Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi EXAMENSARBETE
Biomedicinska analytikerprogrammet Fortsättningskurs D, Vt 2010
CRYOPRESERVATION OF OOCYTES
Comparison between the Cryoloop and the Cryopette vitrification techniques
Sara Ekberg
saer1454@student.uu.se 073-6674208
Handledare: Julius Hreinsson
Praktisk handledare: Fatma Gülen Yaldir
ABSTRACT
Crypreservation of oocytes is recently being considered to be a valid choice in infertility treatments.
Low survival and fertilization rates due to inefficient slow freeze protocols have been the outcome of many previous studies done in the field. However, introduction of the vitrification technique and its application in reproductive medicine and to some extent new improved slow freeze protocols have shown that oocytes can be cryopreserved with successful outcome.
In this project the survival rate of oocytes after vitrification with MediCult Vitrification and Warming Media has been studied. Also, a comparison of the carriers Cryoloop (an open system) and Cryopette (a closed system) has been performed.
A total of 43 oocytes were vitrified and warmed according to MediCult's protocol, of which 21 oocytes with Cryoloop and 22 with Cryopette. The cells were post-thaw incubated in a physiological environment for 24h. During that time the morphology and viability were observed and noted after 2h, over night and after 24h. No significant difference in survival rates of the oocytes' was observed using the two carriers, and the total survival rate of the oocytes was 83.7%. This indicates that
cryopreservation of oocytes is a valid choice in fertility treatments and that the new product Cryopette can be used clinically with just as good results as the well established Cryoloop technique. This merits further studies on the applicability of vitrification on oocytes and the Cryopette technique.
Keywords: Oocytes, cryopreservation, vitrification, Cryoloop, Cryopette
SAMMANFATTNING
Frysförvaring av spermier och embryon är idag vedertagna tekniker som används regelbundet på fertilitetskliniker runt om i världen med goda resultat. När det kommer till äggceller har utfallet varit sämre. Äggceller har länge ansetts vara svåra att frysa då de är känsligare än embryon.
Konventionella frysmetoder har inte gett tillräckligt bra resultat för att äggfrysning ska kunna tillämpas annat än i forskningssyfte eller undantagsfall. Men med introduktionen av en ny metod vitrifiering - har bättre resultat gällande överlevnad och befruktning kunnat presenterats i ett flertal studier.
I detta projekt har överlevnaden hos äggceller efter vitrifiering undersökts samt en jämförelse mellan två vitrifieringstekniker, Cryoloop och Cryopette utförts. Totalt 43 äggceller vitrifierades antingen med Cryoloop (21 ägg) eller Cryopette (22 ägg). Äggcellerna förvarades i flytande kväve (- 196C) under minst 48h innan de tinades och bedömdes. Av de 43 äggcellerna överlevde 83,7% vilket anses vara ett bra resultat. I jämförelsen mellan de två teknikerna visade denna studien ingen
signifikant skillnad vilket kan tyda på att teknikerna är jämbördiga vilket leder till att fler och mer
omfattande studier bör göras för att med säkerhet fastställa detta.
INTRODUKTION
Det finns idag, i och med att tekniken hela tiden utvecklas och en öppnare syn på fertilitetsbehandlingar och “provrörsbarn” har växt fram, flera olika möjligheter för individer med nedsatt fertilitet att bli föräldrar utan att adoptera. Idag erbjuds förutom in vitro-fertilisering och inseminering med parets egna könsceller även fertilitetsbehandlingar med donerade könsceller både från kvinnliga och manliga donatorer. Embryodonation och surrogatmoderskap är däremot inte lagligt i Sverige även om
diskussioner om ändring i lagstiftningen pågår. Det är främst på grund av etiska skäl som dessa typer av behandlingar inte är tillåtna.
