Examensarbete 15hp C- nivå, VT 2008
Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi Biomedicinska analytikerprogrammet
Development of method for
myosin- and actin-measurements in musclefibers
Rebeca Corpeno
Handledare: Yvette Hedström Institutionen för nerurovetenskap,
Klinisk neurofysiologi, akademiska sjukhuset, Uppsala
ABSTRACT
The purpose of this study was to gain more knowledge about the deleterious effects of decreased muscle protein concentration on skeletal muscle function, by measuring the concentrations of myosin and actin in single pig muscle fibres. The pigs were earlier used in an experimental animal model to study the early stages of acute quadriplegic myopathy (AQM), a disease that is found in mechanically ventilated intensive care unit patients. Percutaneous biopsies were taken from these pigs and where now used in this study.
Even though the method used was accurately tested and theoretically working, certain problems arose. These problems were unexpected and caused problems to the study. The method used to measure the concentration of myosin and actin, an ELISA, gave no logical results. The reason could not be found and because of the time limit of this project no results from the AQM-pigs were gained. The efforts to make the method work is described and discussed.
KEYWORDS
Protein concentration, muscleprotein, myosin heavy chain (MHC), acute
quadriplegic myopathy (AQM), ELISA,
INTRODUKTION
Både för människor och djur utgör fungerande muskler en viktig del av det som krävs för vår överlevnad. Vår andning kräver muskelarbete och likaså krävs friska muskler för att hämta och få i oss föda. För att fritt kunna röra oss hur vi behagar och kunna utföra frivilliga rörelser behöver vi fungerande skelettmuskler. En ringa skada på dessa musklers allra minsta beståndsdel kan dock resultera i att de inte längre kan fungerar normalt, vilket kan leda till en försämrad livskvalité då skelettmusklerna kanske inte längre kan styras med fri vilja. Bristerna kan då vara alltifrån små skador till förlamning av hela kroppen.
Acute quariplegic myopathy (AQM) är en sjukdom som främst drabbar mekaniskt ventilerade intensivvårdspatienter. I dessa patienters muskelceller ses ofta en förlust av speciellt myosin. Förlusten av detta protein har en betydande negativ effekt av funktionen i musklerna och leder till muskelförtvining, muskelsvaghet och minskad muskelfiberkraft [1]. De mekanismer som ligger bakom denna kraftreducering är dock ännu inte väl förstådda. Muskelatrofi är en viktig faktor men kraftreduceringen som sker, kan inte endast förklaras med denna faktor.
Varje muskel i vår kropp består av tusentals muskelfibrer (muskelceller). Varje fiber har formats genom hopsmältningen av flera mononukleära celler som kallas myoblaster [2]. En individuell muskelcell utgörs av flera cylindriska strukturer som kallas myofibriller. Myofibriller byggs i sin tur upp av upprepade enheter som benämns sarkomerer [3]. Antalet muskelceller är i stort sett desamma från födseln.
Antalet förändras inte under en människas liv. All tillväxt av en muskel beror på
tillväxt av muskelcellerna antingen i längd genom addition av sarkomerer eller i
tjocklek genom addition av myofibriller som kan öka upp till 15 gånger [3]. När man
använder en muskel ökar antalet arbetsenheter, sarkomerer, och på motsvarande sätt
minskar antalet när muskeln inte används. Muskelfibrer är ungefär 10-100µm i
diameter och innehåller flera kontraktila proteiner vilka bygger upp myofibrillerna
som har en diameter på 1-2µm. Sarcomeren är ca 1-2µm lång, men varierar något
beroende på art [2]. Sarcomeren utgörs av tunna och tjocka filament tillsammans
med titin- och nebulinfilament som gradvis sträcker ut sig i Z- diskar [4].
Tunna filament består av approximativt 360 actinmonomerer medan tjocka filament består av ungefär 350 myosinmolekyler [1].
