• No results found

Evaluation of an automated method for measuring hematopoietic progenitor cells to determine the start of stem cell apheresis.

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Evaluation of an automated method for measuring hematopoietic progenitor cells to determine the start of stem cell apheresis."

Copied!
21
0
0

Loading.... (view fulltext now)

Full text

(1)

Examinator: Dick Wågsäter

Adress: Institutionen för medicinsk cellbiologi, 751 23 Uppsala Telefon: 018- 611 28 31

E-post: dick.wagsater@mcb.uu.se

Institutionen för medicinsk cellbiologi Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp

Evaluation of an automated method for measuring hematopoietic progenitor cells to determine the start of stem cell apheresis.

Av Märta Bergman

(2)

2 Abstract

Stem cell transplantation is a known treatment for various cancers. Currently most cells transplanted are collected via apheresis. An injection of growth factor is given to the patient to start the proliferation and mobilization of stem cells. Apheresis can be initiated when the patient has a stem cell count of 15 to 20 stem cells/µL of peripheral blood. The standard method with which stem cells are analysed is immune flow cytometry where CD34+ and CD45+ are identified with targeted fluorescent antibodies. This analysis takes more than 45 minutes to perform.

Sysmex XN-9000 analyses samples with flow cytometry by lysing erythrocytes and platelets and staining the leukocytes with fluorescent dye. Analysis of the hematopoietic progenitor cells (HPC) takes less than 4 minutes. The purpose of this study was to investigate if it is possible to predict the start of the apheresis using XN-9000.

For this study, 43 samples were analysed using both methods. Using the sign test, a p-value was calculated to <0.05, which indicates a significant difference between the results received by the two methods. Spearman’s rank correlation gave an observed ρ-value > the critical ρ- value which revealed a correlation between the methods, although not linear according to Pearson’s correlation coefficient. PPV and NPV were calculated with cut-off at 20, 30 and 40 HPC/µL blood where 20 HPC/µL gave an NPV at 100 %. According to the test made, there is correlation between the two methods, but further samples must be analysed to investigate how the results should be compared.

Nyckelord

XN-9000 Sysmex, HPC, CD34, transplantation, flow cytometry.

(3)

3 Introduktion

Stamcellstransplantation är idag en behandling som blir allt vanligare vid blodcancer, immunologiska och maligna tumörer. Forskningen på stamcellstransplantation har pågått länge, inte bara inom blodcancer, utan även gällande exempelvis diabetes typ 11 och multipel skleros2. Den första benmärgstransplantationen på människa skedde 1956 i New York och i Sverige år 19753. Vid insamling av stamceller från benmärgen blir patienten eller donatorn nersövd och benmärg sugs ut från bäckenbenet med en nål. Utförandet kan kräva flera stick för att erhålla tillräckligt med benmärg4. Under många år användes just benmärg vid

transplantation av stamceller och först 1993 beskrevs den idag mest använda metoden för att skörda stamceller, nämligen aferestekniken (som i korthet benämns aferes) [1].

Stamcellsaferes har inte bara revolutionerat stamcellstransplantationen utan även visat sig innebära en mindre risk för infektion och efter transfusionen har patienten en lägre risk att drabbas av transplantat-mot-värdsjukdom [2]. Aferes möjliggör även insamlingen av fler celler än vid benmärgstransplantation vilken påskyndar patientens återhämtande efter transfusionen. Andra fördelar med stamcellsaferes är att patienten inte behöver sövas, inga kirurgiska ingrepp krävs och metoden kan utföras på patienter där benskörhet kan vara ett problem.

Det är känt att hematopoetiska stamceller återfinns i benmärgen tillsammans med övriga omogna celler. Det är från stamceller som alla blodceller härstammar och dessa delar sig kontinuerligt för att bilda nya blodkroppar. När en stamcell delar sig bildas två celler, en ny stamcell och en hematopoetisk progenitorcell (HPC). Till skillnad från stamceller kan en HPC

1 http://www.barndiabetesfonden.se/Aktuellt/Nyheter/-Nytt-stort-genombrott-mot-diabetes-typ-1-/ Stamceller diabetes Typ 1.

2 http://www.neurologiisverige.se/benmargstransplantation-nytt-hopp-ms-sjuka/ Stamceller MS

3 https://www.cancerfonden.se/om-cancer/stamcellstransplantation Första svenska transplantationen.

4 https://www.1177.se/behandling--hjalpmedel/operationer/transplantationer/stamcellstransplantation/

Benmärgstransplantation

(4)

4

vara lymfoida eller myeloida beroende på vilka celler den ska dela sig till5. Hädanefter

används förkortningen HPC i stället för stamceller för att inte förväxla stamceller i benmärgen med HPC i blodbanan.

Aferes utförs på både sjuka patienter vid autolog transplantation och på friska donatorer vid allogen transplantation där aferesprodukten ges till HLA-matchad (från engelskans human leukocyte antigen) sjuk patient. Allogen transplantation kan utföras då patienten är ung6, för sjuk för aferes eller när patienten tidigare i sjukdomsförloppet gjort en autolog transplantation.