Behovet av långtidsförvaring av könsceller har ökat successivt ända sedan frysförvaring började användas kliniskt. Förutom frysförvaring av embryon så sparas könsceller som en fertilitetsbevarande åtgärd inför behandling mot cancer och autoimmuna sjukdomar. Behandling med cytostatika och strålning kan orsaka irreversibla skador på könscellerna, dessutom förekommer invasiv
cancerbehandling där äggstockar eller testiklar och därmed könscellerna avlägsnas helt. Därför försöker man att tillvarata könsceller innan behandlingen påbörjas för att sedan förvara dem tills patienten i fråga är friskförklarad [1]. Även frysförvaring av donerade könsceller förekommer. Främst är det spermier från donatorer som frysförvaras då de är lättåtkomliga vid provtagning samt har frysts ned kliniskt med gott resultat de senaste trettio åren. Nedfrysning av donerade oocyter förekommer också i klinisk verksamhet men i än så länge ganska låg utsträckning, de flesta ET
1som utförs med donerade äggceller görs med färska ägg.
Vid IVF-behandlingar är det önskvärt att ha ett flertal oocyter att befrukta för att öka chanserna för en graviditet. Med hormonbehandling triggas fler ägg att mogna ut än vid en naturlig menstruationscykel,
1 ET – Embryo transfer. Befruktat embryo återförs i livmodern via kateter.
stimuleringen behövs även för att styra cykeln så att embryot befruktas och återförs i rätt fas för att en möjliggöra en graviditet.
Den naturliga menstruationscykeln är indelad i två faser, follikelfasen och lutealfasen, vilka skiljs åt av ägglossningen. Under follikelfasen utsöndras FSH från hypofysen vilket leder till att ett antal äggblåsor börjar mogna i ovariet. FSH stimulerar även bildandet av LH-receptorer i äggblåsorna.
De aktiverade äggblåsorna börjar att utsöndra estradiol vilket i sin tur påverkar LH-sekretionen så att den ökar. LH stimulerar proliferation av äggblåsorna så att de börjar utvecklas till mogna oocyter. När LH når sin maximala nivå (LH-toppen) startas ägglossningen, då kommer en utav de oocyterna som påbörjat mognad att utsöndras medan de övriga avstannar i mognaden och istället tillbakabildas.
Vid hormonstimulering tillförs hormoner utifrån för att starta upp och styra menstruationscykeln så att ett större antal äggblåsor börjar utvecklas och ingen tillbakabildning av äggblåsorna sker. Detta behövs för att få ut ett så stort antal oocyter som möjligt vid OPU
2och därmed öka chanserna till befruktning in vitro.
Oocyter observeras i tre olika mognadsstadier GV
3, MI
4och MII
5(figur 2a-c), dessa stadier bestäms visuellt via ett mikroskop.
I GV-stadiet befinner sig oocyten i profas i den första meiosdelningen och har varit det under hela follikelutvecklingen. Kärnan syns tydligt i ett mikroskop och brukar liknas vid ett öga. Oocyter i GV-stadiet kan inte bli befruktade då de inte genomgått de meiosdelningar som krävs och innehåller för mycket genetiskt material.
2 Ovarian Pick Up – kirurgisk aspiration av äggceller ur ovariets äggblåsor.
3 Germinal vesikel – oocyten första mognadsstadium
Nästa mognadsgrad är MI-stadiet. Oocyten har då gått över till metafas i den första
meiosdelningen. Kärnmembranet har lösts upp och kromosomerna ligger uppradade på spoltrådar.
Visuellt känns MI-oocyter igen via sin släta yta och brist på germinalvesikel och polkropp. Inte heller i MI-fasen kan oocyten befruktas.
Det sista mognadsstadiet för en oocyt är MII-stadiet. Cellen befinner sig i metafas i den andra meiosdelningen och kan inte vidareutvecklas utan befruktning. Det extra genetiska materialet som finns i tidigare stadier har utsöndras i en polkropp. Det är även polkroppen som skiljer MII-oocyter från MI- ägg vid visuell bedömning.
När oocyten befruktas bildas en zygot och meiosen sluförs. Tecknet på befruktning är att två pronuclei kan observeras, även den andra polkroppen blir synlig. Zygoten fortsätter att dela sig och bildar efter ett dygn ett pre-embryo med två celler, efter två dygn fyra celler och efter tre dygn åtta celler. På dag fyra kallas zygoten för morula och består av minst nio celler och fem dagar efter
befruktningen har en blastocyst bildats. Blastocysten känns igen genom ett yttre cellager av trofoblaster samt att den inre cellmassan ligger orienterad mot ena cellväggen det här även uppstått ett hålrum inuti blastocysten.
