Prostasome ELISA – a potential marker for prostate cancer diagnosis
Elisabeth Thermaenius 2012
Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi
1
Abstract
The prostate gland, a male organ situated right under the urine bladder, is involved in male reproduction. It can also be the place for more or less serious diseases such as inflammation, abnormal growth and cancer. Especially prostate cancer is very common in the Western world. Today PSA is the most widely used marker for detection of prostate cancer. Unfortunately, this method is not specific enough. Therefore, there is a need for a better marker for screening of malignant prostate cancer. The marker should be specific both for the organ prostate and for the cancer disease. One promising marker is the prostasome, a small vesicle emanating from epithelial cells in the ejaculatory ducts in the prostate.
The aim of this project was to set up an ELISA and test a number of antibodies for their ability to work as suitable capture or detection antibodies. As blocking agent different concentrations of BSA were tested. Biotin-Streptavidin conjugate was used in the detection step.
Two surface proteins, PSCA and PSMA were used as capture antigens; they are specific for prostasomes. Clusterin, a prostasomal surface-bound protein, was used as antigen for the secondary antibody in the assay. With this experimental setup the detection limit was 2500ng/mL, which is probably not enough to detect prostasomes in cancer.
The development of the ELISA did not reach its final stage, a ready-to-use assay, during this project. We have not yet the knowledge of optimal antibody concentrations and the other test parameters are also at experimental state.
2
Introduktion
Prostatan är ett organ, stort som en valnöt, som finns endast hos män och vissa handjur. Den sitter alldeles under urinblåsan och omsluter urinröret och sädesledaren. Den kan indelas i tre huvudzoner; den perifera, den centrala och övergångszonen.
I prostatan finns körtlar som innehåller acinära (bärliknande) sekretoriska epiteliala
basalceller som producerar viktiga komponenter till sädesvätskan, bl.a. ett sekret som är svagt basiskt och som ska skapa en basisk miljö i urinröret. Det gör också att slidans sura miljö blir lite mer neutral vilket gör att spermierna på sin väg mot ägget kommer att få mer livskraft. Prostatan innehåller också en del glatt muskulatur som hjälper till att pressa ut utlösningen. Det sitter två muskelventiler i vardera änden av urinröret som passerar igenom prostatan. När den nedre ventilen öppnas vid ejakulationen, skapas ett högt tryck och sädesvätskan slungas ut.
Andra komponenter som finns i prostatavätskan är bland annat surt fosfatas, albumin, citrat, olika joner och proteolytiska enzym. En liten intressant och viktig vesikel som utsöndras från epitelcellerna, prostasomen, finns också i vätskan (Lilja 1987, Stridsberg 1996).
Prostatacancer är den i särklass vanligaste cancerformen hos män (Boyle 1995). En tidig cancer kan växa till under en längre tid utan att ge symptom. I de fall där cancern bryter sig igenom körtelväggen sprider sig cancercellerna snabbt till lymfkärl och körtlar och även till skelettet. Vid misstanke om prostataproblem tar man ett serumprov på prostataspecifikt antigen (PSA) som då kan vara förhöjt. Dock kan detta prov vara förhöjt av andra, helt godartade orsaker och är inte en cancerspecifik markör. Prostatacancer diagnosticeras genom rektalpalpation och med vävnadbiopsier. Det finns ett speciellt graderingssystem för biopsier, kallat Gleason index och som grundar sig på utseende och differentiering av cancercellerna i biopsin. Dock är en biopsi inte helt lätt att utföra; man hittar oftast bara en del av tumörerna, den gör ont och den är förenad med biverkningar, främst infektioner, eftersom man går in via tarmen.
Det är önskvärt att hitta en analys som bättre avspeglar cancersjukdomen och inte ger någon förhöjning vid en godartad förändring av prostatan. PSA har hittills varit en viktig markör; den är organspecifik men tyvärr inte cancerspecifik. Intresset ligger på att hitta ett sätt att mäta både en organ- och cancerspecifik markör, en prognstisk markör med hög sensitivitet och specificitet.
3
Benign prostatahyperplasi/-hypertrofi är en godartad förstoring av prostatan vilket kan leda till svårigheter att urinera. Prostatan brukar av okänd anledning växa med stigande ålder (Berry 1984). Tillväxten sker oftast från de centrala delarna där den trycker mot urinröret och urinblåsan. Denna förändring är dock helt ofarlig, men ger ofta samma symptom som den elakartade tillväxten. Förändringen ger oftast upphov till urinretention, att det är svårt att kissa, vilket kan vara mycket obehagligt. Detta kan leda till att man behöver katetrisera patienten.