Förberedelserna som görs innan aferesen ser olika ut beroende på om transplantationen är autolog eller allogen. Vid en autolog transplantation får patienten först genomgå 3 – 4 cytostatikabehandlingar beroende på sjukdom7. Detta för att förstöra så många cancerceller som möjligt så att dessa inte följer med i aferesprodukten som sen ska transfunderas8. Vid en allogen transplantation behöver detta steg inte genomgås då den friska donatorn inte har några cancerceller. Vid 10 – 13 dagar efter sista cytostatikabehandlingen startar behandlingen av tillväxtfaktor med cytokinet granulocyt-kolonistimulerande-faktor (G-CSF)5. G-CSF

möjliggör att stamceller i benmärgen prolifereras fortare till HPC och därefter mobiliseras till det perifera blodet [3]. En injektion med 5 mg G-CSF/kg kroppsvikt ges 1 – 2 gånger dagligen i 8 – 10 dagar. Vid dag 5 – 8 undersöks antalet CD34 celler i patienten/donatorn blod5. Med ett blodprov tagit i ett EDTA-rör kan antalet HPC mätas med flödescytometri. För att aferes ska kunna påbörjas behöver patienten/donatorn uppnå 15 – 20 celler/µL blod [4].

När 15 – 20 HPC/µL blod har uppnåtts förbereds aferespatienten för aferes. I patientens lårven sätts en kateter in som sedan kopplas ihop till aferesmaskinen via slangar. Blodet

5 https://www.stemcell.com/hematopoietic-stem-and-progenitor-cells-lp.html Hematopoetiska progenitorceller.

6 https://www.socialstyrelsen.se/Lists/Artikelkatalog/Attachments/20976/2018-6-10.pdf Cancer i siffror, 2018.

7https://www.regionvasterbotten.se/VLL/Filer/Mobilisering%20och%20sk%C3%B6rd%20av%20autologa%20st amceller%20SOP.pdf Mobilisering och skörd av autologa stamceller SOP 2016-06-03

8 https://www.1177.se/Vasternorrland/behandling--

hjalpmedel/operationer/transplantationer/stamcellstransplantation/ Cytostatika för patienter inför aferes.

(5)

5

pumpas därefter till aferesmaskinen där det centrifugeras för att sortera ut leukocyterna från erytrocyter och trombocyter. Leukocyter tillsammans med HPC filtreras därefter ut från blodet och koncentreras i en produktpåse. Det övriga blodet pumpas därefter tillbaka till patientens blodbana. Aferesen pågår tills tillräcklig mängd celler samlats in eller tills

arbetsdagen är över. Målet för aferesutförandet är olika beroende på patient och sjukdom men är vanligtvis 4 x 106 celler/kg kroppsvikt hos patienten [5]. Efter aferes genomgår patienten en tung kemoterapi. Utan efterföljande stamcellstransfusion har patienten en liten chans att återhämta sig och kan i värsta fall avlida9.

Den vanligaste metoden för att räkna antalet HPC i blodet är genom immunoflödescytometri.

Genom att använda fluorescerande antikroppar som binder in till ytproteinet CD34 kan HPC mätas i helblod [6]. CD34 är ett fosfoglykoprotein som endast finns hos progenitorceller10. Denna metod tar minst 45 minuter att utföra eftersom den kräver manuell lysering och färgning med fluorescerande antikroppar.

Innan en aferes förbereds tas ett blodprov på patienten/donatorn. Från att blodprovet tagits tills ett analyssvar finns tar det minst en timme där både aferespersonal och

patienten/donatorn väntar på ett besked om aferes kommer utföras eller inte. Förberedelserna inför aferes tar olika lång tid beroende på patienten/donatorn och det är därför inte ovanligt att aferesen startar tre timmar efter att provet tagits. Då aferes är obekvämt att genomgå och utförandet tar flera timmar, ibland mer än en dag, så bör tiden från att provet tagits till dess att aferes förbereds vara så kort som möjligt. Om aferes kan påbörjas tidigare så kan det vara möjligt att korta ner aferesen med en dag vilket gör det mer bekvämt för patienten/donatorn.

En annan fördel är om patienten/donatorn har för lågt antal HPC så blir de informerade

9 https://www.1177.se/Vasternorrland/behandling--

hjalpmedel/operationer/transplantationer/stamcellstransplantation/ Cytostatika för patienter inför aferes.

10 https://www.stemcell.com/hematopoietic-stem-and-progenitor-cells-lp.html CD34 antigen.

(6)

6

tidigare om att aferesen bli fördröjd och att injektionerna av G-CSF kan fortsätta tills tillräckligt antal celler uppnåtts.

