KOLAGEN A JEHO POUŽITÍ V TKÁŇOVÉM INŽENÝRSTVÍ
Bakalářská práce
Studijní program: B3107 – Textil
Studijní obor: 3106R004 – Netkané textilie Autor práce: Václav Peroutka
Vedoucí práce: Ing. Petr Mikeš, Ph.D.
Tento list nahraďte
originálem zadání.
Prohlášení
Byl jsem seznámen s tím, že na mou bakalářskou práci se plně vzta-huje zákon č.
121/2000 Sb., o právu autorském, zejména § 60 – školní dílo.
Beru na vědomí, že Technická univerzita v Liberci (TUL) nezasahuje do mých autorských práv užitím mé bakalářské práce pro vnitřní potřebu TUL.
Užiji-li bakalářskou práci nebo poskytnu-li licenci k jejímu využití, jsem si vědom povinnosti informovat o této skutečnosti TUL; v tomto pří-padě má TUL právo ode mne požadovat úhradu nákladů, které vyna-ložila na vytvoření díla, až do jejich skutečné výše.
Bakalářskou práci jsem vypracoval samostatně s použitím uvedené literatury a na základě konzultací s vedoucím mé bakalářské práce a konzultantem.
Současně čestně prohlašuji, že tištěná verze práce se shoduje s elek-tronickou verzí, vloženou do IS STAG.
Datum:
Podpis:
ANOTACE
Tato práce se zabývá popisem kolagenu ve všech strukturách, jeho lokalizací a funkcí v lidském organismu. Je také zaměřena na využití kolagenu ve tkáňovém inženýrství. Jsou zde popsány postupy výroby nanovláken z kolagenu vyrobených nebo kolagenem obohacených. Dále je zde uveden stručný popis několika přístrojů, používaných k pozorování a hodnocení těchto nanovlákenných materiálů. Experimentální část byla zaměřena na extrakci kolagenu, získaného ze šlach a následně rozpuštěného ve zředěné kyselině octové. Byla použita metoda elektrostatického zvlákňování z tyčky.
KLÍČOVÁ SLOVA:
Kolagen, polymer, protein, aminokyselina, polysacharid, disacharid, extracelulární matrix, tkáňové inženýrství, nanovlákno, elektrostatické zvlákňování
ANNOTATION
´
This bachelor thesis deals with the description of collagen in all structures, its location and function in human organism. Then it disserts on the use of collagen in tissue engineering.
In this thesis there is described production sequence of collagen-enriched nanofibres and nanofibres made of collagen. It also gives a brief description of several devices used for observation and evaluation of these nanofibrous materials. Experimental part was focused on extraction of collagen acquired from sinews and dissolved in a solution of acetic acid. The method of electrospinning from a bar was used.
KEY WORDS:
Collagen, polymer, protein, amino acid, polysaccharide, disaccharide, extracellular matrix, tissue engeneering, nanofiber, electrospinning
Obsah
1. Úvod – cíl práce ...6
2. Teoretická část ...7
2.1. Popis kolagenu a jeho funkce v lidském těle ...7
2.1.1. Kolagen – pojivá tkáň ...7
2.1.2. Kolagen – extracelulární matrix – složky ...10
2.1.3. Biosyntéza kolagenu ...13
2.2. Využití kolagenu ve tkáňovém inženýrství ...14
2.2.l. Praktické příklady využití kolagenu ve směsi s jinými polymery ...14
2.2.2. Praktické příklady využití uměle připravených peptidů, podobných kolagenu ..15
2.2.3. Praktické příklady využití přímého zvláknění extrahovaného kolagenu ...21
2.2.4. Infračervená spektroskopie s Fourierovou trannsformací ...23
2.2.5. Shrnutí a porovnání různých způsobů zpracování kolagenu...24
3. Praktická část ...24
3.1. Získávání vzorků ...24
3.2. Zpracování vzorků ...26
3.3. Rozpouštění vzorků ...27
3.4. Popis přístrojů a chemikálií...31
3.5. Diskuze výsledků – zhodnocení ...32
4. Závěr ...33
Použitá literatura ...34
l. Úvod – cíl práce
Kolagen je jako přírodní protein, který se nachází v živých organismech, využíván již po staletí. Představuje důležitou přirozenou součást mezibuněčné hmoty. Není toxický a nezpůsobuje zánět ani podráždění organismu. Pro tyto vlastnosti se v současné době kolagen jeví jako vhodný materiál pro použití v regenerativní medicíně. Její obor – tkáňové inženýrství se zabývá navrhováním, specifikací a vytvářením buněk, biologických materiálů nebo biomolekul s cílem obnovit nebo modifikovat biologické funkce tkání. Protože se jedná o novou a dosud málo probádanou oblast, je třeba široké mezioborové spolupráce lékařů, biologů, chemiků a materiálových inženýrů. [12]
Aby se však kolagen mohl pro tyto aplikace využít, je třeba jej převést do roztoku, vhodného ke zvláknění do podoby nanovláken. Nanovlákna fungují jako dočasná buněčná lešení – scaffoldy, která mají zajistit buňkám oporu, dokud si nevytvoří své vlastní podpůrné bílkoviny a další ochranné a výplňkové struktury. V průběhu tohoto výrobního procesu nesmí dojít k degradaci kolagenu, což by vedlo k jeho přeměně na želatinu. V procesu nahrazování scaffoldu živou tkání, je naopak žádoucí, aby se v důsledku přirozené degradace scaffold postupně rozkládal na tělu neškodné produkty. [12]
Splnění těchto požadavků klade velké nároky na použité pracovní postupy a na vhodně zvolené způsoby aplikace při řešení konkrétních případů v regenerativní medicíně. [12]
Úkolem této bakalářské práce je hledat a získat co nejvíce informací o kolagenu a ověřit je na praktickém příkladu. Cílem je shrnout výsledky současné vědy v oblasti přípravy a použití kolagenových scaffoldů. Smyslem této práce je poskytnout informace, které by v budoucnu mohly vést k vytvoření struktury co nejvíce napodobující a nahrazující extracelulární matrix.
Vzhledem k tomu, že v Krajské vědecké knihovně v Liberci je nedostatek odborné literatury, týkající se tohoto problému, je proto úkolem této práce zmapovat danou oblast.
Teoretická část obsahuje popis kolagenu a jeho význam v lidském organismu, dále pak jeho využití pro tkáňové inženýrství.
Praktická část zahrnuje popis experimentu, přípravu vzorků, jejich rozpouštění, tabulku průběhu odpařování vzorků a shrnující tabulku, ukazující chování vzorků během pokusů.
2. Teoretická část
2.1. Popis kolgenu a jeho funkce v lidském těle
Kolagen, který je těžištěm této bakalářské práce, je jedna z nehojnějších bílkovin, neboli proteinů v lidském těle. Tvoří asi 25 % všech proteinových struktur v živých tkáních.
Tato látka je zkoumána bezmála 70 let a jeden produkt jejího rozkladu – želatina je znám snad každému. Pro pochopení významu kolagenu v živém organismu je třeba si udělat alespoň přibližnou představu, na jakých úrovních se tato látka projevuje a kde ji lze sledovat. Kolagen tvoří součást mezibuněčné hmoty, nazývané extracelulární matrix. Tato hmota udržuje buňky na svých místech, poskytuje jim oporu a ochranu a v některých případech možnosti růstu. Je pochopitelně také tvořena a produkována buňkami, což spolu vytváří systém nazývaný pojivá tkáň. [1]
2.1.1. Kolagen – pojivá tkáň
Většina orgánů, pomineme-li různé specializované buňky (jako jsou jaterní hepatocity a zárodečné buňky v kostní dřeni), si je podobná, protože ve své hmotě obsahuje jednu z několika typů pojivých tkání. [1]
Obr. č. 1 Všechny složky, vyskytující se v pojivé tkáni [1]
K základním typům těchto tkání patří: areolární vazivová tkáň, tuková tkáň, retikulární pojivá tkáň, hustě neuspořádané kolagenní vazivo, hustě uspořádané kolagenní vazivo, hyalinní chrupavka, elastická chrupavka, vazivová chrupavka a kost. [1]
Areolární vazivová tkáň
Vystýlá nervy a drobné cévy. Obsahuje kolagenní vlákna, retikulární vlákna a elastinová vlákna. Buňky se nazývají fibriocyty. [1]
Tuková tkáň
Je podobná areolární tkáni. Obsahuje navíc asi 90% objemu tukových buněk. Existuje ve dvou podobách, obě jsou silně cévně zásobeny. Bílá tuková tkáň funguje jako zásobárna tuku a nachází se pod kůží a v blízkosti srdce, lymfatických uzlin, v kostní dřeni a v blízkosti dalších orgánů se zvýšenou metabolickou aktivitou. Tukové polštářky vystýlají očnici a stabilizují vnitřní orgány, jako například žaludek. Hnědá tuková tkáň také přijímá tuky a živiny z krevního oběhu, ale neslouží jako jejich mezisklad. Tato tkáň se ve zvýšeném množství nachází v podkoží novorozenců, kde kromě přirozené izolace využívá v sobě energii obsaženou k produkci dalšího metabolického tepla. [1]
Retikulární pojivá tkáň
Obsahuje hlavně retikulární síť. Vyskytuje se v lymfatických uzlinách, v kostní dřeni a ve slezině. [1]
Hustě neuspořádané kolagenní vazivo
Jedná se o typ areolární vazivové tkáně, která obsahuje silná neuspořádaná vlákna.