Som huvudsaklig markör i blod används idag PSA som fungerar som ett proteas; det produceras i fr.a. prostatans körtelepitel och utsöndras i normala fall till prostatasekretet. Funktionen där är att ”likvefiera”, d.v.s. lösa upp den gelstruktur som bildas vid en sädesuttömning, vilket i sin tur ska leda till att spermierna blir mer lättrörliga.
I blodet ska inte PSA förekomma, annat än i mycket låga halter (<4µg/L). PSA kan dock läcka ut vid vissa sjukdomstillstånd i prostata, inte enbart vid elakartad cancer. Det kan även förekomma cancer vid ”normal” PSA-koncentration, liksom måttligt förhöjd halt inte behöver betyda cancer (Ruckle 1994, Oesterling 1991).
För mer än 30 år sedan upptäcktes en liten vesikel, prostasomen (Ronquist 1985, Brody 1983). Den påträffades då i det som kallas seminalplasma, d.v.s. ejakulat utan spermier, inte bara hos människa utan även hos djur (Arienti 1998, Piehl 2006). Prostasomen har en diameter av 40-500nm med en medeldiameter av 100-150nm och härrör från de acinära prostatacellerna, epitelceller som ligger utefter utförsgången i urinröret som går genom prostata. Prostasomen omges av ett speciellt membran, uppbyggt av en hög andel
sfingomyelin och kolesterol (Poliakov 2009), jämfört med andra cellmembran. Det normala är att dessa vesikler utsöndras med vätskan som kommer från prostatan och som ska göra
spermierna sällskap på sin väg mot att befrukta ägget hos kvinnan. Man tror att de har olika funktioner; genom att interagera med spermatozoer (Ronquist 1990) kan det göra dessa mer rörliga, förhindra att kvinnans immunförsvar förstör spermierna via sitt komplementsystem och också hindra bakterieangrepp (Carlsson 2000).
Från att ha fungerat som spermiehjälpare kan hos äldre män, efter att den reproduktiva
perioden börjar klinga av, prostasomers egenskaper i stället hjälpa eventuella cancerceller från prostatan att sprida sig; befordra rörligheten och också hindra individens eget immunsystem att attackera och förinta cancercellerna (Ronquist 2004, Babiker 2005).
4
invaderas av växande blodkärl och på så sätt ämnen från epitelcellerna har hamnat på fel ställe (Sahlén 2004).
En användbar metod för att mäta specifika antigen i små mängder har visat sig vara sandwich ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) och den ville vi också använda oss av. Genom att välja antikroppar mot ytprotein på prostasomen; Prostate stem cell antigen och Prostate specific membrane antigen (PSCA, PSMA) som primär antikropp tänker man sig att dessa ska binda till enbart prostasomer. Som sekundär antikropp, detektionsantikropp, användes
Clusterin, ett protein som uttrycks på flera andra ställen, inte bara i prostasomen och vid ett flertal stress- och sjukdomstillstånd i kroppen. Efter infångning med hjälp av PSCA och PSMA och påföljande tvättsteg, förväntas det återstående clusterinet vara prostasombundet. Eftersom det är av största vikt att man upptäcker en aggressiv tumör, vill man gärna hitta en markör som specifikt påvisar cancer (Tavoosidiana 2011). Syftet med studien har varit att optimera en sandwich ELISA assay för att i serumprover kunna mäta prostasomkoncentration som markör för prostatacancer.
Material och metoder
Alla ingående parametrar testades med olika koncentrationer och optimerades var för sig och tillsammans. Den här analysen är uppdelad i ett antal steg som sinsemellan har varierats. De infångningsantikroppar och sekundära antikroppar som användes i studien var monoklonal mus anti human prostate stem cells antigen (PSCA), monoklonal mus anti human prostate specific membrane antigen (PSMA), polyklonal kanin anti human (PSCA), polyklonal kanin anti human (PSMA), monoklonal mus anti human Clusterin, monoklonal mus anti human CD38, och monoklonal mus anti human CD59. För blockering användes BSA 1%, BSA 2%, IgY eller Skimmed milk 5%. Som biotinylerade sekundära antikroppar användes monoklonal get anti human Galectin3, monoklonal get anti human matrix metallopeptidas (MMP9), monoklonal get anti human koagulationsfaktor 3 (F3 Tromboplastin), monoklonal får anti human CD38 och monoklonal mus anti human Clusterin. Prostasomerna späddes från en stamlösning som hade koncentrationen 2mg/mL, brukslösningen var 20µg/mL. Den
seriespäddes i steg 1:2 eller 1:10 ner till 625pg/mL som lägst. Som buffertar användes PBS, pH=7,4, PBS-B (1% (w/w) eller 2% BSA), eller PBS-T(0,5%(v/v) Tween).
