Detektion av hydrolyserad β-laktamantibiotika i plasma med
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass
Spectrometry och Liquid Chromatography tandem Mass
Spectrometry
Detection of hydrolyzed β-lactam antibiotics in plasma by
Matrix-Assisted Desorption Laser Ionization – Time of Flight Mass
Spectrometry and Liquid Chromatography tandem Mass
Spectrometry
Författare: Niklas Thenstedt
Vårterminen 2020
Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap
Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng
Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Huvudhandledare: Martin Sundqvist, Med dr. Överläkare.
Laboratoriehandledare: Ellionor Rapp, Leg. Biomedicinsk analytiker. Laboratoriemedicinska kliniken, Klinisk mikrobiologi. Örebro universitetssjukhus.
ABSTRAKT
Introduktion
Antibiotikaresistens är ett globalt växande problem. Till gruppen β-laktamantibiotika hör piperacillin-tazobaktam och cefotaxim som båda verkar genom att försvaga
cellväggen med kovalenta bindningar till peptidoglykanlagret som lyserar cellen. E. coli och K. pneumoniae tillhör gruppen Enterobacteriaceae, som är en del av den humana tarmfloran och ofta förekommande vid urinvägsinfektion och sepsis. Utvidgat Spektrum β-Laktamas (ESBL) är ett enzym som finns hos Enterobacteriaceae och som
hydrolyserar β-laktamantibiotika. Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) är en kvalitativ analysteknik för detektion av kemiska föreningar i avseende på massa och laddning. Kännedom om
antibiotikametaboliters molekylvikt vid hydrolys möjliggör detektion. Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) är en högsensitiv kvantifieringsmetod som separerar molekyler i avseende på polaritet för vidare detektion i avseende på massa och laddning.
Syfte
Syftet med denna studie var att vidareutveckla en snabb och effektiv metod för att påvisa nedbrytning av piperacillin-tazobaktam och cefotaxim i blodplasma med LC-MS/MS.
Material och Metod
Tiofaldigt sjunkande koncentrationer av piperacillin-tazobaktam från 2000 till 2 µg/ml, och cefotaxim med koncentrationerna 500 till 0,5 µg/ml analyserades med MALDI-TOF MS, dels intakt men även med bakterierna E. coli och K. pneumoniae med uttryck av olika resistensmekanismer. Vid optimerade koncentrationer spikades plasmaprover med nedbrutet antibiotika som sedan kvantifierades med LC-MS/MS.
Resultat
Lägsta detektionsgräns med MALDI-TOF MS för intakt och hydrolyserat piperacillin-tazobaktam var 20/2,5 µg/ml. För cefotaxim var lägsta gränsen 5 µg/ml. Med kliniskt relevanta blodkoncentrationer gick hydrolys inte att detektera för. Med tre
bakteriekolonier/50 µl kunde dock hydrolys detekteras och kvantifieras med LC-MS/MS.
Detektion av β-laktamantibiotika är möjligt med både MALDI-TOF MS och MS/MS. För att påvisa hydrolys krävdes större mängder bakterier än förväntat med LC-MS/MS.
Nyckelord: LC-MS/MS, MALDI-TOF MS, Enterobacteriaceae, sepsis, piperacillin-tazobaktam, cefotaxim, Extended spektrum β-laktamas, hydrolys.
ABSTRACT
Introduction
Antibiotic resistance is a global growing problem. Piperacillin-tazobactam and
cefotaxime are parts of the group β-lactam antibiotics. The common feature is to inhibit the cell wall synthesis by covalent bindings to the peptidoglycan layer and thereby causing lysis of the bacterial cell. E. coli and K. pneumoniae are members of the
Enterobacteriaceae which is a part of the human normal flora but also are commonly
associated with urinary tract infections which sometimes develops into to sepsis.
Extended Spectrum β-Lactamases (ESBLs) are enzymes with hydrolytic abilities acting on β-lactam antibiotics, expressed by Enterobacteriaceae. The qualitative, Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) can be used to detect chemical compounds in the ratio of mass to charge in accordance to their molecular weight. Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) is a highly sensitive two-step method of quantification which first separate molecules by their polarity attraction force and then by the ratio of mass to charge. Aim
The aim of this study was to develop a fast and efficient method to determine
degradation of piperacillin-tazobactam and cefotaxime in blood plasma by LC-MS/MS. Method
Tenfold dilution of piperacillin-tazobactam in concentrations of 2000 to 2 µg/ml, and cefotaxime in concentrations of 500 to 0,5 µg/ml where analyzed by MALDI-TOF MS, intact and also with the bacteria E. coli and K. pneumoniae with different expression of antibiotic resistance. Optimized concentrations where fixed in blood plasma and then quantified by LC-MS/MS.
Result
The detection limit by using MALDI TOF MS of hydrolyzed as well as non-hydrolyzed piperacillin-tazobactam was 20/2,5 µg/ml. The detection limit in cefotaxime was 5 µg/ml. Hydrolysis could not be detected in clinically fixed blood concentrations. Detection and quantification of hydrolysis by LC-MS/MS was possible in a concentration of three bacteria colonies/50 µl.
Conclusion
It is possible to detect hydrolysis in both MALDI TOF MS and LC-MS/MS. A larger amount of bacteria than expected was needed to demonstrate hydrolysis In LC-MS/MS.
Keywords: LC-MS/MS, MALDI-TOF MS, Enterobacteriaceae, sepsis, piperacillin-tazobactam, cefotaxime, Extended spectrum β-lactamase, hydrolysis.
FÖRKORTNINGSLISTA
AmpC Ampicillinase C
ATCC American Type Culture Collection
CCUG Culture Collection University Of Gothenburg
CFU Kolonibildande enhet
CTX Cefotaxim
CTX-M Cefotaximinase – Munich
E. coli Escherichia coli
ESBL Extendended Spectrum β-lactamase, (betalaktamas med
utvidgat spektrum).
ESBLA Extended Spectrum β-lactamase Klass A.
ESBLCARBA Extended Spectrum β-lactamase Karbapenemase
ESBLM Extended Spectrum β-lactamase Micsellaneous
EUCAST The European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing
K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae
LC-MS/MS Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight
Mass Spectrometry
m/z Mass-to-charge ratio (Massa över laddning)
NAM N-acetylmuraminsyra
NAG N-acetylglukosamin
NMD-1 New Delhi metallo β-laktamase
OXA-ESBL Oxacillinaseproducerande-Extended Spectrum β-lactamase
pAMP C Plasmidmedierad ampicillinase C
PBP Penicillin-bindande proteiner
PMF Peptide Mass Fingerprinting
PIP-TAZ Piperacillin-tazobaktam
SCORE Kvalitativt värde som erhålls mellan 1–3 vid analys
INNEHÅLLSFÖRTECKNING
1. INTRODUKTION ... 1
1.1 Antibiotika och antibiotikaresistens ... 1
1.2 β-laktamantibiotika ... 1
1.3 Piperacillin-tazobaktam och cefotaxim ... 2
1.4 Enterobacteriaceae ... 3
1.5 β-laktamaser ... 4
1.6 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry ... 4
1.7 Analys av hydrolyserat antibiotika med MALDI-TOF MS ... 5
1.8 Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry ... 7
1.9 Syfte och frågeställning ... 9
2. MATERIAL OCH METOD ... 10
2.1 Introduktion och förberedelse av experiment ... 10
2.2 Provberedning och detektion av antibiotikahydrolys med MALDI-TOF MS ... 10
2.2.1 Artbestämning av bakteriestammar ... 11
2.2.2 Beredning av kliniskt relevanta koncentrationer antibiotika ... 11
2.2.3 McFarland´s turbiditet och seriespädning av bakterier ... 11
2.2.4 Beräkning av viable count ... 11
2.2.5 Bearbetning av analysresultat ... 12
2.3 Spikning av plasmaprover för detektion med LC-MS/MS ... 12
2.4 Kvantifiering av β-laktamantibiotika i plasmaprover med LC-MS/MS ... 12
2.5 Sammanställning av analysdata från LC-MS/MS ... 13
2.6 Antibiotikakänslighetstest och reproduktion av plasmaprover ... 13
2.7 Etiska överväganden ... 14 2.8 Statistik analys ... 14 3. RESULTAT ... 15 3.1 Artbestämning av bakteriestammar ... 15 3.2 Viable count ... 15 3.3 Antibiotikakänslighetstest ... 16
3.4 Lägsta detektionsgräns av antibiotika med MALDI-TOF MS ... 17
3.5 Varierande koncentration antibiotika med konstant bakteriekoncentration ... 19
3.6 Konstant koncentration antibiotika med varierande mängd bakterier, försök I ... 21
3.6.1 Varierande mängd bakterier i konstant antibiotikakoncentration, försök II ... 23
3.7 Kvantifiering av piperacillin-tazobaktam och cefotaxim med LC-MS/MS, försök I 26 3.7.1 Antibiotikakvantifiering med LC-MS/MS, försök II ... 28
3.8 Analysdata från LC-MS/MS ... 30
4.1 Artbestämning och viable count ... 31
4.2 Optimering av antibiotika- och bakteriekoncentration... 31
4.3 Försök I ... 33
4.4 Antibiotikakänslighetstest ... 33
4.5 Försök II ... 34
4.6 Analysdata ... 35
4.7 Hydrolyserande bakterier i blodet ... 36
4.8 Styrkor och svagheter ... 36
4.9 Slutsats ... 36
1. INTRODUKTION
1.1 Antibiotika och antibiotikaresistens
En av sjukvårdens stora utmaningar innan det första penicillinet togs i kliniskt bruk 1941, var utvecklandet av behandlingsmöjligheter mot bakteriella infektioner (1). De senaste decenniernas användning av antibiotika korrelerar med observationer om ökad antibiotikaresistens. Olika resistensmekanismer förekommer hos olika bakteriearter och kan orsakas av morfologiska eller fysiologiska barriärer som utgör en naturlig
antibiotikaresistens. Plasmidmedierad överföring av extrakromosomalt genetiskt material och punktmutationer i det genetiska materialet bidrar till alternativa
metaboliska processer och förekomst av hydrolyserande enzymer. Multiresistens är ett globalt växande problem och utgör en av dagens största utmaningar inom det
mikrobiologiska forskningsfältet, där bakterier har utvecklat eller förvärvat egenskaper som de tidigare har saknat, vilket bidrar till en förhöjd motståndskraft mot antibiotika (2). Antibiotika klassificeras utifrån dess verkningsmekanismer och delas in i följande fem huvudgrupper: hämning av cellväggssyntes, proteinsyntes, nukleinsyrasyntes, cytoplasmamembranfunktion och metaboliska processer (3).