Všemi směry tato vlákna míří ve škáře, naopak tam, kde tato skupina tvoří vazivová pouzdra kloubů a dalších orgánů, jsou vlákna uspořádána do vrstev, kdy každá další obsahuje vlákna s kolmým průběhem na předchozí vrstvu. [1]
Hustě uspořádané kolagenní vazivo
Jedná se o v jednom směru uspořádané kolagenové svazky, jež jsou bez napětí mírně zvlněné a obklopené jen malým množstvím základní substance. Fibroblasty vytvářejí řady a narozdíl od areolární tkáně nejsou v této tkáni přítomny zásobovací vlásečnice v takovém množství, což ovšem nesnižuje její důležitost. Tato tkáň totiž vytváří hlavní složku vazů a šlach. V několika vazech převládají nad kolagenovými vlákny vlákna elastinová, která jsou přítomná v takovém množství, že tato tkáň dostala název elastická vazivová tkáň. Například tyto vazy spojují mezi sebou obratle. [1]
Hyalinní (sklovitá) chrupavka
Obsahuje kolagen typu II, proteoglykany, například agrekan, dekorin a biglykan, které váží vodu a umožňují chrupavce tlumit nárazy. Vlastní buňky chondrocyty jsou umístěny
v lakunách, což jsou dutiny extracelulární matrix. Jako speciální skupina se někdy uvádí růstové chrupavky, ze kterých se tvoří kosti v embryu a které umožňují prodlužování kostí během růstu. Vnitřním složením se však jedná o zvláštní typ hyalinní chrupavky. Povrch většiny chrupavek pokrývá vazivová vrstva perichondrium. Na povrchu kloubních chrupavek se vyskytuje synoviální membrána. [1]
Elastická chrupavka
Obsahuje kromě kolagenových vláken vlákna elastická. Je více ohebná než hyalinní.
Tvoří například hranovou příklopku nebo boltec vnějšího ucha. [1]
Vazivová chrupavka
Tato hmota se skládá z několika vrstev tlustých kolagenních vláken přerušených vrstvami chrupavky. Protože odolává tlaku podobně jako chrupavky a tahu jako husté uspořádané vazivo, nachází se ve vazivovém prstenci meziobratlových plotének a chrupavkách kolena (meniskus). [1]
Kost
Jedná se o tkáň, složenou z kolagenu typu I, který je dále pokryt a zpevněn pomocí anorganické minerální složky hydroxyapatitu. V kosti se nacházejí tři hlavní typy buněk.
Osteoklasty, které díky kartáčovému lemu s protonovými pumpami rozpouští starou kost, zatímco osteoblasty pomocí matrixových vezikul vytvářejí nové krystalky z hydroxyapatitu, zároveň syntetizují nové proteiny kosti, protože osteoklasty pomocí proteáz rozpouštějí a rozkládají i tyto sloučeniny. Takto vzniká dynamická struktura kostí, která se rozpouštěním a znovutvořením přizpůsobuje změnám zatížení. Stabilitu extracelulární matrix pomáhají udržovat osteocyty, které vznikají z osteoblastu. [1,2,3]
Obr č. 2 Vnitřní stavba kosti [3]
2.1.2. Kolagen – extracelulární matrix - složky
Obecně se dá říci, že se skládá z vláken, buněk a základní substance. Základem těchto vláken bývá kolagen. Je to složená bílkovina, která je vytvořena převážně z těchto aminokyselin: glycinu, prolinu, hydroxyprolinu, lysinu a hydroxylysinu. [2,3]
Dalším typem vláken jsou elastinová vlákna. Elastin se podobá svým složením kolagenu tím, že obsahuje prolin a glycin, ale obsahuje málo hydroxyprolinu a neobsahuje hydroxylysin. Naopak má v molekule nepolární aminokyseliny jako je alanin, leucin, izoleucin a valin. Elastin je z buňky vylučován jako rozpustný tropoelastin a kromě nepolárních aminokyselin uprostřed obsahuje polární aminokyseliny převážně na konci.
Z těchto aminokyselin je důležitý lysin, který podobně jako u kolagenu umožňuje vytvářet mezimolekulové vazby. Tento spoj ale má jinou strukturu, než příčné vazby v kolagenu a nazývá se desmocin. Protože má střed molekuly tendenci tvořit klubka, funguje tato sloučenina po zesítění jako výborná pružina na tkáňové úrovni. [2]
Buňky, které produkují extracelulární matrix, jak již z předešlého textu vyplývá, jsou fibroblasty, chondroblasty a osteoblasty. Ovšem to jsou pouze buňky, které poskytují službu ostatním buňkám. Všechny buňky, které se nacházejí v extracelulární matrix, jsou k ní připojeny pomocí integrinu. To jsou molekuly, umístěné v cytoplazmické membráně buňky a pomocí dalších sloučenin se připojují k vnitřní buněčné aktinové kostře buňky. [2,3]
Základní substance obsahuje fyziologický roztok, v něm rozpuštěné živiny a odpadní látky a hlavně různé typy glykoproteinů, proteoglykanů a dalších typů proteinů. [2,3]
Glykoproteiny jsou bílkoviny, na které byl navázaný oligosacharidový řetězec. Tento řetězec může mít různou délku, ale v lidském organismu se pro jeho konstrukci používá pouze osm druhů převážně disacharických stavebních jednotek. Je to galaktosa, glukosa, mannosa, kyselina N-acetylneuraminová, fukosa, N-acetylgalaktosamin, N-acetylglukosamin a xylosa.
Mezi glykoproteiny patří i některé spojovací sloučeniny. Jsou to fibronektin a laminin.
Fibronektin spojuje přes integriny buňky s dalšími vláknitými složkami extracelulární matrix.
Laminim připojuje buňky ke kolagenu IV v bazálních membránách. [2,3]
Proteoglykany jsou také proteiny s obsahem oligosacharidu, ale tentokrát s delšími řetězci. příkladem budiž agrekan, který ve své rozvětvené struktuře obsahuje kromě proteinů a již zmíněných oligosacharidů centrální molekulu kyseliny hyaluronové. [2,3]
V lidských tkáních bylo nalezeno asi 28 různých typů kolagenu, tvořeného 30 různými polypeptidovými řetězci. Mnoho dalších proteinů má ve své struktuře podobné uskupení jako
kolageny i když nejsou mezi ně řazeny. Takovým látkám se obvykle říká nekolagenové kolageny. [2,3]
Hlavní rozdělení známých kolagenových typů a jejich struktury podle Harperovy Ilustrované biochemie [3] (zjednodušená tabulka):
Typ Tkáň I většina pojivých tkání včetně kostí II chrupavka, sklivec
III roztažitelné pojivové tkáně (kůže, plíce, vaskulární systém) IV bazální membrány
V minoritní složka ve tkáních obsahující kolagen I VI většina pojivových tkání
VII kotvící vlákna VIII endotel, další tkáně
IX tkáně obsahující kolagen II X hypertrofická chrupavka XI tkáně obsahující kolagen II XII tkáně obsahující kolagen I XIII mnoho tkání
XIV tkáň obsahující kolagen I XV mnoho tkání
XVI mnoho tkání
XVII hemidesmosomy v kůži
XVIII mnoho tkání (např. ledviny, játra) XIX buňky rabdomyosarkomu
Třída (struktura) Typ
fibrilní kolageny I, II, III, V a XI kolageny tvořící sítě IV, VIII, X
FACIT kolageny (vláknité kolageny s přerušovanou trojšroubovicí) IX, XII, XIV, XVI, XIX kolageny tvořící filamenta s korálkovou strukturou VI
ukotvující kolageny VII
transmembránové kolageny XIII, XVII ostatní kolageny XV, XVIII
Většina kolagenů, která má vláknitou strukturu, je tvořena třemi α-řetězci. Jedná se buď o homotrimery, tři stejné α1,příkladem jsou řetězce v kolagenu III, pak se píše α1(III)3, nebo heterotrimery, dva stejné řetězce α1a jeden odlišný řetězec α2, pak se píše α1(I)2 α2(I). [2]
Obr. č. 3 Struktura a vazby u lamininu a fibronektinu [3]
Obr. č. 4 Vnitřní vazby v kolagenu [2]
2.1.3. Biosyntéza kolagenu
Tento protein je v lidském těle syntetizovaný v ribozomech. Vzhledem k tomu, že obsahuje signální peptid, je jeho vyloučení z ribozomu směřováno do endoplazmického retikula, kde jak známo probíhá u bílkovin vznik vnitřních tisulfidových můstků. To ale není nejdůležitější vazba, která vzniká v kolagenu. [2,3]
Kolagen by se dal z větší části vyjádřit jako struktura Gly-X-Y. Gly znamená glycin, X znamená prolin a poslední Y je buď prolin nebo lysin. Tato poslední část je ale, pravděpodobně v Golgiho aparátu, enzymy chemicky pozměněna. Prolin je pomocí enzymu prolylhydroxylázy oxidován na 4hydroxyprolin a 3hydroxyprolin. Lysyl je pomocí lysylhydroxylázy oxidován na hydroxylysin. [2,3]
V knize Základy lékařské chemie a biochemie [2] se o těchto enzymech píše:
„Oba enzymy patří do skupiny oxidas, které po aktivaci vyžadují dvojmocné železo, dále redukční činidlo – vitamin C – a 2-oxoglutarovou kyselinu. Jeden atom z molekuly kyslíku je inkorporován do vznikající hydrosylové skupiny v HYP (hydroxyprolin), druhý atom je inkorporován do 2-oxoglutarové kyseliny (která se tím změní na kyselinu jantarovou).