Coatning med infångningsantikropp
5
antikroppar har en stark affinitet till plasten i brunnarna. Koncentrationen späddes till 1µg/mL och 100µL tillsätts i varje brunn. Inkubationen skedde under olika betingelser; antingen över natten i 2-8C, eller under 2h i 25C på skakbord Titertek®, (Flow Laboratories, USA). Antikropparna späddes i en buffert innehållande 0,15mol/L NaCl, 0,02mol/L
Na2HPO4; fysiologisk fosfatbuffert, (PBS) pH 7,6, (Merck, Tyskland). Antikropparna som
testades var riktade mot prostate stem cell antigen (PSCA) (klon 5C2, Sigma, USA) prostate specific membrane antigen (PSMA) (Invitrogen, UK), SP 40 (40 Clusterin, Quidel, USA), CD38 (Sanquin, Holland), CD59 (Sanquin, Holland), CD26 (Sanquin, Holland) och CD46 (Immunotech Frankrike) och CD143 (Sanquin, Holland). Efter inkubationen slogs innehållet noga ur plattan.
Blockering
Brunnarna blockerades sedan med en PBS-buffert innehållande 1% eller 2% bovint serum albumin, fraction V, (Sigma, USA) (BSA). Blockering med äggframställda antikroppar från höns, IgY, Immun System, Sverige provades också. 150µL av blockeringsreagenset tillsattes. I ett senare skede användes fettfri skummjölk (Biorad, USA). Blockeringen skedde antingen över natt i 2-8C eller i minst 1h på skak i 25C. Efter inkubationen slogs innehållet noga ur plattan.
Prostasomtillsats
Därefter tillsattes det som ska analyseras, i det här fallet prostasomer, framrenade från human seminalplasma som är en del av ejakulatet (Carlsson 2003). Prostasomerna späddes i en PBS-buffert innehållande 1 % BSA (PBS-B) till olika koncentrationer från 2mg/mL som sedan späddes till 20µg/mL. Prostasomer späddes i 1:2 steg ytterligare i de olika försöken, 100µL tillsattes i varje brunn och inkuberades i 2h, 25C.
Efter inkubationen tvättades plattan tre gånger med PBS-buffert med tillsats av en detergent, Tween 20 (PBS-T). Vid tvätt användes 150-200µL/brunn i varje steg. Efter varje tvätt slogs innehållet noga ut.
Detektion i flera steg
Olika typer av detektion provades. Ett sätt var att utföra en direkt fluorometrisk emissionsspektrummätning vid en inkommande våglängd av 355nm och en utgående våglängd av 460nm. Detta skedde efter tillsats av ett substrat H-Gly-Pro-AMC-HBr,
6
ger en mätbar produkt. Koncentrationen var ca 1µg/mL och 100µL tillfördes varje brunn. ELISA-plattan inkuberades i 37C, Termaks (Termaks, Norge), under olika tider; 15min, 30min, 60min och över natt. Mätningen gjordes direkt därefter med Victor2 Wallac (Wallac OY, Finland) 1420 multilabel counter.
Det andra detektionssättet var att koppla på en sekundär antikropp på prostasomen och sedan koppla på ytterligare en antikropp konjugerad med ett enzym som kan klyva ett substrat till en färgad, spektrofotometriskt mätbar produkt.
Motsvarande antikroppar som plattan behandlades med från början användes även i detta steg, d.v.s. PSCA, PSMA, Clusterin, CD38 och CD59 men nu i hälften så hög koncentration som vid coatningen, d.v.s. 0,5µg/mL. Därefter tillsattes ett Goat-anti-Mouse IgG (H+L)HRP conjugate, (Zymed, USA) 1µg/mL och 100µL/brunn för att därefter kunna tillsammans med ett substrat ge en färgad produkt.