1.2 β-laktamantibiotika
Majoriteten av alla bakterier är omgivna av en cellvägg, som utgör ett vitalt skydd mot osmotisk och mekanisk stress samt bidrar till dess unika struktur. Cellväggen är
uppbyggd av peptidoglykan som är en socker- och aminosyrapolymer bestående av bindningar mellan aminosocker N-acetylglukosamin (NAG) och N-acetylmuraminsyra (NAM). Syntesen av cellväggen startar i cytoplasman där varje NAM-molekyl bär en pentapeptid (PEP) av alternerande L- och D-aminosyror. NAG och NAM binds till varandra och bildar ett PEP-NAM-NAG-komplex som förflyttas över cellmembranet av transportproteinet baktoprenolpyrofosfat. PEP-NAM-NAG-komplexet förlänger den befintliga cellväggen och bildar en tredimensionell struktur genom tvärbindningar av peptidbryggor mellan PEP-molekylerna under inverkan av enzymet transpeptidas som fäster till D-ala-D-ala och klyver den yttersta alaninmolekylen och kopplar den
kvarvarande till glycinrester i bryggpeptiden, se figur 1. De enzym som är involverade i cellväggssyntesen går under begreppet penicillinbindande proteiner (PBP) (3-5).
Figur 1. Cellväggen består av peptidoglykan som är en sammansättning av aminosockermolekylerna N-acetylglukosamin (NAG) och N-acetylmuraminsyra (NAM). Enzymet transpeptidas bildar tvärbindningar av NAM genom att koppla de samman vid ändarna av D-ala-D-ala. Illustrationen i figuren baseras på beskrivning av cellväggsyntesen i kapitel 21, Sherris Medical Microbiology (3) Thenstedt N. Till gruppen β-laktamantibiotika hör penicillin, cefalosporin, karbapenem,
monobaktamer och β-laktamashämmare, som gemensamt består av en reaktiv cyklisk, baktericid β-laktamring, vilken konkurrerar med PBP att med hög affinitet binda kovalent till peptidoglykankedjorna. När β-laktamringen har bundit till PBP förhindras tvärbindningar mellan peptidoglykaner som resulterar i att bakteriecellen lyseras (4). 1.3 Piperacillin-tazobaktam och cefotaxim
Piperacillin är ett semi-syntetiskt bredspektrumantibiotikum inom gruppen penicillin, som är verksamt vid infektioner orsakade av både gramnegativa- och grampositiva bakterier under aeroba- och anaeroba förhållanden. Piperacillin, vars
verkningsmekanism är att inhibera PBP har en molekylvikt på 517,6 Dalton (Da). β-laktamasproducerande bakterier har förmågan att degradera piperacillin och hämma dess effekt. Tazobaktam är en β-laktamasinhibitor med en molekylvikt på 300,29 Da, som bildar en irreversibel bindning med β-laktamas. Kliniskt administreras piperacillin-tazobaktam (PIP-TAZ) intravenöst i ett kombinationspreparat med förhållandet 8:1, då dess synergiska effekt i kombination, uppnår bättre terapeutisk effekt för patienten samt sänker gränsen för den minsta inhiberande koncentrationen av antibiotikumet (6). Efter intravenös administrering av PIP-TAZ är högsta maximala mätbara koncentration i plasma av piperacillin 298 µg/ml och av tazobaktam 34 µg/ml (7).
Cefotaxim (CTX) är ett bredspektrumantibiotikum tillhörande den tredje generationens cefalosporiner. CTX har en molekylvikt på 455,5 Da och är verksamt mot vissa
gramnegativa bakteriestammar som har utvecklat resistens mot penicilliner, då dess enklare molekylstruktur bidrar till en större penetrationsförmåga genom cellmembran än penicilliner, se figur 2. (4, 8). Högsta mätbara koncentration av CTX i plasma efter intravenös administrering är 20-30 µg/ml (9).
Figur 2. Molekylstrukturer av antibiotika. Piperacillin från vänster i figur med en molekylvikt på 517,6 Dalton (Da), följt av tazobaktam med en molekylvikt på 300,29 Da och cefotaxim med en molekylvikt på 455,5 Da. β-laktamringen är den reaktiva delen av antibiotikumet och är i figur markerat med grönt. Figuren är skapad baserad på PubChem´s beskrivningar av molekylstrukturer (10-12) Thenstedt N. 1.4 Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae utgör ett stort släkte av bakterier som klassificeras utifrån dess
biokemiska- och molekylärbiologiska funktioner (4). Viktiga bakteriologiska kännetecken för släktet är att de är gramnegativa, fakultativt anaeroba och icke sporbildande stavar med storlek på 0,3-1,0 x 1,0-6,0µm (13). Vanligtvis är
Enterobacteriaceae apatogena då de utgör den humana tarmfloran, den främsta orsaken
till uppkomst av infektion är samhällsförvärvad- och vårdrelaterad, där
immunsuppression utgör en riskfaktor för infektion (4). Escherichia coli (E. coli) och
Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) är två bakteriearter, tillhörande familjen Enterobacteriaceae som orsakar urinvägsinfektioner. E. coli och K. pneumoniae
symtombilden kopplat till kliniska laboratoriefynd av biomarkörer samt specifika symtom från primärt infektionsfokus (15,16).
American Type Culture Collection (ATCC) och Culture Collection University Of Gothenburg (CCUG) är två internationella organisationer som inom det
mikrobiologiska fältet distribuerar helgenomsekvenserade bakterier, referensstammar (RS) till kliniska forskningsprojekt. Varje organisation genererar ett unikt
identifikationsnummer för respektive bakteriestam. Bakterier kan erhållas flera olika identifikationsnummer om de är katalogiserade hos flera organisationer (17, 18). 1.5 β-laktamaser
Extended spektrum β-laktamas (ESBLs) är en grupp om över 500 kända enzymer som bryter ned β-laktamantibiotika genom hydrolys av β-laktamringen och därmed inhiberar den baktericida effekten. Det finns olika internationella klassificeringssystem av ESBLs. Ambler molecular classification utgör fyra klasser (A-D) av ESBLs i avseende på dess strukturella likheter i aminosyrasekvenser. Bush-Jacoby-Medeiros klassificeringssystem av ESBLs baseras på enzymets funktioner och dess fenotypiska egenskaper i avseende på den inhiberande effekten av antibiotika (19). ESBLs med hydrolytisk aktivitet mot bredspektrumantibiotika delas ytterligare in i följande tre klasser baserat på Medeiros taxonomi; klass A (ESBLA), ESBL med karbapenemasaktivitet (ESBLCARBA) och Miscellaneous ESBL (ESBLM). ESBLA hydrolyserar cefalosporiner men inaktiveras av klavulansyra. Till denna grupp av enzymer hör cefotaximinase – Munich (CTX-M). Miscellaneous ESBL (ESBLM) hydrolyserar cefalosporiner men hämmas inte av klavulansyra. Till gruppen ESBLM hör ampicillinase C (AmpC), plasmidmedierad ampicillinase C (pAmpC) och Oxacillinaseproducerande ESBL (OXA-ESBL).
ESBLCARBA utgör två grupper av metallo-β-laktamaser som har hydrolytisk förmåga av cefalosporiner och karbapenemer och inkluderar enzymet New Delhi metallo
β-laktamase (NMD-1) (20, 21).
1.6 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry
Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) är en automatiserad analysteknik som möjliggör detektion av kemiska
föreningar i avseende på förhållandet mellan molekylvikt och laddning. Provmaterialet som skall analyseras stryks ut på en detektionsplatta och beläggs med en
energiabsorberande matrixlösning som extraherar och co-kristalliserar sig med provmaterialets proteiner. Under bestrålning av ultraviolett laser joniseras och
fragmenteras proteinkomplexen till positivt laddade molekyler. Ett elektriskt fält skapas i ett slutet vakuumrör där separation av joner sker. Små molekyler migrerar snabbare än stora molekyler till detektorn. Resultatet avbildas i ett diagram där förhållandet mellan massa och laddning (m/z) plottas på x-axeln i förhållande till den relativa intensiteten av energiabsorbansen, ”arbitrary units” (a.u.) på y-axeln, (se figur 3) (22).