En analysmetod som kan korta ner svarstiden är flödescytometri på instrument XN-9000 (Sysmex). Detta är ett hematologiskt instrument som inte kräver någon manuell

provförberedelse. Instrumentet är vanligtvis ett rutininstrument som inte kräver övrig behörighet och har beredskap dygnet runt till skillnad från immunoflödescytometern som kräver särskild kompetens och därför inte alltid är bemannad. Analysen av HPC på XN-9000 tar endast 4 minuter vilket är betydligt snabbare än med immunoflödescytometri. Instrumentet lyserar, färgar och plottar automatiskt vilket minska mänskliga felkällor. Metoden för

immunoflödescytometri är dock mer specifik då den tillämpar riktade antikroppar mot CD34.

XN-9000 detekterar istället cellerna efter dess storlek, granulering och cellinnehållets

fluorescens. HPC är till storlek medelstor, den har liten mängd granula i förhållande till övriga leukocyter och dess RNA/DNA-innehåll ger ifrån lågt till medelstarkt i fluorescerande ljus11.

Tidigare studier talar för att metoden för analys av HPC med XN-9000 kan ersätta analys av CD34. I denna studie undersöktes 43 prover insamlade från patienter med olika cancerformer.

Analysen skedde med immunoflödescytometri på FACSCalibur (Becton,Dickinsson) och flödescytometri på XN-9000 (Sysmex). Syftet med studien var att undersöka om HPC går att analysera med XN-9000 som en reservmetod vid de tillfällen då analys på

immunoflödescytometri inte går att utföra.

11 https://www.sysmex-europe.com/academy/knowledge-centre/sysmex-parameters/haematopoietic-progenitor- cells-hpc.html Sysmex,Hematopoetiska progenitorceller.

(7)

7 Metod och material

Studiematerial

De blodprov som analyserades i studien bestod av helblod i EDTA-rör tagna på patienter eller donatorer kvällen innan och på morgonen dagen som aferes var inplanerad i syfte att

kontrollera antalet HPC. Proverna samlades in mellan april 2018 och april 2019 och analyserades direkt efter ankomst till laboratoriet. I studien fanns det totalt 43 insamlade prover från 13 patienter där 2 – 5 prover samlades in från vardera patienten.

Etik

De prover som undersöktes i studien var från cancersjuka patienter som skulle genomgå en stamcellstransplantation. Behandlingen är mer eller mindre obekväm att genomgå och patienten kan då känna sig sårbar. Om studien hade tagit med faktorer som exempelvis kön eller cancerform hade en etisk prövning behövts. För denna studie var proverna

avidentifierade och kunde inte kopplas till patienten och därför krävdes ingen etisk granskning.

Kemikalier och utrustning

Det instrument som användes för immunoflödescytometri var FACSCalibur (Becton, Dickinson, New Jersey, USA)12. Analysprovet förbereddes i ett BD Trucount-rör (Becton, Dickinson, USA) innehållande frystorkade fluorescerande kulor med 4,2 µm i diameter. Till analysmetoden användes fluorescerande antikroppar CD45 FITC/CD34 PE (Becton,

Dickinson, USA) lösta i fosfatbuffrad salinlösning (PBS) och hade koncentrationen 12,5 µg/mL CD45 och 10,0 µg/mL CD34. Reagens 7-AAD (Becton, Dickinson, USA) med koncentrationen 45 – 65 µg/mL användes för att färga celler i apoptos och lyseringslösning

12 https://www.bd.com/sv-se/ Becton, Dickinson.

(8)

8

(Becton, Dickinson, USA) av ammoniumklorid spädd 1:10 med destillerat vatten lyserade erytrocyter och trombocyter. Under analysen användes PBS som flödesreagens i instrumentet.

Automatpipetter med volym 1 – 50 µL, 100 – 1000 µL och pipettspetsar (ThermoFisher13, Massachusetts, USA) användes till det manuella momentet.

Till instrumentet XN-9000 modul 20 (Sysmex Corporation14, Tokyo, Japan) användes reagenser Lysercell WPC, Fluorocell WPC och flödesreagens Cellpack DFL tillverkat av Sysmex (Sysmex Corporation, Tokyo, Japan).

Analys med XN-9000

Analys av HPC skedde på XN-9000 modul 20 på instrumentets HPC-kanal direkt efter provets ankomst till laboratoriet. Utöver analys av antalet HPC utfördes även en fullständig blodstatus där leukocytantalet (LPK) var av intresse. Provet blandades försiktigt och

placerades därefter manuellt i instrumentets provhållare. Instrumentets lägesbrytare

aktiverades för att växla från automatisk till manuell inmatning. HPC-kanalen valdes i menyn i mjukvaran och instrumentet startades genom att trycka på instrumentets startknapp. XN- 9000 aspirerade 190 µL blod för analysen. XN-9000 plottade HPC och övriga leukocyter och beräknade antalet HPC i förhållande till leukocyterna. XN-9000 svarade ut antal HPC x 109/L blod och HPC% av leukocyterna15.

Analysprincip för XN-9000 Modul 20 (Sysmex)

Lysering av erytrocyter och trombocyter sker med Lysercell WPC genom en reaktion på blodkropparnas hydrofoba grupper. Lysercell WPC permeabiliserar även leukocyterna genom att skapa små konstgjorda hål på cellmembranet utan att ändra på cellens struktur så att

13 https://www.thermofisher.com/se/en/home.html ThermoFisher.

