Production and evaluation of spider silk protein for sortase A- mediated functionalization

Full text

(1)

INOM TEKNIKOMRÅDET EXAMENSARBETE

BIOTEKNIK

OCH HUVUDOMRÅDET MEDICINSK TEKNIK, AVANCERAD NIVÅ, 30 HP STOCKHOLM SVERIGE 2020,

Production and evaluation of spider silk protein for sortase A- mediated functionalization

ANNA ERIKSSON

(2)

Production and evaluation of spider silk proteins for sortase A-mediated functionalization

Anna Eriksson

Master thesis in medical biotechnology, 30 hp

KTH, Royal Institute of Technology

Department of Protein Science, AlbaNova University Center Stockholm, Sweden 2020

Supervisors: My Hedhammar & Ronnie Jansson Examiner: Qi Zhou

(3)

Abstract

The recombinant spider silk protein 4RepCT has been functionalized in many ways through the years. Sortase A coupling is an important method used when proteins or binders cannot be expressed as fusion proteins with 4RepCT, because of size, complexity or if the protein is in need of post-translational modifications. Previous studies have shown that an increasing number of glycine residues increase the yield and rate of the enzymatic coupling. The project aim was to investigate two new silk proteins, 4RepCT-Srt and G5-4RepCT, to be able to evaluate if the sortase A coupling could be improved. The IgG binding domain Z(containing three N-terminal glycine residues) was coupled both in solution and on coatings of 4RepCT- Srt, both on coatings of 4RepCT-Srt and in solution using SDS-PAGE. IgG-fluorophore was used to be able to detect and get an estimation of coupled product (4RepCT-Z), and SDS- PAGE was used to estimate the amount and rate of product formation, which was compared to the wild type silk, G-4RepCT. The G5-4RepCT had to be re-cloned, due to difficulties in expression and purification of the previous construct. The results show that three or more glycines improve the rate of coupling, and 4RepCT-Srt works at least as efficient as the 4RepCT. Improved sortase coupling could be beneficial for future cancer immunotherapy using 4RepCT silk, where sortase can be used to covalently attach antibody fragments to the silk.

Keywords: Spider silk, 4RepCT, functionalization, Z domain, sortase A coupling, silk coatings.

Abstrakt

Det rekombinanta spindelsilket 4RepCT har genom åren funktionaliserats på många sätt.

Sortase A-koppling är en viktig metod som används när proteiner eller bindaren inte kan uttryckas som ett fusionsprotein med 4RepCT, p.g.a. storlek, komplexitet eller om proteinet behöver post-translationella modifikationer. Tidigare studier har visat att ett ökat antal av aminosyran glycin ökar utbytet och hastigheten för den enzymatiska kopplingen. Projektets mål var att utvärdera två nya silkeproteiner, 4RepCT-Srt och G5-4RepCT, för att kunna utvärdera om sortas A kopplingen var möjlig att förbättras. 4RepCT-Srt kopplades till IgG- bindningsdomänen Z (innehållande tre N-terminala glyciner), både vid coating av 4RepCT- Srt och i lösning med användning av SDS-PAGE. IgG-fluorofor användes för att kunna detektera och få en uppskattning av mängden koppling mellan silket och Z (4RepCT-Z), SDS-

(4)

genom att jämföra med viltyp-silket, GP- 4RepCT. G5-4RepCT behövde klonas om på grund av tidigare uttrycks- och reningssvårigheter. Resultaten av sortas A-koppling i lösningar och på coating av silket bekräftade att tre eller mer glyciner ökar hastigheten av kopplingen, och att 4RepCT-Srt fungerar minst lika effektivt som 4RepCT. En mer effektiv sortas A-koppling till är önskvärd för framtida cancerimmunoterapi, där sortas kan användas för att binda antikroppsfragment kovalent till silket, 4RepCT.

Nyckelord: Spindelsilke, 4RepCT, funktionalisering, Z-domän, sortas A-koppling, coating

(5)

www.kth.se

Figur

Updating...

Referenser

Updating...

Relaterade ämnen :