Figur 3. Schematisk illustration av Matrix assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight. Provet beläggs med en matrixlösning som extraherar proteiner som joniseras och separeras i ett elektriskt fält. Proteinkomplexen migrerar i avseende på storlek och laddning till en detektor. Resultatet avbildas i ett diagram med laddning och storlek i förhållande till den relativa energiabsorbansen. Illustrationen är baserad på teknisk metodbeskrivning av Singhal et al. (22) Thenstedt N.
1.7 Analys av hydrolyserat antibiotika med MALDI-TOF MS
I klinisk verksamhet har MALDI-TOF MS utvecklats för artidentifiering av
mikroorganismer. Peptide mass fingerprinting (PMF) är ett begrepp som definierar referensdatabaser, upprättade med information om mikroorganismers unika
peptidsammansättning (22). Joniseringsspektrat av oidentifierade stammar jämförs med PMF, där överensstämmande resultat erhålls i ett värde (SCORE) mellan 1-3, där massenheten anges i Da. Ett SCORE över 2 anses vara av hög artspecifik kvalitet, medan SCORE under 2 kan ge utslag på närbesläktade arter från samma familj av mikroorganismer (5). Den ökade antibiotikaresistensen har genererat vidareutveckling av metoden som har bidragit till möjlig detektion av antibiotikahydrolys med MALDI-TOF MS, enligt samma grundläggande princip som vid artidentifikation. Kännedom om
den kemiska sammansättningen av intakt antibiotika gör det möjligt att kalibrera
instrumentet och detektera för detta. In vitro inkubering av antibiotika tillsammans med kända bakteriestammar möjliggör detektion av hydrolseringsmetaboliter där
antibiotikamolekylen förväntas öka eller minska i masstal (5, 22, 23). Masstalet för antibiotikan ökar vanligtvis med 18 Da under en additionsreaktion av H2O som
efterföljs av en dekarboxyleringsreaktion där masstalet minskar med 44 Da när en CO2 avspjälkas (Se sammanställning av referensmassor för cefotaxim, piperacillin och tazobaktam i tabell 1).
Vid simulering av plasma för analys, motsvarande kliniska fynd av bakterier in vivo med kliniskt relevanta koncentrationer av antibiotika mäts turbiditeten i linjär skala, där 0,5 på McFarland-skalan motsvarar en uppskattning på 1,5 x 108 kolonibildande enheter per milliliter (CFU/ml). Vid symtomgivande infektioner med bakterier i blodbanan kan bakterietalet vara så lågt som ≤ 1,5 x 102 CFU/ml i plasma. Viable count är en metod för beräkning av antalet levnadskraftiga bakterieceller i en suspension. Odling av bakterier från en logaritmisk seriespädning med utgångspunkt från McFarland möjliggör exakt beräkning av antalet CFU (24).
Tabell 1. Sammanställning av referensmassor för intakt och hydrolysrat cefotaxim, piperacillin och tazobaktam. Molekylvikten anges i Dalton (Da).
Molekylmassa av intakt antibiotika, anges i Dalton (Da)
Cefotaxime 396,1 455,4 456,5 478,5 500,10
Piperacillin 517,6 518,6 540,6 562,6
Tazobaktam 300,3
Molekylmassa av hydrolyserat antibiotika, anges i Dalton (Da)
Cefotaxim 370,5 414.5
Piperacillin 492,5 536,5 558,5 580,5
Tazobaktam * * Går inte att detektera
1.8 Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) är en högsensitiv, automatiserad separations- och detektionsteknik, kombinerad av vätskekromatografi (LC) och masspektrometri (MS) i två serier för detektion av biokemiska föreningar. LC är en kvantifieringsteknik av analyter i mobil vätskefas. Eluering av provmaterialet sker under högt tryck, uppemot 1000 bar genom att skapa en gradient med ett polärt tillsatt lösningsmedel som provmaterialet injiceras samman med under ett konstant flöde till en kolonn. En liten provmängd injiceras till vätskefasen som inledningsvis består av ultrarent vatten för att successivt gradientförskjutas till 100% metanol. Kolonnen består av ett stålrör och utgör en fast fas. Kolonnens insida är beklädd med lipofila partiklar som är 0,2-5 µm stora, 18 kolatomer långa svansar som kallas för C18-svansar och som interagerar med den mobila vätskefasen. Momentant inleds reaktionen med att lipofila analyter attraheras av kolonnens insida. Allteftersom den mobila fasen övergår från vatten till metanol kommer attraktionskraften av den mobila fasen resultera i att de lipofila anlyterna lämnar den fasta fasen och sorteras efter dess lipofilitet. Mellan den fasta fasen och elektrolyter som är små vattenlösliga komponenter uppstår ingen interaktion varvid de passerar kolonnen till en avfallsuppsamlare för att inte störa detektionen. Retentionstiden är beroende av molekylstorlek, affinitet och
interaktionskraft mellan de två faserna (25-28).
Med MS identifieras de molekyler som selekterats fram i LC. Inne i masspektrometern är det ett högt vacuum med ett tryck på 10-6 atmosfärer. För att överföra analyterna till masspektrometern måste de joniseras till laddade partiklar. Flödet av vätska från LC är cirka 0,6 ml/min. Från kolonnen via en kapillär passerar analyterna en joniseringskälla, där partikelbestrålning sker med elektrospray. Vid kapillärspetsen utsätts partiklarna för en spänning på cirka 1-3kV samtidigt som de elektrosprayas och fördelas i små
aerosoler. Aerosolerna dunstar till mindre droppar, vars elektriska laddningar
accelererar till kinetisk energi och repellerar varandra. När aerosolerna kolliderar slås de sönder till ännu mindre droppar. Indunstningen påskyndas med att spola kvävgas som värms upp till 400-500oC. Masspektrometern har ett insug som attraherar analyterna i avseende på dess laddning. I detta steg sker en grovsortering av laddade molekyler mellan atmosfärtryck och högvakuum, det finns en risk att oladdade partiklar följer med samt att föroreningar från LC utövar jonsuppression av målmolekylerna (28).
Separation av jonerna sker i en mass-selektor i avseende på massa och laddning (m/z) och är uppdelad i tre quadrupoler. Den första quadrupolen består av två positiva- och två negativa parallella stavar. Med kännedom om sökta analyters molekylvikt kan ett elektriskt fält skapas med växelspänningar mellan stavarna i quadrupolen för ytterligare selektion av molekyler. Anpassning av växelspänningen genererar endast att analyter med motsvarande massladdning passerar quadrupolen i longitudinell riktning medan oönskade partiklar med andra laddningar kommer oscillera ur fas. I realiteten kan man endast detektera en analyt åt gången men med snabba justeringar i växelspänningen kan man skenbart detektera för upp till 20 analyter per prov samtidigt. Den andra
quadrupolen är en kollisionscell med argonjoner, med vilka analyterna kolliderar och delas upp i mindre fragment. I den tredje quadrupolen kan man undersöka utvalda fragment och dess kvotfördelning. Kvotfördelningen skall förhålla sig proportionellt mot varandra, då klyvningen av molekyler inte är slumpmässig utan följer ett bestämt klyvningsmönster. För att godkänna analysresultatet måste kvotfördelningen vara konstant. Sannolikt finns det en risk att fragment som är kluvna från olika
modermolekyler erhåller samma molekylvikt men med avvikande kvotfördelning. Efter sista quadrupolen sitter en laddningsdetektor som räknar antalet laddningar per
tidsenhet som överförs till ett dataprogram för bearbetning och avbildas i ett
kromatogram. Toppen i kromatogrammet förväntas bli en symmetrisk, gausisk topp, där arean under kurvan är direkt proportionell mot mängden analyt i provet, se figur 3 (27, 28).
Figur 3. Flödesschema av Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry. En gradientskillnad av polära lösningsmedel upprätthålls i den mobila fasen. Mobilfasen pumpas under ett konstant flöde, till vilken provmaterialet injiceras. Mobila fasen passerar en stål-kolonn som på insidan är bekläd med lipofila kolsvanser som analyterna attraheras av och opolära ämnen passerar kolonnen till en avfallsuppsamlare. Mobila fasen gradientförskjuts, analyterna sorteras efter dess lipofilitet. Med
elektrospray joniseras analyterna och fragmenteras till mindre partiklar som sugs in i masspektrometerns högvacuum. I Masspektrometern utnyttjas analyternas laddning genom att använda växelspänning där en massladdning detekteras momentant. Resultatet behandlas i ett dataprogram och avbildas i ett
kromatogram. Figuren är baserad på Waters produktbeskrivning (29) Thenstedt N.
För att öka metodens sensitivitet och specificitet används en internstandard, en
isotopinmärkt molekyl med samma struktur som den sökta analyten. Internstandarden har samma potential att attrahera laddningar som den sökta analyten medan
masspektrometern kan sortera bort internstandarden mot målanalyten då de har olika molekylvikter. Kravet för internstandarden är att den måste vara minst tre Da större än målanalyten, detta på grund av naturlig förekomst av kol-13 i målanalyten som ger en procentuell normalfördelning av masskillnader. Användandet av en internstandard med minst tre Da i masskillnad resulterar insignifikanta skillnader, vars respons kan utnyttjas för att beräkna kvotskillnaden mellan internstandarden och målanalyten (28, 30-31). Qiu et al. har använt analystekniken i syfte att detektera för β-laktamantibiotika i kontaminerade livsmedel och lyckades detektera- och kvantifiera antibiotika med en nedre detektionsgräns på 0,2 ng/ml (32).