14 http://www.sysmex.se/ch-fr.html Sysmex Corporation.

15 XN-2000 Bruksanvisning, reviderad nov 2016.

(9)

9

Fluorocell WPC lättare kan ta sig in i cellen. Fluorocell WPC färgar cellens RNA/DNA och cellorganeller. HPC cellmembran skiljer sig från övriga leukocyter i sin lipidsammansättning vilket medför att HPC påverkas mindre av permeabilisering och Fluorocell WPC har då svårare att ta sig in i cellen.

Provet förflyttas löst i Cellpack DFL och går igenom en Hydro Dynamic Focusing (DC- detektor) där Cellpack DFL flödar runt provet så att cellerna centreras till uppsamlingsröret som leder in cellerna till flödescellen. I flödescellen träffas de av en laserstråle med

våglängden 633 nm. Det utgående ljuset och den emitterade fluorescensen detekteras av två fotodioder och en halvledarbaserad fotodetektor som omvandlar ljusstyrkan till en elektrisk spänning. Laserstrålen träffar cellen och det förbipasserande ljuset träffar en fotodiod som detekterar Forward Scatter Light (FSL) som mäter cellernas storlek. Det spridda och det emitterade ljuset samlas upp av en centrerande lins 90o från laserstrålen. Ljuset bryts direkt efter av en strålsplittrare som riktar ljuset och gör det möjligt för en fotodiod att detektera Side Scatter Light (SSL) som detekterar cellernas struktur och grumlighet och en halvledarbaserad

fotodetektor som detekterar Side Fluorescent Light (SFL) som mäter det fluorescerande ljuset från cellernas innehåll. HPC skiljer sig till utseende från övriga leukocyter genom att vara medelstora i cellstorlek, granulan är mindre än resterande leukocyter och cellinnehållets fluorescens är lägre. Cellerna går därför att plotta i ett spridningsdiagram där HPC går att urskilja.

Analys med FACSCalibur, BD

Till ett Trucount-rör (Becton, Dickinson) tillsattes 20 µL CD45 FITC/CD34 PE SCE-

antikroppar till rörets botten. Därefter tillsattes 20 µL 7-AAD-antikroppar vars funktion är att binda till celler i apoptos och på så sätt gör det möjligt för instrumentet att räkna bort dessa för att få ett värde på viabla celler. Från blodprovet togs 100 µL blod med pipett och

(10)

10

pipetterades ner i Trucount-röret. Provet blandades med vortex på låg hastighet i 5 s innan det inkuberades mörkt i 20 minuter i rumstemperatur. Efter inkuberingen tillsattes 2 mL

lyseringslösning till provröret och röret blandades ännu en gång med vortex på låg hastighet i 5 s innan det inkuberades ytterligare en gång mörkt 10 minuter i rumstemperatur. Efter inkuberingen placerades proverna i isbad inför analysen som bör ske inom 1 h16.

FACSCalibur startades upp och inställningarna hämtades i mjukvaran. Den information som mjukvaran behövde för att utföra analysen var antalet fluorescerande kulor i Trucount-röret, mängden patientblod i provet och provets spädning. Innan provet sattes i provhållaren blandades provet med vortex i 2 s. Mängden celler angavs i procent viabla CD34+ i

förhållande till viabla CD45+ och beräknades därefter med WBC från XN-9000 Sysmex för att få fram antalet totala CD34/µL blod17.

Analysprincip för FACSCalibur, BD

Flödescytometern startas och instrumentet aspirerar provlösningen tills den räknat 75 000 celler. Cellerna transporteras med PBS till flödescellen där de belyses av en blå

argonlaserstråle med våglängden 488 nm. I flödescellen analyseras CD34 (HPC), CD45 (samtliga leukocyter) och kulorna i Trucountröret genom att detektera dem vid de tre emitterande våglängderna. Analysen sker med samma princip som för XN-9000 där FSC, SFL och SSL detekteras för både HPC och CD45. Cellerna plottas i spridningsdiagram där CD34 går att rama in. FACSCalibur beräknar totala och viabla CD34+ och CD45+ genom att räkna bort celler färgade med 7-AAD. Analyssvaret ges i procent och är en kvot för antalet viabla CD34+ i blodet.

16 http://www.bdbiosciences.com/ds/is/tds/23-7867.pdf BD Stem Cell Enumeration Kit – 190308

17 https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf FACSCalibur Instruktionsmanual - 190308

(11)

11 Statistik

Analyserna skedde på FACSCalibur och Sysmex XN-9000. De statistiska beräkningarna utfördes i Microsoft Office Excel. Med resultaten beräknades korrelationen med Pearsons korrelationskoefficient (r) och Spearmans rangkorrelation18 (ρ) mellan totala och viabla CD34+ för att undersöka skillnaden i förhållande till HPC. Signifikansen för Pearsons korrelationskoefficient undersöktes med ett t-test. Det observerade ρ-värdet (ρobs) för Spearmans rangkorrelation beräknades och jämfördes med det tabulerade kritiska ρ-värdet för tvåsidigt test vid en signifikansnivå på p = 0,05. Nollhypotesen, att ingen korrelation fanns mellan metoderna förkastas om ρobs > ρkrit.