Pokud je nedostatek kyslíku, přeměny prolinu na HYP a lysinu na HYL (hydroxylysin) neprobíhají. Reakce také neprobíhá při nedostatku vitaminu C (Fe3+ v tkáních nebylo totiž redukováno na Fe2+). Onemocnění kurdějemi (porucha vyzrávání kolagenu), pozorované kdysi u námořníků, bylo vyvoláno právě nedostatkem vitaminu C.“ (Bohuslav Matouš a kol., 2010)
Některé hydroxylysiny jsou ještě v Golgino aparátu glykosylovány. Tento 5hydroxylysin je tedy upraven připojením cukernaté složky na volnou amino a nebo i hydroxyskupinu. [2,3]
Dalším krokem tvorby kolagenu je svinutí třech těchto polypeptidových řetězců do trojšroubovice a sekrece tohoto prokolagenu v sekrečním váčku z Golgiho aparátu ven z buňky. V mezibuněčném prostoru jsou odstřiženy koncové peptidy, které dosud vyčnívaly z obou konců asi 300 nanometrů dlouhé molekuly a zabraňovaly jejich vzájemnému přiblížení. [2,3]
Hotový kolagen se začíná sám uspořádávat do fibril a tyto fibrily do vláken. Tato vlákna jsou postupně zpevňována enzymem lysyloxidázou a to tak, že přeměňuje lysylové zbytky na aldehydy, které se navzájem spojují pomocí adolového zesítění. Takto je kolagen spojen uvnitř své trojpramenné šroubovice a zároveň se tak spojují tyto šroubovice navzájem mezi sebou uvnitř fibrily. Kolagenní vlákna uvnitř fibril jsou uspořádána s mezerami mezi
sebou, takže vzdálenost konců kolagenů je 40 nanometrů. Tato mezera je překlenuta tím, že v další vrstvě jsou kolagenní vlákna posunuta o 67 manometrů v jednom směru a ve stejném směru i ve třetí vrstvě. Toto uspořádání vytváří pruhování kolagenu. Vlákna kolagenu mají průměr 0,5 až 3 mikrometry a vznikají agregací fibril kolagenů. [2,3]
2.2. Vyžití kolagenu ve tkáňovém inženýrství
Touto problematikou se ve své odborné práci zabývala Miroslava Rysová:
„Tkáňové inženýrství je relativně mladý, avšak intenzivně se rozvíjející obor, který v současné době představuje hlavní odvětví regenerativní medicíny.“ (Miroslava Rysová, 2011) [4]
V literatuře jsou popsány tři způsoby využití kolagenu pro tkáňové inženýrství.
První je využití směsi kolagenu s jinými polymery, například polykaprolaktonem. Pro toto využití je třeba znát, jaké směsi rozpouštědel a jaké poměry polymerů jsou vhodné pro daný zvlákňovací proces.
Druhý postup využívá zcela uměle připravené peptidy podobné kolagenu a to jak pro výzkum vnitřní chemie kolagenu a jeho struktury, tak pro výrobu nanovláken.
Třetí postup se zabývá využitím extrahovaného kolagenu a pokouší se o jeho přímé zvláknění, často s pokusem o úplnou rekonstrukci struktury, kterou měl původní zdroj.
Toto jsou způsoby, kterými je kolagen využíván a zpracováván do co nejlepších tkáňových scaffoldů. Dále pokračuje Miroslava Rysová:
„Scaffold představuje tkáňový nosič, jehož funkcí je usnadnění růstu buněk migrujících z okolních tkání (navádění tkáňového růstu) nebo usměrňování růstu buněk, nasazených do struktury scaffoldu.“ [4]
Dále zde budou uvedeny měřící přístroje, které se používají pro určování a pozorování mikrovlákenných a nanovlákenných struktur. Pro příklad je zde popsán infračervený spektrometr s Fourierovou transformací.
2.2.1. Praktické příklady využití směsi kolagenu s jinými polymery
V jednom z experimentů byl použitý syntetický biodegradabilní polymer poly-ε- kaprolakton. Pro elektrostatické zvlákňování byly připravovány roztoky tohoto polymeru za pomocí rozpouštědel tetrahydrofuranu (THF) a ethylacetátu. Jako druhá složka byl použit kolagen ze dvou zdrojů. Z prvního zdroje byl dodaný kolagen pocházející z krysích ocásků a
měl koncentraci 0,375 % (hm) v roztoku kyseliny octové (0,02N). V roztoku druhého zdroje byl použit kolagen získaný z kuřecích běháků. Z něho byly připravovány roztoky s kyselinou octovou o koncentraci 70 – 99 %. [4]
Nanovlákenné vrstvy byly připravovány zvlákňováním z tyčky. Při výrobě směsných kolagenních nanovláken nebyla používána pouze čistá rozpouštědla kaprolaktonu, ale byla do nich přimíchávána takzvaná nerozpouštědla. Jejich účelem mělo být vytváření porézních nanovláken, která mají lepší možnost použití, protože mají dobrou přilnavost díky velkému měrnému povrchu a tudíž jich nemusí být použito takové množství, čímž se zlepšují cesty migrace buněk při růstu uvnitř scaffoldu. Protože se ale nikdy nepodařilo vytvořit nanovlákna, která by byla porézní a zároveň obsahovala kolagen, nebude se tato práce těmito složkami už více zabývat. [4]
Přítomnost nebo nepřítomnost kolagenu byla zjišťovaná pomocí metody infračervené spektrografie s Fourierovou transformací. Tato metoda bude vysvětlena ke konci této práce.
Výsledkem této práce bylo několik scaffoldů, na které byla nasazena kultura osteoblastu MG 63. Ta ukázala, že nezáleží na množství kolagenu ve vláknech, ale na průměru vláken. Pokud se pohybuje kolem 100 nanometrů, tak vzniká největší růst buněk. Ani na zdroji a čistotě kolagenu nezáleží. [4]
V další práci je diskutována možnost využití těchto směsných vláken pro regeneraci nervů jakožto tkáňové můstky mezi jejich přerušenými částmi. Maximální tahová síla v poly- ε-kaprolaktonových scaffoldech byla přibližně 3,5 MPa. Elektrospinové kolagenové scaffoldy měly maximální sílu do přetrhu okolo 1,3 MPa. Výzkumy ukázaly, že tahová síla uvnitř čerstvých krysích nervových vláken je 2,72 ± 0,97 MPa. Když byla vyrobena směsná vlákna z kolagenu a poly-ε-kaprolaktonu elektrospiningem, tak scaffold z nich získaný měl pevnost asi 5 MPa a 60 % prodloužení do přetrhu. I když tato „směs“ vypadá v porovnání s ostatními způsoby neprofesionálně, může se v budoucnu ukázat, že vyprodukuje nejlepší výrobky s obsahem kolagenu. [5]
2.2.2. Praktické příklady využití uměle připravených peptidů podobných kolagenu
Moderní metoda přípravy peptidů, kterou v roce 1953 publikoval R. B. Merrifield, je takzvanou metodou na pevné fázi. Jako základ syntézy využívá kopolymer styrenu a 4 (chlormetyl) styrenu (asi 10 % z celku). K těmto chlorovaným částem polymeru se připojují v neaktivním rozpouštědle aminokyseliny s chráněnými aminovými skupinami. Po napojení
karboxyskupiny aminokyseliny na polymer se odstraní chránící skupina na aminoskupině aminokyseliny. Nová aminokyselina s chráněnou aminoskupinou se k té první připojí tak, že se nejdříve aktivuje reakcí s dicyklohexylkarbodiimidem. Takto aktivovaná molekula reaguje v aminoskupinu první aminokyseliny a zároveň se vyloučí odpadní dicyklohexylmočovina.