1.9 Syfte och frågeställning
Nedbrytning av cefotaxim och piperacillin-tazobaktam har kunnat påvisas in vitro med MALDI-TOF MS. Syftet med denna studie var att vidareutveckla en snabb- och effektiv metod för att påvisa nedbrytning av cefotaxim och piperacillin-
tazobaktam i blodplasma med LC-MS/MS. I slutändan var frågeställningen om metoden skulle kunna användas för att avgöra varför en patient under pågående behandling har för låg koncentration av β-laktamantibiotika, vilket även skulle kunna bidra till snabb diagnostik- och handläggning av patient.
2. MATERIAL OCH METOD
2.1 Introduktion och förberedelse av experiment
I denna studie användes för samtliga försök två bakteriestammar inköpta från Culture Collection University Of Gothenburg (CCUG). En stam cefalosporin- och
penicillinkänslig E. coli med referensnummer CCUG17620 samt en ESBLA-positiv, cefalosporin- och penicillinresistent K. pneumoniae med referensnummer CCUG54718. De båda isolaten används i kliniskt rutinarbete och erhölls av laboratoriet för klinisk mikrobiologi, Universitetssjukhuset Örebro. Isolaten odlades på blodagar (3,7 %w/v Columbia blod agar bas (Oxoid, Basingstoke, England) och (5,7% defibrinerat hästblod (Håtunalab, Bro, Sverige), i MilliQ-vatten) om ett intervall på 24–48 timmar i 36,5oC. De antibiotikum som testades i studien var cefotaxim Villerton (Mylan Hospital AS, Asker, Norge) (CTX) och piperacillin-tazobaktam Reig Jofre (Bioglan AB, Malmö, Sverige) (PIP-TAZ). Nya antibiotikalösningar bereddes vid varje laborationstillfälle. Studien var uppdelad i följande två experiment: 1) optimering av lägsta detektionsgräns för antibiotikahydrolys med Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) i kliniskt relevanta koncentrationer CTX och PIP-TAZ med konstant bakteriekoncentration samt detektion av hydrolys vid konstant koncentration antibiotikum i varierande koncentrationer bakterier. 2) Med Liquid Chromatography tanden – Mass Spectrometry (LC-MS/MS) detektera för kliniskt relevanta koncentrationer av antibiotikum och kliniska normalfynd av bakterier i plasma. För samtliga experiment genom hela studien utfördes analyser i triplikat. 2.2 Provberedning och detektion av antibiotikahydrolys med MALDI-TOF MS Samtliga prover som analyserades med MALDI-TOF MS inkuberades under samma förhållanden. Bakteriekolonierna från odlingsmediumet överfördes med platinös och slammades i eppendorfrör tillsammans med antibiotika och inkuberades á två timmar, 36,5oC på skakbord i 800 rpm. Efter inkubation centrifugerades proverna med 14100 rpm x 2 min (Hettich Lab Technology, Tuttlingen, Germany). Av supernatanten analyserades 1 µl från MALDI-96 stålplatta (Bruker Daltonics), med 1µl (10 mg/ml α-Cyano-4-hydroxykinnaminsyra, 50% acetonitril, 0,1% triflourättiksyra (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland), i MilliQ-vatten). Efter intorkning utfördes MALDI-TOF MS i
MicroflexTM LT-masspektrometer, med följande inställningar i flexControl 3.4 (Bruker Daltonics): Lens: 5.4 kV, Pulsed Ion Extraction: 110 ns, detection gain: 1.76x, Ion Source 1: 18.00 kV, Ion Source 2: 16.20 kV, laser attenuator minimum pos: 28.0%, laser attenuator maximum pos: 68.0%, laser frequency: 60.0 Hz.
2.2.1 Artbestämning av bakteriestammar
Vid varje laborationstillfälle utfördes en vidimerande analys för artbestämning av E.
coli CCUG17620 och K. pneumoniae CCUG54718. Ett blankprov av matrixlös och
Natriumklorid (NaCl) 0,85% analyserades med MALDI Biotyper Compass (MBT Compass, Bruker Daltonics, Bremen, Tyskland), enligt leverantörens anvisningar. 2.2.2 Beredning av kliniskt relevanta koncentrationer antibiotika
En tiofaldig spädningsserie (1:10) gjordes från standardlösning av CTX på 50 mg/ml och PIP-TAZ på 200 mg/ml, i NaCl (0,85%) för att uppnå följande slutkoncentrationer: CTX: 500, 50, 5, och 0,5 µg/ml och PIP-TAZ: 2000/250, 200/25, 20/2,5 och 2/0,25 µg/ml. Tre bakteriekolonier av E. coli CCUG17620 och K. pneumoniae CCUG54718 tillsattes till 50 µl av respektive antibiotikakoncentration och inkuberades tillsammans med blankprover av varje antibiotikakoncentration.
2.2.3 McFarland´s turbiditet och seriespädning av bakterier
Bakterier av E. coli CCUG17620 och K. pneumoniae CCUG54718 slammades i NaCl (0,85%) med en turbiditet på 1,0 McFarland, motsvarande en approximering av 3,0 x 108 CFU/ml. En spädningsserie (1:10) gjordes för att erhålla följande koncentrationer av respektive bakteriestam: (3,0 x 107 till 3,0 x 102). Prover spikades i konstanta
koncentrationer antibiotikum, CTX med 50 µg/ml och PIP-TAZ med 200 µg/ml med en volym på 100µl och en förväntad slutkoncentration på 3,0 x 106, 3,0 x 104 och 3,0 x 102 bakterier.
2.2.4 Beräkning av viable count
Bakteriersuspensioner från koncentrationsspädningen odlades ut på blodagar med förväntat CFU på 3,0 x 104 till 3,0 x 102. Suspensionen med CFU på 3,0 x 104 odlades med en spädningsfaktor på 1:100 och suspensionen med 3,0 x 103 och 3,0 x 102 odlades med en faktor på 1:10. Inkubering av agarplattorna gjordes i 36,5oC under 20 timmar.
Medelvärdet av antalet CFU beräknades vid avläsning för vardera bakteriekoncentration.
2.2.5 Bearbetning av analysresultat
Förhållandet mellan massa och laddning (m/z) i MALDI-TOF MS för respektive analys avbildades som ett masspektrum inom ett intervall på 0-1000 m/z. Resultatet överfördes automatiskt till dataprogrammet flexAnalysis 3.4 (Bruker Daltonics). Avgränsning för resultattolkning av antibiotikahydrolys gjordes mot intakt antibiotika och bakterier i NaCl 0,85% inom intervallet 285-600 m/z för PIP-TAZ och 360-510 m/z för CTX samt kalibrerades mot matrixlösningens masstoppar (190 och 379 Da).
2.3 Spikning av plasmaprover för detektion med LC-MS/MS
Plasma från helblod taget venöst med EDTA-rör användes från en frivillig försöksperson utan kända sjukdomar för att simulera prover in-vitro motsvarande förhållandet in-vivo vid en bakteriell infektion under pågående behandling av antibiotika. Efter provtagning centrifugerades provrören 4000 rpm x 7 min innan avhällning. Spädningsserier av CTX stamlösning på 50 mg/ml, stamlösning PIP-TAZ på 200 mg/ml, E. coli CCUG17620 och K. pneumoniae CCUG54718 med 1,0
McFarland utfördes samt adderades till varandra för att uppnå följande
slutkoncentrationer för inkubation av respektive bakteriestam och antibiotika: CTX 500 µg/ml, PIP-TAZ 200 µg/ml, E. coli 3,0 x 103 och K. pneumoniae 3,0 x 103. Proverna inkuberades i eppendorfrör á två timmar, 36,5oC på skakbord i 800 rpm. Efter
inkubation centrifugerades proverna med 14100 rpm x 2 min. Supernatanten adderades till färsk plasma i förhållandet 1:10 för att uppnå följande kliniskt relevanta
slutkoncentrationer av vardera bakteriestam och antibiotika: CTX 50 µg/ml, PIP-TAZ 20 µg/ml, E. coli 3,0 x 102 och K. pneumoniae 3,0 x 102. Proverna överfördes till kryorör, vortexades till en homogen lösning och frystes omedelbart ned till -70oC för förvaring och tinades i rumstemperatur vid analystillfället.
2.4 Kvantifiering av β-laktamantibiotika i plasmaprover med LC-MS/MS Simulerade plasmaprover, blankprov som negativ kontroll och fyra kalibratorer per antibiotika med följande koncentrationer: (0,15, 1,0, 10, 100 µg/ml), samt hög och låg kontroll med följande koncentrationer: (0,31 och 50 µg/ml) tinades upp och vortexades.
Till varje prov tillsattes 20 µl internstandard innehållande: ((13C, 2H3)-Cefotaxime, (2H5)-Piperacillin Sodium Salt, (13C2, 15N3)-Tazobaktam Sodium Salt), (Alsachim Group Company, Illkirch-Graffenstaden, Frankrike)), I en minut mixades proverna på ett skakbord med 750 MOT 1/min. Acetonitrillösning med 0,1% myrsyra tillsattes proverna för att fälla ut proteiner i provet, följt av skak 2500 MOT1/min, en minut. Proverna centrifugerades i 12536 rpm x 10 minuter (Sigma 2-16P Centrifuge, Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Germany). Supernatant och MilliQ-vatten sattes till glasvialer i förhållandet 1:1 och korkades med slittade korkar. Kalibratorer och kontroller upparbetades som prover och vortexades innan analys.
