Innehållsförteckning Innehållsförteckning... 1

1

Laborationskompendium bakteriologi

Termin 5, Läkarutbildningen, Lunds universitet HT 2020

Innehållsförteckning

Innehållsförteckning ... 1

Säkerhet i laboratoriet ... 1

Åtgärder vid olycksfall ... 2

Syftet med laborationen ... 2

Teori: Bakteriologisk diagnostik ... 3

Påvisning av bakterier med mikroskopi ... 3

Påvisning av bakterie-DNA ... 3

Påvisning av antigen från bakterier ... 4

Odling av bakterier ... 4

Artbestämning ... 4

Är fynden relevanta? ... 5

Resistensbestämning ... 5

Laboration dag 1, del 1: Gramfärgning ... 6

Laboration dag 1, del 2: Urinodling – utodling ... 8

Laboration dag 1, del 3: Övriga odlingar ... 9

Instuderingsfrågor ... 10

Laboration dag 2, del 1: Urinodling – avläsning ... 10

Laboration dag 2, del 2: Övriga odlingar - avläsning ... 11

Säkerhet i laboratoriet

1. Ta en skyddsrock i lämplig storlek. Den skall skydda privata kläder från kontakt med infekterat material och skall bäras väl knäppt och helt skydda ärmarna. Skyddsrocken får inte bäras utanför laboratorielokalen.

2. Händerna hos den laborerande bör inte komma i kontakt med infekterat material. Om så skulle vara fallet ska händerna tvättas med tvållösning följt av en handdesinfektion. Normalt används inte plasthandskar när man arbetar med bakterier. Om man får stänk av bakterier på handskarna känner man det inte och kan omedvetet sprida bakterierna i rummet. Undantag: Vid utsättning

2 av urinproven ska handskar användas. När utsättningen är klar kastas handskarna i den lilla sopsäcken som står på bänken.

3. Undvik att laborationskompendiet kommer i kontakt med smittfarligt material. Laborera inte ovanpå kompendiet.

4. Använt engångsmaterial skall kastas i den lilla sopsäcken som står på bänken.

5. Spills infekterat material, skall detta oskadliggöras med ytdesinfektionsmedel.

6. Efter avslutat arbetsmoment avtorkas arbetsplatsen med ytdesinfektionsmedel.

7. Efter avslutat arbetsmoment tvättas händerna med tvål och vatten. Tvålen sköljs bort grundligt i rinnande vatten, och händerna torkas med pappershandduk. Stäng sedan vattenkranarna med pappershandduken. Därefter sker slutlig handdesinfektion med handdesinfektionsmedel som får lufttorka.

8. I laboratoriet är all form av förtäring förbjuden. Detta inkluderar exempelvis att stoppa pennor i munnen eller att slicka på fingrarna.

9. Sätt upp håret om du har långt hår.

10. Ta av ringar, armband och armbandsklockor 11. Telefoner får inte användas under laborationerna!

Åtgärder vid olycksfall

Kontakta alltid amanuens/assistent.

Sår- och hudskador tvättas noggrant med rinnande vatten och eventuellt med tvål. Rengör därefter med handdesinfektionsmedel. Kemikaliespill på händer saneras genom att man spolar huden med vatten.

Vid stänk i ögonen ska ögonen sköljas med vatten, ögonbad eller fysiologisk koksaltlösning. Gnugga ej!

Syftet med laborationen

Målet med denna laboration är att ni ska få kännedom om grundprinciperna för bakteriologisk diagnostik. Vi vill inte att ni lägger detaljer på minnet. Exakt vilka tester man gör och vilka plattor man använder och hur de fungerar behöver ni alltså inte komma ihåg! Tänk istället på principer för hur man kan artidentifiera en bakterie. T.ex. använder vi snabbtester för detektion av ytantigener, agar med antibiotikatillsats som tillåter växt av vissa grupper av bakterier och agar som ger färgomslag vid växt av vissa bakterier. Vi vill att ni ska se att man faktiskt kan se bakterier, både som enskilda bakterier genom mikroskopi och som kolonier på agarplattor.

