• No results found

Heterologous expression and purification of Saprolegnia parasitica Cellulose synthase

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2021

Share "Heterologous expression and purification of Saprolegnia parasitica Cellulose synthase"

Copied!
3
0
0

Loading.... (view fulltext now)

Full text

(1)

IN

DEGREE PROJECT BIOTECHNOLOGY, SECOND CYCLE, 30 CREDITS

,

STOCKHOLM SWEDEN 2020

Heterologous expression and

purification of Saprolegnia

parasitica Cellulose synthase

ULRIKA VON OTTER

KTH ROYAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY

(2)

1

Abstract

The oomycete Saprolegnia parasitica is a pathogen that infects mainly wild fish and cultivated fish, causing severe losses in the fish industry every year. Aquacultured fishes exists worldwide and constitutes an important food source for humans ever since overfishing started. Previously used methods for controlling pathogenic infections e.g. malachite green, has been proven non safe. It is today crucial to find an environmentally friendly method for controlling pathogenic infection such as saprolegniosis. One of six identified cellulose synthases in S. parasitica (SpCesA3.1) is highly expressed in the hyphal cell walls and therefore suggested as a potential target as drug control for saprolegniosis. To enable characterization of the structure and function of SpCesA3.1, it needs to be purified in its catalytically active full-lengths form. The aim of this project was to test a method for

heterologous expression, solubilization and purification of SpCesA3.1. The expected project outcome was an optimized protocol for the purification of membrane protein SpCesA3.1 in its catalytically active form. Solubilization and purification of SpCesA3.1 was assessed

experimentally, using detergent n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) as a solubilization agent and IMAC with preequilibrated Ni-NTA His•Bind® Resin protein purification. Experiments resulted in successful heterologous expressions in yeast strain LoGSA and FGY217,

transformed with pDD-8HIS-GFP-SpCesA3 plasmid. However, there was a negative purification of SpCesA3.1. Results were compared to previous research and a protocol on how to proceed with the optimization of solubilization and purification of SpCesA3.1 is presented here. It is proposed that the presented protocol is applied in further research on this subject.

Abstrakt

Oomyceten Saprolegnia parasitica är en fisk patogen som huvudsakligen infekterar vild fisk och odlad fisk, vilket orsakar allvarliga förluster för fiskindustrin varje år. Fiskodlingar finns över hela världen och utgör en av de viktigaste producenterna för fisk, ända sedan överfiske blev ett problem. Tidigare använda metoder för att kontrollera infektioner orsakade av patogen är malakitgrön, som har visat sig vara en hälsorisk. Det är idag avgörande att hitta miljövänliga metoder för att kontrollera saprolegniosis. En av sex identifierade

cellulosasyntaser i S. parasitica är SpCesA3.1, som uttrycks starkt i de hyfala cellväggarna och har därför föreslagits som ett potentiellt mål för läkemedelskontroll för saprolegniosis. För att kunna karakterisera struktur och funktion hos SpCesA3.1 måste proteinet renas fram i sin katalytiskt aktiva form. Målet med detta projekt var att testa en metod för att heterologt uttrycka, solubilisera och rena fram proteinet SpCesA3.1. Den förväntade slutprodukten var ett optimerat protokoll. Solubilisering och rening av SpCesA3.1 utvärderades experimentellt, där n-Dodecyl-B-D-Maltoside (DDM) användes som solubiliseringsmedel och IMAC för proteinrening. I detta projekt så lyckades SpCesA3.1 uttryckas heterologt i jäst celler från

Saccharomyces cerevisiae LoGSA och FGY217, men proteinet lyckades inte renas fram. Ett

protokoll med förslag på hur projektet ska fortgå presenteras här som en del av uppnådda slutsatser.

Key words

Saprolegnia parasitica | Cellulose synthase SpCesA3.1 | Saposin A | DDM | heterologous

(3)

References

Related documents

Svetta schalottenlök i smör tillsammans med kantareller, häll på grädde och låt koka ihop till simmig

1.) Identification and characterisation of the 2,3-oxidosqualene cyclase enzyme, which produces the key sterol intermediate of the sterol synthesising oomycete S. 2.) Use

Vid jämförelse med friska hanar kan den dock ha sämre förutsättning för fortplantning, till exempel på grund av att feminiseringen leder till minskning av sekundära

• Producera klimatsmart, miljövänlig och hållbar fisk med fokus på miljö, kvalitet och regional hållbar utveckling.. Fisk

Påståenden och antal svar: ”Vildfångad fisk är nyttigare än odlad fisk” (n=1 581), ”Odlad fisk har bättre kvalitet än vildfångad fisk” (n=1 570), ”Att äta odlad

Lokaliseringsorten för Ålands fiskodling vid Guttorp gård i Sund valdes för att man hade tillgång till både sött vatten från Östra Kyrksundet och saltvatten från

Fågel, fisk eller...

De två fiskarna Lennart Kjellberg och Ove Ahlström och deras bolag Fiskeri AB Nordic respektive Fiskeri AB Ganthi är åtalade för att under perioden april 2007 till och med maj