Myosin är en dominant strukturell komponent i skelettmuskler och anses vara motorn i omvandlingen från fri energi till mekaniskt arbete genom hydrolys av ATP [5]. Den karakteristiska myosinmolekylen med två huvuden (myosinfamilj II) är en hexamer som består av en dubbel uppsättning av en tung kedja (MHC) med molekylvikt 220 kD och två lätta kedjor (MLC). Dessa har en molekylvikt på 17-23kD [6]. Från de tunga kedjorna går två alphahelixar ut och i början av dessa svansar sitter de lätta kedjorna för att ge de tunga kedjorna stadga och tjocklek. Varje huvud kan fungera självständigt ifrån varandra. Myosin är både ett strukturellt och ett regulatoriskt protein och utgör ungefär 20% av totalproteinet i friska muskler [5] . Skelettmuskulaturen hos däggdjur innehåller fyra huvudsakliga isoformer av MHC.
Den långsamma MHCI β och tre snabba, MHCIIa, MHCIIb och MHCIId (MHCIId anses vara likvärdiga med MyHCIIx)[6,7]. Detta leder till att det finns fyra typer av ”rena” fiber, som endast innehåller en typ av dessa isoformer. De är de långsamma TypI (MHCI ) och de snabba typIIA (MHCIIa), typIIB (MHCIIb) β och typIID/X (MHCIId/x). Därefter har man upptäckt att det även finns hybrid muskelfiber som innehåller två eller flera isoformer av MHC [7].
Aktin finns i tre isoformer i kroppen, , , och . - aktin är den isoform som α β γ α finns i muskelvävnaden och den utgör ungefär 50% av myosins koncentration i muskelcellerna [3]. Aktin består av en enda polypeptidkedja, som innehåller fyra domäner i en dubbelhelix.
De tunna filamenten har till uppgift att fungera som ankare till myosin arrangerade i
ordnade serier av bindningsställen där myosin kan binda [3]. Aktin är
huvudkomponenten som bygger upp de tunna filamenten tillsammans med
tropomyosin och troponinkomplexet. Troponin bundet till aktin dämpar
interaktionen mellan aktin och myosin och den avaktiveras med en höjd
kalciumkoncentration [8].
Proteinerna myosin och aktin är således viktiga för musklernas funktion och verksamhet. Långa perioder av viktlöshet, oanvända muskler och även åldrande har en reducerande effekt på skelettmuskelfunktionen, vilket leder både till en minskad proteinsyntes och till förlorad muskelmassa [9].
Syftet med detta projekt var att mäta koncentrationen av myosin och aktin med en ELISA. Proteinkoncentrationerna skulle mätas i singelmuskelfibrer från grisar som tidigare ingått i en studie där man återskapade en modell för intensivvårdspatienter. Som tidigare nämnts är AQM en sjukdom som framför allt drabbar dessa patienter.
Man ser ofta en förlust av framför allt myosin i muskelcellerna och förlusten av detta protein har en betydande negativ effekt på funktionen i musklerna. Syftet med grisstudien var att studera de tidiga stadierna av AQM. Sjukdomen diagnostiseras oftast vid ett sent stadium. Sjukdomens tidigare stadium är något man vet lite om och orsakerna till sjukdomen är fortfarande inte klargjorda. Användandet av neuromuscular blocking agent, en grupp mediciner som hämmar signaleringen mellan motorändplattorna och skelettmusklerna, och kortikosteroider är möjliga orsaker eftersom de används inom intensivvården. Syftet med detta projekt var således att öka förståelsen för denna typ av försämrad muskelfunktion.
Myosin och aktin skulle bestämmas med hjälp av en ELISA där man utifrån en
standardkurva, med kända proteinkoncentrationer, kunde beräkna muskelfibrernas
myosin- respektive aktinkoncentrationer. En totalproteinbestämning gjordes också
på dessa muskelceller för att kunna använda dessa värden som en referens till erhållna
värden från ELISAn. Totalproteinvärdet användes således endast som en typ av
kontroll då man vet att myosin är omkring 20% av detta värde i friska muskelceller
[4] och att aktin då är ungefär 50% av myosins koncentration. Bestämning av
totalprotein vid de låga värden som finns i singelmuskelfiber innebär mer än sällan
problem. Många metoder som används idag för bestämning av låga koncentrationer
av totalprotein i exempelvis serum, har olika sensitivitet för olika proteinfraktioner
[10].