Det utfördes även ett teckentest på differensen mellan HPC och viabla CD34+ för att undersöka om resultaten från de två analyserna skilde sig åt signifikant. Ett p-värde

beräknades och om det var <0,05 förkastades nollhypotesen, att ingen skillnad fanns 18. Andra beräkningar gjordes som sensitivitet, specificitet, positivt prediktivt värde (PPV) och negativt prediktivt värde (NPV).

18 Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, Miller & Miller, 4’th edition.

(12)

12 Resultat

De insamlade proverna analyserades på XN-9000 (Sysmex) och FACSCalibur (Becton, Dickinson). Av de 13 patienter som medverkade i studien svarade två av dessa dåligt på G- CSF där en av dessa aldrig kom upp i tillräckligt antal HPC och aferes uteblev medan den andre patienten fick vänta ytterligare 3 dagar för att uppnå tillräckligt antal HPC. En tredje patient hade även en infektion som resulterade i att aferes inte kunde utföras på grund av hälsorisker trots att antalet HPC hade uppfyllts. Dessa tre patienter togs med i beräkningarna trots de avvikande faktorerna då det inte är känt att det skulle påverka analysresultatet.

Ett spridningsdiagram för hematopoietiska prekursorceller (WPC) plottades där HPC

presenterades, se figur 1. Cellerna presenterades i diagrammet efter dess cellstorlek, granula och flourescens.

Figur 1: Spridningsdiagram från XN-9000 (Sysmex). Diagrammet visar de hematopoetiska prekursorcellerna där HPC är inringade. X-axeln (side scatter light) visar cellens granula och Y-axeln (side flourescens light) som visar cellens fluorescerande RNA/DNA.

Av de 43 prover hade 25 av dessa uppnått antalet HPC för att påbörja aferes. Mellan de två analysmetoderna beräknades Pearsons korrelationskoefficient med de 25 proverna och resultaten visas i Figur 2.

(13)

13

Figur 2: Linjär korrelation mellan antalet HPC och Totala CD34+ (a) med en linjär korrelation på r = 0,375 och antalet HPC och Viabla CD34+ (b) med en linjär korrelation på r = 0,372.

För de 25 proverna var korrelationskoefficienten mellan HPC och totala CD34+ (r = 0,375) var en aning högre än HPC och viabla CD34+ (r = 0,372). Ett t-test utfördes för att testa om korrelationen var signifikant. T-testet prövades för ett p = 0,05 med det kritiska t-värdet = 2,5.

Det kritiska t-värdet för viabla och totala CD34+ överskred det observerade t-värdet och visade då att det inte fanns en signifikant linjär korrelation mellan metoderna.

Med Spearmans rangkorrelation beräknades korrelationen mellan de två analysmetoderna med samma 25 prover. Korrelationen mellan HPC och viabla CD34+, respektive HPC och totala CD34 gav resultaten ρviabla = 0,74 och ρtotala = 0,72. Det kritiska ρ-värdet vid p = 0,05 taget ur tabell var 0,447 vilket betyder att både viabla och totala CD34+ överskred det kritiska värdet och att det då fanns en signifikant korrelation mellan metoderna.

Ett p-värde för de 25 proverna beräknades för skillnaden mellan HPC och viabla CD34+

med teckentest. Det gav ett resultat på 0,00091 vilket representerar sannolikheten att skillnaden berodde på slumpen och talar då för att det är signifikant skillnad mellan analysmetoderna.

(14)

14

Sensitiviteten och specificiteten beräknades för alla 43 proverna med olika gränsvärden för HPC (20,30 och 40 HPC/µL blod) och med ett gränsvärde för viabla CD34+ vid 20 celler / µL. Resultaten visas i tabell 1 där ett gränsvärde för HPC på 40 celler/µL blod är mest förlitlig till att inte ge ett falskt lågt antal CD34+ och ett falskt tillräckligt antal CD34+.

Tabell 1: Beräknad sensitivitet och specificitet av viabla CD34+ analyserat på FACSCalibur och HPC analyserat på Sysmex XN-9000. CD34+ har ett gränsvärde på 20 celler/µL blod för alla värden medan HPC har tre olika, 20, 30 och 40 celler/µL blod.

HPC \ CD34+ Sensitivitet % Specificitet %

20 \ 20 celler/µL 92,3 76,5

30 \ 20 celler/µL 95,5 71,4

40 \ 20 celler/µL 86,4 90,5

Positivt prediktivt värde (PPV) och negativt prediktivt värde beräknades för alla 43 prover med gränsvärdena för viabla CD34 på 20 celler/µL och HPC 20 – 40 celler/µL som visas i tabell 2. PPV och NPV talar för att HPC under 30 celler/µL har en 93,8 % sannolikhet att antalet CD34+ inte kommer vara tillräcklig till att aferes kan utföras medan HPC över 40 celler/µL har 90,5 % sannolikhet att CD34+ överskrider 20 celler/µL.

