Examensarbete, 15 hp
Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2020
Kvantitativ-PCR för analys av atypiska patogener vid
samhällsförvärvad pneumoni
Stina Sjölund
Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk analytikerprogrammet
Examensarbete, 15 hp
Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson ylva.hedberg.fransson@umu.se
Läraropponent:
Mari Norgren
Examinator:
Ylva Hedberg Fransson
Datum för godkännande:
2020 06 16
Analysis of Atypical Pathogens Causing Community-Acquired Pneumonia by Quantitative PCR
Handledare
Johanna Keskitalo, Kliniskt mikrobiologiskt laboratorium, Sunderby sjukhus
3
Abstrakt
Pneumoni är en vanlig dödsorsak runt om i världen och samhällsförvärvad pneumoni (SFP) representerar majoriteten av alla pneumoni-fall. De atypiska patogenerna, däribland Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae och Legionella pneumophila kan orsaka 15-20% av all SFP och kan dessutom orsaka extrapulmonära infektionssjukdomar. Bakterierna är svårodlade och det krävs en annan antibiotikabehandling än för typiska patogener vilket gör att en korrekt diagnos är viktig.
Syftet var att undersöka om analys med kommersiell kvantitativ multiplex-PCR (mqPCR) skulle kunna påvisa atypiska patogener vid samhällsförvärvade pneumonier. Genom att använda svalgprover och kvantitativ PCR (qPCR) med fluorescerande prober kan mängden av den valda sekvensen detekteras efter ett antal amplifieringscykler. Resistens mot makrolidantibiotika har rapporterats i M.
pneumoniae och L. pneumophila vilket försvårar behandlingen av dessa patogener samt gör dem ännu viktigare att diagnostisera. De alternativa metoderna serologi och urinantigentest har nackdelar som gör det svårt att diagnostisera dessa tre patogener samtidigt. Metoden qPCR är känslig och specifik samt minskar tiden innan diagnostisering och i multiplex-format minskar provmängden som behövs.
Asymtomatiskt bärande kan dock i vissa fall försvåra diagnostik med denna metod. Konklusionen av arbetet var att kommersiell mqPCR bör vara en lämplig metod för att analysera de atypiska
patogenerna vid diagnostik av samhällsförvärvad pneumoni.
Introduktion
Samhällsförvärvad pneumoni
Pneumoni är en vanlig dödsorsak i världen, framförallt bland barn och äldre (1, 2). Typen av pneumoni som orsakas utan ett samband med vård eller behandling kallas för samhällsförvärvad pneumoni (SFP) och den står för ca 78,8% av alla pneumoni-fall som har en årlig incidens på mellan 1,6 och 10,8 per 1 000 vuxna varje år i Europa (3). Svårighetsgraden av SFP är främst relaterad till underliggande immun-status och hjärtfunktion hos värden. Mortaliteten i Sverige rapporteras vara 0,5-6% (4, 5).
Atypisk pneumoni
Termen atypisk pneumoni innebär infektioner i de nedre luftvägarna på grund av specifika zoonotiska eller icke-zoonotiska patogener som bland annat Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae och arter av familjen Legionella. Virus tillhör inte denna grupp utan klassas som viral SFP. Atypiska pneumonier utgör ungefär 15-20% av all SFP och är för det mesta sporadiskt förekommande utbrott (4, 6). Dessa atypiska patogener kan även orsaka vårdrelaterad infektion, men detta är ovanligt.
Typiska patogener som Streptococcus pneumoniae är ofta begränsade till infektion i lungorna, medan varje atypisk patogen även har en benägenhet till infektion i vissa extrapulmonala organsystem. Det betyder att atypiska patogener kan orsaka systemisk infektionssjukdom med en lungkomponent, det vill säga pneumoni. Betydelsen av de atypiska pneumonierna är inte baserade på deras kliniska
incidens i sig, vilket i sig är viktigt, utan snarare på andra kliniska- och folkhälsoaspekter. De kräver en annan typ av terapeutisk strategi än för typisk SFP då många av dessa bakterier inte har cellvägg och vissa är intracellulära. De atypiska patogenerna är dessutom svåra att odla eller till och med farliga att isolera (4).
Mycoplasma pneumoniae
M. pneumoniae är en av de minsta självreplikerande prokaryota patogenerna och den saknar en typisk cellvägg som många andra prokaryoter har. För underhåll av sin membranintegritet och funktion samt för tillväxt så krävs kolesterol (7). Mycoplasma pneumoniae växer mycket långsamt och vid vidhäft- ning av bakteriens membran till värdcellens membran så möjliggör avsaknaden av cellvägg ett utbyte av olika komponenter mellan dessa (8, 9). Släktet Mykoplasma är kända för att vara extracellulära, men man har ibland upptäckt intakta bakterier i cytoplasman av humana celler och bevis på att de är kapabla till att replikera samt överleva länge intracellulärt (10). Cytoadherens är det enda av M.
pneumoniae virulensegenskaper som har utretts och de händelser i patogenesen som följer
adhereringen är inte klarlagd då inga klassiska toxinliknande aktiviteter har uppvisats av de produkter som bakterien producerar. Infektionsförloppet tros snarare bero på värdens immun- och
inflammatoriska svar än cytopatologiska effekter från cellkomponenter hos patogenen (7).
Vidhäftning av bakterien till luftvägsepitelet är en avgörande händelse för initieringen av infektion och patogenesen av M. pneumoniae då mutanter utan denna virulensmekanism är avirulenta och
dessutom har mycket svårt att överleva (11, 12). Ett protein som ger bakterien möjlighet för adherens till värdceller är P1, som är lokaliserat på spetsen av M. pneumoniaes pili (11).
M. pneumoniae orsakar 20-50% av SFP och utbrott av pneumoni-infektioner orsakade av denna bakterie sker med 3-7 års intervall, men den kan även orsaka andra infektioner i luftvägarna som thracheobronkit, bronkiolit, bronkit och faryngit (6 - 8, 13, 14). Utbrotten sker ofta i fängelser, sjukhus, skolor samt på andra ställen i samhället där många vistas samtidigt, intervallerna sker eftersom nya subtyper introduceras och att flockimmunitet avtar (13). Infektionerna uppstår ofta bland barn som är i skolåldern samt unga vuxna och inkubationstiden för en infektion är 1-2 veckor innan kliniska symtom uppvisas (7, 14).