3 Vi vill även att ni ska börja fundera på vad svar från mikrobiologiska laboratorier innebär, t.ex.

avseende svar på mikroskopi av blododlingar då man i klinisk vardag får besked om exempelvis grampositiva kocker i klasar. Vi vill även att ni ska få viss insikt i hur man som läkare kan behöva tolka odlingssvar (avseende relevans av de bakterier som växer, kvalitén på provtagningen etc.). Vi vill också belysa vikten av en korrekt ifylld remiss då vi som arbetar med bakteriologisk diagnostik i högsta grad använder oss av den kliniska information som där ska finnas.

Teori: Bakteriologisk diagnostik

Bakteriella infektioner kan påvisas på två principiellt olika sätt:

1: Bakterierna i sig kan påvisas genom att se dem i mikroskopi av provmaterial, genom att odla fram dem, eller genom att detektera deras nukleinsyror eller andra specifika ämnen de producerar.

2: Bakteriella infektioner kan påvisas indirekt genom immunförsvarets reaktion på infektionen, till exempel produktion av specifika antikroppar mot en viss typ av bakterie. Detta kallas serologi och kommer inte att beröras vidare i denna text.

Påvisning av bakterier med mikroskopi

Ibland kan bakterier hittas i direktmikroskopi av provmaterial. För att underlätta vid mikroskoperingen färgas bakterierna oftast och den vanligaste färgningen är Gramfärgning, som utvecklades av dansken Hans Christian Gram år 1884. Indelat enligt denna färgningsmetod finns det så kallat Grampositiva och Gramnegativa bakterier. Man färgar först in bakterierna med ett basiskt färgämne som sedan fixeras med en jodinnehållande lösning (Lugols lösning). Grampositiva bakterier har en så tjock cellvägg med peptidoglykan att detta blå färgkomplex inte avfärgas av alkohol, medan Gramnegativa bakterier som har en tunnare cellvägg avfärgas. När man sedan kontrast-färgar med ett rött färgämne ser de Grampositiva bakterierna blåvioletta ut medan de Gram-negativa ser rosaröda ut.

Cellväggens uppbyggnad är principiellt olika hos Grampositiva och Gramnegativa bakterier och eftersom Gramfärgningen även är nära korrelerad till andra morfologiska och fysiologiska egenskaper hos bakterierna har den fått stor användning vid klassificeringen av dem.

Andra färgningsmetoder finns, exempelvis Ziehl Nielsen-färgning för att identifiera mykobakterier såsom Mycobacterium tuberculosis.

Direktmikroskopi av provmaterial är tidskrävande, sensitiviteten är låg och det är oftast omöjligt att avgöra exakt vilken art av bakterie man ser. Därför utförs direktmikroskopi alltmer sällan, till förmån för andra metoder för direktpåvisning som har utvecklats.

Påvisning av bakterie-DNA

Påvisning av bakteriers DNA sker oftast med hjälp av Polymerase Chain Reaction (PCR), där ett av primer-par avgränsat DNA-avsnitt amplifieras. Oftast används så kallad ”Real-Time PCR”, där förekomsten av amplifierat DNA detekteras samtidigt som PCR-reaktionen pågår. Dessa metoder är i de flesta fall betydligt känsligare än direktmikroskopi och oftast snabbare än odling. Beroende på vilka primers man använder kan man välja att detektera specifika bakteriearter, exempelvis Neisseria menigitidis i cerebrospinalvätska eller Bordetella pertussis i luftvägsprover, eller om man vill leta

4 efter alla typer av bakterier i provet (med så kallat 16S-rDNA PCR). Vissa bakterier, exempelvis Chlamydia trachomatis och Mycoplasma pneumoniae, är på grund av sin intracellulära natur dessutom mycket besvärliga eller tidskrävande att odla fram, och nukleinsyrapåvisning är i de fallen en mycket viktig diagnostisk metod.

Påvisning av antigen från bakterier

I vissa fall kan produkter som frisätts från bakterier användas för att detektera deras förekomst i kroppen, med hjälp av tester som innehåller specifika antikroppar riktade mot produkterna.

Exempelvis kan polysackarid från kapseln hos Streptococcus pneumoniae detekteras i urin med hjälp av ett antigentest hos patienter med pneumokock-pneumoni, liksom ett polysackarid-antigen hos Streptococcus pyogenes i tonsillsekret hos patienter med streptokock-tonsillit.

