna valdes som referensprover och placerades i plastburkar med 200 ml peptonvatten för att strippas på bakterier. Efter två timmar gjordes spädningsserier på peptonvattnet. Odlingar sattes sedan på alla spädningar som på grund av helg fick inkuberas i 3,5 dygn, bilaga 6.

Övriga 18 morötter placerades i två 1500 ml bägare med vardera 1000 ml buljong. Bägarna täcktes med plastfolie och ställdes i skakinkubatorn i 24 timmar vid 37°C och ca 60

skakningar/min. Efter 24 timmar plockades morötterna ut ur buljongen och placerades i förslutna plastpåsar för att sedan inkuberas i 45 timmar, bilaga 6.

6.1.4 Ångning av morötter

Morötterna fraktades i förslutna plastpåsar till Brämhult Juice AB. Ett galler monterades upp med hjälp av fyra stycken stativ. En ånggenerator avsedd för städning, Technovap Steam tech 12000, användes för att ångbehandla morötterna.

Morötterna flyttades sedan med hjälp av en degeltång till gallret där de ångades. Morötterna ångades från cirka 30 cm avstånd under 5, 10 15, 10 och 25 sekunder. Först ångades

morötterna från ovansidan och sedan lika länge från undersidan. När morötterna blivit behandlade med ånga placerades de i 250 ml plastburkar innehållande cirka 100 ml buffrat peptonvatten. Tre stycken morötter placerades direkt i varsin burk utan att ha blivit

behandlade med ånga. Dessa tre morötter fick utgöra referensprover, bilaga 4.

6.1.5 Strippning av bakterier

Morötterna strippades efter ångningen på bakterier genom att placeras i plastbägare med 100 ml buffrat peptonvatten. Peptonvattnet hade mätts upp ungefärligt genom att 100 ml

kranvatten mättes upp i ett 100 ml mätglas och hälldes i en burk. Övriga burkar ställdes en och en bredvid och peptonvatten fylldes på tills nivåerna i de båda burkarna var lika.

Morötterna fick ligga i peptonvattnet i två timmar innan prov togs ut från peptonvattnet, bilaga 6.

6.1.6 Uppodling av bakterier

Från varje burk med referensmorot och peptonvatten pipetterades 0,8 ml buljong ned i ett spädningsrör med peptonvatten. Spädningen gjordes om 5 gånger så att en spädnings serie med 6 rör erhölls för varje referensprov. Från de övriga 15 burkarna med morötter och

(15)

buljong pipeterades 1 ml buljong ner i ett spädningsrör. Även detta upprepades fem gånger så att spädningsserier med sex rör erhölls för varje morot.

Från samtliga 108 spädningsrör pipetterades 100 µl till lika många blodagarplattor. Proverna racklades ut över plattorna och plattorna märktes upp identiskt med spädningsrören.

Agarplattorna sattes sedan i inkubator vid 37°C i 48 timmar.

6.2 Andra omgången

Under andra omgången genomfördes inhämtning, infektering, strippning och uppodling på samma sätt som under första omgången. Det som skilde sig från första omgången var metoden för att ånga morötterna då tillräckligt hög temperatur kunde uppnås första gången.

6.2.1 Ångning andra omgången

Denna omgång genomfördes i högskolans kemiteknik laboratorium. Som ånggenerator användes autoklaven, som fylldes med extra vatten och ställdes in på 130°C. När autoklaven nått utsatt temperatur och ett övertryck på nästan 1,8 bar öppnades en ventil och ånga

strömmande ut. Med hjälp av en degeltång hölls morötterna cirka 4 cm från ventilen under en viss tid och sedan roterades morötterna 180° och ångades lika lång tid igen. Ångans

temperatur uppmättes till 78°C på det avstånd som morötterna ångades på, bilaga 4.

6.3 Tredje omgången

Inhämtning, infektering, strippning och uppodling genomfördes på samma sätt som de två tidigare omgångarna men då ingen av de två första ångningsmetoderna uppnådde önskad temperatur provades en ny metod för att ånga morötterna.