För att en cell ska kunna överleva nedfrysning måste den först behandlas med kryoprotektaner. Dessa lösningar är ofta toxiska i höga doser och brukar indelas i permeabla eller icke-permeabla [2]. Till de permeabla kryoprotektanterna hör DMSO
6, propandiol och etylenglykol, två välanvända men toxiska ämnen som stabiliserar cellen inifrån och bevarar den inre cellstrukturen. Vitrifieringslösningar brukar även innehålla sukros, som är en icke-permeabel kryoprotektant som via osmos driver ut vattnet i cellen och därmed minskar risken för att skadliga iskristaller bildas inuti den. Då cellen minskar en del
6 DMSO - Dimetylsulfoxid
av sin storlek efter det osmotiska utbytet minskar behovet av höga koncentrationer permeabla
kryoprotektanter. Därför anses det att förekomst av sukros sänker toxiciteten i vitrifieringslösningar då risken att cellen skadas av de toxiska kryoprotektanterna ökar med ökande koncentration och
exponeringstid. Därför pågår ett forskningsarbete för att ta fram frysprotokoll med så låg koncentration och exponeringstid av kryoprotektanter som möjligt.
I dagsläget är det främst spermier och embryon som frysförvaras i samband med
donationsprogram och fertilitetsbehandlingar. Oocyter har tidigare ansetts vara svåra att förvara då överlevnad och fertilisering efter frysning har varit låg i ett flertal studier [3 – 5]. Bland annat så publicerade Tucker et al.[3] 1998 resultat från studier där överlevnaden hos nedfrysta och tinade oocyter var 55%. De undersökte även fertiliseringsgraden och av 45 tinade ägg var det endast 1 som ledde fram till en avslutad graviditet. I samma artikel beskrevs även skillnaden i överlevnad mellan mogna MII-oocyter och omogna GV-oocyter. Av de mogna äggen var det 2.2% av de som frysts ned som överlevde medan 44% av de omogna oocyterna överlevde.
MII-oocyter har sina kromosomer uppradade på kärnspolen och inte skyddade i kärnan vilket gör dem mer utsatta än GV-äggen [6]. Det finns dock andra studier [7,8] som föreslår att GV-ägg skulle vara känsligare för nedfrysning. Orsaken till detta tros vara att cellerna har ett skörare cellmembran i det här stadiet och att även om de har en högre överlevnadsgrad än MII-oocyterna så kan de förlora sin förmåga att mogna ut och därmed bli fertiliserade.
Ovanstående studier har genomförts med metoden slow-freeze, en väletablerade metod som
används kliniskt vid frysförvaring av embryon i det flesta länder. Det har dock på senare tid forskats
mycket på en annan metod, vitrifiering, som enligt många kan vara lösningen på problemet med låg
överlevnadsgrad hos nedfrysta oocyter.
Den första lyckade nedfrysningen av embryon gjordes 1972 av Whittingham et al [9]. Det är det försök som ligger till grund för det konventionella slow-freezeprotokollet som används idag. Försöket gjordes på musembryon som har en hel del likheter med humana embryon, men det dröjde dock fram till 1983 innan det första barnet föddes efter en human embryonedfrysning [10].
När man frysbevarar oocyter med ett slow-freezeprotokoll prepareras äggen med låga koncentrationer av kryoprotektant och laddas därefter i en hållare, vilken långsamt kyls ned till -6C.
Vid -6C induceras bildandet av iskristaller manuellt i lösningen, så kallad ”seedning”. Efter seedning kyls hållaren ned till -196C i vilken temperatur ägget sedan förvaras. Ett slow-freezeprotokoll tar cirka 2 timmar vilket medför att oocyten utsätts för en lång exponering av kryoprotektanter även om det sker vid en låg koncentration. Detta anses vara en orsak till att slow-freeze inte gett så goda resultat för oocyter. På senare tid har dock bättre protokoll tagits fram bland annat med Na-fria lösningar vilka genererat betydligt bättre resultat än tidigare protokoll [11].