Odling av bakterier

Bakterier kan odlas på fast medium i petriskålar (ofta kallade plattor) eller i flytande medium (ofta kallat buljong). När prover för odling kommer till ett mikrobiologiskt laboratorium sorteras de efter provmaterial och odlas ut på olika typer av medium. För normalt sterila provmaterial som blod eller likvor kan alla bakteriefynd vara potentiellt relevanta, och man använder därför medium som tillåter växt av så många olika bakterier som möjligt, inklusive anaeroba arter. Dessa typer av prov inkuberas i flera dygn för att även kunna hitta långsamväxande arter. För prover där det normalt finns en stor mängd andra bakterier, såsom avföring, måste man däremot använda medier som är anpassade för att hitta just de få bakteriearter som är relevanta, exempelvis Salmonella, Shigella, Yersinia eller Campylobacter. Detta kan man uppnå exempelvis genom att tillsätta ämnen (antibiotika) som hämmar växt av andra bakterier som finns i provmaterialet, genom att använda ett näringsfattigt medium som utesluter växt av vissa bakterier, eller genom att tillsätta ämnen som ger ett tydligt färgomslag runt kolonier av just den art som man är intresserad av att hitta. Också för många andra provmaterial där det förekommer normalflora, som sår, urinprover och övre luftvägsprover, använder man medier som framförallt är anpassade för att kunna hitta de vanliga patogena bakterierna i respektive lokal och för att genom ett typiskt utseende (färg, form) av kolonierna kunna hjälpa till med att identifiera arten. I en normal urinodling hittar man exempelvis aldrig obligat anaeroba bakterier, eftersom plattorna inte inkuberas anaerobt.

Artbestämning

När bakterier som man tror är relevanta växer fram i en odling, måste de artbestämmas. Oftast kan bakteriernas utseende på ett medium ge en bra uppfattning om ungefär vilken grupp av bakterier det handlar om, exempelvis en zon av betahemolys runt betahemolytiska streptokocker som växer på en blodagarplatta. Kromogena medier såsom ”uriselect” används ofta: de ger olika färg på bakteriekolonierna genom att ämnen i plattan spjälkas till olika färgämnen av olika bakteriearter.

Ofta krävs utöver utseendet på medierna ytterligare tester för att ge en säker artbestämning, exempelvis snabba tester för att avgöra om en bakterie kan bryta ned vissa aminosyror eller om en stafylokock har koagulas-aktivitet (som Staphylococcus aureus).

Sedan 2010-talet har man alltmer börjat förlita sig till masspektrometri av typen MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight) för artbestämning av bakterier: framväxta bakteriekolonier stryks ut på en metallplatta och behandlas med matrix-lösning. När plattan förs in i MALDI-TOF instrumentet befinner den sig i ett vakumrör. Ytan med bakterier beskjuts med laser, som joniserar proteinfragment från bakterien och får dem att accelerera över ett spänningsfält, mot en detektor i andra änden av vakuumröret. Från tiden det tar för de olika molekylerna att färdas genom röret, kan man beräkna deras massa. Det masspektrum som uppstår kan genom ett program jämföras mot ett bibliotek av masspektra från tusentals olika bakteriearter och -stammar. Man får då

5 ett svar för med vilken sannolikhet ett bakterieisolat tillhör en viss art. Metoden är mycket snabb, enkel att använda och billig i jämförelse med tidigare metoder för artidentidentifiering.

Är fynden relevanta?

Beroende på i vilken typ av provmaterial man har hittat bakterierna, försöker man att avgöra hur relevanta de är för patientens symptom. Exempelvis koagulasnegativa stafylokocker (KNS) i ytliga sår anses oftast som irrelevanta fynd och de visas inte ut i svaret på odlingen, medan betahemolytiska streptokocker i samma sår alltid svaras ut. Laboratoriet kan inte alltid avgöra om fyndet har klinisk relevans. För att underlätta laboratoriets relevansbedömning och ambitionsnivå är uppgifter om patientens sjukdomshistoria (anamnes) viktiga. Det är viktigt att specificera vilken provlokal det handlar om: är det ett prov från ett ytligt sår på benet, eller från ett djupt operationssår intrakraniellt? Ibland är detta oklart för laboratoriet eftersom det inte står något på remissen. Ett fynd av KNS i det förra är irrelevant, medan samma fynd i det senare är relevant. Vilka symptom har patienten? Om patienten är immunsupprimerad kan det också påverka om fynden bedöms som relevanta och svaras ut samt får gå vidare för resistensbestämning.