Na řetězci je opět vázána chráněná aminoskupina, kterou je potřeba této chránící skupiny zbavit a celý cyklus se opakuje znovu. [7]
Obr. č. 5 R. B. Merrifield [14]
Samotný dicyklohexylkarbodiimid lze získat reakcí chlorhexanu s thiomočovinou a oxidativním odstraněním síry z molekuly. Získaný produkt je následně z polystyrénového nosiče uvolněn a protože lze v průběhu tohoto postupu vznikající protein libovolně promývat, je výsledná sloučenina obvykle mnohem čistší, než u jakékoliv jiné metody. [7,8]
Bohužel tato metoda nemá žádný vliv na prostorovou strukturu a prostorové skládání vznikajícího polymeru a proto s ní v žádném případě nelze vyrábět například funkční enzymatické bílkoviny. To ale neznamená, že by se nehodila pro výrobu jednodušších nebo kratších bílkovin. [7]
Už několik různých přístupů se pokusilo napodobit samosestavu přírodního kolagenu v nějakém syntetickém systému tak, aby bylo možno detailně zkoumat tento jev a to na stejných úrovních, jako to probíhá v přírodě. Tyto úrovně jsou přeměna peptidového řetězce na trojitý helix a případné složení těchto řetězců do svazků a posléze seskládání do co nejkvalitnějšího makroskopického materiálu → hydrogelu s možným potenciálním využitím jako scaffold. Tyto pokusy byly částečně úspěšné, ale zatím žádný systém se nedokázal seskládat stejným způsobem jako přírodní kolagen a ani neměl stejné mechanické a termodynamické vlastnosti. [6]
Zatím nejlepší postupy byly založeny na speciálních krátkých polypeptidech, napodobujících strukturu přírodního kolagenu. Příkladem tohoto řetězce je řetězec o vzorci (Pro-Arg-Gly)4(Pro-Hyp-Gly)4(Glu-Hyp-Gly)4, u kterého se podařilo dosáhnout úspěšného samosestavení do stabilnějšího vlákna. Nicméně toto vlákno má ještě určité slabiny, například nedostatečnou čistotu s příliš velkým množstvím pohlceného dalšího amorfního materiálu nebo příliš přísné požadavky na prostředí a na pufry, ve kterých tato vlákna mohou vznikat.
Nevhodný pufr obvykle vede k rozkladu celé sestavy. Další slabinou je sklon na jedné straně ke srážení a jinde naopak k výskytu nedostatečné hustoty vláken, narozdíl od požadované tvorby homogenního hydrogelu. [6]
Autoři této práce si proto vytvořili přesný chemický model těchto peptidů, zobrazující vzájemné mezimolekulové síly, které pravděpodobně působí mezi řetězci. Podařilo se jim tak určit dvě nevhodné aminokyseliny, které, zdá se, nevytvářejí mezi sebou a tudíž ani mezi řetězci dostatečně silné mezimolekulové vazby. Zároveň objevili jejich možnou náhradu a tak přestože střed molekuly zůstává stejný, vedla tato myšlenka ke vzniku nového polypeptidového řetězce o vzorci (Pro-Lys-Gly)4(Pro-HypGly)4(Asp-Hyp-Gly)4. Vyrobený a přečištěný peptid byl samosestavován ve fosfátovém pufru při pH 7. [6]
Analýza CD (cirkulární dichroismus) ukázala, že vzniklá vlákna obsahují trojitý helix.
Nyní bylo třeba zjistit, jakou strukturu má skutečný samosestavený hydrogel. K tomu byla použita transmisní elektronová mikroskopie (TEM). Před vložením do TEM byly vzorky negativně barveny kyselinou fosforwolframovou (PTA) pro dobré zobrazení tohoto uhlíkového materiálu. Na zobrazení TEM se objevilo mnohem více vláken, než u předchozích pokusů s jinými peptidy. Tato nová vlákna o různých délkách neobsahovala tolik shluků a tvořila podstatnou část vzorku. Vzorky před vložením do TEM musí být ovšem sušeny, což může způsobit jejich sražení díky kapilárním silám, navíc PTA může zkreslit některé důležité detaily. [6]
Způsob, jak zabránit potenciálnímu sražení, je možnost použití takzvané cryogenní transmisní elektronové mikroskopie (zkráceně cryo-TEM).Tato technika obchází bouřlivé odpařování vody ve vakuovaném prostoru mikroskopu tím, že jako vzorky používá preparáty s tenkou vrstvou vody, které byly hluboce zmrazeny v etanové rozbředlé směsi. Výsledky z tohoto měření ale potvrdily pozitivní očekávání a mikroskop ukázal asi 5 manometrů silná vlákna rovnoměrně rozprostřená po celám vzorku, co potvrzuje kvalitu získané hmoty, jež bylo možné pozorovat díky makroskopickým vlastnostem hydrogelu, který udržoval tvar a byly na něm patrné i hrany. [6]
Poslední použitá metoda byla mikroskop atomových sil (AFM). S jeho pomocí byly měřeny parametry vláken. Bylo zjištěno, že výška vláken je jenom 1,2 nanometrů ± 0,3 nanometrů. Tedy mnohem méně, než by odpovídalo šířce vláken, zjištěných cryo-TEM. Také délka vláken byla mnohem menší. Nejpravděpodobnějším výsledkem je, že cryo-TEM nezobrazil jednotlivá vlákna, ale quasihexagonální svazky o pěti jednotlivých helixech, což dalo šířku přibližně 5 nanometrů a AFM změřil výšku jednotlivého trojitého helixu. Autorům této metody se podařilo vyrobit kolagenní polymer, který se degraduje stejnou rychlostí jako přírodní kolagen. [6]
Tuto problematiku popisují ve své práci také Selestina Gorgieva a Vanja Kokol z Univerzity v Mariboru [10]:
„Degradace kolagenu vyžaduje proniknutí vody a enzymu a strávení vazeb. Kontaktem s vodou kolagen do určité míry nabobtná, ale kvůli jeho zvláštnímu sterickému uspořádání (trojšroubovicová konformace) může být přírodní kolagen zcela stráven pouze určitými kolagenázami a enzymy štěpícími pepsin, které dokáží rozkládat kolagen v jeho nedenaturovaných šroubovicových oblastech při fyziologickém pH a teplotě (Harrington, 1996;Sternlicht et Werb, 2001). Mezi tyto kolagenázy patří i ty, které štěpí naráz všechny tři řetězce, jako na příklad tkáňové kolagenázy, stejně tak mezi ně patří také kolagenázy, které vytvoří několikanásobné rozštěpení na každém z řetězců, jako například kolagenáza z Clostridium histolyticum (CHC) (Seifter et al., 1971), zatímco nespecifikované protenázy jako je pepsin, který může napadnout pouze telopeptidy nebo denaturované šroubovicové oblasti kolagenu (Weiss, 1976), jsou zodpovědné za další degradaci až na úroveň
aminokyselin.
Obr. č. 6 Pepsin [15]
CHC typy kolagenázy se v tkáni nacházejí pouze na velmi nízkých úrovních těsně svázané s kolagenem (Woessner, 1991), zatímco tkáňové kolagenázy se váží na všechny typy kolagenu bez zjevné preference pro nějaký určitý kolagenový substrát (Welgus et al.,; 1983).
V závislosti na typu kolagenu může být utvořeno přibližně 150-200 částí na jeden řetězec (Seifter et al., 1971).
V současnosti je známo sedm forem CHC (Mookhtiar et al., 1992). Všech sedm enzymů obsahuje zinek a vápník a skládají se z jednoho polypeptidového řetězce s jedním aktivním místem. Atom zinku se nachází na aktivním místě a je proto nezbytný pro katalýzu, zatímco atomy vápníku jsou potřebné pro stabilizaci enzymové konformace a následně k enzymové aktivitě Bond et al., 1984). Na základě jejich primárních a sekundárních struktur, jejich substrátových specifikací a způsobu, jakým útočí, mohou být CHC rozděleny do dvou tříd. Třída I obsahuje α-, β-, γ- a η-kolagenázu a napadá trojšroubovici kolagenu nejprve blízko jejího konce. Po rozštěpu na konci C-terminalu následuje řez blízko N-terminusu, předtím než je kolagen postupně degradován na menší fragmenty. Třída II obsahuje δ-, ε- a ζ- kolagenázu a štěpí tropokolagen v jeho středu za vzniku dvou fragmentů. Následuje další trávení větších fragmentů (Mookhtiar et al., 1992). Následkem toho se třída II více podobá tkáňovým kolagenázám, které štěpí kolagen na TCA a TCB fragmenty (Seifter et al., 1971;
Welgus et al., 1980)
. Obr. č. 7 Aktivní centrum kolagenázy [16]
Kolagenové fibrily jsou degradované blíže nespecifikovatelným způsobem, bez toho, že by preferovaly nějaké určité místo na rozštěpu uvnitř nebo na koncích fibril (Paige et al.;
2002). Bylo usouzeno, že kolagenáza je příliš veliká na to, aby pronikla do fibril, takže se trávení může odehrávat pouze na povrchu fibril (Okada et al., 1992; Paige et al., 2002).