Symtomen av infektioner med M. pneumoniae är ofta milda, asymtomatiska och självbegränsande, vilket gör att många inte behöver uppsöka sjukhusvård, men ungefär 1-5% av de drabbade behöver sjukhusvård (13). Infektionen kan leda till att de drabbade utvecklar allvarliga extrapulmonära sjukdomar som encefalit eller andra manifestationer i CNS, leder, njurar, pancreas, skelettmuskler samt dermatologiska, hematopoetiska och kardiovaskulära syndrom. Bakterien har även kopplats till allvarliga multiorgan-sjukdomar (6, 7, 13, 15). Odling av M. pneumoniae är svårt och bakterien växer mycket långsamt vid isolering på platta eller buljong och kräver 10-21 dagar för att tillväxa, vilket riskerar att diagnostisering samt behandling blir försenad (7).
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia pneumoniae är en obligat intracellulär bakterie som genomgår en tvåfasig livscykel i värden, nämligen som både elementärkropp (EB) och retikulärkropp (RB) (6, 16). Dessa två former har olika funktioner. Formen EB infekterar värdcellen genom att fästa vid och komma in i cellen via endocytos där den sedan utvecklas till en RB. Den senare är en icke-infektiös metaboliskt aktiv form som kan replikera inom icke-lysomala inklusioner i cellen för att sedan forma nya EBs som släpps ut från cellen (16). Bakterien tar sig ur värdcellen genom att lysera cellen eller genom extrudering, det vill säga utstötning av C. pneumoniae-inlagringen genom att cellmembranet sträcks ut och sedan knoppar av inlagringen. Den första metoden är destruktiv och slutar med att värdcellen dör, medan den andra metoden lämnar cellen intakt. Båda dessa metoder har ungefär samma frekvens i C. pneumoniae infektioner (17).
De celltyper som C. pneumoniae föredrar att infektera är lung-epitelceller eller alveolära makrofager som sedan sprider patogenen till immunceller som infiltrerar den infekterade cellen. C. pneumoniae har flera antigen som aktiverar det medfödda immunförsvaret som i sin tur startar inflammation.
Antigenen som gör detta finns på yttermembranet av EB och exempel på dessa är heat-shock protein 60 samt yttermembranprotein A (OmpA) (16). Tillväxten av C. pneumoniae förbättras vid låga syrekoncentrationer som är ett resultat av inducerad inflammation och proliferation till följd av bakterier i cellen. Hypoxi anses därför som en förvärrande faktor för infektion av C. pneumoniae då det leder till ökad inflammation och vävnadsfibros, vilket i sin tur leder till bättre tillväxt av bakterier.
C. pneumoniae är anpassad till hypoxiska tillstånd och det tros ha en betydande inverkan på inflammatoriska svar inducerade av infektionen (18). Bakterien sprids från människa till människa
och är en orsak till akuta luftvägssjukdomar, inklusive sinusit, faryngit, bronkit samt pneumoni (6).
Enligt studier beräknas C. pneumoniae orsaka allt från 10% upp till 15% av SFP (6, 19). Infektionen med C. pneumoniae kan uppstå samtidigt med andra patogener, vilket kan ge en annorlunda klinisk presentation av sjukdomen dock är infektionen oftast mild och det tros även finnas personer som är reservoarer av bakterien i samhället asymtomatiskt bärarskap (16, 20, 21).
Epidemiologiska studier visar att så mycket som 50-70% av vuxna har antikroppar mot C.
pneumoniae, varför slutsatsen är att de flesta i samhället någon gång under sitt liv har haft infektionen. Ytterligare studier har visat på att infektioner med C. pneumoniae har kopplingar till andra sjukdomar som astma, ateroskleros, lungcancer, kroniskt obstruktiv lungsjukdom, artrit, alzheimers, schizofreni och multipel skleros (16, 18, 21).
Det finns svårigheter med odling och isolering av C. pneumoniae då den måste inokuleras i celler, exempelvis HEp-2 celler, i flera omgångar eftersom den är obligat intracellulär. Bakterien växer även mycket långsamt vilket kan innebära att odlingen inte är lämplig för avläsning förrän flera veckor efter den påbörjats (22, 23).
Legionella pneumophila
L. pneumophila är en fakultativt intracellulär patogen som förökar sig inom och dödar fritt levande amöbor samt humana makrofager (24). Den tillhör ett stort släkte av bakterier som är allmänt förekommande i färskvatten-reservoarer både i naturen och i dricksvatten. Den överlever i biofilm samt genom att parasitera på och föröka sig inom eukaryota fagocytiska celler, alltså fritt levande protozoer som Acanthamoeba castellanii och andra protozoer i sin miljö (25, 26). Bakteriens virulens strategier är starkt formade efter selektiv stress som den upplever i den akvatiska miljön den kommer ifrån, men den har även en del olika eukaryotliknande protein som tros kunna komma från eukaryoter genom horisontell genöverföring som har skett under evolutionen vid olika tidpunkter och är en pågående process (25, 27). Det har rapporterats att L. pneumophila är naturligt kompetent och därför kan förskaffa sig eukaryotiskt DNA när den parasiterar på bland annat amöbor (28). L. pneumophila växer vid en temperatur mellan 20-42°C och kan invadera samt kolonisera konstgjorda livsmiljöer som luftkonditioneringssystem, kall- samt varmvattenfördelningssystem och kylartorn där de sedan kan ta sig in i människan via inhalation av aerosoler. Det är dessa källor som primärt är orsaken till Legionärssjukan och försök att utrota bakteriesläktet från dessa miljöer har visat sig omöjlig då man har observerat att när vattenfördelningssystem en gång har blivit koloniserade så bibehåller de en relativt konstant population av stammar under många år (29, 30).
Macrophage infectivity potentiator (Mip) är ett yttermembranprotein som binder till en inhibitor för peptidyl-prolyl-cis/trans-isomeraser, som främst bidrar till stabilitet, aktivitet och vikning av
proteiner. Mip bidrar även till ”sliding”-motilitet, en speciell sorts rörlighet som bakterier har över en utsöndrad surfaktant-film och den bidrar även till tillväxtmöjligheter i kallare och varmare
temperaturer än optimalt. Båda egenskaperna är viktiga under de tidiga stadierna av intracellulär replikation i alveolära makrofager. Genen för detta protein kan användas till PCR-analyser (31).