Det är dock alltid den behandlande läkaren, som har patientens hela sjukdomshistoria, som avgör om fyndet som svaras ut från laboratoriet är relevant för sjukdomen eller inte.

Resistensbestämning

Ett allvarligt problem vid antibiotikaterapi är att en infekterande bakterie kan vara resistent eller kan utveckla resistens mot ett eller flera preparat, så att preparaten blir verkningslösa. Redan några månader efter att ett nytt preparat introducerats på marknaden kan resistenta mikroorganismer påträffas. Somliga arter har även naturlig resistens mot vissa grupper av antibiotika, alltså att inga bakterier av den arten är känsliga för medlet, jämfört med förvärvad resistens. Bakteriers känslighet för antibiotika brukar i skrift anges med förkortningarna S (= känslig för preparatet vid normal exponering/dosering), I (= känslig för preparatet vid högre exponering/dosering) samt R (= resistent för preparatet).

Man kan bestämma bakteriernas resistensförhållanden mot antibiotika med två olika fenotypiska metoder, spädningstest eller diskdiffusion. Utöver dessa kan man i vissa fall påvisa gener för specifika resistensmekanismer.

Spädningstest

Utförs genom spädning av den verksamma substansen i flytande eller fast medium, varefter den mikroorganism som skall testas tillsätts. Efter inkubering ett dygn i 37°C kan man iaktta gränsen mellan växt och ickeväxt av bakterier. Resistensen anges efter minsta nödvändiga koncentration av medlet som hämmar tillväxt (MIC = Minimal inhibitory concentration). MIC-bestämning kan också göras på fasta medier med hjälp av så kallade E-testremsor, vilka innehåller en gradient av ett antibiotikum. MIC-värdet läses då av vid den punkt där bakterierna klarar av att växa ända in till den graderade remsan.

Diskdiffusion

Den andra metoden baserar sig på diffusion i agar av medlet från en lapp innehållande den verksamma substansen. Koncentrationen avtar ju längre bort man kommer från lappen. Efter att bakterierna har vuxit fram erhålls hämningszoner av olika storlek kring lappen. Zonernas storlek beror på vilken nivå av resistens den testade bakterien har mot medlet. Genom tidigare testning av stora mängder bakterieisolat har man kunnat utarbeta standardtabeller som gör det möjligt att

6 korrelera en diffusionszons diameter till nivån av antibiotikakänslighet för enskilda kliniska bakterieisolat. Gränsvärdena för resistens är artrelaterade och är även bestämda med hänsyn till dosering. Diffusionstesterna med diskar gör det möjligt att pröva en bakterie mot flera olika antibiotika med användande av endast en agarplatta.

Laboration dag 1, del 1: Gramfärgning

Vid mikroskopi av Gramfärgade preparat bedömer man om bakterierna är Gramnegativa eller Grampositiva, bakteriernas form (sfäriska bakterier = kocker, avlånga bakterier = stavar) och i viss mån storlek (främst för Grampositiva stavar), samt för Grampositiva kocker om de ligger separat eller om de är grupperade i kedjor, i par, eller i klasar.

Generellt delas bakterier efter mikroskopi in i någon av grupperna nedan:

Grampositiva kocker: i kedjor eller diplokocker (par) = troligen streptokocker eller enterokocker.

i klasar = troligen stafylokocker (eller närbesläktade arter).

Gramnegativa kocker: ovanligt, t.ex Neisseria-arter. Delas allmänt ej in i klasar eller kedjor.

Gramnegativa stavar: t.ex. Enterobacterales-arter som Escherichia coli.

Grampositiva stavar: t.ex. Clostridie-arter eller Corynebakterie-arter.