Z toho důvodu je rychlost degradace přímo závislá na těchto molekulách substrátu, které se nacházejí na povrchu fibril. Jestliže kolagen utvoří vlákna a vlákenné svazky a tropokolageny uvnitř se stanou nepřístupné, rychlost degradace se sníží ještě více (Steven, 1976).“ (Selestina Gorgieva a Vanja Kokol, 2011) [10]
Je patrné, že i když vytvořené svazky, jež se vlastně trochu podobají přírodním fibrilám, nejsou uvnitř vázány žádnými chemickými vazbami, jak tomu je v přírodě, tak výsledný materiál je dobrým výchozím produktem nejenom pro biochemický výzkum, ale snad i pro budoucí lékařské aplikace. [10]
Stojí za povšimnutí, že řetězce, použité při těchto studiích, mají poměrně malou délku.
Je tomu tak proto, že pravděpodobnost připojení další aminokyseliny k narůstajícímu polypeptickému řetězci není úplně stoprocentní. Jsou-li zadány do kalkulačky hodnoty 0,99 xy 20 neboli 99 % na dvacátou, vyjde přibližně 81 %. Pokud je zadáno 99 % na třicátou, vyjde 74 %. A 99 % na čtyřicátou, je jenom 67 %. Tato čísla znamenají pravděpodobnost, se kterou došlo k zařazení správného počtu a správného pořadí všech aminokyselin. Číslo 67 % tedy znamená, že ve vzniklé směsi je 67 % správných molekul a zbytek je více či méně odlišný.
Kdyby tedy někdo dokázal oddělit, alespoň přibližně, originál od odpadu, mohl by snadno určit parametry správné molekuly a na základě těchto parametrů příště oddělovat jenom ji.
[13]
A přesně tak se postupuje. Při postupu výroby se jako hlavní čistící člen používá vysoce výkonné kapalné chromatografie (HLPC) a navíc je za ni nasazena dialýza proti destilované vodě, která má za úkol odstranit z produktu soli. [6]
Z předešlého popisu by mohlo vyplývat, že by bylo možno touto syntézou na pevné bázi vytvářet složitější struktury tím, že se místo aminokyselin použijí jako stavební kameny předem vyrobené a vyčištěné polypeptické řetězce. Pravděpodobně by to bylo možné, ale jak už bylo výše napsáno, tato metoda neposkytuje žádné programovatelné a řiditelné prostorové uspořádání budoucích molekul. Navíc by se takto složité polypeptidy obtížně čistily. [13]
2.2.3. Praktické příklady využití přímého zvláknění extrahovaného kolagenu
Tento postup je založený na myšlence, že kolagen rozpuštěný v kyselině chlorovodíkové a zbavený telopeptických oblastí pomocí peptidu, může být znovu rekonstruován ve vhodném prostředí, například pomocí elektrospinningu do nanovláken.
Podobně, jako lze ze dřeva vyrobit nakonec viskózové vlákno. [9]
Tento postup navrhuje přibližně po 15 hodinách působení pepsinu zvýšit pH až na 5,5 pomocí roztoku NaOH a několikrát dekandovat destilovanaou vodou. Následně je v postupu uvedeno použití jednomolárního NaOH po dobu jedné hodiny pro odstranění glykosidických částí molekul a zneškodnění virů. Nakonec se má roztok zneutralizovat pomocí roztoku HCl o pH 5,5. Výsledný roztok se má připravit tak, aby měl koncentraci 1 % hmotnostní kolagenu a suspenze vytvořit rozpouštěním a mícháním vláken s 0,3 % (w/v) kyseliny octové. [9]
Protože tento postup obsahoval málo neobvyklých chemikálií a byl i relativně jednoduchý na přístrojové vybavení, proto bylo rozhodnuto, že bude při této bakalářské práci použit. [9]
I když byl postup poněkud upraven, aby mohlo být rychleji vyrovnáváno pH vzniklých roztoků, je třeba říci, že každá práce, která se pokouší napodobovat věrně kolagen, tím více kolagen rekonstruovaný bez použití jakýchkoliv síťovacích činidel, jak je tomu i v přírodě, kdy jsou vzniklá vlákna síťována pomocí lysyloxidázy, musí počítat s menší stabilitou produktu. [9,10]
V jedné práci, která se síťováním zabývá, se dokonce v opozici proti dobrým výsledkům této studie tvrdí, že kolagen s odstřiženými telopeptickými proteinovými konci, se stává nestabilním a to nejenom v hotových vláknech, ale i struktura trojitého helixu se dostává do nebezpečí rozkladu hydrolýzou. [10]
Síťovadla pro kolagen a želatinu [10]
Metoda Kolagen Želatina Chemcká síťovadla
aldehyd Charulatha a kol., 2003 Sisson a kol., 2009; Farrist a kol., 2009 e.g. glutaraldehyd Kukuchi a kol., 2004;
Mu a kol., 2010;
Ma a kol., 2003
dialdehyd starch Mu a kol., 2010 Martucci a Ruseckaite, 2009 acyl azid Charulatha a kol., 2003;
Friess, 1999 difenilfosforylazid Khor, 1997;
Roche a kol., 2001
kadbodiimid, e.g.1etyl-3- Park a kol., 2002; Barbetta a kol., 2010; Natu a kol., 2007 (3 dimetylaminopropyl) Pieper a kol., 1999; Chang a kol., 2007;
Kim a kol., 2001; Kuijpers a kol., 2000 Song a kol., 2006
hexametylen diisocyanat Friess, 1999
etylenglykol diglycidyleter Vargas a kol., 2008 polyepoxidové složky Friess, 1999; Khor, 1997;
Zeeman a kol., 1999
fenolitické složky Han a kol., 2003; Kim a kol., 2005; Zhang a kol., 2010;
Jackson a kol., 2010 Pena a kol., 2010
genipin Ko a kol., 2007; Yao a kol., 2005; Lien a kol., 2010;
Yan a kol., 2010 Bigi a kol., 2002; Chiono a kol., 2008;
Mi a kol., 2005 deriváty kyseliny Satio a kol., 2004 citronové
Enzymatická síťovadla
transglutamináza Jus a kol., 2011 Bertoni a kol., 2006;
Fuchs a kol., 2010;
Sztuka a Kolodziejska, 2008 tyrosináza Jus a kol., 2011 Chen a kol., 2003
laccáza Jus a kol., 2011 Fyzikální síťovadla
dehydrotermální zacházení Pieper a kol., 1999; Dubruel a kol., 2007 Tangsadthakun a kol., 2006
UV-záření Torikai a Shibata, 1999 Bhat a Karim, 2009 γ-záření Labout, 1972 Cataldo a kol., 2008
Prvním účinným síťovadlem byl glutaraldehyd (GTA), který poskytuje dostatečně silné zesítění pro široké spektrum spoužívaných polymerů. V současné době se však začínají zvažovat jeho možné negativní účinky. Díky tomu, že polymeruje, dochází k zesíťování často jen na povrchu. Při přirozené degradaci kolagenu se může GTA uvolňovat zpět do tkání a zdá se, že jeho cytotoxicita se začíná projevovat už při koncentraci tři molekuly na milion dalších částic. [10]
Jako další síťovadla byla proto vyvinuta ditiobispropionimid (DTBP) a diimidoester dimetyl suberimid (DMS), která mají lepší vlastnosti a hlavně méně agresivní chování v organismu. [10]
Dalšími skupinami jsou acyl azidy a karbodiimidy. Jsou zajímavé tím, že nezůstávají uvězněny jako součást síťovací vazby v molekule, ale pouze umožňují vzájemné zesítění polymerů pomocí skupin, které se v nich nacházejí. [10]
Další skupinou síťovadel jsou polyfenoly, které kromě zesítění přinášejí i zvýšenou odolnost proti volným radikálům. [10]
Novou látkou, zkoumanou pro využití při síťování je genipin. Jedná se o přírodní produkt, získávaný z iridoidu glukosidu geniposidu, které jsou přítomné v rostlinách Genipa Americana a Gardenia jasminoides Ellis a je 10 000 krát méně jedovatý než GTA. Zkouší se i některé enzymové postupy, například pomocí tyrosinázy a laccázy. [10]
Poslední metodou, kterou lze použít je působení UV-záření. Materiál - nejčastěji želatina - je nutno připravit pomocí metakrylového anhydridu. Takto připravená látka může být zesíťována i elektrony a γ-zářením. Příliš dlouhá expozice UV-záření způsobuje denaturaci. Tomu může být zabráněno použitím roztoku s malým obsahem kyslíku. Síťování pomocí elektronů a rentgenových paprsků navíc sterilizuje výsledný produkt. [10]
2.2.4. Infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací
Tato metoda je důležitá ke kvalitativnímu určení složení různých organických látek a to i v jednodušších směsích.