Proverna analyserades på LC-MS/MS, Xevo TQ-S micro med tillhörande kolonn, Acquity UPLC T3 1,8 µm, 2,1 x 50mm, filterhållare, Acquity UPLC Column In-Line Filter Unit, samt förfilter, Stainless Steel Replacement Filters, 0,2 µm (Waters
Chromatography Europé BV, Etten-Leur, Nederländerna). Instrumentprogramvaran MassLynx 4.2 användes för mätning av proverna och koncentrationsberäkning utfördes med TargetLynx 4.2. För PIP-TAZ användes linjära kalibreringskurvorna viktade till 1/x2 och för CTX användes kvadratisk passning.
2.5 Sammanställning av analysdata från LC-MS/MS
Data från kvantifieringsanalyser av β-laktamantibiotikat PIP-TAZ i plasma utförda mellan december 2019 och januari 2020 erhölls från laboratoriet för specialkemi, laboratoriemedicinska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro. Bearbetning och kvotberäkning utfördes och sammanställdes.
2.6 Antibiotikakänslighetstest och reproduktion av plasmaprover
Antibiotikakänslighetstest med diskdiffusion utfördes enligt European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) (33) på E. coli CCUG17620, K.
pneumoniae CCUG54718 samt ESBLA-positiva Tromsøstammen K. pneumoniae 50518740, som erhölls från Norges arktiska universitet, Tromsø. Bakteriesuspensioner från respektive stam med 0,5 McFarland ströks ut på Mueller Hinton II agar (3,8%w/v Mueller Hinton II agar (Becton, Dickinson & Company, Le pont de Claix, Frankrike), i MilliQ-vatten). Antibiotikalappar, (Oxoid, Basingstoke, UK) med CTX 5 µg och
PIP-TAZ 30 µg placerades på agarplattorna och inkuberades i 20 timmar, 36,5oC innan avläsning av hämningszonernas diameter.
Detektion och provberedning av antibiotikahydrolys med MALDI-TOF MS reproducerades enligt avsnitt 2.2. Simulering av prover framställdes ånyo enligt
beskrivning under avsnitt 2.3-2.4, med förändring i slutkoncentration av bakterier enligt följande: tre bakteriekolonier/50 µl, 3,0 x 106 och 3,0 x 102 i antibiotikalösning. Till det upprepade försöket inkluderades även K. pneumoniae 50518740 för prover som
inkuberades med PIP-TAZ. 2.7 Etiska överväganden
Bakterier är biologiskt material som saknar koppling till patientdata och kräver såldes inget etiskt prövningstillstånd. För denna pilotstudie användes 25 ml plasma från en frisk frivillig person efter information om vad plasman skulle användas till. Plasman som har använts är anonymiserad utan möjlig spårbarhet till enskild individ och är taget, dels enligt riktlinjer med Helsingforsdeklarationen och även enligt socialstyrelsens riktlinjer. Resultatet i studien erhåller ingen data som riskerar integritetsintrång eller utlämnande av känsliga personuppgifter och kräver inget etiskt övervägande.
2.8 Statistik analys
Statistiska beräkningar har inte kunnat bearbetas i denna studie då erhållna resultatdata är i mindre skala. Studien bör således reproduceras i större omfattning för att kunna dra slutsatser om statistisk signifikans.
3. RESULTAT
3.1 Artbestämning av bakteriestammar
Detektion av direkt-ID med MALDI-TOF MS återgav ett SCORE på 2,32 för E. coli CCUG17620, 2,08 för K. pneumoniae CCUG54718 och ett SCORE på 2,14 för K.
pneumoniae 50518740.
3.2 Viable count
Det absoluta antalet viabla bakterieceller av E. coli CCUG17620 var efter spädning 2,9 x 104, 2,9 x 103 och 2,7 x 102 CFU/L. För K. pneumoniae CCUG54718, 3,0 x 104, 2,9 x 103 och 2,7 x 102 och för K. pneumoniae 50518740 var antalet viabla bakterieceller 2,9 x 104, 3,0 x 103 och 2,9 x 102 CFU/L efter spädning (se sammanställning av
resultatberäkning i tabell 2).
Tabell 2. Sammanställning av antalet CFU/odlingsplatta vid avläsning efter 20 timmars inkubation i 36,5oC. Det absoluta antalet CFU/L för stammarna E. coli CCUG17620, K. pneumoniae CCUG54718 och
K. pneumoniae 50518740 baseras på medelvärdet av antalet CFU/odlingsplatta från tre odlingsplattor,
omvänt proportionellt mot spädningsfaktorn 1:100 respektive 1:10.
Bakteriestam Koncentration/faktor CFU/odlingsplatta Medelvärde CFU/mL
E. coli CCUG17620 3,0 x 104/1:100 255 312 291 286 2,9 x 104 E. coli CCUG17620 3,0 x 103/1:10 321 264 297 294 2,9 x 103 E. coli CCUG17620 3,0 x 102/1:10 39 27 18 15 2,7 x 102 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 104/1:100 303 324 279 302 3,0 x 104 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 103/1:10 279 288 291 286 2,9 x 103 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 102/1:10 27 21 33 27 2,7 x 102 K. pneumoniae 50518740 3,0 x 104/1:100 281 294 303 293 2,9 x 104 K. pneumoniae 50518740 3,0 x 103/1:10 292 315 304 303 3,0 x 103 K. pneumoniae 50518740 3,0 x 102/1:10 30 24 33 29 2,9 x 102
3.3 Antibiotikakänslighetstest
E. coli CCUG17620 var känslig mot både PIP-TAZ och CTX. K. pneumoniae
CCUG54718 var intermediärt känslig mot PIP-TAZ men resistent mot CTX. K.
pneumoniae 50518740 var resistent mot PIP-TAZ och CTX, se sammanställning i tabell
3.
Tabell 3. Sammanställning av hämningszoner av E. coli CCUG17620, K. pneumoniae CCUG54718 och
K. pneumoniae 50518740 utifrån EUCAST definition om bakteriers känslighet mot antibiotika. Känslig
(S), intermediärt känslig (I) och resistent (R).
Antibiotika Bakteriestam Diameter (mm) Resistens (SIR)
Piperacillin-tazobaktam E. coli CCUG17620 26 S K. pneumoniae CCUG54718 18 I K. pneumoniae 50518740 6* R Cefotaxim E. coli CCUG17620 30 S K. pneumoniae CCUG54718 6* R K. pneumoniae 50518740 6* R * Bakterieväxt utan hämningszon.
3.4 Lägsta detektionsgräns av antibiotika med MALDI-TOF MS
I masspektrumet för intakt piperacillin-tazobaktam (PIP-TAZ) med sjunkande
koncentrationer från 2000/250 till 2/0,25 µg/ml kunde intakta masstoppar detekteras för piperacillin på 518, 540 och 562 Dalton (Da) och för tazobaktam på 300 Da ned till en lägsta koncentration på 20/2,5 µg/ml, se figur 4.
Figur 4. Masspektrum över intakt piperacillin-tazobaktam inkuberat i NaCl (0,85%) i tiofaldigt sjunkande koncentrationer, från 2000/250 µg/ml (A), 200/25 µg/ml (B), 20/2,5 µg/ml (C) till 2/0,25 µg/ml (D).
Intensiteten visas i arbitrary units (a.u) på y-axeln och kvoten mellan massa och laddning (m/z) anges på x-axeln motsvarande massenheten Dalton (Da). Lägsta detektionsgräns för piperacillin-tazobaktam var med koncentrationen 20/2,5 µg/ml som återgav masstoppar på 300, 518, 540 och 562 Da, märkta med pilar i figuren (C).
För cefotaxim (CTX) med sjunkande koncentrationer från 500 till 0,5 µg/ml detekterades masstoppar av intakt antibiotika på 456 Da i samtliga angivna koncentrationer. Masstoppar på 396, 478 och 500 Da kunde detekteras vid
koncentrationer ned till 50 µg/ml. Lägsta detektionsgräns för intakt antibiotika var vid 5 µg/ml där masstopparna på 456 och 478 Da detekterades. Masstoppen för hydrolyserat antibiotika på 414 Da detekterades med låg intensitet, arbitrary units (a.u.) i
koncentrationer ned till 50 µg/ml. Masstoppen för intakt CTX på 455 Da kunde inte detekteras, se figur 5.
Figur 5. Masspektra över intakt cefotaxim inkuberat i NaCl (0,85%) i tiofaldigt sjunkande
koncentrationer, från 500 µg/ml (A), 50 µg/ml (B), 5 µg/ml (C) till 0,5 µg/ml (D). På y-axeln anges
intensiteten i arbitrary units (a.u) och på x-axeln visas kvoten mellan massa och laddning (m/z) angivet i enheten Dalton (Da). Masstoppar för intakt cefotaxim identifierades på 456 och 478 Da vid en lägsta koncentration på 5 µg/ml, utmärkta med pilar i figur (C). Hydrolyserat antibiotika med masstoppen 414
3.5 Varierande koncentration antibiotika med konstant bakteriekoncentration Detektion av hydrolyserat PIP-TAZ med tre bakteriekolonier av K. pneumoniae CCUG54718 var vid en lägsta koncentration på 20 µg/ml. Masstoppen på 540 Da för intakt antibiotika försvann vid 20 µg/ml (figur 6). För CTX kunde hydrolys detekteras vid en lägsta koncentration på 5 µg/ml. Ingen hydrolystopp gick att identifiera för CTX däremot en tydlig dekarboxyleringstopp på 370 Da (figur 7).