Familjen Legionellae orsakar ungefär 2-8% av all atypisk SFP och 70% av alla dessa fall är på grund av L. pneumophila serogrupp 1, följt av serogrupp 2, 4 och 6 (6). Det finns dock vissa studier som
rapporterar att L. pneumophila serogrupp 1 orsakar upp till 90% av alla Legionellae-pneumonier och från 2-16% av all SFP (32). Denna serogrupp utgör endast 28,2% av all Legionellae i miljön medans den utgör 95,4% av alla kliniska isolat, vilket tros bero på att de bär på en speciell uppsättning gener som inte finns i andra serogrupper och arter, generna för lipopolysackarid-syntes (26).
Sjukdomen som L. pneumophila orsakar är Legionärssjukan, vilket är en atypisk pneumoni som kan få en dödlig utgång om den inte behandlas omgående (25). Sjukdomsincidensen varierar mellan studier och länder där en studie rapporterar incidensen i Europa som tio per miljon, medan en populations- baserad studie rapporterade incidensen som 80 per en miljon (32). Den genomsnittliga dödligheten är beräknad till 8% i USA och 10% i Europa, vilket framför allt utgörs av personer med försvagat
immunförsvar samt äldre där dödligheten är högst (33, 34). Infektion av denna bakterie sprids ej från människa till människa och inkubationstiden är 2-10 dagar (25, 30). Riskfaktorer för att få
Legionärssjukan är bland annat diabetes, rökning, hög ålder, underliggande kronisk sjukdom samt immunsuppresion med immunbrist till exempel efter en transplantation. Det finns även
miljöriskfaktorer som kopplas till utbrott av infektionen, vilka är närhet till kyltorn, dekorativa fontäner, bubbelpooler och vistelse på sjukhus/vårdinrättning i länder där bakterien är vanlig (33).
L. pneumophila är kräsna bakterier när det kommer till odling och växer inte på de flesta
standardmedia som används för isolering av luftvägspatogener på kliniska laboratorier, utan den kräver det speciella mediumet ”buffrat kol-jästextrakt”-agar. Legionella växer långsamt på platta och det går inte att urskilja bakterien på art nivå. Vissa kan dessutom finnas som en livskraftig men icke- odlingsbar form i prover som kommer från miljön (33).
För att kunna diagnostisera och välja passande antibiotikabehandling för samhällsförvärvad
pneumoni orsakad av de atypiska patogenerna M.pneumoniae, C. pneumoniae och L. pneumophila på ett mindre kliniskt laboratorium behövs det snabba, säkra och kostnadseffektiva metoder. Syftet med detta arbete var att undersöka om analys med kommersiell kvantitativ multiplex-PCR (mqPCR) skulle kunna påvisa atypiska patogener vid samhällsförvärvade pneumonier.
Material och metoder
Svalgprover
Det planerades att analysera 30-50 st svalgprov av vardera M. pneumoniae (Sunderby Sjukhus, Sunderbyn, Sverige), C. pneumoniae (Sunderby Sjukhus) samt en CCUG-stam för L. pneumophila (Culture Collection University of Gothenburg, Göteborg, Sverige) med kontroller för alla reaktioner.
Svalgproverna som avsågs för analysen bestod av både positiva och negativa prover för M.
pneumoniae samt C. pneumoniae detekterade med en tidigare använd PCR-analys. Inga övriga kriterier som ålder, kön eller antibiotikabehandling fanns för svalgproverna.
Kvantitativ Multiplex-PCR
Metoden utförs efter protokoll för b-CAP assay (Biolegio, Nijmegen, Nederländerna), en real- tids/kvantitativ multiplex PCR på BD MAX™ System (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Testet, b-CAP assay (Biolegio) består av en ”snap-in” innehållandes torkade prober och primers för C. pneumoniae, M.pneumoniae samt L.pneumophila och ska ej bearbetas i förväg utan placeras bara i rätt position i provställningen. ExK DNA-1 kit (Becton, Dickinson and Company) för extraktion, provet tillsätts i DNA Sample Buffer Tube (Becton, Dickinson and Company) och Mastermixen BD MMK (Becton, Dickinson and Company) körs som intern kontroll för processen.
Mastermixen innehåller alla PCR-reagenter i en tub samt primer och prob-sekvenser för Drosophila melanogaster. Alla inställningar för programmet görs i ”Channel settings” på BD Max och detta görs efter protokoll för b-CAP assay. De gener som detekteras är P1 för M. pneumoniae, Mip för L.
pneumophila och OmpA för C. pneumoniae.
Metodprincip
Analysen PCR bygger på en grundprincip att alla mikroorganismer har unika gensekvenser som särskiljer dem från alla andra mikroorganismer (35). Målet med denna analys är att få en selektiv amplifiering av en vald region/sekvens i en DNA-molekyl för att påvisa till exempel en patogen. För att göra detta måste man veta sekvenserna bredvid den valda genen för att skapa matchande sekvenser av oligonukleotider, det vill säga primers, som vid hybridisering till var sin sida av dubbelhelixen
begränsar området som kan kopieras. Efter extraktion av DNA startas reaktionen med att blandningen upphettas till 94°C så att DNA-molekylen denatureras till två separata strängar.
Temperaturen sänks sedan för att primers ska kunna fästa till sina positioner och syntesen kan sedan starta genom att åter höja temperaturen till ca 74°C så att polymeraset, enzymen som bygger på strängen med fria nukleotider, kan arbeta. Det resulterar i kopior av den utvalda genen som ökar exponentiellt för varje cykel som genomgås och amplifieringen fortsätter tills någon av
komponenterna i reaktionen tar slut (36).