Redan på slutet av 1800-talet presenterades den första teorin om vitrifiering. Det var dock inte för än Basile J Luyet började förbättra metoden under 1930-talet som den på allvar blev riktigt
uppmärksammad. Men på grund av svårigheterna med att kyla ned cellerna tillräckligt snabbt och samtidigt skydda dem mot frysskador lyckades han inte överföra teorin i praktiken. Trots att fler forskargrupper arbetade med vitrifiering dröjde det ända fram till 1985 innan Rall och Fahy fastställde ett såpass bra protokoll för vitrifiering att metoden kunde börja användas praktiskt. De lyckades med att frysa ned och tina upp 8-celliga musembryon utan degenerering [12]. Sedan dess har tekniken fortsatt att utvecklas.
Vid vitrifiering doppas cellen direkt ned i flytande kväve efter behandling med kryoprotektanter
och vitrifieringslösning. Vitrifieringslösningen bildar vid kontakten med kvävet en glasliknande
struktur i vilken cellen kapslas in. Med vitrifering frångår man helt bildandet av iskristaller vilka kan skada cellen, det behövs dock höga halter kryoprotektant för att skydda cellen mot den mycket snabba nedkylningen. Trots detta är överlevnaden och fertiliseringsgraden hos oocyter som vitrifierats
dokumenterat bättre än hos dem som frysts med slow-freeze [13, 14]. Anledningen till detta beror troligtvis på den korta exponeringstiden i lösningen innan nedfrysningen.
Efter att oocyterna frysts ned så förvaras de i tankar fyllda med flytande kväve. Kväve är flytande vid -196C, en temperatur där ingen biologisk aktivitet är möjlig. Cellen kommer därför att befinna sig i dvalliknande tillstånd och därmed inte åldras eller genomgå cellförändringar. Den enda risken för skador medan cellen är i förvaring anses vara från bakgrundsstrålning [1].
En annan risk med frysförvaring anses vara smittspridning i kvävet [15]. Mikroorganismer som kan överleva i extremt kalla miljöer har en teoretisk möjlighet att spridas mellan celler som förvaras öppet i kvävet. Även om den risken anses vara mycket liten så arbetas det med att ta fram slutna förvaringssystem där cellerna är helt isolerade från kvävet.
När oocyten genomgår ett frys- och tiningsprotokoll utsätts den för flera typer av stress; mekanisk vid själva handhavandet av cellen, kemisk vid prepareringen med frys- och tiningslösningar och termisk vid nedkylning och uppvärmning. Detta kan orsaka ett flertal patologiska tillstånd hos cellen och till och med få den att degenerera.
Hos oocyter i MII-stadiet har det bildats tubulintrådar (även kallat spoltrådar) mellan
kärnspolarna. På dessa finns kromosomerna uppradade inför delning. Detta komplex är känsligt för
temperaturförändringar, vilka orskar de- och repolymerisation av spoltrådarna. Vid temperaturer lägre
än 35C depolymeriseras spoltrådarna och nedkylning till rumstemperatur (20C) kan vara skadligt för
oocyterna vilket Pickering et al. publicerad data om 1990 [16]. Repolymerisering sker efter inkubering i fysiologisk miljö. Det är dock debatterat om repolymerisationen sker korrekt och misstankar om aneuploidi och andra kromosomavvikelser finns sammankopplade med frysförvaring av oocyter.
Senare studier har dock påvisat att cellen är förmögen att återbilda spoltrådarna korrekt [2, 17] och en studie pekar även på att oocyter frysta efter vitrifieringsprotokoll återhämtar sig snabbare än de frysta med slow-freezemetoden [17].
Skador på zona pellucida (oocytens yttersta skal) så som frakturer och förtätning av zonan är förenat med kryoförvaring av oocyter. Förtätning av zonan påverkar fertiliseringen då spermier inte kan penetrera zonan och därmed ta sig in i oocyten. Problemet har dock kringåtts genom att de oocyter som tinats alltid befruktas genom ICSI
7[17].