Figur 6. Masspektrum över piperacillin-tazobaktam (PIP-TAZ) med bakterier inkuberat i NaCl (0,85%). I koncentrationen 20/2,5 µg/ml inkuberades tre bakteriekolonier av β-laktamasnegativa bakteriestammen E.
coli CCUG17629 (A). Den β-laktamaspositiva bakteriestammen K. pneumoniae CCUG54718
inkuberades med tre bakteriekolonier i PIP-TAZ-koncentrationen 20/2,5 µg/ml (B) och 2/0,5 µg/ml (C).
Y-axeln anger intensiteten i arbitrary units (a.u) och x-axeln anger kvoten mellan massa och laddning (m/z), motsvarande massenheten Dalton (Da). Intakt antibiotika detekterades för den β-laktamasnegativa bakteriestammen med en masstopp på 540 Da, märkt med pil i figuren (A). Lägsta detektionsgräns av
hydrolystoppar med den β-laktamaspositiva bakteriestammen var med PIP-TAZ-koncentrationen 20 µg/ml. Masstoppar på 492 och 580 Da är märkta med pilar i figuren (B).
Figur 7. Masspektrum över cefotaxim (CTX) med bakterier inkuberat i NaCl (0,85%). I koncentrationen 5 µg/ml inkuberades tre bakteriekolonier av β-laktamasnegativa bakteriestammen E. coli CCUG17629 (A). Den β-laktamaspositiva bakteriestammen K. pneumoniae CCUG54718 inkuberades med tre
bakteriekolonier i CTX-koncentrationen 5 µg/ml (B) och 0,5 µg/ml (C). Y-axeln anger intensiteten i
arbitrary units (a.u) och x-axeln anger kvoten mellan massa och laddning (m/z), angivet i enheten Dalton (Da). Lägsta detektionsgräns av hydrolys var med en koncentration på 5 µg/ml CTX och identifierades av en dekarboxyleringstopp på 370 Da är märkt med pil i figur (B).
3.6 Konstant koncentration antibiotika med varierande mängd bakterier, försök I Ingen antibiotikahydrolys kunde detekteras för bakteriestammen K. pneumoniae
CCUG54718 med PIP-TAZ 200 µg/ml (figur 8) och CTX 50 µg/ml (figur 9) i bakteriekoncentrationer på 3,0 x 106, 3,0 x 104 och 3,0 x 102 CFU/ml. Ingen skillnad kunde heller observeras av masstoppar med samma koncentrationer från
laktamnegativa bakteriestammen E. coli CCUG17620 i förhållande till
β-laktamaspositiva, K. pneumoniae CCUG54718. Intakt antibiotika kunde detekteras i samtliga bakteriekoncentrationer för både PIP-TAZ och CTX. Antibitotikahydrolys med en massladdning på 414 Da och låg a.u. kunde identifieras för CTX.
Figur 8. Masspektrum över spikad koncentration piperacillin-tazobaktam på 200 µg/ml (A-D), inkuberat
med olika bakteriekoncentrationer. β-laktamasnegativa bakteriestammen E. coli CCUG17629
inkuberades med 3,0 x 106 CFU/ml (A) och 3,0 x 102 CFU/ml (B). β-laktamaspositiva bakteriestammen
K. pneumoniae CCUG54718 inkuberades med bakteriekoncentrationer på 3,0 x 106 CFU/ml (C) och 3,0 x
102 CFU/ml (D). Ingen detektion av antibiotikahydrolys kunde observeras och inte heller någon skillnad i
avseende på närvaro av β-laktamasenzym. Intakt antibiotika detekterades i samtliga
bakteriekoncentrationer (A-D). Intensiteten anges på y-axeln i arbitrary units (a.u) och kvoten mellan
Figur 9. Masspektrum över spikad koncentration cefotaxim 50 på µg/ml (A-D), inkuberat olika
bakteriekoncentrationer. β-laktamasnegativa bakteriestammen E. coli CCUG17629 inkuberades med 3,0 x 106 CFU/ml (A) och 3,0 x 102 CFU/ml (B). β-laktamaspositiva bakteriestammen K. pneumoniae
CCUG54718 inkuberades med bakteriekoncentrationer på 3,0 x 106 CFU/ml (C) och 3,0 x 102 CFU/ml
(D). På y-axeln anges intensiteten i arbitrary units (a.u) och på x-axeln, kvoten mellan massa och
laddning (m/z) angivet i enheten Dalton (Da). Hydrolys av cefotaxim kunde påvisas med masstoppen på 414 Da i låg intensitet för samtliga spektrum (A-D) Intakt cefotaxim påvisades med masstoppar på 456,
478 och 500 Da i samtliga spektrum (A-D). Ingen signifikant skillnad kunde observeras i avseende på
3.6.1 Varierande mängd bakterier i konstant antibiotikakoncentration, försök II Med inkubering av högre bakteriekoncentrationer detekterades förekomst av
hydrolyserat PIP-TAZ och CTX. Hydrolys kunde inte detekteras för vare sig PIP-TAZ eller CTX för de prover med reproducerade koncentrationer (3,0 x 106 och 3,0 x 102 CFU/ml). I bakteriekoncentrationen av tre kolonier/50 µl K. pneumoniae CCUG54718 med PIP-TAZ 200/25 µg/ml detekterades ingen hydrolys- eller dekarboxyleringstopp. Nedbrytningen av tazobaktam påverkades inte av den högre bakteriekoncentrationen. Däremot observeras att intakt piperacillin med en masstopp på 518 Da försvann och således hamnade under detektionsgränsen (figur 10). Med samtliga koncentrationer av
K. pneumoniae 50518740 i PIP-TAZ detekterades intakt antibiotika med masstopparna
300, 518, 540 och 562 Da samt hydrolystoppar av piperacillin på 580 Da. För den högre koncentrationen på tre kolonier/50 µl kunde även dekarboxyleringstoppar på 492 Da och hydrolystoppar på 536 Da detekteras (figur 10).
Med bakteriestammen K. pneumoniae CCUG54718, tre kolonier/50 µl i CTX 500 µg/ml försvann masstopparna på 396 och 500 Da. Hydrolystoppen på 414 Da kunde detekteras med dubbelt så hög a.u mot β-laktamnegativa kontrollstammen. En dekarboxyleringstopp på 370 Da kunde detekteras (figur 11).
Figur 10. Masspektra med spikad koncentration piperacillin-tazobaktam (PIP-TAZ) på 200 µg/ml inkuberat med olika bakteriekoncentrationer. β-laktamasnegativa bakteriestammen E. coli CCUG17620 inkuberades med tre bakteriekolonier/50 µl (A). β-laktamaspositiva bakteriestammen K. pneumoniae
CCUG54718 inkuberades med tre bakteriekolonier/50 µl (B) β-laktamaspositiva bakteriestammen K.
pneumoniae 50518740 inkuberades med tre bakteriekolonier/50 µl (C) och 3,0 x 102 CFU/ml (D). På
y-axeln anges intensiteten i arbitrary units (a.u) och på x-y-axeln, kvoten mellan massa och laddning (m/z) angivet i enheten Dalton (Da). Ingen hydrolys eller dekarboxyleringstopp kunde detekterades för K.
pneumoniae CCUG54718, däremot observerades hydrolys genom att masstoppen av intakt PIP-TAZ på
518 inte gick att detektera, se pilar i figur (B). För K. pneumoniae 50518740 detekterades intakt
antibiotika med hydrolystoppar på 580 Da i alla testade koncentrationer (C-D). För koncentrationen tre
bakteriekolonier/50 µl detekterades en dekarboxyleringstopp på 492 Da och hydrolystoppar på 536 och 580 Da, se pilar i figur (C). Identifierade masstoppar är märkta med pilar i figuren.
Figur 11. Masspektra över spikad koncentration av cefotaxim på 500 µg/ml inkuberat med olika bakteriekoncentrationer. β-laktamnegativa bakteriestammen E. coli CCUG17620 inkuberades med tre bakteriekolonier/50 µl (A) och 3 x 106 CFU/ml (B). β-laktamaspositiva bakteriestammen K. pneumoniae
CCUG54718 inkuberades med tre bakteriekolonier/50 µl (C) och 3,0 x 106 CFU/ml (D). På y-axeln anges
intensiteten i arbitrary units (a.u) och på x-axeln, kvoten mellan massa och laddning (m/z) angivet i enheten Dalton (Da). Med bakteriekoncentrationen på 3,0 x 106 CFU/ml i jämförelse mellan den
β-laktamaspositiva och β-laktamasnegativa bakteriestammen (B och D) kunde ingen skillnad observeras i
avseende på hydrolystoppar och intakt antibiotika. Med β-laktamaspositiva bakteriestammen i koncentrationen tre bakteriekolonier/50 µl gick masstoppen på 500 Da inte att detektera för medan hydrolystoppen på 414 Da ökade i a.u samt att en dekarboxyleringstopp på 370 Da detekterades (C).