Ytterligare ett antal sekundära antikroppar provades och dessa har varit biotinylerade; Galectin 3 (R&D Systems, USA) Matrix Metallopeptidas (MMP 9) (R&D Systems, USA) Koagulationsfaktor III, tromboplastin (F3) (R&D Systems, USA) CD38 (R&D Systems, USA) och Clusterin (R&D Systems, USA). Koncentrationen var 0,5µg/mL i plattans översta rad och utifrån den gjordes spädningar i steg om 1:2;100µL tillsattes till varje brunn.
Sekundärantikroppen inkuberades i 2h i 25C. Därefter tvättades med PBS-T, här 3 gånger och innehållet slogs noga ut mellan varje tvätt.
På sekundärantikroppen sitter ett konjugat med ett enzym som klyver ett substrat för själva mätningens utförande. Här var det Streptavidin Horseradish Peroxidase conjugate, (Zymed, USA). Spädningen var från 1/2000 och nedåt. Ett liknande konjugat från (R&D Systems, USA) i samma spädning provades också. Till varje brunn tillsattes 100µL.
Inkubationen skedde 1h i 25C. Därefter tvättades med PBS-T 3 eller 5 gånger med noggrann utslagning av innehållet mellan varje tvättsteg.
Sista steget vid detektion
7
Undersökning av detektionssteget
Ett försök med coatning av prostasomer direkt på ELISA-plattan gjordes också. Övriga steg lika som ovan förutom att infångningsantikroppen saknades. Här testades tre av de
biotinylerade antikropparna i sekundärsteget; Galectin, MMP9 och F3. Alla övriga
inkubations- och tvättsteg som ovan. StreptavidinHRP späddes i 8 steg (1:2) med början vid 20µg/mL. Detektionen följde i övrigt ovanstående schema. Vi har också testat innehållet av clusterin med ett kit från BioVendor, Tjeckien; Human Clusterin ELISA.
Mätmetoder
Absorbans mättes med antingen fluorometri (fluorescens spektrometri) eller spektrofotometri. Fluorometri innebär att ljus från en viss våglängd exciterar elektroner i de molekyler man vill mäta. Dessa emitterar ljus som i sin tur kan mätas vid en annan våglängd. Spektrofotometri innebär att man mäter absorption av ljus för de molekyler som är av intresse, vid en viss våglängd.
Tvättsteg
Efter provpåsättning och inkubation med prostasomer tvättades plattan 3 gånger med 150µl PBS-T i varje brunn. Efter tillförsel och inkubation av den sekundära antikroppen tvättades plattan också 3 gånger med 150µl PBS-T i varje brunn. Efter tillförsel och inkubation med StreptavidinBiotinHRP-konjugatet tvättades plattan 5 gånger med samma mängd PBS-T som tidigare. Efter varje tvättsteg slogs innehållet i brunnarna noga ut.
Resultat
Test av infångningsantikropp
8
Figur1. Mätning av infångningsantikropparna PSCA (blå), PSMA (röd), clusterin (grön), CD38 (turkos) CD59 (violett) och med fluorometri efter inkubering i 60min. Prostasomerna späddes från 20 g/mL till 0,156 g/mL.
Test av detektionssteg
Detektionssteget utfördes med olika sekundära antikroppar riktade mot ytproteiner hos prostasomer. Prostasomerna var direkt coatade till ELISA-plattan, utan någon
infångningsantikropp, dock med BSA-blockering. Koncentrationen av prostasom var konstant, 1µg/mL. Detektionen utfördes med spektrofotometri.
För att testa vilken av antikropparna som var bäst för detektion användes fem olika antikroppar riktade mot kända ytproteiner. Av de testade antikropparna gav clusterin den starkaste signalen (Figur 2).
Test av både infångnings- och sekundär antikropp
I ett försök användes Galectin3, MMP9, TF3, CD38 och clusterin som
9
Figur 2. Mätning av de sekundära antikropparna galectin 3 (blå), MMP 9 (röd), TF (grön), CD38 (violett) och clusterin (turkos) med streptavidin-biotinkoncentrationer från 625 g/mL till 5 g/mL, med spektrofotometri. Prostasomer, 1 g/mL, coatades direkt på plattan, utan infångningsantikropp.
10
En noggrannare standardkurva visade att detektionsgränsen var ca 2500ng/mL (Figur 4).