Kvantitativ-PCR (qPCR) kallas även realtids-PCR och är den version av PCR som mäter mängden syntetiserat DNA under analysen jämfört mot mängden produkt från en PCR som har en känd startmängd DNA. Instrumentet läser av bildandet av DNA-kopior under hela tiden PCR-reaktionen
pågår genom en fluorescerande signal. Den kommer antingen från en färg som avger signalen då den hybridiserar till dubbelsträngat DNA eller från en reporter-prob som emiterar signalen när den binder till PCR produkten (36). Fluorescensen uppmäts och avläses sedan i ett optiskt instrument och denna fluorescens blir mätbar efter ett visst antal amplifieringscykler då signalen når ett förinställt tröskel- värde, ”cycle threshold” eller Ct-värde. Ju färre partiklar av patogenen som finns i provet desto fler cykler behövs för att testet ska nå tröskelvärdet och bli positivt (35). Resultatet visas som en graf där mängden produkt, som uppmäts i fluorescens, är en funktion av antalet cykler som har genomgåtts (36). Metoden mäter mängden detekterade bakterier vilket kan användas för att bedöma hur aggressiv en infektion är hos en transplantationspatient , men den används för det mesta bara för ett ”positivt”
eller ”negativt” svar om den sökta sekvensen finns i provet (35).
En multiplex-PCR analys använder samma prob och primersekvenser som en single/monoplex-PCR, det vill säga en qPCR som bara undersöker en patogen. Skillnaden är att med multiplex-analysen analyserar man flera patogener samtidigt och har då de passande primer- och prob-sekvenserna för var och en, poolade i samma rör (6).
Etiska överväganden
Inget etiskt tillstånd eller ansökan behövs för detta är ett kliniskt utvecklingsprojekt där
patientproverna som skulle användas som kontroller till validering/verifiering av denna kliniska metod var avidentifierade. Detta gör att proverna ej går att spåra tillbaka till patienten, vilket gör att ett etiskt tillstånd ej skulle vara nödvändigt då inga känsliga uppgifter kan komma i fel händer.
Proverna är från patienter som redan har fått diagnos, vilket gör att patienten inte har utsatts för någon extra hälsorisk vid deltagande i denna studie.
Diskussion
Antibiotikaresistens
För att SFP drabbade patienter ska kunna få en bra vård krävs korrekta diagnoser som tälls i tid. En inkorrekt eller försenad diagnos av den patogen som orsakade pneumonin kan leda till att patienten får ineffektiv/fel antibiotikabehandling, vilket påverkar vården av patienten negativt (23). Då C.
pneumoniae, M. pneumoniae och L. pneumophila ej kan behandlas med beta-laktam antibiotika så har makrolider varit förstahandsvalet för behandling av dessa patogener (37 - 40).
Innan år 2000 fanns det mycket få rapporter om resistens mot makrolid-antibiotika i M. pneumoniae, men sedan dess har makrolid-resistenta M. pneumoniae rapporterats och spritt sig till Japan, USA, Frankrike och Kina (41, 42). Resistensen beräknas vara så hög som 30,6% i Japan, 27% i USA och 9,8% i Frankrike (41). I Kina rapporterar studier att den största resistensen har uppvisats i barn där den beräknades ligga på >80% medan den i tonåringar och vuxna ligger på 69% för de som hade en infektion i luftvägarna orsakad av M. pneumoniae (42). Tetracykliner och fluorokinoloner
rekommenderas vanligtvis inte som behandling till barn utan ges bara när andra antibiotikum ej kan användas eller är ineffektiva mot patogenen. Den ökade makrolid-resistensen i M. pneumoniae kommer då att tvinga läkare att använda behandling med tetracykliner och fluorokinoloner för att bekämpa infektioner med den patogenen (40, 41).
Resistens mot azitromycin, ett makrolidantibiotika, i L. pneumophila serogrupp 1 har upptäckts i Kina, men i dagsläget finns det väldigt få rapporter om en resistensutveckling in vivo. Resistens har observerats in vitro mot bland annat fluorokinoloner samt makrolider och resistenta L. pneumophila har visat sig lätt kunna induceras i denna typ av miljö (39, 43). Legionellaes förmåga att lätt bilda resistens tros bero på dess förmåga att förvärva gener från andra prokaryoter och protozoer genom horisontell genöverföring (44). Studier indikerar att 30-40% av alla makrolider som utsöndras via urin gör det i en oförändrad form, vilket gör att bakterier i miljön kan bygga upp resistens vars gener L. pneumophila sedan skulle kunna ta upp (43). Det finns idag inga uppgifter som visar på antibiotika- resistens mot makrolider hos C. pneumoniae (38), men vid hypoxi i infekterad vävnad kunde en dämpande effekt av azitromycin ses (18, 38).
Val av provmaterial
De utvalda 30-50 svalgproverna borde vara en tillräcklig mängd för att testa reliabiliteten för M.
pneumoniae och C. pneumoniae, dock borde fler prover testas för att detektera L. pneumophila så att den inte bara testas som en ”ren”-stam utan även från annan typ av provmaterial. Provtagningen för att erhålla ett svalgprov är inte invasiv och provmaterialet används ofta till diagnos av luftvägssjukdomar då patienten ej kan producera sputum (personlig kommunkation). Alternativa material som kan användas till den kommersiella mqPCR analysen förutom svalgprov är sputum, nasofarynx aspirat och nasofarnyxprov (45, 46). Sputum och nasofarynx aspirat har rapporterats uppvisa en större känslighet än andra provmaterial som används till detta test, vilket då borde kunna ge ett ännu säkrare resultat för
diagnos (45, 47). Den ökade känsligheten gör att dessa material bör användas för analysen när det är möjligt att erhållas dessa från patienten (47). De alternativa metoderna kräver andra material som serum eller urin vilka finns i kroppen eller kan produceras i stora kvantiteter, vilket gör dem lättillgängliga (35, 48).
Alternativa metoder
Serologi, som metod, fokuserar på antikroppspåvisning där man i serum undersöker om patienten har antikroppar mot det sökta antigenet genom att detektera bindningen mellan dem. Det är viktigt att påvisning av antigenspecifikt IgG och IgM skiljs åt, då IgM är ett tecken på att man nyligen har genomgått eller genomgår en infektion medan IgG är ett tecken på att patienten tidigare har varit infekterad. För att upptäcka en nyligen genomgången infektion analyserar man om det finns en ökad mängd antikroppar mellan ett prov som har tagits i anslutning till insjuknandet och ett prov som är taget under konvalescensfasen. Mängden antikroppar som patienten har mot antigenet brukar anges som antikroppstiter, det vill säga hur mycket serumet kan spädas ut och fortfarande påvisa en reaktion.