Na rozdíl od normální spektroskopie, která vpouští do vzorku pouze slabý proud s přesně vyčištěnou postupně se měnící jednou frekvencí, tak tento přístroj vysílá do zkoumaného prostoru celé spektrum frekvencí a na druhém konci změří, která frekvence byla pohlcena. Na to je ovšem potřebná Fourierova transformace, která obvykle probíhá v počítači pomocí specializovaného programu. [11]
Díky zjednodušenému vysílacímu členu lze touto metodou měřit vzorky i v silně pohlcujícím prostředí, například v zakaleném roztoku. Absorpční pásy mající vrcholy v intervalu 4000 – 1500 cm-1, jsou vhodné pro identifikaci funkčních skupin (například –OH, C=O, NH, CH3). Pásy v oblasti 1500 – 400 cm-1jsou nazývané oblastí „otisku palce“. [11]
V prvním pokusu byly použity k určení kolagenu skupiny OH a NH absorpcí na 3288 cm-1 a dále také 1710 cm-1 pro skupinu C=O. Nejdůležitější se ale ukázala kombinovaná absorpce, kdy spolu absorbovaly skupina C=O a N-H, jež spolu zvláštním způsobem absorbovaly ze spektra záření o vlnočtu 1653 cm-1a stejná skupina na jiném místě molekuly o absorpci 1633 cm-1. [4]
2.2.5. Shrnutí a porovnání různých způsobů zpracování kolagenu
Způsob využití kolagenu výhody nevýhody Směs kolagenu s jinými
polymery spolehlivost díky využití
osvědčených polymerů a pouze přídavku kolagenu, malé nároky na čistotu a kvalitu kolagenu,
pevnost, podobná se syntetickými vlákny, nižší cena
díky špatné mísitelnosti roztoků nelze připravovat vlákna o vyšší koncentraci
Uměle připravené peptidy,
podobné kolagenu velká variabilita připravova-
ných krátkých peptidů omezená délka peptidů, vyšší cena
Přímé zvláknění extrahova-
ného kolagenu biologická podobnost,
nižší cena
nízká stabilita vláken, nebezpečí úmrtí buněk při použití toxických síťovadel v nevhodném množství Z tohoto shrnutí se jeví jako nejvhodnější způsob využití kolagenu ve tkáňovém inženýrství metoda, využívající směsi kolagenu s jinými polymery.
3. Praktická část
V této části bude představen experiment, ve kterém bylo zkoumáno extrahování, rozpouštění a pokusy o zvláknění kolagenu.
3.1. Získávání vzorků
Nejprve bylo třeba získat zdroj kolagenu, což v tomto případě byly konce předních vepřových nožiček. Z nich bylo třeba odebrat vzorky šlach.
Jako zdroj kolagenu byly použity konce třech kusů předních vepřových nožiček z čerstvé porážky, které byly zakoupeny v Řeznictví – uzenářství Luboše Kužela v Turnově.
Byly odseknuty přibližně v oblasti zápěstního kloubu, byly bez drápů a převážně odsrstěny.
K pitvání v laboratoři byl použit malý skalpel, zavírací nůž a dřevěná deska.
Byly odseknuty a rozpitvány první klouby u dvou prostředních prstů. Dále byly rozpitvány klouby dvou vnějších prstů, nacházející se u jejich kořene. Řezem mezi nimi se otevřel prostor, kterým bylo možné spatřit mohutný šlachový kořen s několika výběžky šlach.
Aby byla zvětšena přehlednost místa, byl směrem vpřed od mezikloubního řezu vyříznut čtverec tkáně. Po přeříznutí a odříznutí několika malých šlach, mířících k postranním prstům, začal být šlachový kořen vyřezáván ze svého lůžka. Díky odřezaným koncům prstů bylo zřejmé, že šlachy, odvětvené z kořene pokračují až ke koncovým článkům. Několik těchto větví bylo odřezáno, ale většina jich zůstala a byla vypreparována i s kořenem z nožičky. U třetího vzorku byla k uvolnění šlach z prstů použita nová metoda. Bříška prstů byla podélně hluboce naříznuta a pak byla z boků prstů seříznuta kůže. Tím se odhalila a uvolnila šlacha, mířící ke konci prstu. Byl pokus pitvat i vnější stranu nožičky, ta ale obsahovala příliš malé šlachy hustě obrostlé tkání.
Z těchto vepřových nožiček bylo tedy získáno několik druhů šlach:
- šlachový kořen, jež byl stále obalen zbytky červených membrán, které bylo nutno co nejlépe odstranit.
- menší množství větví z hlavního kořene, které musely být z různých důvodů od kořene odříznuty. Často se jednalo o nejkvalitnější šlachy, které se podařilo získat.
- tenké šlachy, které obvykle vedly k bočním prstům, neobsahovaly sice mnoho hmoty, ale daly se rychle přeměnit na vzorek pomocí jednoho podélného rozříznutí.
Během práce bylo obnaženo a rozbito mnoho kloubů. Bylo rozhodnuto seškrábat a odsekat skalpelem z kloubních ploch malé množství chrupavky. Bohužel získaná chrupavka nebyla zcela čistá. Určité procento získaných šupinek mělo při pohledu z opačné strany hnědavé skvrny, což už byl zřejmě přechod ke kosti. Celkem bylo ze všech tří nožiček získáno asi 0,7 gramů chrupavky.
Obr. č. 5 Vnější strana nožičky Obr. č. 6 Nožička s oddělenými prsty
3.2. Zpracování vzorků
Všechny získané šlachy byly uloženy ve vakuových igelitových sáčcích do lednice.
Na první vzorek (později přeznačen na druhý vzorek první generace – V2G1) byla použita kvalitní šlacha o hmotnosti asi dva gramy. Šlacha byla ponechána vcelku, pouze byla několikrát příčně naříznuta pro lepší rozpouštění v roztoku kyseliny chlorovodíkové.
Po vložení do roztoku se po určité době začala uvolňovat z naříznutých míst a hlavně z obou konců mlhavá vlákénka a roztok se začal po několika dnech zakalovat. Protože bylo ale rozpouštění mnohem pomalejší, než se očekávalo, byl vytvořen ještě jeden vzorek.
V tomto vzorku (V1G1) byly podélně nakrájeny šlachy na asi milimetr silné podlouhlé útvary, které byly nejprve rozpouštěny v kyselině chlorovodíkové. Už po 30 minutách bylo vidět, že vzorek má tendenci se rozpouštět. Avšak ani po přidání pepsinu a několikadenním rozpouštění a dorovnávání kyselosti nedošlo k úplnému rozpuštění podlouhlých útvarů.
Naopak nabobtnaly kapalinou a několikanásobně se zvětšily.
U prvního vzorku druhé generace (V1G2) bylo tedy rozhodnuto použít osvědčené milimetrové krájení, ale protože evidentně dobrá rozpouštěcí schopnost byla způsobena odhalením vnitřní části šlach pro působení roztoku, bylo rozhodnuto druhý vzorek (V2G2) pouze na několika místech nakrojit.
Po špatných zkušenostech s velkými vzorky bylo rozhodnuto vytvořit oba vzorky třetí generace v podlouhlé podobě. U prvního vzorku (V1G3) bylo rozhodnuto pro lepší vytahování přivázat postupně odřezky k dlouhému skleněnému svazku vláken. Druhý vzorek (V2G3) byl ponechán nesvázaný.
Ukázalo, že vytahování svázaného vzorku je opravdu mnohem snadnější, než složité hledání nesvázaných odřezků ve třepací lahvičce. Bohužel ale práce s obyčejným nezakrouceným svazkem skleněných vláken je díky třepivým koncům tak složitá, že vytahování nerozpuštěných vzorků z roztoku bude zřejmě jednodušší, dokud nebude vyzkoušeno a ověřeno, jak rozumným způsobem spojit nebo ztavit třepivé konce skleněného kabelu.