Följaktligen kan en metod ge precisa värden för ett protein som används vid framtagandet av standardkurvan och därefter visa annorlunda mönster vid mätning andra proteiner [10]. I denna studie användes ett kommersiellt kit för att bestämma totalprotein.
MATERIAL OCH METODER
Material
ELISA
MF20, biotinkonjugerade myosinsarkom-specifika antikroppar köptes från Development studies Hybridoma bank, The university of Iowa för att påvisa myosin i muskelfibrerna. För aktin användes biotinkonjugerade aktin-specifika antikroppar från Santa Cruz Biotechnology.
Poly-HRP streptavidin från Endogen Pierce användes som sekundär antikropp.
Muskelfibrer
Muskelfiber från 8 inhemska grisar användes. Grisarna ingick i en studie för att
efterlikna tillståndet för intensivvårdspatienter. Syftet med studien var då att studera
det tidiga stadierna av AQM. 8 grisar med en medelvikt på 22,8 kg (22-24kg)
användes. De sövdes intravenöst och fick därefter kontinuerlig intravenös tillförsel
av lugnande sömnmedel och smärtstillande. Grisarna ventilerades med konstant
flöde, en volymkontrollerad mekanisk ventilation. Efter den förberedande
behandlingen fick gris 1-6 en kombination av kortikosteroider, neuromuscular
blocking agent och endotoxin som inducerar sepsis. Gris 7 fick endast
kortikosteroider och gris nummer 8 hölls endast med mekanisk ventilation utan att
utsättas för några mediciner. Experimentet pågick under 5 dagar och grisarna fick
sedan en dödlig dos av pentobarbiturat följt av arteriell blödning för att avsluta
försöket. Biopsier togs från biceps femoris och från muskulus masseter (en
tuggmuskel) dag 1, 3 och dag 5.
Muskelcellerna behandlades och förvarades enligt publicerad metod [11]. Kort kan det beskrivas så att muskelcellerna lades i ”skinninglösning” och behandlades med sukros innan de frystes ned för bevaring i buntar (bundles). Skinninglösningen är till för att skada cellmembranet och för att sukrosen lättare ska nå muskelfibrerna.
Sukrosen skyddar fibrerna vid frysning och motverkar kristallbildning. När muskelfibrerna därefter användes ”desukroserades” muskelcellerna. De togs från -80
oC och lades direkt i 2,0M sukroslösning på is. Muskelcellerna flyttades sedan var trettionde minut till sukroslösningar i sjunkande koncentrationer 1,5M, 1,0M och sedan 0,5M. Därpå lades muskelbunten i skinninglösning innan den lades i en
”relaxlösning” för att kunna ta ut singelmuskelfiber under mikroskop. Relaxlösningen är till för att få muskelcellen att relaxera och man lättare kan ta ut fibrerna ur muskelbuntarna. Singelmuskelfibrerna lades i 20µL vit ureabuffert, en buffert som används för att denaturera cellerna, och behandlades därefter för att lysera dem göra proteinet tillgängligt för antikropparna. Muskelfibrer från gris nummer 8 användes för standardkurvan.
Metod
Totalproteinbestämning
För att mäta totalprotein från muskelfibrer användes Nanoorange protein quantification, ett kit från Molecular Probes- Invitrogen detection Technologies.
Instruktioner och standardprov (bovint serum albumin, BSA) från distributören användes.
Indirekt ELISA
Singelmuskelfibrernas proteinkoncentration (myosin och aktin) bestämdes med indirekt ELISA. Brunnarna ”coatades” med 50µL fiberprov. Proverna, som låg i vit ureabuffert, späddes innan 1:400 med 0,05M karbonat-bikarbonatbuffert, pH 9,0.