Det finns många olika varianter av serologiska metoder men de vanligaste är enzyme-linked immuno- sorbent assay/enzyme immunoassay (ELISA/EIA) eller microimmunofluorescence test (MIF) som anses vara ”Golden standard” (35, 49). EIA/ELISA-analysen detekterar bindningen mellan antikropp och antigen med enzymmärkta antikroppar och analysen utförs oftast i en mikrotiterplatta. I botten på varje brunn i plattan är det sökta antigenet fäst och sedan tillsätts patientserum i olika spädningar till varsin brunn, vilket leder till att eventuella antikroppar binder till antigenet i bottnen och fastnar där.
Antikroppar som ej har bundit sköljs bort och därefter tillsätts enzymmärkta antikroppar som är riktade mot patientens IgM eller IgG. För att kunna detektera bindningen tillsätts ett substrat som enzymet kan bryta ned till ett färgat ämne, vilket ger ett färgomslag som kan avläsas i en fotometer (35).
Microimmunofluorescence test (MIF) är en indirekt antikroppsteknik som möjliggör observation av bindningen mellan antigen och antikropp som detekteras sekundärt med fluorescein-konjugerat anti- globulin till motsvarande antikroppsmolekyler. Ett spätt antigen med en bestämd mängd partiklar/mL är fixerade till ett objektglas. Det fixerade antigenet är placerat som flera prickar på objektglaset och för att differentiera immunoglobulinklasserna av antikroppar används fluorescein-konjugat av anti-IgM eller anti-IgG. Serumet som används är spädda och sedan appliceras de på varsin ”antigen-prick” där de får reagera och inkuberas innan de tvättas, torkas och de fluorescein-konjugerade anti-immun- globulinerna blandas med en lämplig motfärg/counterstain, inkuberas igen, sköljs och torkas. Täckglas monteras och fluorescensmikroskopi utförs för att bedöma det eventuellt positiva resultatet (50).
Urinantigenanalys är ett immunokromatografiskt test som används för kvalitativ detektion av L.
pneumophila serogrupp 1 urinantigen. Metodprincipen för denna är att urinen migrerar genom konjugeringsmembranet via kapillärkraft och L. pneumophila antigen i provet binder till anti-L.
pneumophila antikroppar som är konjugerade till kolloidala guldpartiklar som hjälper till att markera komplexet av antigen och antikropp. Komplexet migrerar sedan vidare uppför testremsan och binder sedan specifikt till en anti L. pneumophila antikropp som är fixerad till membranet och vid bindningen genereras en röd linje på membranet om testet är positivt. Testet valideras av att en kontrollinje
genereras och bara om den framställs kan resultatet anses vara korrekt (48, 51). Det finns även test som kan detektera både L. pneumophila och Streptococcus pneumoniae (52).
För och nackdelar med PCR
Metoden PCR har rapporterats som en mycket känslig och specifik diagnostisk metod för att kunna diagnostisera akuta M. pneumoniae infektioner där prov tas med svalgprover. Detektion av DNA från M. pneumoniae i proverna ger en förbättrad standard för att kunna diagnostisera akuta infektioner (53).
Beroende på vad PCR-analysens primers är riktade mot varierar känsligheten. När det gäller M.
pneumoniae är primers riktade mot P1-genen, vilka är mer känsliga än primers riktade mot genetiska
”house-keeping” markörer som 16S rRNA. Beroende på vilket format PCR-analys och referenssystem som används har kommer känslighet samt specificitet att variera, från 65-90% känslighet och 90- 100% specificitet (45). Används qPCR med fluorescens-analyser, som möjliggör amplifikation och detektion av sekvensen i samma rör, så behövs ingen extraanalys som elektrofores efteråt av PCR produkten, vilket är en klar fördel jämfört med konventionell PCR. De fluorescerande proberna ökar specificiteten och qPCR blir då en bättre metod för patienthantering då tiden till ett resultat minskas.
Om konventionell PCR används är det viktigt att PCR-resultatet, alltså produkten, bekräftas med en annan metod som Southern blot hybridisering eller en EIA detektion för att veta att man har tillförlitlig PCR-amplifiering. Vid efteranalyser ökar också riskerna för produktöverföring och kontaminering av proverna, vilket kan leda till falsk-positiva eller falsk-negativa svar som påverkar diagnosen negativt (45).
Under tidiga infektionsstadier då ett större antal av patogenen troligtvis kommer att befinna sig i patienten är qPCR mest användbart. Sannolikheten att få ett positivt PCR-resultat minskar dock med tiden då sensitiviteten signifikant minskar ju längre tid det tar från att personen uppvisar symtom till dess att ett prov tas. Minskningen kan observeras redan efter sju dagar från symtomuppvisning (13, 54). En studie rapporterade att PCR är 2,5 gånger mer känsligt om ett prov har samlats in under de första 21 dagarna efter patienten har börjat uppvisa symtom, än om det samlas in efter de 21 dagarna (13). Det provmaterial som används vid PCR kan också vara svårare att få tag på än material som används vid andra metoder som serologi eller urinantigenprov, då patienten kanske inte kan producera sputum och man kan få falsk-positiva resultat av PCR-inhibitorer i provmaterialet (54).
En multiplex-PCR-analys har många fördelar jämfört med andra detektionsmetoder inklusive enkel- PCR-analyser. Först och främst kan denna analys testa testets alla patogener samt kontroll i ett enda rör, vilket minskar tiden från analys till resultat samt mängden provmaterial som behövs för analysen.
Detta är fördelaktigt när tillgången till provmaterialet är begränsat. Multiplex-PCR minskar även risken för fel under preparation av både mastermix och tillsats av provmaterialet (55).