Figur 4. Mätning av prostasomer i koncentration från 20 g/mL till 0,625ng/mL. Infångningsantikroppar var PSCA och PSMA i lika stor koncentration, Clusterin användes som sekundär antikropp.
Blockering av ospecifik bindning med BSA 1% eller 2%, IgY eller fettfri skummjölk 5% med en prostasomkoncentration från 20 g/mL till 0,2 g/mL och en sekundär
antikroppskoncentration från 0,5 g/mL spädd 1:2 ner till 0,004 g/mL förbättrade inte detektionsgränsen.
Diskussion
Det har länge varit önskvärt att hitta en bättre malignitetsmarkör för prostatacancer än att med hjälp av biopsier från prostatakörteln klassificera cellerna genom Gleasonindex. Det är också önskvärt att finna en lämplig markör för screening än PSA då denna har en för låg specificitet. Ett sätt att göra detta på är genom en sandwich ELISA assay som kan detektera prostasomer, mikrovesikler som kan läcka ut i blodet vid cancertillväxt i prostatakörteln. En mindre organell skulle lättare kunna detekteras i ett blodprov än en hel cell.
11
andra celler och cellorganeller. Infångningsantikroppen fångar upp prostasomer och därefter kan detektionen ske med en andra antikropp som riktar sig mot prostasomer men som även förekommer i andra vävnader (Jones 2002).
Eftersom prostasomer finns i mycket små mängder, är det ändå viktigt att välja antikropp mot ett protein som man säkert vet finns i tillräcklig mängd för att man över huvud taget ska kunna hitta prostasomer.
Delmål är att kunna mäta koncentration av rena prostasomer i PBS-buffert utan störande bakgrund. Tanken var att sedan optimera analysen steg för steg. Sekundärantikroppen och detektionsstegen är också viktiga, speciellt när det gäller så små mängder prostasomer som lär finnas i patientproverna.
När optimeringen av denna assay är tillfredsställande kan vi testa serumprover som är positiva för PSA/har höga PSAvärden och se om det också finns mätbara koncentrationer av
prostasomer i dessa prov. Man kan också välja att testa serumprover från patienter som är Gleasonpositiva eller sådana som har avlidit i prostatacancer och som nu finns i biobank. Svårigheterna visade sig redan vid val av infångningsantikropp. Av de tester av rena PSCA-, PSMAantikroppar och blandningar därav som utfördes var det ingen som utmärkte sig för vara helt tillförlitlig och godtagbar. Jag valde dock en blandning av dessa två i lika delar. Vid pilotförsök med test av serumprover visade det sig att ingen skillnad kunde uppmätas. Alla prover visade för hög bakgrund.
Gängse substanser för att blockera ospecifik bindning provades; BSA i olika koncentrationer, IgY-antikroppar från höns och fettfri skummjölk. Ingen av dem fungerade bättre än den andra, det vill säga hjälpte till att minska bakgrunden.
För att kontrollera om detektionen fungerade, kopplades prostasomer direkt till ELISA-plattan, utan att infångningsantikroppar var coatade. Då kunde man avläsa en skillnad i koncentration av de olika spädningarna när man hade den sekundära antikroppen och en konjugerade Streptavidin-biotin-antikroppen.
Den analys som hittills har använts för prostasomanalys är en s.k. multiple recognition assay. Principen är en proximity ligation assay (PLA) vilket innebär en infångning genom en
antikropp. Därefter fästs fyra antikroppar med tillhörande DNA-strängar på denna. Alla dessa måste fastna på rätt sätt för att kunna detekteras med PCR. Det bygger på en samtidig
igenkänning av fem epitoper på fyra olika ytproteiner på prostasomen. Den metoden är en forskningsmetod, kostsam, svår att använda och lämpar sig inte för rutindiagnostik
12
En möjlighet skulle kunna vara att rikta sina krafter mot någon annan markör på
prostasomytan, t.ex. Caveolin-1 (Llorente 2004, Corn 2011), Galectin-3 ((Block 2011), TF (Fernández 1997) eller att mäta autoantikroppar mot prostasomer (Nilsson 2001).
Flödescytometri kan också vara en möjlighet (Carlsson 2006) enligt tidigare arbeten.