Tabell 2: PPV och NPV med HPC analyserat på Sysmex XN-9000 och CD34+ analyserat på FACSCalibur med olika gränsvärden för HPC. Viabla CD34+ har ett gränsvärde för 20 celler/µL för alla mätvärden.

HPC PPV % NPV %

20 celler/µL 78,6 100

30 celler/µL 77,8 93,8

40 celler/µL 90,5 86,4

(15)

15 Diskussion

I studien analyserades sammanlagt 43 prover från 13 patienter med olika cancerformer som hade genomgått en behandling för att utföra stamcellsaferes. Proverna analyserades med flödescytometri på intrumentet Sysmex XN-9000 för att mäta antalet HPC och med

immunoflödescytometri på FACSCalibur för att undersöka CD34+. Syftet med studien var att undersöka om HPC analyserat på XN-9000 kunde användas som en reservmetod då

möjligheten att utföra analysen på immunoflödescytometri inte fanns.

En stor skillnad som upptäcktes direkt vid analys är att Sysmex XN-9000 ger ett högre cellantal än FACSCalibur. Detta kan bero på att det är oklart hur stor andel av antalet HPC som bär på CD34 då detta är olika mellan individer. Eftersom FACSCalibur använder sig av riktade antikroppar så ges endast resultatet i CD34 fraktionen där de övriga leukocyterna fortfarande är okända. Vid tolkning av spridningsdiagrammet kan XN-9000 fortfarande ge en ledtråd i vilka celler som finns närvarande. En tidigare studie som reflekterat över att det är okänt vad Sysmex analyserar är Oelschlaegel et al. där de diskuterar möjligheten att

instrumentet även analyserar HPC utan CD34 (CD34-) [7]. För att undersöka detta vidare krävs andra metoder som till exempel andra riktade antikroppar som binder till andra

ytantigener för att detektera CD34- celler. Det kan även finnas manuella faktorer som kan ha påverkat. I FACSCaliburs mjukvara är det möjligt att manuellt rama in de celler som ska tolkas som CD34+ i spridningsdiagrammet om ramen är förskjuten. I XN-9000 är detta ej möjligt utan mjukvaran gör detta automatiskt. Det är då svårt att veta vilka celler som finns inom ramarna för HPC i spridningsdiagrammet hos XN-9000 och det går då inte att utesluta möjligheten att celler som inte är HPC tas med i beräkningarna. Dessutom går det att

undersöka om hållbarheten på reagenserna Lysercell WPC och Fluorocell WPC kan påverka

(16)

16

resultatet, men då dessa reagenser regelbundet förnyas så finns liten sannolikhet att reagensets hållbarhet kan vara en bidragande faktor till att HPC på XN-9000 skiljer sig från CD34+.

Korrelationen mellan metoderna var låg vid beräkning av Pearsons korrelationskoefficient och ett t-test visade att korrelationen inte var signifikant och var därför inte tillförlitlig som ett resultat. Därav beräknades Spearmans rangkorrelation som inte undersöker linjär

korrelationen utan undersöker sambandet mellan två metoder som är rangordnade men samtidigt har en korrelation. Vid användandet av Spearmans rangkorrelation var det möjligt att bekräfta att metoderna hade en signifikant korrelation. Resultatet visade även att det var en högre korrelation mellan totala CD34 och HPC än viabla CD34 och HPC. Detta beror på att XN-9000 analyserar HPC för totala antalet celler och kan inte urskilja mellan friska celler och celler i apoptos som FACSCalibur kan göra. I denna studie var det väldigt liten skillnad mellan viabla och totala vid beräkning av korrelationen så det inte var avgörande för resultatet.

Beräknat PPV och NPV visar att om ett gränsvärde på 20 celler/µL för både HPC och CD34+används så bör inte 100 % av analyssvar under 20 HPC/µL överskrida 20 CD34+/µL medan PPV var 78,6 % och betyder att sannolikheten att ett provsvar över 20 HPC/µL har en 78,6 % sannolikhet att överskrida 20 CD34+/µL. Detta är inte ett optimalt gränsvärde för det skulle betyda att 21,4 % av alla prov där HPC överskrider 20 celler/µL inte är tillräckligt i antal för att aferes kan utföras. Om gränsvärdet för HPC ökar till 40 celler/µL så ökar PPV till 90,5 % och NPV sjunker till 86,4 %. Detta betyder att ett analyssvar där HPC överskrider 40 HPC/µL har en sannolikhet med 90,5 % att CD34+ är över 20 celler/µL och att HPC under 40 celler/µL har en sannolikhet på 86,4 % att CD34+ är mindre än 20 celler/µL. I denna studie

(17)

17

var ett gränsvärde på 40 HPC/µL ett mer optimalt mål för XN-9000 för att avgöra om aferes kan utföras då gränsen för antalet CD34+ var 20 celler/µL blod.