När det gäller bedömning av positiva PCR-resultat för M. pneumoniae så kan detta kompliceras av eventuellt asymtomatiskt bärande, då graden av bärande hos friska individer i samhället tidigare har rapporterats ligga mellan 0–13,5% (55). Asymtomatiskt bärarskap förekommer även för C.
pneumoniae som tros ligga på nära 5% (20, 21). Det är ännu okänt om personer kan vara asymtomatiska bärare av L. pneumophila, då en tidigare studies resultat som pekade på 6%
asymtomatiskt bärande ej kunde styrka sina resultat med odling (56). Risken för asymtomatiskt bärande sänker reliabiliteten för de patogener där det förekommer och skulle eventuellt kunna ge ett falskpositivt-svar vid en PCR-analys om individen bär på bakterien oavsett om den är den faktiska orsaken till patientens problem eller inte. Denna egenskap kan dock vara gynnsam då provmaterial där bakterierna dör under transport eller som inte går att odla/är svårodlade vid en beständig infektion ändå kan upptäckas och underlätta den kliniska bedömningen. Det är dock viktigt att ha i åtanke att även icke-levande eller icke-livskraftiga organismer kan förekomma efter till exempel en genomförd antibakteriell behandling (57). En PCR kräver dessutom omfattande kvalitetskontroll och validering av procedurerna för att förhindra falskt positiva resultat (53).
För- och nackdelar med serologiska metoder
Serologiska metoder har nackdelen att det är en tidsfördröjning innan resultat kan erhållas eftersom det behövs en fyrfaldig ökning av antikroppstitern mellan ”parade prover” som tas vid den akuta och konvalescenta fasen för att kunna ställa en diagnos (33, 58). Detta gör att serologiska metoder har liten inverkan på det kliniska beslutstagandet i den akuta fasen, men fortfarande anses vara ett komplement för diagnos av Legionellae och är mer användbara för epidemiologiska ändamål (32, 33).
Det finns fortfarande studier som anser att serologi är ett billigare och bättre alternativ för rutindiagnostik av M. pneumoniae än PCR då rutinerna för PCR är laboratoriespecifik (57).
Metoderna kan även ha problem med att detektera en infektion i immunsupprimerade patienter, då dessa ej kan komma upp i en accepterad ökning av antikroppstitern (58). En annan nackdel med denna typ av testning är oförmågan att kunna detektera alla arter av Legionellae och inte heller alla serogrupper utan bara L. pneumophila serogrupp 1 (33). Serologiska test för C. pneumoniae kan också korsreagera mot en annan Chlamydia art, Chlamydiae psittaci, vilket kan göra det svårt att skilja mellan dessa patogener med denna metod (19). Serologiska metoder måste därför kombineras med direkt patogendetektion för att kunna utesluta möjligheten att det förhöjda antalet antikroppar är på grund av en tidigare infektion (57). Olika serologiska tester har varierande sensitivitet och MIF är den som anses mest pålitlig samt är den som brukar rekommenderas. De flesta använder ej detta test för diagnos då analysen är tidskrävande, tekniskt krävande och preparering av antigen är svårt. Testet innehåller även element av subjektiv bedömning för att tolka resultat (49).
I vissa länder använder man ofta kommersiella serologiska testkit för att diagnostisera C. pneumoniae.
Testkiten kan bestå av en ELISA som ska detektera antikroppar mot C. pneumoniae. ELISA kan ofta visa falsk-positiva resultat som inkluderar falsk-positiva fall där individen har en hög titer av IgM i både friska personer och patienter med luftvägsinfektioner. Alla orsaker till att falsk-positiva
reaktioner sker är inte välkänt, men faktorer som anti-nukleära antikroppar, kroniska lungsjukdomar och reumatoidfaktor (RF) kan påverka testet på det sättet. För att använda denna typ av test krävs ett absorberande medel mot RF. När det gäller C. pneumoniae så detekterar bland annat MIF antikroppar mot C. pneumoniae-renade EBs yttermembrankomponenter medans ELISA detekterar C.
pneumoniae-yttermembrankomplex exklusive LPS från renade EBs (49).
För och nackdelar med Urinantigentest
Urinantigentest för L. pneumophila har som fördel att provmaterialet som behövs är lätt för patienten att producera i stora kvantiteter och det krävs inte heller invasiva metoder för att samla in provet (52).
Testet är också mycket enkelt att genomföra och man får snabbt ett lättolkat resultat (32). Testet kan detektera antigenet först efter 48-72 tim från symtomens början, vilket kan innebära längre tid innan diagnos kan erhållas jämfört med exempelvis PCR. En annan fördel med urinantigentestet är att antigenet kan detekteras i flera veckor efter uppvisandet av symtom, vilket i genomsnitt är i 3-4 veckor. Testets sensivitet varierar dock med sjukdomens svårighetsgrad, som i milda fall detekterar antigenet hos 40-53% och i allvarliga fall 88-100% (33). En stor begränsning för detta test är att det endast finns ett test för L. pneumophila serogrupp 1 och testet kan då inte upptäcka 30% av
infektionerna som orsakas av de andra serogrupperna eller av andra arter Legionellae, vilket kan leda till ett falsk-negativt resultat (6, 33).
Konklusionen av arbetet var att en kommersiell mq-PCR-teknik bör vara en lämplig metod för att analysera de atypiska patogenerna för att kunna diagnostisera samhällsförvärvad pneumoni.
Referenser
1. Kumar S, Saigal S, Sethi G. Detection of IgM and IgG antibodies to Chlamydophila pneumoniae in pediatric community-acquired lower respiratory tract infections. Indian J of Pathol and Microbiol. 2011;54(4):782-785.
2. Stupka JE, Mortensen EM, Anzueto A, Restrepo MI. Community-acquired pneumonia in elderly patients. Aging health. 2009;5(6):763-774.
3. Ostermann H, Garau J, Medina J, Pascual E, McBride K, Blasi F. Resource use by patients hospitalized with community-acquired pneumonia in Europe: analysis of the REACH study. BMC Pulm Med. 2014;14(1):36. doi: 10.1186/1471-2466-14-36
4. Cunha BA. The atypical pneumonias: clinical diagnosis and importance. Clin Microbiol Infect.
2006;12:12-24.
5. Läkemedelsverket. Farmakologisk behandling av nedre luftvägsinfektioner i öppen vård - Bakgrundsdokumentation 2008.
https://www.lakemedelsverket.se/globalassets/dokument/behandling-och-
forskrivning/behandlingsrekommendationer/bakgrundsdokument/bakgrundsdokumentation- antibiotika-vid-nedre-luftvagsinfektion.pdf (2020-06-05)
6. Thurman KA, Warner AK, Cowart KC, Benitez AJ, Winchell JM. Detection of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, and Legionella spp. in clinical specimens using a single- tube multiplex real-time PCR assay. Diagn Microbiol Infect Dis. 2011;70(1):1-9.