3.7 Kvantifiering av piperacillin-tazobaktam och cefotaxim med LC-MS/MS, försök I
Kalibratorer samt hög- och låg kontroll godkändes och låg inom metodens angivna gränsvärden. I kvantifieringen för samtliga analyter saknades tydliga skillnader mellan intakt antibiotika och prover inokulerade med olika bakteriekoncentrationer.
Medelvärdet för triplikat av analyserade prover sammanställdes, se tabell 4. Tabell 4. Analyssammanställning av medelvärdet för prover i triplikat med Liquid Chromatography Tanden Mass Spectrometry, gällande intakt antibiotika (piperacillin, tazobaktam och cefotaxim) och bakterieinokulat med olika koncentrationer (3,0 x 106, 3,0 x 104 och 3,0 x 102) av β-laktamnegativa
stammen E. coli CCUG17620 och β-laktampositiva stammen K. pneumoniae CCUG54718.
Antibiotika Bakterieinokulat
Kvantifierad analyt-mängd
Preparat µg/ml Stam Konc. CFU/ml µg/ml
Piperacillin 20 * * 17,83
Piperacillin 20 E. coli CCUG17620 3,0 x 106 16,31
Piperacillin 20 E. coli CCUG17620 3,0 x 104 16,28
Piperacillin 20 E. coli CCUG17620 3,0 x 102 16,09
Piperacillin 20 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 106 16,29
Piperacillin 20 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 104 16,24
Piperacillin 20 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 102 16,47
Tazobaktam 2,5 * * 1,89
Tazobaktam 2,5 E. coli CCUG17620 3,0 x 106 1,69
Tazobaktam 2,5 E. coli CCUG17620 3,0 x 104 1,73
Tazobaktam 2,5 E. coli CCUG17620 3,0 x 102 1,70
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 106 1,72
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 104 1,73
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 102 1,77
Cefotaxim 50 * * 44,04
Cefotaxim 50 E. coli CCUG17620 3,0 x 106 41,05
Cefotaxim 50 E. coli CCUG17620 3,0 x 104 41,38
Cefotaxim 50 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 106 38,92
Cefotaxim 50 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 104 38,96
Cefotaxim 50 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 102 39,47
3.7.1 Antibiotikakvantifiering med LC-MS/MS, försök II
Kalibratorer samt hög och låg kontroll godkändes då de låg inom metodens angivna gränsvärden. För K. pneumoniae CCUG54718 kvantifierades intakt piperacillin och tazobaktam i samma, högt uppmätta koncentrationer oberoende av
bakteriekoncentration. Med K. pneumoniae 50518749 kvantifierades 10,70 µg/ml piperacillin och 1,38 µg/ml tazobaktam med koncentrationen tre bakteriekolonier/50 µl. I de lägre koncentrationerna bakterier (3,0 x 106 och 3,0 x 102 CFU/ml) uppmättes intakt antibiotika motsvarande ingående inkubationskoncentrationer. För cefotaxim kvantifierades 3,67 µg/ml från bakteriekoncentrationen, tre bakteriekolonier/50 µl av K.
pneumoniae CCUG54718 medan de lägre bakteriekoncentrationerna (3,0 x 106 och 3,0 x 102 CFU/ml) uppmättes till 45,73 respektive 46,42 µg/ml, se sammanställning av kvantifierade data i tabell 5.
Tabell 5. Sammanställning av kvantifierat läkemedel med Liquid Chromatography Tanden Mass
Spectrometry från intakt antibiotika (piperacillin, tazobaktam 20 µg/ml och cefotaxim 50µg/ml) och med inokulat av olika koncentrationer bakterier från laktamnegativa stammen E. coli CCUG17620, β-laktampositiva stammarna K. pneumoniae CCUG54718 och K. pneumoniae 50518749.
Antibiotika Bakterieinokulat
Kvantifierad analyt-mängd
Preparat µg/ml Stam Konc. µg/ml
Piperacillin 20 * * 18,12
Piperacillin 20 E. coli CCUG17620 tre kolonier/50 µl 17,24
Piperacillin 20 E. coli CCUG17620 3,0 x 106 CFU/ml 16,13
Piperacillin 20 E. coli CCUG17620 3,0 x 102 CFU/ml 16,19
Piperacillin 20 K. pneumoniae CCUG54718 tre kolonier/50 µl 16,11
Piperacillin 20 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 106 CFU/ml 15,98
Piperacillin 20 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 102 CFU/ml 16,09
Piperacillin 20 K. pneumoniae 50518749 tre kolonier/50 µl 10,70
Piperacillin 20 K. pneumoniae 50518749 3,0 x 106 CFU/ml 15,93
Piperacillin 20 K. pneumoniae 50518749 3,0 x 102 CFU/ml 15,99
Tazobaktam 2,5 * * 1,97
Tazobaktam 2,5 E. coli CCUG17620 3,0 x 106 CFU/ml 1,76
Tazobaktam 2,5 E. coli CCUG17620 3,0 x 102 CFU/ml 1,74
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae CCUG54718 tre kolonier/50 µl 1,85
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 106 CFU/ml 1,74
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 102 CFU/ml 1,76
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae 50518749 tre kolonier/50 µl 1,38
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae 50518749 3,0 x 106 CFU/ml 1,75
Tazobaktam 2,5 K. pneumoniae 50518749 3,0 x 102 CFU/ml 1,75
Cefotaxim 50 * * 50,34
Cefotaxim 50 E. coli CCUG17620 tre kolonier/50 µl 47,55
Cefotaxim 50 E. coli CCUG17620 3,0 x 106 CFU/ml 45,81
Cefotaxim 50 E. coli CCUG17620 3,0 x 102 CFU/ml 46,01
Cefotaxim 50 K. pneumoniae CCUG54718 tre kolonier/50 µl 3,67
Cefotaxim 50 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 106 CFU/ml 45,73
Cefotaxim 50 K. pneumoniae CCUG54718 3,0 x 102 CFU/ml 46,42
3.8 Analysdata från LC-MS/MS
Kvotberäkningar med tazobaktam/piperacillin av sammanställda data från kvantifieringsanalyser av β-laktamantibiotikat PIP-TAZ in vivo av plasma. Sammanställningen presenteras i avseende på kön, ålder och tid (timmar) mellan
senaste intravenös injektion av piperacillin-tazobaktam och provtagningstillfälle (Tabell 6). Kvotberäkning av kvantifierad mängd PIP-TAZ efter in vitro inkubering á två timmar av intakt PIP-TAZ (20 µg/ml) samt PIP-TAZ (20 µg/ml) inkuberat med bakteriestammarna E. coli CCUG17620, K. pneumoniae CCUG54718 och K.
pneumoniae 50518740.
Tabell 6. Sammanställd data över kvantifierad piperacillin-tazobaktam från analyser utförda med LC-MS/MS mellan perioden från december 2019 och till januari 2020 vid laboratoriet för specialkemi, laboratoriemedicinska kliniken, universitetssjukhuset Örebro. Kvoten över förhållandet
tazobaktam/piperacillin in vivo är beräknad och presenteras i avseende på kön, ålder och provtagningstid efter senaste intravenös injektion. Kvantifierat Intakt piperacillin-tazobaktam samt inkuberat med bakteriestammarna E. coli CCUG17620, K. pneumoniae CCUG54718 och K. pneumoniae 50518740 presenteras efter inkubationstid på två timmar.
Kön/ålder Tid (h) efter iv.
injektion Piperacillin µg/ml Tazobaktam µg/ml Kvot
♀64 8 >100 19 <0,19 ♀64 5 >100 26 <0,26 ♂54 4 73 14 0,19 ♂54 8 27 7,3 0,27 ♂83 6 17 1,8 0,11 ♂61 6 79 7,6 0,10 ♂83 3 43 4,4 0,10 ♂61 * >100 13 <0,13 ♀56 12 >100 2,9 <0,03
Bakteriestam Inkuberingstid Piperacillin
µg/ml Tazobaktam µg/ml Kvot ** 2 18,12 1,97 0,11 E. coli CCUG17620 2 17,24 1,95 0,11 K. pneumoniae CCUG54718 2 16,11 1,85 0,11 K. pneumoniae 50518740 2 10,70 1,38 0,13 * Ej angivet. ** Intakt antibiotika.
4. DISKUSSION
Frågeställningen till studien initierades av att bredspektrumantibiotika rutinmässigt sätts in vid sepsis som ett led i det akuta omhändertagandet av patienten (34). I rutinarbetet på laboratorier för klinisk mikrobiologi utförs en okulär bedömning direkt från
odlingsmedium vid resistensbestämning, vilket kräver en stor mängd bakterier och kan svaras ut tidigast efter två dygn. Nyttoeffekten av laboratoriesvaret kommer initialt inte den enskilda patienten till godo, utan besvarar frågan om varför insatt behandling var verksam eller inte (35). Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) är en metod som används för att följa distributionsvolymen och
elimineringshastigheten hos antibiotikabehandlade patienter som underlag för
dosjustering (36). Den teknologiska utvecklingen av Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), har sedan metoden introducerades för klinisk tillämpning i början på 2010-talet förkortat svarslatensen för artidentifiering av bakterier. I Sparbier et als. studie (23) påvisades antibiotikahydrolys med MALDI-TOF MS, i högre bakteriekoncentrationer än vid karaktäristiska kliniska normalfynd av sepsis, i syfte att bredda metodens användningsområde. Globala svårigheter med resistensutveckling har ökat efterfrågan på snabba- och effektiva behandlingsstyrande metoder.