Förutom de tillstånd som tagits upp ovan kan det ha uppkommit skador på DNA vid behandlingen. Dessa syns inte vid undersökning i mikroskop men kan påverka fertilisering eller utveckling av embryot [18].
Målen med projektet var att jämföra två olika metoder vid vitrifiering av obefruktade oocyter i olika mognadsstadier samt att undersöka viabiliteten hos obefruktade oocyter efter vitrifiering. De två metoder som jämfördes var Cryoloop från Vitrolife – ett öppet och väletablerat system som används kliniskt på många IVF-laboratorier och Cryopette från Medicult – ett helt nytt slutet system som ej ännu lanserats på marknaden. Detta utfördes delvis för att evaluera en för laboratoriet ny metod med nytt material (Cryopette), samt för att undersöka viabiliteten för oocyter efter vitrifiering.
7 Intracytoplasmisk injektion – direktinjektion av spermie i oocytens cytoplasma
MATERIAL OCH METOD
Oocyter
Etiktillstånd för forskning om vitrifiering av oocyter har utfärdats till Reproduktionscentrum. Alla oocyter som användes i projektet kommer från patienter på Reproduktionscentrum, Akademiska sjukhuset. Oocyterna som användes i projektet var antingen omogna eller bedömda som ej befruktningsdugliga och skulle kasseras då de exkluderats ur patientens behandling.
Innan oocyterna togs med i projektet denuderades de av embryolog på Reproduktionscentrum.
Vid denudering avlägsnas de stödceller som normalt omger oocyten enzymatiskt, med hyaluronidas och mekaniskt genom att oocyten pipetteras upprepade gånger tills stödjecellerna släppt från oocyten.
Då stödjecellerna avlägsnats bedömde en embryolog äggets mognadsgrad som GV, MI eller MII (figur 1a-c) samt morfologin. De oocyter som inte var befruktningsdugliga flyttades från den kliniska
verksamheten till projektet, efter att de avkodats från patientuppgifter. När oocyterna använts i projektet kasserades de.
Figur 1a: GV-oocyt, med synlig germinal vesikel.
Bild: Svend Lindenberg
Figur 1b: MI-oocyt, ingen synlig vesikel eller polkropp.
Bild: Sara Ekberg
Figur 1c: MII-oocyt med en tydlig polkropp.
Bild: Standford Hospital and
Clinics
Cryoloop
Cryoloop (figur 2) tillverkas av Vitrolife och består av en 20 µm tjock nylontråd formad till en loop med en diameter på 0.5-0.7mm. Tråden är monterad på en hållare som i sin tur sitter i locket på ett cryorör. Vid vitrifering 'coatades' loopen med vitrifieringslösning och oocyten applicerades på ytan av loopen med en pipett. Då vitrifieringslösningen är mycket viskös hölls oocyten fast i loopen med hjälp av ytspänning. Cryoloop är ett öppet system och loopen doppades direkt ned i flytande kväve vid vitrifieringen. Cryoröret tillhörande Cryoloopen sänktes därefter ned i kvävet och locket med loopen skruvades fast i röret.
Cryopette
Cryopette (figur 3) är ett nytt system vid vitrifiering av oocyter och embryon. Systemet är helt slutet så att oocyten aldrig kommer i direkt kontakt med kvävet. Cryopette är en pipett med en inre diameter på 275µm och en längd på 23,7mm, vilket gör att den suger upp exakt 1,2µl, en optimal mängd
vitrifieringsmedium vid långtidsförvaring av oocyter. Äggcellen sugs upp i cryopetten från
vitrifieringslösningen och förseglas genom att spetsen av pipetten smältes samman. Cryopetten doppas därefter direkt ned i flytande kväve där den sedan förvaras.