7. Kannan TR, Baseman JB. ADP-Ribosylating and vacuolating cytotoxin of Mycoplasma
pneumoniae represents unique virulence determinant among bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(17):6724-6729.
8. Waites KB, Crabb DM, Bing X, Duffy LB. In vitro susceptibilities to and bactericidal activities of Garenoxacin (BMS-284756) and other antimicrobial agents against human Mycoplasmas and Ureaplasmas. Antimicrobl Agents Chemother. 2003;47(1):161-165.
9. Drasbek M, Christiansen G, Drasbek KR, Holm A, Birkelund S. Interaction between the P1 protein of Mycoplasma pneumoniae and receptors on HEp-2 cells. Microbiology. 2007;153(11):3791- 3799.
10. Dallo SF, Baseman JB. Intracellular DNA replication and long-term survival of pathogenic mycoplasmas. Microb Pathog. 2000;29(5):301-309.
11. Waldo RH, III, Krause DC. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. J Bacteriol. 2006;188(2):569-575.
12. Krause DC, Leith DK, Wilson RM, Baseman JB. Identification of Mycoplasma pneumoniae proteins associated with hemadsorption and virulence. Infect Immun. 1982;35(3):809-817.
13. Thurman KA, Walter ND, Schwartz SB et al. Comparison of laboratory diagnostic procedures for detection of Mycoplasma pneumoniae in community outbreaks. Clin Infect Dis.
2009;48(9):1244-1249.
14. Kumar S, Garg IB, Sethi G. Serological and molecular detection of Mycoplasma pneumoniae in children with community-acquired lower respiratory tract infections. Diagn Microbiol Infect Dis.
2019;95(1):5-9.
15. Dallo SF, Kannan TR, Blaylock MW, Baseman JB. Elongation factor Tu and E1 β subunit of pyruvate dehydrogenase complex act as fibronectin binding proteins in Mycoplasma pneumoniae. Mol Microbiol. 2002;46(4):1041-1051.
16. Porritt RA, Crother TR. Chlamydia pneumoniae infection and inflammatory diseases. For Immunopathol Dis Therap. 2016;7(3-4):237-254.
17. Kevin H, Richard SS. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proc Nat Acad Sci U S A. 2007;104(27):11430-11435.
18. Matsuo J, Sakai K, Okubo T, Yamaguchi H. Chlamydia pneumoniae enhances Interleukin 8 (IL- 8) production with reduced azithromycin sensitivity under hypoxia. APMIS. 2019;127(3):131-138.
19. Wolff BJ, Morrison SS, Winchell JM. Development of a multiplex TaqMan real-time PCR assay for the detection of Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae in human clinical specimens.
Diagn Microbiol Infect Dis. 2018;90(3):167-170.
20. Sharma L, Losier A, Tolbert T, Dela Cruz CS, Marion CR. Atypical pneumonia: updates on Legionella, Chlamydophila, and Mycoplasma Pneumonia. Clin Chest Med. 2017;38(1):45-58.
21. Miyashita N, Niki Y, Nakajima M, Fukano H, Matsushima T. Prevalence of asymptomatic infection with Chlamydia pneumoniae in subjectively healthy adults. Chest. 2001;119(5):1416- 1419.
22. Apfalter P, Barousch W, Nehr M et al. Comparison of a new quantitative OmpA-based real-time PCR TaqMan assay for detection of Chlamydia pneumoniae DNA in respiratory specimens with four conventional PCR assays. J Clin Microbiol. 2003;41(2):592-600.
23. She RC, Thurber A, Hymas WC et al. Limited utility of culture for Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae for diagnosis of respiratory tract infections. J Clin Microbiol.
2010;48(9):3380-3382.
24. Zusman T, Yerushalmi G, Segal G. Functional similarities between the icm/dot pathogenesis systems of Coxiella burnetii and Legionella pneumophila. Infect Immun. 2003;71(7):3714-3723.
25. Gomez-Valero L, Rusniok C, Jarraud S et al. Extensive recombination events and horizontal gene transfer shaped the Legionella pneumophila genomes. BMC Genomics. 2011;12:536. doi:
10.1186/1471-2164-12-536.
26. Cazalet C, Jarraud S, Ghavi-Helm Y et al. Multigenome analysis identifies a worldwide distributed epidemic Legionella pneumophila clone that emerged within a highly diverse species. Genome Res. 2008;18(3):431-441.
27. Lurie-Weinberger MN, Gomez-Valero L, Merault N, Glöckner G, Buchrieser C, Gophna U. The origins of eukaryotic-like proteins in Legionella pneumophila. Int J Med Microbiol.
2010;300(7):470-481.
28. de Felipe KS, Pampou S, Jovanovic OS et al. Evidence for acquisition of Legionella type IV secretion substrates via interdomain horizontal gene transfer. J Bacteriol. 2005;187(22):7716- 7726.
29. Edelstein PH, Edelstein MA, Shephard LJ, Ward KW, Ratcliff RM. Legionella steelei sp. nov., isolated from human respiratory specimens in California, USA, and South Australia. Int J Syst Evol Microbiol. 2012;62(8):1766-1771.
30. Harrison T, Afshar B, Doshi N, Fry N, Lee J. Distribution of Legionella pneumophila serogroups, monoclonal antibody subgroups and DNA sequence types in recent clinical and environmental isolates from England and Wales (2000–2008). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2009;28(7):781- 791.
31. Rasch J, Ünal CM, Klages A et al. Peptidyl-prolyl- cis / trans -isomerases Mip and PpiB of Legionella pneumophila contribute to surface translocation, growth at suboptimal temperature, and infection. Infect Immun. 2019;87(1):e00939-17.
32. Simonsen O, Wedege E, Kanestram A et al. Characterization of the extent of a large outbreak of Legionnaires' disease by serological assays. BMC Infect Dis. 2015;15(1):163. doi: 10.1186/s12879- 015-0903-2
33. Janczarek M, Palusińska-Szysz M. PCR method for the rapid detection and discrimination of Legionella spp. based on the amplification of pcs, pmtA , and 16S rRNA genes. J Appl Genet.
2016;57(2):251-261.
34. Mojtahedi S-Y, Rahbarimanesh A, Noorbakhsh S, Shokri H, Jamali-Moghadam-Siyahkali S, Izadi A. Urinary antigene and PCR can both be used to detect Legionella pneumophila in children’s hospital-acquired pneumonia. Eur J Transl Myol. 2019;29(2): 112-117.