Obr. č. 7 Vzorek po rozpouštění
3.3. Rozpouštění vzorků
Byly rozpouštěny vždy dvojice vzorků s cílem získat homogenní suspenzi kolagenu a pomocí pepsinu ji zbavit telopeptidů. Vzorky byly vždy nejprve rozpouštěny po dobu přibližně 30 minut v kyselině chlorovodíkové o pH 2,5 a potom se přidal pepsin v množství o jedné setině hmotnosti vzorku. Pro zlepšení promíchávání roztoků a vzorků bylo rozpouštění prováděno v třepacích lahvičkách a po celou dobu byly vzorky protřepávány na třepačce.
U prvních dvou vzorků bylo rozhodnuto ponechat je v roztoku co nejdéle, takže vždy další den byla doplněna kyselina, která od minulého měření vytěkala ze vzorků.
Nedopatřením se podařilo první vzorek při jednom z doplňování okyselit až na přibližně pH 2,42, což bylo operativně řešeno rychlým přilitím destilované vody.
Po několika dnech vyvstalo nebezpečí, že vzorek by mohl začít želatinovat. Proto bylo rozhodnuto vyndat nerozpuštěné části šlach a pokusit se vzorek zneutralizovat pomocí hydroxidu sodného, kterým ale nebylo dosaženo v návodu požadovaných pH 5,5 ale pH 9!, jež bylo zvednuto na pH 5,5 pomocí kyseliny chlorovodíkové. Tento malý omyl nemusí mít tak fatální následky, protože v návodu je tento vzorek také následně vystaven působení hydroxidu sodného. Následně byl roztok několikrát dekandován pomocí destilované vody.
Druhé dva vzorky bylo rozhodnuto udělat ve správném časovém rozvrhu. Do připravené kyseliny byly přidány vzorky a následně bylo pH dorovnáváno až na 2,5. Tato na první pohled dobrá myšlenka se ale ukázala být „kamenem úrazu“ těchto vzorků.
I když jsou magnetická míchadla dobrým způsobem k homogenizaci roztoků, jež je potřebná k přesnému měření pH, tak měřit pH v roztoku se vzorkem, který v něm vytváří různé laguny a všeobecně znemožňuje dobré rozmíchání přidávaných kyselin, se ukázalo jako špatná cesta. Nejhůře dopadl druhý vzorek, který byl největší a vytvářel mnoho silně oddělených oblastí v roztoku. První roztok, ačkoliv byl zřejmě také mírně překyselený, se možná, jak bude později patrné, nejvíce přiblížil ideálu a reakcím, které předpovídá pracovní postup.
Po těchto přípravách se ukázalo, že pro použití při elektrospiningu je potřeba tyto roztoky přefiltrovat. Protože žádný filtrační papír neposkytoval díky malým otvorům dostatečně velkou filtrační rychlost, byly použity pro filtraci části silonových punčoch. Po přefiltrování dopadly nejlépe první vzorky. Ten v první generaci byl v celém objemu nažloutle zakalený. Vzorek v druhé generaci byl nejenom bíle zakalený, ale časem se usadil a u dna se tak vytvořila poměrně zřetelná, asi 1 milimetr silná bílá vrstva.
Protože se první vzorek v první generaci už téměř vůbec nedal dekandovat, bylo rozhodnuto oba vzorky první generace zkušebně alkalizovat hydroxidem sodným, který by v ideálním případě mohl způsobovat srážení či usazení. Ani po 60 minutách se vzorky nezměnily a bylo velmi obtížné srovnat jejich pH. U druhého vzorku nebylo z časových důvodů srovnáno pH a byl ponechán při pH 11.
Protože ani předchozí dvě pracovní strategie nenaplnily přesně pracovní postup, bylo rozhodnuto udělat třetí generaci bez přidávání kyseliny a s přesným časovým harmonogramem. Aby se zabránilo odpadu kyseliny, bylo rozhodnuto obalit hrdla třepacích lahviček takzvaným parapapírem. Ten byl použit i pro uchovávání různých polotovarů jako například zředěných kyselin a hydroxidů. Tento postup, který se někdy osvědčil při rozpouštění vzorků v první generaci, ale tentokrát selhal a vzorky měly druhý den pH okolo 4.
Tentokrát, narozdíl od druhého pokusu, kdy se roztok alkalizoval před dorovnáním přibližně na 8 pH, bylo díky použití zředěnějších chemikálií dosaženo mnohem lepších a přesnějších výsledků. Oba vzorky se asi dvakrát dekandovaly, ale první vzorek se dekandoval mnohem snadněji než druhý. Po dekandování byly oba vzorky přefiltrovány.
Nyní byly k dispozici čtyři vzorky, které zatím neprošly hodinovým působením hydroxidu sodného, jak popisuje návod. Protože první vzorek první generace projevoval mimořádně dobré vlastnosti, které předpovídá návod, nebyl podroben nejistému působení
hydroxidu sodného a raději byl slit a dolní vrstva byla přelita do odměrného válce pro případnou další dekandaci. Protože k ní nedošlo, zůstal nakonec vzorek č. 1 druhé generace jako 20 mililitrový relativně koncentrovaný roztok.
Bylo rozhodnuto působit hydroxidem sodným na první roztok třetí generace. Protože nebylo známo, jaké množství hydroxidu se má k danému vzorku přilít, bylo rozhodnuto přilít stejný objem jednomolárního hydroxidu sodného, jaký činil v té době objem vzorku. Po 60 minutovém působení byl proveden pokus roztok zneutralizovat. Protože všechny naředěné kyseliny selhaly, bylo rozhodnuto lít do roztoku koncentrovanou kyselinu chlorovodíkovou.
Když hodnota pH klesla na 12, začínalo být zřejmé, že je třeba zvolit opatrnější dávkování.
Protože ale zředěné roztoky kyseliny chlorovodíkové snižovaly pH roztoku při mililitrových dávkách jen nepatrně, bylo rozhodnuto ještě jednou zkusit koncentrovanou kyselinu. Po změření pH se ale ukázala hodnota okolo 0,5. I když se nakonec podařilo roztoky zředit na přibližně pH 5,5, bylo při tom použito takové množství zředěného hydroxidu a dalšího množství kyseliny chlorovodíkové, že výsledný vzorek musel být rozlit do dvou kádinek a byl tak zředěný, že byl z dalšího zpracování vyřazen.
Zůstaly tak čtyři vzorky: první vzorek první generace, první a druhý vzorek druhé generace a druhý vzorek třetí generace. Pomocí přesné pipety bylo naměřeno do roztoku takové množství 20 % kyseliny octové, že daný roztok vzorku obsahoval tři procenta objemová kyseliny octové. U těchto vzorků byl učiněn pokus o zvláknění na tyčce. Žádný ze vzorků však nezvlákňoval, pouze se při napětí 20 kilovoltů začaly kapky na tyčce chvět a evidentně elektrosprejovaly. Druhý vzorek třetí generace se začal chvět již při napětí 17 kilovoltů. Všechny tyto vzorky byly přelity do velkých odpařovacích Petriho misek.
Protože už ale při vážení plných Petriho misek se ukázalo, že se kapalina odpařuje rychlostí asi 2 miligramy za sekundu, neboli přibližně 7 gramů za hodinu, bylo rozhodnuto přelít roztoky do menších odpařovacích misek. Vzorek číslo 1 první generace a vzorek číslo 1 druhé generace byly přelity, zbývající vzorky se ale nevešly do žádné menší Petriho misky a tak byla těmito miskami alespoň částečně překryta odpařovací plocha velkých Petriho misek se vzorky.
Další den byly odpařovací misky zváženy, kapátkem byly vyjmuty vzorky a misky byly opět zváženy. Žádný z těchto vzorků opět nezvlákňoval. Byly odstraněny krycí misky z velkých odpařovacích Petriho misek.
Protože byl minulý den spotřebován téměř celý první vzorek druhé generace, vytvořil se na ploše odpařovací misky kolagenový film, který zaplňoval téměř celý povrch mimo několika kapek roztoku u kraje misky.
Další vzorek, který vytvořil film byl druhý vzorek druhé generace a protože byl evidentně nejkoncentrovanější, bylo rozhodnuto vyzkoušet samostatně u něho zvlákňování.
Ani tento vzorek však nezvlákňoval, patrně pro malou viskozitu. Aby se u tohoto vzorku nevytvořil i ze zbývající kapaliny film, byla jedna strana odpařovací misky podepřena, čímž se přelila zbývající kapalina na jedno místo.