4.1 Artbestämning och viable count
Artbestämning utfördes vid varje laborativt moment av bakteriestammarnas peptide mass fingerprint (PMF) som förväxlings- och kontaminationskontroll. Turbiditeten i McFarland är en ungefärlig uppskattning av antalet celler i en lösning men tar inte hänsyn till eventuell förekomst av celldöd. Antalet levande bakterieceller visade sig vara representativt efter spädning, då viable count utfördes som kontroll efter varje spädningsserie.
4.2 Optimering av antibiotika- och bakteriekoncentration
Optimerade prover med kliniskt relevanta koncentrationer av piperacillin-tazobaktam (PIP-TAZ) och cefotaxim (CTX), analyserades med MALDI-TOF MS för att bestämma lägsta möjliga detektion. Normal intravenöst administrerad dos i avseende på dess farmakonkinetiska egenskaper, med fokus på distribution och elimination var
utgångspunkten för försöket. 4000/500 µg/ml PIP-TAZ ges var åttonde timma och 1000 µg/ml CTX var 12:e timma. Den fria andelen PIP-TAZ och CTX i plasma motsvarar 60-75% och står i jämvikt med resterande 25-40%, proteinkomplexbundna andel. Maximal plasmakoncentration av PIP-TAZ uppnår 298/34 µg/ml med en halveringstid på 42-72 minuter och för CTX 81-102 µg/ml med en halveringstid på 50-80 minuter. Detektion av intakt PIP-TAZ var möjlig med MALDI-TOF vid en lägsta koncentration på 20/2,5 µg/ml och för CTX på 5 µg/ml. Autohydrolys på 414 Dalton (Da) för CTX kunde detekteras i koncentrationer ned till 50 µg/ml med låg intensitet. Masstoppen på 518 Da för piperacillin och på 500 Da för cefotaxim hade låg intensitet i samtliga koncentrationer och gick inte med säkerhet tolka som antibiotikatoppar vid
koncentrationer på 20 µg/ml respektive 50 µg/ml och tolkades därför som brytpunkten av möjlig detektion för intakt antibiotika med MALDI-TOF MS (7, 9, 22).
Av de varierande koncentrationerna antibiotika som undersöktes, tillsattes en stor mängd (tre bakteriekolonier/50 µl) β-laktamaspositiva respektive β-laktamasnegativa bakterier för att forcera hydrolys av antibiotika och avgöra lägsta detektionsgräns av hydrolys och dekarboxylering med MALDI-TOF MS. Den β-laktamasnegativa
bakteriestammen användes som negativ kontroll för att minimera risken för tolkning av annan interferens än hydrolys. Lägsta detektionsgräns av hydrolys för PIP-TAZ var vid koncentrationen 20 µg/ml. Ingen hydrolys eller dekarboxylering gick att identifiera, därav baserades tolkningen på jämförelse mellan β-laktamasnegativa bakteriestammen som hade tydliga masstoppar av intakt antibiotika, vilka saknades för den
β-laktamaspositiva bakteriestammen. För CTX var lägsta gräns för hydrolysdetektion 5 µg/ml med en tydlig dekarboxyleringstopp på 370 Da (10, 11, 22).
Vid Sepsis är det vanligt med relativt låga bakteriekoncentrationer i blodbanan ≤ 1,5 x 102 CFU/ml. Detektion av bakterier vid blododling med kontinuerlig övervakning kräver en koncentration på omkring 3,0 x 106-8 CFU/ml för att kunna detekteras i avseende på stigande nivåer koldioxid i odlingsmediumet. Mot bakgrund om
normalförhållandet in vivo förväntades detektion av hydrolys in vitro med MALDI-TOF MS vara möjlig inom intervallet 3,0 x 106 till 3,0 x 102 CFU/ml (37).
4.3 Försök I
I resultatet med varierande bakteriekoncentrationer (figur 8, 9) för PIP-TAZ och CTX kunde ingen hydrolys påvisas med MALDI-TOF MS. Metodens krav på matrixlösning höjer tröskelvärdet och sänker sensitiviteten för detektion av metaboliter med låg förekomst, vilket skulle kunna förklara varför eventuella hydrolysmetaboliter från PIP-TAZ och CTX inkuberat med 3,0 x 106 till 3,0 x 102 bakterier inte gick att detektera. Metodjämförelse av lägsta detektionsgräns utfördes mellan MALDI-TOF MS som är en kvalitativ analysmetod och LC-MS/MS, som är en högsensitiv kvantifieringsmetod, genom att simulera plasmaprover (27, 28, 30). En tiofaldigt större koncentration av antibiotika (200 µg/ml PIP-TAZ och 500 µg/ml CTX), laktamaspositiva och β-laktamasnegativa bakterier (3,0 x 106 till 3,0 x 102) än vad som fastställdes som lägsta detektionsgräns med MALDI-TOF MS inkuberades för att kompensera för den spädningsfaktor som uppstår när supernatanten av hydrolysatet adderades till plasma. Resultatet visade sig vara överensstämmande mellan metoderna.
Vid kvantifiering med LC-MS/MS var resultatet för PIP-TAZ (tabell 4) ekvivalent med ingående koncentrationer. För CTX (tabell 4) detekterades en marginellt lägre
koncentration från den laktamaspositiva bakteriestammen i förhållande till den β-laktamasnegativa bakteriestammen vilket gav en inkonklusiv indikation om förekomst av hydrolys. Utifrån antalet replikat och låg skillnad i antibiotikanivån mellan β-laktamaspositiva och den β-laktamasnegativa bakteriestammen kunde resultatet inte med säkerhet tolkas som hydrolys. Inverkan av andra felkällor som slumpmässig normalvariation kan ha bidragit till resultatets utfall.
4.4 Antibiotikakänslighetstest
Bakteriestammen CCUG54718 är fenotypad för enzymuttrycket av CTX-M med hydrolytiska resistensegenskaper av CTX och PIP-TAZ (17). β-laktamasproduktionen är vanligtvis plasmidmedierad från extrakromosomalt kodande, transposabla element, vilket gör det möjligt att en stam av bakterier kan innehålla både β-laktamasnegativa och β-laktamaspositiva bakterier (38). Resultatet kan leda till en svag eller utebliven nedbrytning av antibiotika där en positiv reaktion är att förvänta. Ett
antibiotikakänslighetstest utfördes av bakteriestammarna E. coli CCUG17620 och K.
EUCAST definition om bakteriers känslighet mot antibiotika (SIR) (33) bekräftades att
E. coli CCUG17620 var känslig mot både PIP-TAZ och CTX som förväntat. K.
pneumoniae CCUG54718 var däremot intermediärt känslig mot PIP-TAZ och resistent
mot CTX. Bakteriers effektiva adaptionsförmåga till sin omgivning medför snabb reglering av genexpression under replikationsfasen. När en bakteriestam som tidigare har bekräftats vara laktamaspositiv in vitro odlas om, finns en risk att
β-laktamasnegativa bakterier selekteras fram (38-40) vilket kan vara en möjlig förklaring av resultatet för PIP-TAZ med MALDI-TOF MS och LC-MS/MS. Tromsøstammen K.
pneumoniae 50518740 inkluderades i studien efter utfört antibiotikakänslighetstest som
visade sig vara resistent mot både PIP-TAZ och CTX. 4.5 Försök II
Simulering av plasmaprover reproducerades i ett andra försök med varierad mängd bakterier i konstant antibiotikakoncentration. Bakteriestammen K. pneumoniae 50518740 inkluderades i försöket med PIP-TAZ. Följande slutkoncentrationer av antibiotika (20 µg/ml PIP-TAZ och 50 µg/ml CTX) och bakterier (tre
bakteriekolonier/50 µl, 3,0 x 106 och 3,0 x 102) i plasma testades vid försök II. Med MALDI-TOF MS analyserades tiofaldigt högre koncentrationer av antibiotika och bakterier. Syftet med att höja bakteriekoncentrationen var att erhålla jämförbara resultat från MALDI-TOF MS med resultat från LC-MS/MS. De lägre koncentrationerna inkluderades som verifieringskontroll att metodutförande och resultat från försök I var överensstämmande.
I resultatet från försök II med MALDI-TOF MS kunde svag hydrolys för PIP-TAZ detekteras med K. pneumoniae CCUG54718 i koncentrationen med tre
bakteriekolonier/50 µl. Vid jämförelse från resultatet av optimeringen med bakteriekoncentrationer i PIP-TAZ (figur 6) har β-laktamasproduktionen för K.
pneumoniae CCUG54718 avtagit under studiens framskridande. Med K. pneumoniae
50518740 detekterades tydligt avgränsade hydrolystoppar med koncentrationen tre bakteriekolonier/50 µl, medan hydrolys inte gick att påvisa i de lägre koncentrationerna. För CTX identifierades hydrolys med K. pneumoniae CCUG54718 i koncentrationen tre bakteriekolonier/50 µl. Med LC-MS/MS kvantifierades lägre koncentrationer av intakt antibiotika överensstämmande med resultatet från MALDI-TOF MS.