35. Brauner A, Arvidsson S, Blomberg J et al. (2015). Medicinsk mikrobiologi & immunologi. Upplaga 1:3. Studentlitteratur AB. ISBN: 978-91-44-03868-1. 627-638
36. Brown T.A. (2016). Gene cloning and DNA analysis: an introduction. Upplaga 7. Wiley-Blackwell.
ISBN: 978-1-119-07256-0. 157-171.
37. Miyashita N, Akaike H, Teranishi H et al. Chlamydophila pneumoniae serology: cross-reaction with Mycoplasma pneumoniae infection. J Infect Chemother. 2013;19(2):256-260.
38. Kutlin A, Kohlhoff S, Roblin P, Hammerschlag MR, Riska P. Emergence of resistance to rifampin and rifalazil in Chlamydophila pneumoniae and Chlamydia trachomatis. Antimicrob Agents Chemother. 2005;49(3):903-907.
39. Sikora A, Gładysz I, Kozioł-Montewka M et al. Assessment of antibiotic susceptibility of Legionella pneumophila isolated from water systems in Poland. Ann Agric Environ Med.
2017;24(1):66-69.
40. Morozumi M, Iwata S, Hasegawa K et al. Increased macrolide resistance of Mycoplasma
pneumoniae in pediatric patients with community-acquired pneumonia. Antimicrob Agents and Chemother. 2008;52(1):348-350.
41. Peuchant O, Ménard A, Renaudin H et al. Increased macrolide resistance of Mycoplasma
pneumoniae in France directly detected in clinical specimens by real-time PCR and melting curve analysis. J Antimicrob Chemother. 2009;64(1):52-58.
42. Cao B, Zhao CJ, Yin YD et al. High prevalence of macrolide resistance in Mycoplasma
pneumoniae isolates from adult and adolescent patients with respiratory tract infection in China.
Clin Infect Dis. 2010;51(2):189-194.
43. Jia X, Ren H, Nie X, Li Y, Li J, Qin T. Antibiotic resistance and azithromycin resistance mechanism of Legionella pneumophila serogroup 1 in China. Antimicrob Agents Chemother.
2019;63(10): e00768-19.
44. Graells T, Hernández-García M, Pérez-Jové J, Guy L, Padilla E. Legionella pneumophila recurrently isolated in a Spanish hospital: two years of antimicrobial resistance surveillance.
Environ Res. 2018;166(1):638-646.
45. Templeton KE, Scheltinga SA, Graffelman AW et al. Comparison and evaluation of real-time PCR, real-time nucleic acid sequence-based amplification, conventional PCR, and serology for
diagnosis of Mycoplasma pneumoniae. J Clin Microbiol. 2003;41(9):4366-4371.
46. Nakayama E, Hasegawa K, Morozumi M et al. Rapid optimization of antimicrobial chemotherapy given to pediatric patients with community-acquired pneumonia using PCR techniques with serology and standard culture. J Infect Chemother. 2007;13(5):305-313.
47. Ursi D, Dirven K, Loens K, Ieven M, Goossens H. Detection of Mycoplasma pneumoniae in respiratory samples by real-time PCR using an inhibition control. J Microbiol Methods.
2003;55(1):149-153.
48. Congestrì F, Morotti M, Vicari R et al. Comparison of the novel Immunocatch Legionella Test with Sofia Legionella FIA assay and with BinaxNOW Legionella card assay for detection of Legionella pneumophila (serogroup 1) antigen in urine samples. J Clin Microbiol. 2019;57(8):
e00305-19.
49. Miyashita N, Ouchi K, Kawasaki K et al. Comparison of serological tests for detection of
immunoglobulin M antibodies to Chlamydophila pneumoniae. Respirology. 2008;13(3):427-431.
50. Wang S. The microimmunofluorescence test for Chlamydia pneumoniae infection: technique and interpretation. J Infect Dis. 2000;181 (3):S421-S425.
51. Badoux P, Euser SM, Bruin JP, Mulder PPG, Yzerman EPF. Evaluation of the bioNexia Legionella Test, including impact of incubation time extension, for detection of Legionella pneumophila serogroup 1 antigen in urine. J Clin Microbiol. 2017;55(6):1733-1737.
52. Athlin S, Iversen A, Özenci V. Comparison of the ImmuView and the BinaxNOW antigen tests in detection of Streptococcus pneumoniae and Legionella pneumophila in urine. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2017;36(10):1933-1938.
53. Beersma MFC, Dirven K, van Dam AP, Templeton KE, Claas ECJ, Goossens H. Evaluation of 12 commercial tests and the complement fixation test for Mycoplasma pneumoniae-specific immunoglobulin G (IgG) and IgM antibodies, with PCR used as the "gold standard". J Clin Microbiol. 2005;43(5):2277-2285.
54. Jung CY, Choe YH, Lee SY et al. Use of serology and polymerase chain reaction to detect atypical respiratory pathogens during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.
Korean J Intern Med. 2018;33(5):941-951.
55. Nilsson AC, Björkman P, Persson K. Polymerase chain reaction is superior to serology for the diagnosis of acute Mycoplasma pneumoniae infection and reveals a high rate of persistent infection. BMC Microbiol. 2008;8(1):93. doi: 10.1186/1471-2180-8-93.
56. Kumar S, Wang L, Fan J et al. Detection of 11 common viral and bacterial pathogens causing community-acquired pneumonia or sepsis in asymptomatic patients by using a multiplex reverse transcription-PCR assay with manual (enzyme hybridization) or automated (electronic
microarray) detection. J Clin Microbiol. 2008;46(9):3063-3072.
57. Kashyap B, Kumar S, Sethi GR, Das BC, Saigal SR. Comparison of PCR, culture & serological tests for the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae in community-acquired lower respiratory tract infections in children. Indian J Med Res. 2008;128(2):134-139.
58. Merida-Vieyra J, Aquino-Andrade A, Palacios-Reyes D, Murata C, Ribas-Aparicio RM, De Colsa Ranero A. Detection of in Mexican children with community-acquired pneumonia: experience in a tertiary care hospital. Infect Drug Resist. 2019;12(1):925-935.