Exempel på hur det kan se ut i gramfärgning från blododlingsflaska:

Gramnegativa stavar (Klebsiella) Gramnegativa kocker (Meningokocker)

7

Material Mikroskop Immersionsolja

Gramfärgade preparat på objektglas.

Utförande

Använd endast objektivet märkt 100x och med en svart ring längst ned - det är avsett att användas med immersionsolja. Placera en droppe immersionsolja på objektglaset. Justera höjden på plattan som håller objektglaset tills objektivet kommit ned i oljedroppen. Leta sedan efter fokus.

Grampositiva kocker i kedjor (Streptokocker)

Grampositiva kocker i klasar (Stafylokocker)

Grampositiva stavar (Listeria)

8 Notera vad du ser i de olika preparaten:

Preparat Gram +/- Form: stav? kock? annat? Gruppering: kedjor? klasar?

(gäller främst G+ kocker) 1

2 3

Vilka vanliga patogena bakterier skulle det kunna vara som har färgats?

Genomgång av resultat sker under laborationen.

Laboration dag 1, del 2: Urinodling – utodling

Vanliga bakterier som orsakar urinvägsinfektion hos i övrigt friska kvinnor är Escherichia coli och Staphylococcus saprophyticus – dessa bakterier kallas primärpatogener. Även vid komplicerade urinvägsinfektioner är E. coli vanligast, men även Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae och flera andra arter förekommer och de kallas sekundärpatogener.

Urinodlingar kan förorenas av bakterier som lever vid urethras mynning och för att bli av med denna kontamination ska "mittstråleprov" alltid eftersträvas. Urinprovet förvaras sedan kylt för att hindra tillväxt av de bakterier som finns i urinen. Vid odling av urin bedöms på laboratoriet förutom arten eller arterna som växer, även deras koncentration i urinen. Detta görs i enheten Colony forming units/liter (CFU/L). Vid utsättning av urinprovet tas 10 µl urin till plattan och genom att räkna antalet kolonier kan antal CFU/L beräknas. Vid urinodling gör man ofta resistensbestämning direkt, genom att urinen också stryks ut på en agarplatta där antibiotikadiskar placeras.

Material

Urinprover – 2 olika prover per grupp (sifferkod) Plastinöser 10 µl (blå).

Bomullspinnar

Delade plattor uriselect/CNA (URI/CNA) Hela plattor Müller-Hinton (MH)

Antibiotikadiskar i "hackare": Ampicillin - AMP, mecillinam - MEL, cefadroxil - CFR, nitrofurantoin - F, ciprofloxacin - CIP, trimetoprim - W.

Utförande

Använd handskar vid hantering av urinproverna.

1. Märk plattorna med namn och provnummer. För varje prov ska en uriselect/CNA och en MH- platta användas.

2. Skaka urinproverna försiktigt.

3. Doppa ner en blå (10 μl) plastinös i röret. Se till att filmen som bildas i öglan finns med när plastinösen tas upp ur röret.

9 4. Ta upp och håll uriselect/CNA-plattan (den vit-röda) i handen. Lägg an plastinösen och låt urinen bilda ett tjockt streck (se A i figuren ovan) på URI-halvan (den vita). Sprid sedan ut urinen tätt över hela URI-halvan (enligt B i figuren ovan). Börja längst upp och gå nedåt, och låt det om möjligt bli glesare mot slutet av stryket.

5. Upprepa punkt 3 och 4 på CNA-halvan (den röda) av plattan.

6. För resistensbestämningen doppas en steril bomullspinne i urinprovet.

7. Stryk ett kryss på resistensplattan (MH, den genomskinliga) med den fuktade bomullspinnen (se figur ovan).

8. Stryk sedan bomullspinnen tätt fram och tillbaka över hela plattan. Rotera pinnen mellan fingrarna under stryket. Målet är att försöka täcka så stor del av plattan som möjligt.

9. Upprepa dessa steg med alla prover gruppen ska analysera.

10. När resistensplattorna torkat (ca 1 min) appliceras antibiotikalappar på varje platta med

”hackaren” (görs av amanuenserna).

11. Plattorna kommer att inkuberas övernatt vid 37^oC i luft.

Laboration dag 1, del 3: Övriga odlingar

I denna del av laborationen delas plattor ut, där provmaterial har strukits ut dagen innan, på liknande sätt som vid utsättning av urinodlingar. Ni får remisser till varje prov, där anamnes och provmaterial finns nedskrivet. De bakterier som har vuxit fram har redan Gramfärgats på glas.