6.3.1 Ångning tredje omgången

Eftersom två tidigare försök gjorts där högtrycksånga använts gjordes nu ett försök att

använda ånga genererad vid atmosfärstryck. Två stycken trehalsade 250 ml rundkolvar fylldes med vatten och två torkrör sattes i de yttre halsarna. Mittenhalsen sattes igen med en

glaspropp. Torkrören och deras halsar isolerades med hjälp av glasfiberull för att ge en så liten värmeförlust som möjligt hos ångan. Vattnet i de båda kolvarna värmdes med

gasolbrännare och ångan leddes ut genom de fyra torkrören, som mynnade ut precis under ett galler där morötterna placerades.

Ångans temperatur uppmättes till 89°C på gallret där morötterna placerades i ångströmmen.

Morötterna fick ligga i ångan under exponeringstiden för att sedan snurras 180° och exponeras ytterligare.

(16)

7. Resultat och diskussion

7.1 Första analys omgången

7.1.1 Råa referensprover

Vid första analysomgången plockades tre stycken morötter ut direkt vid urvalet. Dessa morötter fick utgöra en referens för hur mycket bakterier som fanns på morötterna innan de infekterades. Morötterna fick genomgå samma strippningsbehandling som övriga morötter och spädningsserier gjordes som sedan odlades upp. Odlingarna visade att det i buljongen från morötterna fanns cirka 3,2⋅10³bakterier per ml. Det gjordes inga försök att identifiera vilka bakterier det var som växte, utan det var bara en jämförelse för att veta att morötterna efter infektering huvudsakligen bar på Lactobacillus plantarum.

7.1.2 Övriga morötter

Då ångan endast höll 45°C skedde en liten avdödning av bakterier men inte alls i den önskade utsträckningen. Efter 5 sekunder hade 30% av bakterierna dött och vid 10 sekunders

besprutning 60%. Avdödningen avstannade sedan vilket syns i tabell 1 och ingen direkt påverkan av tiden kunde ses. Detta beror troligen på att bakterierna snarare slets bort från morötterna på grund av högt tryck hos ångan än att de dog av temperaturen (Bilaga 5).

Tabell 1: Ångbehandling av morötter vid 40^oC (Bilaga 1)

Tid Bakterier/ml Avdödning (%)

Rå referens 3,2⋅10³ -

Infekterad referens 3,1⋅10⁷ -

5 sekunder 2,1⋅10⁷ 30,1

10 sekunder 1.2⋅10⁷ 60,5

15 sekunder 1.2⋅10⁷ 61,1

20 sekunder 8,8⋅10⁶ 71,2

25 sekunder 1.4⋅10⁷ 54,5

7.2 Andra analys omgången

Andra gången ångningen skedde på Högskolans kemitekniklaboratorium och med hjälp av autoklaven. Ångan höll denna gång en temperatur på 78°C. I tabell 2 kan en tydlig gräns synas mellan 15 och 20 sekunders behandling. Även denna ånga genererades vid ett övertryck vilket gjorde att morötterna utsattes för ett högt tryck som mycket väl kan ha slitit bort

bakterier till viss del. Övertrycket medförde även att en drastisk temperaturminskning när trycket minskade (Bilaga 5).

(17)

5 sekunder 9,7⋅10⁶ 56,6

10 sekunder 1,7⋅10⁷ 22,7

15 sekunder 9.3⋅10⁶ 58,5

20 sekunder 2,2⋅10⁶ 90,0

25 sekunder 5,6⋅10⁵ 97,5

7.3 Tredje analys omgången

Tredje omgången med ångbehandling skedde med hjälp av ett hemmabygge med rundkolvar som det kokades vatten i. Vattenångan leddes sedan med hjälp av torkrör till en gemensam punkt över vilken morötterna placerades på ett galler. Resultaten från denna ångbehandling beror enbart på ångans temperatur då det inte var något tryckskillnad som kunde skapa krafter till att slita bort några bakterier.

Resultatet denna gång visar att 96,5% av bakterierna dör vid 15 sekunder behandling men tyvärr så stiger inte siffran med de längre behandlingstiderna. Detta tyder på att det krävs en temperaturökning för att få en bättre avdödning. Minskningen i avdödning kan ha berott på skillnader i morötternas skrovlighet eller att ångan inte kommit runt moroten lika bra.

5 sekunder 1,6⋅10⁷ 58,7

10 sekunder 6,9⋅10⁶ 81,5

15 sekunder 1,3⋅10⁶ 96,5

20 sekunder 2,2⋅10⁶ 94,2

25 sekunder 1,7⋅10⁶ 95,6

En stor möjlig felkälla i arbetet är Viable count spread plate metoden, då den bygger på att alla kolonier på plattan enbart uppkommit av vardera en bakterie. Då flera kolonier är mycket större och man på vissa ställen kan se att en stor koloni består av två kolonier som växt ihop, ger metoden som bäst en uppskattning av antalet bakterier.