Figur 2: Cryoloop från Vitrolife laddad med två oocyter. Bild:
Fertlitetscentrum
Vitrifiering av oocyter
Vitrifieringsmediet som användes var Vitrification Cooling, product No.1218 (MediCult). Produkten utgörs av två lösningar; 'equilibration medium' och 'vitrification medium'. Produkten innehåller etylenglykol och 1,2-propandiol, vilka fungerar som kryoprotektanter. I vitrfication medium finns det utöver detta sukros. I övrigt består produkten av små mängder plasmaprotein, natriumklorid, L- glutamin, natriumlaktat, natriumbikarbonat, kaliumklorid, kalciumklorid, kaliumfosfat,
magnesiumfosfat och natriumpyruvat. I lösningarna finns det även antibiotika i form av penicillin och streptomycin. Inga koncentrationer på beståndsdelarna kan anges då dessa är konfidentiella och endast kända av tillverkaren.
500 µl av de båda lösningarna pipetterades ned i en fyrbrunnsskål och värmdes till rumstemperatur under 30 minuter. De oocyter som skulle vitrifieras i en hållare placerades i 'equilibration medium' under i 5 minuter och flyttades sedan till vitrification medium. Oocyterna monterades i hållaren med 'vitrification medium' inom 1 minut från nedläggning i mediet. Hållaren doppades därefter direkt ned i flytande kvävet där den sedan förvarades. Tid och temperatur för 'Vitrification Cooling' finns redovisat i tabell 1.
Tabell 1: Tid och temperatur för Vitrification Cooling
Lösning Temperatur Exponeringstid för oocyt i lösning
Equilibration medium Rumstemperatur (~ 20C) 5 minuter Vitrification medium Rumstemperatur (~ 20C) 1 minut
Figur 3: Cryopette från MediCult. Bild: MediCult
Uppvärmning av oocyter
Vid uppvärmning av frysta oocyter användes produkten MediCult 'Vitrification Warming' Product No 1219. Kitet innehåller 5 lösningar; 'Warming medium', 2 'dilution medium', 2 'washing medium'.
'Warming medium' och 'dilution medium' innehåller sukros vilket behövs för att oocyten skall kunna utjämna vätskebalansen som rubbats av vitrifieringslösningen på ett säkert sätt. Sukros minskar risken för att cellen sväller för mycket vid rehydreringen när kryoprotektanterna tagits bort.'Washing solution' innehåller dock inte sukros då cellen utjämnat vätskebalansen klart när den placeras i 'washing medium'. Utöver dessa kompontenter ingår det små mängder glukos, natriumklorid, L-glutamin,
natriumlaktat, natriumbikarbonat, kaliumklorid, kalciumklorid, kaliumfosfat, magnesiumfosfat och natriumpyruvat. Det ingår även antibiotika i form av pencillin och streptomycin för att motverka bakterieväxt. Inga koncentrationer på beståndsdelarna kan anges då dessa är konfidentiella och endast kända av tillverkaren
'Warming medium' värmdes till 37C under 30 minuter, resterande 4 lösningar värmdes till rumstemperatur under 30 minuter. Vid upptining av oocyter vitrifierade i cryoloop flyttades loopen till lösningen 1 direkt från det flytande kvävet. Oocyter vitrifierade i cryopette värmdes genom att
cryopetten sänktes i 37C vatten i 5 sekunder innan de pipetterades i lösning 1. Oocyterna fick ligga i
vardera lösning (1-5) under 3 minuter innan de flyttades till odlingsmedium. Tid och temperatur för
'Vitrification Warming' finns redovisade i tabell 2.
Tabell 2: Tid och temperatur för Vitrification Warming
Lösning Temperatur Exponeringstid för oocyt i lösningen
Warming medium 37C 3 minuter
Dilution medium Rumstemperatur (~ 20C) 3 minuter Dilution medium Rumstemperatur (~ 20C) 3 minuter
Washing medium Rumstemperatur (~ 20C) 3 minuter
Washing medium Rumstemperatur (~ 20C) 3 minuter
Odling och bedömning
Oocyterna odlades i odlingsmediet G-IVF Plus, produktnr:10136,Vitrolife.