Material

Objektglas med Gramfärgade bakterier Agarplattor med framvuxna bakterier Mikroskop

Immersionsolja

Schema för artbestämning av bakterier

10 Utförande

Det är er uppgift att för varje prov mikroskopera de framvuxna bakterierna samt studera kolonierna som växer på plattorna. Vad ser ni vid mikroskopin? Vad ser ni på plattan? Vilka bakterier skulle man kunna förvänta sig att hitta i de olika proverna givet provmaterial och anamnes? Hur skulle ni vilja gå vidare för att artbestämma bakterierna enligt schemat för artbestämning (t.ex. möjliga snabbtester, användande av selektiva eller differentierande tillväxtmedier/plattor)?

Provnummer (bokstav)

Gramfärgning samt utseende på plattan

Vilka bakterier skulle det kunna vara?

Metod/tester för artbestämning

Vid nästa laborationstillfälle kommer artbestämningen att utföras. Inför detta ska ni gå igenom och besvara följande instuderingsfrågor. Det går också bra att gå igenom instuderingsfrågorna före den första laborationsdagen.

Instuderingsfrågor

1. Vilka bakterier är alltid relevanta patogener i en urinodling? Hur ska man bedöma fynd av bakterier i urin tagen från en urinkateter (KAD)?

2. Ge två exempel på bakterier som är relevanta patogener i en sårodling. Ge också två exempel på bakterier som kan förekomma som en del av normalfloran i en sårodling.

3. Vilka bakterier kan vara relevanta i en svalgodling? Vilka kan vara en del av normalfloran?

4. Vilka är de viktigaste meningitagens i olika åldersgrupper?

Laboration dag 2, del 1: Övriga odlingar - avläsning

De olika bakterierna från dag 1, del 3 har nu strukits ut på plattor som ska hjälpa till i artbestämningen.

Material

Anteckningar från förra laborationstillfället Agarplattor med framvuxna bakterier Plastinöser (vita 1µl)

Objektglas

11 Väteperoxid 3 % för att testa katalas-aktivitet (finns hos amanuenserna)

Pastorex - Staph-plus, ett reagens för artbestämning av Staphylococcus aureus (finns hos amanuenserna)

Utförande

Artbestäm bakterierna med hjälp av resultaten från gramfärgningen, snabbtester och schemat för artbestämning av bakterier. Be någon av assistenterna om hjälp om ni vill utföra något av snabbtesterna:

Väteperoxid används för att testa om bakterierna producerar katalas, ett enzym som omvandlar väteperoxid till vatten och syrgas. En droppe väteperoxid placeras på ett objektglas och en bakteriekoloni rörs ut i droppen med en plastinös. Kraftig gasutveckling sker vid positiv reaktion.

Pastorex Staph-plus är ett så kallat latex-agglutinationstest där små färgade latexkulor binder till clumping factor, protein A och kapselpolysackarider från S. aureus och som därför agglutinerar till stora komplex när de blandas med denna bakterie. Ur den jämnt rödfärgade vätskan fälls då synliga röda aggregat ut. Vid testning av koagulasnegativa stafylokocker (KNS) sker ingen reaktion.

Fyll i vilka arter ni hittat i varje prov.

Provnummer (bokstav)

Utfall av biokemiska tester samt odling på selektiva plattor

Bakterieart

Efter laborationen följer genomgång av resultaten och diskussion i helgrupp.

Laboration dag 2, del 2: Urinodling – avläsning

Material

Agarplattor med framvuxna bakterier Plastinöser (vita)

Filterpapper indränkta i lösningar för test av oxidas och indol. Förvaras i petriskålar för att förhindra att de torkar ut.

Utförande

De agarplattor ni igår strök ut urinproven på har nu inkberats i 37°C i luft över natten. Er uppgift är nu att artbestämma de framvuxna bakterierna genom att följa schemat för artbestämning av bakterier. Till er hjälp har ni först den delade plattan: Den vita halvan - uriselect, är ett kromogent medium där många bakteriearter får en typisk färg. Den röda halvan - CNA, innehåller colistin och nalidixinsyra. Dessa antibiotika är främst verksamma mot Gramnegativa bakterier och alltså växer främst Grampositiva bakterier på CNA (eller ibland ovanligt resistenta gramnegativa bakterier).