Lokalen hos Brämhults Juice AB var inte någon optimal lokal då ångningen utfördes i deras källare. Denna lokal medförde en stor risk för kontaminering som förhoppningsvis

minimerades genom noggrant och försiktigt arbete. Då enbart den första ångbehandlingen genomfördes där påverkades inte de övriga två omgångarna av detta.

Uppodlingen av råreferenserna säger inte mycket mer än att det fanns bakterier på morötterna som växer på blodagar. Det fick förutsättas att dessa bakterier, om det var annat än

lactobaciller, antingen dog under den syrefria inkubationen eller inte tålde ångbehandlingen bättre än Lactobacillus plantarum.

(18)

När morötterna ångbehandlades uppstod felkällor på grund av att ånga endast kunde sprutas från ett håll i taget. Detta medförde att morötterna ångades två gånger på varje tid, en gång uppifrån för att sedan vändas 180° och ångans samma tid en gång till nedifrån. Ångan kryper utmed sidorna på morötterna och gör att delar av morötterna utsätts för längre exponering än tänkt ända upp till dubbel exponeringstid.

Morötterna blev även de en felkälla då morötter inte växer i formar utan alla ser lite olika ut.

Morötterna som valdes ut var så lika som möjligt vilket inte var alltför svårt inom vardera analysomgång men tyvärr blev det små skillnader omgångarna emellan, morötternas volym ska ha varit relativt lika men skrovligheten var svår att matcha emellan gångerna. Detta är visserligen representativt för morötterna som finns i juiceproduktionen, men eftersom så få morötter användes till den här rapporten kan värdarna variera lite för mycket.

8. Slutsats

Sterilisering av morötter med hjälp av ånga fungerar inte då temperaturminskningen hos ångan sker för snabbt. När ångan lämnar kokkärlet sker en tryckminskning som innebär en värmeförlust. Ju högre tryck inne i kokkärlet desto kraftigare värmeförlust, när ångan

expanderar ut i normalt lufttryck. Temperaturen sjunker så pass mycket att ångan inte ger en tillfredställande avdödning. Resultaten visar på en tydlig ökning i avdödningen mellan 40 och 80°C, och en tydlig skillnad även mellan 80 och 90°C. Siffrorna visar att en högre temperatur ger en snabbare avdödning.

9. Referenser

Azarmehr, N, Majlesi, M (2007) UV-ljusets effekter på Lactobacillus plantarum vid kortvarig bestrålning på morötter. Borås: Högskolan i Borås. Teknisk rapport K4/2007.

Brämhults Juice (2008) <http://www.bramhults.se> [hämtad 080228]

Madigan, M, Martinko, J M, & Parker, J,(2003) Brock Biology Of Microorganisms , National Encyklopedin (2008) <http://www.ne.se> [hämtad 080228]

Ryftes Grönsaker AB (2008) <http://www.ryftes.se/vegetable.shtml> [hämtad 080228]

Sárvári Horváth, I (2008) post doc vid Institutionen Ingenjörshögskolan, Högskolan i Borås, tel, 033 – 435 46 84 [samtal 10 mars]

Tylestrand, U (2008) Kvalitetschef Brämhults Juice AB, Borås, tel. 033 – 20 45 18 [flera samtal våren 2008]

Wikipedia (2008) <http://en.wikipedia.org/wiki/Lactobacillus_plantarum> [hämtad 080229]

(19)

Resultat första analysomgången Bilaga 1

Platta nr Späd. Kolonier Medelvärde Bakterier/ml

10^1 Många Många

10^2 34 32,33333333 3,2333⋅10³

10^3 6 2,333333333

10^4 0 0,333333333

10^5 0 0

rå ref 1

10^6 0 0

10^1 Många

10^2 28

10^3 1

10^4 0

10^5 0

rå ref 2

10^6 0

10^1 Många

10^2 35

10^3 0

10^4 1

10^5 0

rå ref 3

10^6 0

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 102 125,3333333 3,0599⋅10⁷

10^5 10 10

infek ref 1

10^6 1 0,333333333

10^1 Många 10^2 Många 10^3 Många

10^4 128

10^5 11

infekt ref 2

10^6 0

10^4 146

10^5 9

infekt ref 3

10^6 0

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 253 214 2,1400⋅10⁷

10^5 22 21

5 sekunder 1

10^6 1 2,333333333

10^4 169

10^5 24

5 sekunder 2

10^6 5

10^4 220

10^5 17

5 sekunder 3

(20)