I botten av en petriskål placerades odlingsmedium i droppar om 20µl. Dessa täcktes med mineralolja (i det här fallet Ovoil, produktnr: 10029, Vitrolife) och preinkuberades mellan 4 och 24h i fysiologisk miljö - 37C med en gasmättnad på 6.0% CO
2och 6.0% O
2innan oocyterna placerades i mediet. Preinkuberingen behövs för att odlingsmediet ska anta rätt temperatur och gasmättnad så att oocyterna placeras i en så perfekt miljö som möjligt.
Vid tre tidpunkter (efter 2h, efter natt och efter 24h) plockades oocyterna ur inkubatorn och morfologi och viabilitet (figur 1a-c) bedömdes visuellt via ett mikroskop efter förutbestämda kriterier (tabell 3). Exempel på oocyter med nedsatt kvalitet kan observeras i figur 4a-c. Den sista tidpunkten (24h) var vid den som det lades mest vikt vid och är dessutom den tidpunkt som redovisas i resultaten.
Tabell 3: Kriterier vid bedömning av viabilitet och morfologi hos oocyter
Bra kvalitet Nedsatt kvalitet
Form Regelbunden, rund Oregelbunden, kantig
Cytoplasma Ljus Mörk
Slätt utseende Granulerad
Inga vakuoler Vakuoler
Zona pellucida Intakt Bruten, hängande
Polkropp (MII-oocyter) Endast 1 Fler än 1
Statistik
Efter att alla resultat samlats in jämfördes värdena med Fishers exakta test. Detta för att påvisa eventuella signifikanta skillnader mellan de olika grupperna.
RESULTAT
Överlevnad och fryspåverkan
I detta projekt vitrifierades totalt 43 oocyter, som delades in i två grupper – Cryoloop och Cryopette.
Inga oocyter gick förlorade under arbetet utan alla oocyter som vitrifierades återfanns efter tiningen.
Hur oocyterna i vardera grupp klarade av processen finns redovisat i ett flödesschema (figur 5). Med viabla oocyter menas alla de oocyter som ej visade tecken på degenerering. Det finns dock oocyter i den här gruppen som visade tecken på nedsatt kvalitet efter tining och inte skulle ha befruktats i klinisk verksamhet. Dessa oocyter återfinns under rubriken fryspåverkade i flödesschemat och består till största del av oocyter som blivit vakuoliserade under processen, men även oocyter med mycket granulering eller mörk cytoplasma har observerats.
Figur 4c: Degenererad oocyt med ovanligt tjock zona pellucida.
Figur 4b: Vakuoliserad MI- oocyt.
Figur 4a: Granulerad MII-
oocyt. Granulering känns
igen på den korniga
cytoplasman.
Hur överlevnad och fryspåverkan förhåller sig mellan Cryoloop och Cryopette i de olika mognadsstadierna kan observeras i figur 6.
Signifikansen mellan de olika grupperna testades mot varandra i Fishers exakta test. Ingen signifikant skillnad påvisades mellan grupperna.
Vidareutveckling
De oocyter som vidareutvecklats kan observeras i figur 7. Det är endast GV- och MI-ägg som är redovisade då MII-oocyter redan har utvecklats så långt de kan utan befruktning.
Figur 5: Flödesschema över oocyterna i studien
Fryspåverkade 3 Opåverkade
15
Totalt antal oocyter
43
Vitrifierade i Cryopette
22
Degenererade efter tining
3 Viabla efter
tining 18
Erhållna efter tining
21
Degenererade efter tining
2 Viabla efter
tining 18
Fryspåverkade 2 Opåverkade
16
Vitrifierade i Cryoloop
21
Erhållna efter tining
22
Totalt – GV
Cryopette - GV
Cryoloop – GV
Totalt – MI
Cryopette – MI
Cryoloop – MI 0
5 10 15 20 25
Totalt antal Viabla oocyter Vidareutvecklade
Antal oocyter
Figur 7: Vidareutvecklade oocyter i de olika grupperna och mognadsstadierna.
Cryopette - GV
Cryoloop – GV
Cryopette – MI
Cryoloop – MI
Cryopette – MII
Cryoloop – MII 0
2 4 6 8 10 12 14
Totalt antal Viabla oocyter Opåverkade
Antal oocyter