12 Genom att jämföra hur mycket som växer på de båda halvorna kan ni ofta avgöra om bakterien är gramnegativ eller grampositiv. På CNA-halvan kan ni också se eventuell betahemolys.

Ni kan också använda er av snabbtest för att hjälpa er framåt i artbestämningen. Oxidas och indol används i princip uteslutande på Gramnegativa bakterier och testas genom att en liten mängd bakterier tas upp med en plastinös och gnuggas mot filterpappret. Vid positiv reaktion sker färgomslag till blått på pappret. Vid negativt resultat ses inget färgomslag.

Oxidastestet påvisar förekomst av cytokrom c-oxidas, ett enzym som finns hos aeroba bakterier som utvinner energi genom oxidation med hjälp av syrgas.

Indoltestet påvisar om bakterien har ett enzym som bryter ned tryptofan till indol.

Ni kan också titta på resistensplattorna till varje prov. Normalt sätt mäter man diametern på den zon som uppstår runt antibiotikadiskarna och jämför värdet med en tabell för att se om stammen är S, I eller R. I denna laboration gör vi en grövre bedömning – växer bakterierna ända in till disken eller inte? Resistensmönstret kan också ge en vägledning avseende vilken art det rör sig om.

För in resultat av artbestämning samt eventuella kommentarer om resistens i tabellen nedan.

Provnummer Art Kommentarer om

resistensmönster

13

Schema för artbestämning: Gramnegativa stavar

Art Uriselect Oxidas Indol Övrigt

Escherichia coli

- +

Proteus mirabilis

- -

Klebsiella

pneumoniae*

- -

Pseudomonas

aeruginosa

+ (-)

Testas vanligen ej

Grön på resistens-platta.

Aromatisk doft

Haemophilus

influenzae Ingen växt

+

Långsamt omslag

Testas ej Växer ej på blod, endast hematin Små gramnegativa stavar

14

Schema för artbestämning: Grampositiva kocker

Art Gramfärgning Blodagar / CNA Katalas Övrigt Utseende på olika

medier

Utseende på olika medier

Staphylococcus

aureus Klasar gul / gulvit

+

Pastorex: +

Staf-C

Blod

Koagulasnegativa

stafylokocker (KNS) Klasar gulvit / vit

+

Pastorex: -

Staf-C (varierar)

Blod (varierar)

Staphylococcus

saprophyticus Klasar Vit

+

Uriselect

15

Art Gramfärgning Blodagar / CNA Katalas Övrigt Utseende på olika

medier

Utseende på olika medier

Streptococcus pyogenes

Runda kocker i kedjor

Stor betahemolys, kupiga kolonier Kolonier ibland hårda, flyttbara

-

Blod Genomlyst

Streptococcus agalactiae (GBS)

Avlånga eller runda kocker i kedjor

Smal zon med

betahemolys.

-

Streptex: B+

CNA Uriselect

Streptococcus pneumoniae

Avlånga eller runda kocker i par (diplokocker) eller

kedjor

Alfahemolys (grön) Slemmiga eller

navlade kolonier

-

optochin-disk (opt) Växer ej på CAA-agar

Blod

Alfa-streptokocker

Avlånga eller runda kocker i par eller

kedjor

Alfahemolys (grön),

eller ingen hemolys.

-

Se Streptococcus pneumoniae ovan

16

Art Gramfärgning Blodagar / CNA Katalas Övrigt Utseende på olika

medier

Utseende på olika medier

Enterococcus faecalis

Avlånga eller runda kocker i par eller

kedjor

Gråaktiga. Kan ha smal zon av

betahemolys

-

Växer på CAA-agar utan färgomslag

CNA Uriselect

Enterococcus faecium

Avlånga eller runda kocker i par eller

kedjor

Gråaktiga. Ofta alfa-

hemolys (grön)

-

Blå på uriselect.

Växer på CAA-agar med färgomslag till

gult

CNA Uriselect