Resultat första analysomgången forts. Bilaga 1

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 128 121,3333333 1,2100⋅10⁷

10^5 12 14,33333333

10 sekunder 1

10^6 1 1

10^4 50

10^5 7

10 sekunder 2

10^6 1

10^4 186

10^5 24

10 sekunder 3

10^6 1

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 113 119 1,1900⋅10⁷

10^5 14 15,66666667

15 sekunder 1

10^6 0 2

10^4 119

10^5 12

15 sekunder 2

10^6 2

10^4 125

10^5 21

15 sekunder 3

10^6 4

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 71 88 8,8000⋅10⁸

10^5 13 13,66666667

20 sekunder 1

10^6 1 1

10^4 112

10^5 14

20 sekunder 2

10^6 2

10^4 81

10^5 14

20 sekunder 3

10^6 0

(21)

Resultat första analysomgången forts. Bilaga 1

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 81 139,3333333 1,3933⋅10⁷

10^5 10 19

25 sekunder 1

10^6 2 1,666666667

10^4 166

10^5 32

25 sekunder 2

10^6 3

10^4 171

10^5 15

25 sekunder 3

10^6 0

(22)

Resultat andra analysomgången Bilaga 2

Platta nr Späd. Kolonier Medelvärde Bakterier/ml

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 201 224,3333333 2,2433⋅10⁷

10^5 16 49

infek ref 1

10^6 1 3,666666667

10^4 281

10^5 39

infekt ref 2

10^6 5

10^4 92

10^5 191

infekt ref 3

10^6 5

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 47 97,33333333 9,7333⋅10⁶

10^5 4 11

5 sekunder 1

10^6 0 1,333333333

10^4 138

10^5 21

5 sekunder 2

10^6 4

10^4 107

10^5 8

5 sekunder 3

10^6 0

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 135 173,3333333 1,7333⋅10⁷

10^5 18 27

10 sekunder 1

10^6 3 2,333333333

10^4 242

10^5 38

10 sekunder 2

10^6 3

10^4 143

10^5 25

10 sekunder 3

10^6 1

(23)

Resultat andra analysomgången forts. Bilaga 2

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 89 93 9,3000⋅10⁶

10^5 20 16

15 sekunder 1

10^6 3 1

10^4 121

10^5 19

15 sekunder 2

10^6 0

10^4 69

10^5 9

15 sekunder 3

10^6 0

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 152 223,3333333 2,2333⋅10⁶ 10^4 5 25,66666667 2,5667⋅10⁶

10^5 1 1,666666667

20 sekunder 1

10^6 2 1,333333333

10^1 Många 10^2 Många

10^3 126

10^4 18

10^5 3

20 sekunder 2

10^6 1

10^3 392

10^4 54

10^5 1

20 sekunder 3

10^6 1

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 44 56,33333333 5,6333⋅10⁵ 10^4 4 6,333333333 6,3333⋅10⁵

10^5 0 0

25 sekunder 1

10^6 0 0

10^3 57

10^4 2

10^5 0

25 sekunder 2

10^6 0

10^3 68

10^4 13

10^5 0

25 sekunder 3

10^6 0

(24)

Resultat tredje analysomgången Bilaga 3

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 322 375 3,7500E+07

10^5 32 30,66666667

infek ref 1

10^6 4 4

10^4 245

10^5 25

infekt ref 2

10^6 5

10^4 558

10^5 35

infekt ref 3

10^6 3

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 123 155 1,5500E+07

10^5 15 15

5 sekunder 1

10^6 0 1,333333333

10^4 140

10^5 19

5 sekunder 2

10^6 2

10^4 202

10^5 11

5 sekunder 3

10^6 2

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 Många Många

10^4 100 69,33333333 6,9333E+06

10^5 15 9,333333333

10 sekunder 1

10^6 0 0,333333333

10^4 67

10^5 10

10 sekunder 2

10^6 0

10^4 41

10^5 3

10 sekunder 3

10^6 1

(25)