Den utforskade assayanalysen befinner sig på ett basalt stadium, ännu inte användbart för att kunna diagnosticera prostatacancer. Detektionsgränsen befinner sig kring 2500ng/mL, vilket inte är tillräckligt känsligt då prostasomkoncentrationen i blod, vid cancersjukdom troligen är betydligt lägre. Det skulle förmodligen krävas betydligt fler arbetstimmar för att komma underfund med vilka kombinationer av antikroppar som skulle ge bästa resultatet, hur pass låg koncentration prostasomer det är möjligt att mäta, om det överhuvudtaget går att mäta
prostasomkoncentrationer i blodprov, med tanke på interfererande fakorer som kan finnas.
Referenser
Aalberts M et al, Identification of distinct populations of prostasomes that differentially express prostate stem cell antigen, annexin A1, and GLIPR2 in humans. Biol Reprod 86;
2012: in print.
Arienti G et al, Prostasome-like particles in stallion semen. Biol Reprod 59; 1998: 309-313. Babiker AA, Transfer of functional prostasomal CD59 of metatstatic prostatic cancer cell origin protects cells against complement attack. Prostate 62; 2005: 105-114.
Berry SJ et al, The development of human benign prostatic hyperplasia with age. J Urol 132;
1984: 474-479.
Block AS et al, Co-purification of Mac-2 binding protein with galectin-3 and association with prostasomes in human semen. Prostate 71; 2011: 711-21.
Boyle P, Maisonneuve P, Napalkov P, Geographical and temporal patterns of incidence and mortality from prostate cancer. Urology 46; 1995: 47-55.
Brody I, Ronquist G, Gottfries A, Ultrastructural localization of the prostasome – an organelle in human seminal plasma. Ups J Med Sci 88; 1983: 63-80.
Carlsson L et al, Antibacterial activity of human prostasomes. Prostate 44; 2000: 279-286. Carlsson L et al, Characteristics of human prostasomes isolated from three different sources. Prostate 54; 2003: 322-330.
Carlsson L et al, Flow cytometric technique for determination of prostasomal quantity, size and expression of CD10, CD13, CD26 and CD59 in human seminal plasma. Int J Androl 29;
13
Corn PG, Thompson TT, Identification of a novel prostate cancer biomarker; caveolin1: Implications and potential clinical benefit. Cancer Manag Res 2; 2010: 111-122.
Fernández JA, Potent blood coagulant activity of human semen due to prostasome-bound tissue factor. Biol Reprod 56; 1997: 757-763.
Jones SE, Jomary C, Clusterin. Int J Biochem Cell Biol 34; 2002: 427-431.
Lilja et al, Seminal vesicle-secreted proteins and their reactions during gelation and liquefaction of human semen. J Clin Invest 80; 1987: 281-285.
Llorente A, de Marco MC, Alonso MA, Caveolin-1 and MAL are located on prostasomes secreted by the prostate cancer PC-3 cell line. J Cell Sci 117; 2004: 5343-5351.
Nilsson BO et al, Autoantibodies to prostasomes as new markers for prostate cancer. Ups J Med Sci 106; 2001: 43-49.
Oesterling JE, Prostate specific antigen: a critical asessment of the most useful tumor marker for adenocarcinoma of the prostate. J Urol 145; 1991: 907-923.
Piehl LL et al, Biochemical characterization and membrane fluidity of membranous vesicles isolated from boar seminal plasma. Anim Reprod Sci 92; 2006: 401-410.
Poliakov A et al, Structural heterogenity & protein composition of exosome-like vesicles (prostasomes) in human semen. Prostate 69; 2009: 159-167.
Ronquist G, Brody I, The prostasome: its secretion and function in man. Biochem Biophys Acta 822; 1985: 203-218.
Ronquist G, Nilsson, BO, Hjertén S, Interaction between prostasomes & spermatozoa from human semen. Arch Androl 24; 1990: 147-157.
Ronquist G, Nilsson BO, The Janus-faced nature of prostasomes: their pluripotency favours the normal reproductive process and malignant prostate growth. Prost Cancer Prost Dis 7;
2004: 21-31.
Ruckle HC, Klee GG, Oesterling JE, Prostate-specific antigen; critical issues for the practicing physician. Mayo Clin Proc 69; 1994: 59-68.
Sahlén G et al, Prostasomes are secreted from poorly differentiated cells of prostate cancer metastases. Prostate 61; 2004: 291-297.
Stridsberg M et al, Prostasomes are neuroendocrine-like vesicles in human semen. Prostate 29; 1996: 287-295.