Plattan täcktes med parafilm och inkuberades över natt i 4
oC. Efter inkuberingen
avlägsnades fiberprovlösningen och 0,01M phosphate buffered saline, pH 7,4 (PBS),
1% BSA användes för blockering. 200µL blockeringsbuffert tillsattes och plattan
inkuberades i fuktkammare vid rumstemperatur i 2 timmar.
Brunnarna tvättades därefter 6 gånger med tvättbuffert (0,01M PBS, pH 7,4 med 0,05% Tween 20) innan 50µL av den primära antikroppen, spädd 1:50 med 0,01M PBS, 0,1% BSA med 0,05% Tween 20, tillsattes och plattan på nytt inkuberades i fuktkammare vid rumstemperatur i 2 timmar. Efter inkuberingen avlägsnades antikroppen och plattan tvättades 6 gånger med tvättbuffert varpå 100µL av den sekundära antikroppen, en polymer of HRP (horseradish peroxidase) konjugerad till streptavidin (poly-HRP streptavidin) spädd 1:200 med 0,01M PBS, pH 7,4, 0,1%
BSA med 0,05% Tween 20 tillsattes i mörker. All hantering med poly-HRP- streptavidin måste ske i mörker på grund av dess ljuskänslighet. Efter en timmes inkubering i fuktkammare vid rumstemperatur tvättades plattan på nytt 6 gånger med tvättbuffert. Därefter tillsattes 100µL substrat, tetrametylbenzidin, och även detta steg skedde i mörker då substratet också är ljuskänsligt. Plattan inkuberades 10-15 minuter varpå reaktionen stoppades med 50µL 1M H
2SO
4. Absorbansen lästes sedan i en spektrofotometer vid 450nm.
RESULTAT OCH DISKUSSION
Mätning av totalprotein i muskelfiber
Mätning av totalprotein visade att en viss proteinmängd fanns i muskelfiberproverna.
Proteinmängderna som man kommer ner i då de mäts i muskelceller är mycket låga.
Mätning av totalprotein gjordes i 100 muskelfiber, 7 av dessa visade så pass låga absorbansvärden att proteinkoncentrationen ej gick att bestämma. Standardkurvan som användes i metoden för beräkning av provernas proteinkoncentration hade alla en korrelationskoefficient på över 95% . Granskar man kurvans utseende ser man att den ser mer tvivelaktig ut ju mer koncentrationerna sjunker.
Detta gör att proteinkoncentrationer som ligger så pass lågt som de gör i
muskelfiberproverna (motsvarande mindre än 1µg BSA/ml) inte kan betraktas som
helt pålitliga. Syftet med denna studie var dock inte att undersöka det exakta värdet
av totalproteinet i muskelfibrerna utan detta värde användes endast som en kontroll.
Totalproteinmängden användes som ett referensvärde då man vet att myosin är approximalt 20% av den totala proteinmängden i muskelceller [4] varpå aktin är ungefär 50% av myosins koncentration.
Mätning av myosin och aktinkoncentration i muskelfiber med ELISA
Metoden kunde efter åtskilliga försök inte ge några pålitliga resultat. Resultaten som erhölls från standardkurvan visade alla mycket oregelbundna aborbansvärden och följde inte koncentrationsmönstret av de spädningar som gjordes.
Alla absorbanvärden från spädningarna, med sjunkande koncentrationer, låg istället hela tiden på ungefär samma nivå (se figur 1). De resultat som kunde erhållas från muskelfiberproverna var således inte tillförlitliga och kunde heller ej beräknas utifrån en acceptabel standardkurva. Dessutom visade blanken som sattes på varje enskild ELISA- platta i dessa försök förhöjda absorbansvärden som även de låg i närheten av absorbansen på spädningarna som gjordes till standardkurvan.
Figur 1. Exempel på värden som erhölls från spädningar av standardmuskelfiberextrakt i sjunkande koncentrationer. Figuren visar att värderna inte följer koncentrationsmönstret.
Korrelationsgradienten är här endast 42%. Kurvans utseende visar vid senare försök att hitta orsaken, inte några stora förändringar.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
ELISA
Myosin µg/mL
Absorbans