Resultat tredje analysomgången Bilaga 3

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 145 129,6666667 1,2967E+06 10^4 10 16,33333333 1,6333E+06

10^5 1 1,666666667

15 sekunder 1

10^6 0 0,333333333

10^3 76

10^4 29

10^5 1

15 sekunder 2

10^6 0

10^3 168

10^4 10

10^5 3

15 sekunder 3

10^6 1

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 164 218 2,1800E+06

10^4 20 27,33333333 2,7333E+06

10^5 - -

20 sekunder 1

10^6 - -

10^3 314

10^4 47

10^5 -

20 sekunder 2

10^6 -

10^3 176

10^4 15

10^5 -

20 sekunder 3

10^6 -

10^1 Många Många

10^2 Många Många

10^3 46 167 1,6700E+06

25 sekunder 1

10^4 3 25,66666667 2,5667E+06 10^1 Många

10^2 Många

10^3 218

25 sekunder 2

10^4 40

10^3 237

25 sekunder 3

10^4 34

(26)

Bilaga 4

Ånggeneratorn hyrdes in och är en rengörings maskin. Maskinen ska enligt speciﬁ kation avge en ånga med en temperatur på mellan 165 och 180 grader celsius. Vid mätning erhölls dock endast en temperatur på mellan 70 och 80 grader Celsius.

Ställningen som användes till ångningen bestod av fyra stycken stativ med muff och gripklo. Samt en modiﬁ erad gallerkorg. Galler korgen är ursprungenligen tänkt att sättas upp i taket och dra elkablar i. Korgen modiﬁ erades med ståltråd så att morötterna inte skulle falla igenom eller kunna rulla iväg.

Morötterna placerades på gallret för att kunna ångas från både ovan och nedan sidan.

1(3) Ångnings utrustning första analysomgången

(27)

Bilaga 4 Ångningsutrustning andra analysomgången

I andra ananlysomgången användes en autoklav som ånggenerator. Autoklaven fylldes med extra vatten och ställdes sedan in på 130 grader. När autoklaven var uppe i temperatur och nådde ett övertryck på närmare 1,8 bar, öpnnades ventilen så att ångan strömmade ut. Ångans temperatur mättes till 78 grader.

Morötterna hölls i ångan med hjälp av en degeltång.

(28)

Bilaga 4

3(3) Ångningsutrustning tredje analysomgången

Efter att provat två olika ångaggregat släpptes fantasin loss och tredje ångningen genomfördes med delar av destilationsutrustningen från kemiteknik laboratoriet. Det som användes var 5 st stativ med muffar och gripklor, 1 st gallerkorg 2 st tre halsade rundkolvar, 4 st torkrör samt glasﬁ berull för isolering.

Vatten kokades i rundkolvarna och vattenångan leddes genom torkrören ut under korgen. Ångan höll en temperatur av 89 grader vid korgen där morötterna ångades.

(29)

Rå referens 1 spädning 101 Rå referens 1 spädning 103

Rå referens 1 spädning 102

BILAGA 5 Rå referense spädningr 10¹, 10² och 10³.

(30)

Infekterad referens 1 spädning 10

3

5

4

3

5

4

3

5

4

BILAGA 5 Analysomgång 1 Infekterade referenser spädningar 10³, 10⁴ och 10⁵.

2 (19)

(31)

5 sekunder 1 spädning 103 5 sekunder 1 spädning 105

5 sekunder 1 spädning 104

BILAGA 5 Analysomgång 1 5 sekunder spädningar 10³, 10⁴ och 10⁵.

(32)

4 (19)

(33)

(34)

6 (19)

(35)

(36)

Infekterad referens 1 spädning 103 Infekterad referens 1 spädning 105

BILAGA 5 Analysomgång 2 infekterade referenser spädningar 10³, 10⁴ och 10⁵.

8 (19)

(37)

(38)

10 (19)

(39)

(40)

BILAGA 5 Analysomgång 2 20 sekunder spädningar 10², 10³ och 10⁴.

12 (19)

(41)

(42)

3

5

4

3

4

3

5

4

BILAGA 5 Analysomgång 3 infekterad referens spädningar 10³, 10⁴ och 10⁵.

14 (19)

(43)

5 sekunder 3 spädning 103 5 sekunder 3 spädning 105+

(44)

16 (19)

(45)