Två studier där PPV och NPV har diskuterats är Jea-Lyn et al. där deras bästa gränsvärde låg vid 50 HPC/µL då PPV och NPV gav ett resultat på 59,7 % respektive 81,1 % [8]. Den andra studien utfördes av Peerschke et al. där de undersökte två gränsvärden (20 och 38 HPC/µL blod) där de bättre resultaten för PPV och NPV blev 55,4 % respektive 100 % vid gränsvärde 20 HPC/µL blod [9]. Vid jämförande mellan 20 och 50 HPC/µL som gränsvärden går det att se att NPV minskar och PPV ökar när gränsvärdet för HPC ökar. Om XN-9000 ska användas som en reservmetod är det viktigt att överväga vilket gränsvärde som ska användas för HPC. Ett högre NPV betyder mindre risk att starta aferes på en patient som inte har tillräckligt med CD34+ medan chansen att patienten faktiskt har tillräckligt med antal CD34+

då är lägre. Då denna studie baserar på stamcellspatienter så kan ett lågt gränsvärde för HPC användas eftersom det aldrig chansas med att tillräckligt antal finns. Finns det ej tillräckligt med celler får patienten fortsätta med G-CSF injektionerna. Men samtidigt kan inte patienten vänta för länge på att starta aferes då cellernas viabilitet minskar med tiden. Det kan då vara bra att använda immunoflödescytometri som ett komplement för de patienter med ett lågt antal celler men som fortfarande har tillräckligt många för att utföra aferes och använda XN- 9000 för att snabbt kunde klargöra att patienten inte kommer kunna utföra aferes den dagen.

Med de prover som samlats in (n = 43) kunde endast 25 av dessa användas för att undersöka skillnaden mellan metoderna. Då antalet mätvärden var så få så var inte resultaten

normalfördelade så därför gick det inte att utföra parat t-test som annars hade varit fallet.

Istället utfördes ett teckentest. Resultatet på teckentestet talar för att det var signifikant skillnad mellan XN-9000 och FACSCalibur och att slumpen var liten att resultatet var lågt.

Däremot gick det inte med dessa 25 prover avgöra om XN-9000 kan användas som en

(18)

18

reservmetod för att beräkna starten av aferes. Om flera prover samlades in och samma studie utfördes så skulle det kritiska t-värdet för Pearsons korrelationskoeffit minska och en linjär korrelation kan påvisas men ett ökat antal prover är inte nödvändigt för denna studie för att bevisa en korrelation mellan metoderna. 2017 gjordes en studie av Grommé et al där de analyserade 147 prover på tre olika laboratorier som visade en god korrelation med Spearmans rangkorrelation [10].

Något som kan påverka resultatet i denna studie kan vara att de 43 prover som analyserades bara kom från tretton patienter. Av dessa tretton svarade två inte bra på G-CSF eller på kemoterapin, eller behövde längre tid för mobiliseringen, vilket gav dålig

stamcellsmobilisering hos patienten och behandlingen avbröts så att aferes uteblev.

Anledningen till dålig stamcellsmobilisering är oklart då alla individer och sjukdomsformer är olika. Det är inte alltid som 8 - 10 dagar med injektioner av G-CSF är tillräckligt för att uppnå målet för aferes och vissa individer kan behöva ta injektioner i ytterligare några dagar än vad som var planerat. Den faktor som kan påverka är att patienterna och donatorerna själva får ta injektionerna av G-CSF19. Patienten och donatorn blir lärd i att ta injektionerna hemma så att de inte behöver besöka sjukhuset 1 – 2 gånger dagligen för att ta injektionerna. Dålig

hantering av dessa injektioner genom att inte ta dem kan påverka prolifereringen av stamceller som då leder till dålig mobilisering av HPC till blodbanan. De två i denna studie som visade tecken på dålig G-CSF effekt har tagits med i denna studie. Även patienten med högt

neutrofilvärden (tecken på infektion) har tagits med i beräkningarna för PPV och NPV då ett högt neutrofilvärde inte borde påverka HPC eller CD34+ vid analys [11].

19

https://www.regionvasterbotten.se/VLL/Filer/Mobilisering%20och%20sk%C3%B6rd%20av%20autologa%20st amceller%20SOP.pdf G-CSF-injektion tar patienten/donatorn själv i hemmet.

(19)

19

Flera studier har undersökt korrelationen mellan immunoflödescytmetri och tidigare modeller av Sysmex när det kommer till att mäta CD34+. Under en tid undersöktes korrelationen mellan CD34+ och vita blodceller (WBC). Lee et al. undersökte 2003 om HPC och vita WBC kunde avgöra när aferes kunde utföras. I studien medverkade 160 patienten och de kom fram till att WBC hade en lägre korrelation mellan CD34 medan HPC hade en högre korrelation och visade då att HPC är en bättre indikator på när aferes kan påbörja än WBC [12].

Det är inte bara G-CSF och neutrofilantal som avgör om aferes kan utföras. Lågt antal trombocyter kan vara en avgörande faktor till att inte kunna utföra aferes. Cancerpatienter kan ha låga trombocytvärden eftersom de går igenom många cytostatiskabehandlingar och har patienten för låga trombocytvärden är detta en risk för att blöda för mycket vid aferes.