Tabulka vzorků a jejich změny v průběhu pokusů
Vzorky V1G1 V2G1 V1G2 V2G2 V1G3 V2G3 Popis
vzorků
směs středně velkých a tenkých šlach, nakrájených na
milimetrové části
kvalitní šlacha, na několika místech příčně naříznutá
směs středně velkých a tenkých šlach, podélně nakrájených na
milimetrové části
kořen šlachy, na několika místech naříznutý
směs středně velkých a tenkých šlach, nakrájených na
milimetrové části
střední šlachy a části kořene, nakrájené na
milimetrové části
Rozpouštění
v HCl 30 min., z
naříznutých ploch uvolňuje vlákna
30 min., z konců uvolňuje vlákénka
30 min., pravděpo- dobně pře- dávkováno HCl
30 min., pravděpo- dobně silně pře- dávková- no HCl
60 min., silné uvol- ňování vláken z naříznutých ploch
60 min., silné uvol- ňování vláken z naříznutých ploch Rozpouštění
v HCl a pepsinu
asi 5 dní, zakalený roztok, při doplňování předávko- váno HCl
asi 6 dní, zakalený roztok
asi 19 hodin, zakalený roztok
asi 19 hodin, zakalený roztok
asi 19 hodin, zakalený roztok
asi 19 hodin, zakalený roztok
Srovnávání pH na 5,5
výkyv na pH 9
výkyv na pH 9
výkyv na pH 8
výkyv na pH 8
výkyv na pH 6 až 7
výkyv na pH 6 až 7
Vzorky po přefiltrování
mírně žlutě zakalený
téměř průsvitný
bíle zakalený, následné usazení
slabě zakalený
středně zakalený, středně silná snaha usazovat se
středně zakalený, slabá snaha usazovat se Působení
NaOH přilito malé množství NaOH, pH zpět na 5,5
přilito malé množství NaOH, pH 11
roztok NaOH nepoužit
roztok NaOH nepoužit
přilit roztok NaOH rovný objemu vzorku
roztok NaOH nepoužit
Další použití
přelit do malé odpař.
misky
vzorek vyřazen (vysoké pH)
přelit do malé odpař.
misky
přelit do velké odpařov.
misky
vzorek vyřazen (velké zředění)
přelit do velké odpařovací misky
Přehled odpařování vzorků v Petriho miskách
Vzorky V1G1 V1G2 V2G2 V2G3
Váha misek v g 10,810 9,015 200,120 177,499 Celková váha g
po zvlákňovací zkoušce
62,010
25,137
302,133
245,388 Čas vážení
1. den 12,18 12,08 11,44 11,49 Vážení před
odebráním vzorků v g
52,577 15,761 277,227 216,888 Čas vážení
2. den 13,13 13,18 13,20 13,27 Vážení po ode-
brání vzorků v g 50,069 15,108 274,923 213,761 Čas vážení
2. den 14,02 14,18 14,20 14,26 Vážení před
odebráním
vzorků v g 43,418 10,279 253,727 194,158 Čas vážení
3. den 10,13 10,15 10,18 10,19 Vážení po ode-
brání vzorků v g
neměřeno pro nízkou koncentraci 192,335 Čas vážení
3. den 10,29
Vážení po vrácení nespotřebovaného
vzorku v g 192,715
Čas vážení
3. den 10,44
3.4. Popis přístrojů a chemikálií
Při experimentu byly použity tyto přístroje:
mikropipeta 20-200 μl, BIOHIT PROLINE
pH metr EUTECH pH 700 STAND 100/240 VA, EUTECH INSTRUMENTS třepačka VIBRAMAX 100, HEIDOLPH VIBRAMAX 100
míchačka magnetická, PORAGON LAB MS-H-PRO váhy KB 200-2N, KERN KB
váhy ANALYT DID SBC4, SCALTECH SBC 41 váhy PLS 720-3A, KERN PLS
Při experimentu byly použity tyto chemikálie:
NaOH hydroxid sodný P.A. NaOH M 40,00 PENTA, výrobní divize Chrudim PEP-05 pepsin 1:10000 NF, dovozce OK.SERVIS BioPro. s.r.o.
HCl kyselina chlorovodíková MIN 35 %, PENTA, výrobní divize Chrudim
CH3COOH kyselina octová 99 % Mr60,05 číslo, PENTA, výrobní divize Chrudim
3.5. Diskuze výsledků – zhodnocení
Pokus byl zastaven ve stádiu odpařování vzorků. V dané době se nepodařilo zvláknit ani jeden z roztoků. Důvodem byla příliš nízká viskozita. Příčinou může být nedostatečná koncentrace kolagenu v roztoku.
U žádného vzorku se nepodařilo rozpustit celé množství šlachy, které bylo nadávkováno do třepacích misek. Mohlo to být způsobeno příliš hrubě připraveným vzorkem s malým měrným povrchem nebo těkáním kyseliny v průběhu rozpouštění. Kromě prvního vzorku nebyl žádný vzorek rozpouštěn po předepsanou dobu požadovanou koncentrací kyseliny, protože kyselina vždy přes noc vytěkala.
O kvalitě rozpouštění se dá pochybovat i z toho důvodu, že nerozpuštěné zbytky šlach byly silně nabobtnalé a tak není jisté, zda jde o přirozený proces nebo se kolagen při rozpouštění rovnou mění na želatinu. Jistou úlohu v nedostatečném rozpouštění by snad mohl hrát i samotný pepsin, pokud by byl v nevhodné kvalitě nebo byl špatně nadávkován.
Kolagen by snad mohl být poškozen v průběhu rozpouštění předávkováním kyselinou nebo hydroxidem. Ale je třeba říci, že jednotlivé vzorky podstoupily natolik odlišný postup zacházení, že by se tato anomálie musela projevit pouze u některého z nich.
Za nejpravděpodobnější důvod neúspěšného zvlákňování by kromě poškozené vnitřní struktury kolagenu mohla být považována jeho nízká koncentrace ve zvlákňovacích roztocích.
Z tohoto důvodu byly vzorky po připravení přelity do odpařovacích misek, aby se odstranila přebytečná voda z roztoků.
Když je ale koncentrace tak vysoká, že při ní kolagen dokáže vytvářet na odpařovacích miskách filmy a přesto nezvlákňuje, pak může být důvodem nízká koncentrace kyseliny octové v roztoku. Kyselina octová se odpařuje spolu s vodou a tak jí může být v roztoku tak málo, že se v ní kolagen nedokáže rozpouštět v dostatečném množství.
4. Závěr
Byl učiněn pokus alespoň o částečné zmapování oblasti výzkumu, která se snaží využít kolagen jako biolékařský materiál pro regenerativní medicínu. Byly zde popsány a rozebrány tři hlavní způsoby kolagenních nanovlákenných materiálů. Každá z těchto metod přináší své problémy ale i výsledky s potenciálními přínosy pro budoucí výzkumy a použití.
Metoda využití směsi kolagenu s jinými polymery má velkou budoucnost pro velmi dobré mechanické vlastnosti jejich produktů.
Metoda, využívající uměle připravených peptidů podobných kolagenu dokáže produkovat jedny z nejkvalitnějších materiálů a určitě najde využití při výzkumu vnitřní chemie kolagenu ale i dalších složek exttracelulární matrix, které s kolagenem reagují.
Metoda, využívající přímého zvláknění extrahovaného kolagenu je jedna z nejobtížnějších metod, která se v této oblasti výzkumu používá. I přes nestabilitu svých produktů by snad mohla mít použití jako levná náhrada předešlé metody syntetických peptidů, podobných kolagenu. Výhodné je u tohoto rekonstruovaného kolagenu použití síťovacích činidel, která snad jednou v budoucnu umožní vytvořit dostatečně pevný a stabilní materiál s přijatelnými účinky a zatíženími na živé buňky.
Pro další rozvoj tohoto oboru se zdá být výhodné pokusit se o kombinaci některých těchto metod, například pomocí koaxiálního zvlákňování (zvlákňování ze dvou do sebe vložených jehel). V něm by se vnitřní jehla dávkovala tím roztokem polymeru s malou příměsí kolagenu, zatímco vnější jehla by mohla obsahovat silně hydrofilní derivát kolagenu spolu s nějakým netoxickým síťovacím činidlem. Tím by se docílilo dobré mechanické pevnosti a adheze. Zatímco hydrofilní kolagen by umožnil spojení těchto vláken fyziologickým roztokem uvnitř scaffoldu.
K experimentu lze říci, že nebyl proveden přesně podle návodu. Zdrojem kolagenu nebyla jedna velká koňská šlacha, ale několik malých vepřových. U roztoků se nedařilo udržet hodnoty pH po celou dobu rozpouštění na 2,5. Vyrovnávání pH nebylo úplně přesné a k dekandaci byla použita destilovaná voda o pH 6. Kvůli obtížnému srovnávání pH nebylo u většiny vzorků použito předepsané působení hydroxidu po dobu 60 minut.
Na otázku, jestli se těmito odlišnostmi znehodnotila struktura kolagenu natolik, že ho již nelze použít ke zvláknění nebo či stačí do vysušených vzorků přidat jinou koncentraci kyseliny octové, na to musí odpovědět další případné experimenty.