En annan anledning till att det är stor skillnad i korrelationen mellan analyserna beror bland annat på att det endast var 25 av de 43 prover som hade uppnått målet för att utföra aferes. De flesta prover som inte användes i beräkningarna var prover där CD34+ var så lågt så analysen avbröts på FACSCalibur efter tio min om inte instrumentet hade analyserat klart. Analysen avbryts då antalet CD34+ i provet inte är tillräckligt för att kunna uppnå 15 – 20 celler/µL blod. Om analysen hade tillåtits pågå tills den var klar så kunde de andra proverna som skulle analyseras bli för gamla för att analyseras.

Studien har utförts på Laboratoriemedicin Region Västernorrland under februari – april 2019.

Författaren vill tacka Anders Henriksson och Zahra Cherri för handledning under det laborativa momentet och Dan Bylund för hjälp med statistiken.

(20)

20 Referenslista

[1] Weaver CH, Buckner CD, Longin K, et al. Syngeneic transplantation with peripheral blood mononuclear cells collected after the administration of recombinant human granulocyte colony- stimulating factor. Blood. 1993;82:1981-1984.

[2] Mahmoud HK, Fahmy OA, Kamel A, et al. Peripheral blood vs bone marrow as a source for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplantation. 1999;24:355-358.

[3] Aglietta M, Piacibello W, Sanavio F, et al. Kinetics of human hemopoietic cells after in vivo administration of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Clinical Investigation. 1989;83:551-557.

[4] Gowans ID, Hepburn MD, Clark DM, et al. The role of the Sysmex SE9000 immature myeloid index and Sysmex R2000 reticulocyte parameters in optimizing the timing of peripheral blood stem cell harvesting in patients with lymphoma and myeloma. Clinical and Laboratory Haematology. 1999;21:331-336.

[5] Körbling M, Przepiorka D, Huh YO, et al. Allogeneic blood stem cell transplantation for refractory leukemia and lymphoma: potential advantage of blood over marrow allografts.

Blood. 1995;85:1659-1665.

[6] Civin CI, Strauss LC, Brovall C, et al. Antigenic analysis of hematopoiesis III. A Hematopoietic Progenitor Cell Surface Antigen Defined by a Monoclonal Antibody Raised against KG-la Cells. 1984;133:157-165.

(21)

21

[7] Oelschlaegel U, Bornhaeuser M, Thiede C, et al. HPC enumeration with the Sysmex XE- 2100 can guide further flow cytometric CD34+ measurements and timing of leukaphereses.

Cytopherapy. 2003;5:414-419.

[8] Lee JL, Kim SB, Lee GW, et al. Clinical usefulness of the hematopoietic progenitor cell counts in predicting the optimal timing of peripheral blood stem cell harvest. Journal of Korean Medical Science. 2003;18:27-35.

[9] Peerschke EI, Moung C, Pessin, et al. Evaluation of new automated hematopoietic progenitor cell analysis in the clinical management of peripheral blood stem cell collections.

Transfusion. 2015;55:2001-2009.

[10] Grommé M, Russcher H, Braakman E, et al. Multicenter study to evaluate a new enumeration method for hematopoietic stem cell collection management. Transfusion.

2017;8:1949-1955.

[11] Xu A, Höglund M, Håkansson L, et al. Granulocyte colony-stimulatng factor (G-CSF) induces the production of cytokines in vivo. British Jourmal of Haematology. 2000;108:848- 853.

[12] Yu J, Leisenring W, Heimfeld S, et al. Enumeration of HPC in mobilized peripheral blood with the Sysmex SE9500 predicts final CD34+ cell wield in the apheresis collection.

Bone Marrow Transplantation. 2000;25:1157-1164.

References

Related documents

Stem cells are unspecialized cells with the remarkable ability to give rise to many different cell types. Stem cells are discriminated from other cell types by two

I) To develop an improved and more robust protocol for the transfer of hESCs to feeder-free conditions (paper I). II) To develop a culture method that facilitates

The general aims of this thesis were four-fold: 1, to develop efficient and simple methods for the large scale propagation of hESCs and hESC-derived NPs; 2, to optimise

The overall aim of this thesis was firstly to give an account of the achievements of the national Swedish cord blood bank from an international perspective and secondly to develop

Keywords: Cord blood, Cord blood bank, Cord clamping, Hematopoietic stem cell transplantation, Hematopoietic stem and progenitor cells, CD34, Side Population, Aldehyde

Keywords: Neural stem cells, neural progenitor cells, stroke, ischemia, reactive astrocytes, astro- gliosis, proliferation, differentiation, neurogenesis, excitotoxicity,

Whether the lineage selection of neural stem/progenitor cells is altered following a lesion in the brain, what signals that are responsible for their activation or whether these

Paper III: To quantify myofibroblasts and polyploid cells in a larger group of allo-HSCT recipients and investigate the associations between these cell types and various