Examensarbete 10 poäng C-nivå Vt. 2005 Institutionen för medicinsk biokemi och mikrobiologi
Biomedicinska analytikerprogrammet
Survival of Spore forming bacteria during pasteurisation and anaerobic digestion in biogas plants.
Mari Danielsson
Department of Bacteriology, National Veterinary Institute, Uppsala Supervisors: Elisabeth Bagge and Marianne Persson
ABSTRACT
Anaerobic digestion is one way of handling biowaste and generating energy in the form of methane, biogas.
This study shows that spore forming bacterias survive the process of pasteurisation and anaerobic digestion in biogas plants. It has also been established that both the nonpasteurised- and digestion- waste contains pathogen spore forming bacterias. Two Swedish full-scale commercial biogas plants were sampled before pasteurisation, after pasteurisation and after digestion on 10 occasions with one week intervals. The samples were analysed quantitatively and qualitatively, with biochemical methods, for Clostridium spp and Bacillus spp.
Polymerase Chain Reaction, a biomolecular method, was used for C. chauvei analysis, with C. chauvei specific primers. For this analyse the biogas plants were sampled at 11 occasions.
Survival of pathogenic spore forming bacteria in digestion residue may be a health risk for both humans and animals. The digested residue may be used as fertiliser on arable land and the risk of contamination by pathogenic Clostridium spp and Bacillus spp is hard to assess, but can not be neglected.
KEYWORDS: Pathogenic bacteria, Biowaste, Digestion residue, Bacillus spp, Clostridium spp
1. INLEDNING
Ett kretslopp av biologiskt avfall från stad till land är en förutsättning för ett hållbart samhälle, men det får inte ske på bekostnad av en anrikning av miljöfarliga ämnen i jorden eller en spridning av smittämnen i naturen. Det är först på senare år som smittskyddsproblem med kretslopp har uppmärksammats.
Biologiskt avfall behandlas på olika sätt för att utvinna biogas, metan, vid reningsverk och biogasanläggningar genom rötning. Det finns många sätt att behandla bioavfall. Rötning vid biogasanläggningar är ett sätt att utvinna biogas från avfallet och dessutom på ett kontrollerat sätt hygienisera avfallet genom pastörisering.
För närvarande finns det tio stora biogasanläggningar som samrötar gödsel med olika biologiska avfallsfraktioner från livsmedelsindustrier, restauranger, storkök,
läkemedelsindustri och skörderester (Sahlström L. 2003). Biogasanläggningar tar inte emot slam från reningsverk. Vissa anläggningar tar även emot animaliskt lågriskavfall från slakterier, mag- tarminnehåll, fett och spillblod. Om biogasanläggningarna ska få ta emot detta är det ett krav från EU att ha ett separat pastöriseringssteg där substratet behandlas vid 70ºC i en timme (EEC 1774/2002).
Pastörisering i en biogasanläggning kan ske antingen satsvis eller kontinuerligt. Den satsvisa pastöriseringen är att föredra ur hygienisk synvinkel, då den kontinuerliga pastöriseringen är svår att kontrollera när det gäller uppehållstid och temperatur. Vid pastörisering reduceras flertalet patogena mikroorganismer till en acceptabel nivå ur
smittskydds synpunkt. En studie (Bagge E. et at. 2005) har visat att pastöriseringssteget före rötning reducerar indikatorbakterier så som koliforma bakterier, enterokocker och Escherichia coli (Larsen H.E. et al. 1994) samt patogena bakterier som Salmonella, Listeria,
Campylobakter och E.coli 0157. Sporbildande bakterier, vissa värmetåliga virus och prioner påverkas dock inte nämnvärt av pastörisering eller rötning.
Rötningen kan ske på två olika sätt. Mesofil rötning sker vid 35-40°C medan den termofila rötningen, vilken är att föredra ur hygienisk synvinkel när det saknas ett pastöriseringssteg, sker vid 55°C. Uppehållstiden är kortare i en termofil reaktor än i en mesofilreaktor vilket ger ett snabbare flöde genom anläggningen. En termofil rötanläggning är dock mer känslig vad gäller förändringar i råsubstratet då rätt sammansättning och jämn fördelning av råsubstrat krävs. Andra parametrar som påverkar en rötkammare är torrsubstanshalt, temperatur, pH och lättflyktiga fettsyror (Sahlström L. 2003).
För att med säkerhet kunna intyga att inget obehandlat substrat passerar vid
hygieniseringssteget måste anläggningarna kunna dokumentera uppehållstid och temperatur i pastöriseringssteget för varje behandlad sats. Anläggningarna har varningssystem för kontroll av detta (Bagge E. 2003).
Rötresterna är att betrakta som en biprodukt till gasproduktionen och den har en
torrsubstanshalt på 4-6%. Detta är ett uppskattat gödselmedel av lantbruket då det har en mer homogen struktur än flytgödsel och en god växttillgänglighet av näringsämnena. Då
biologiskt avfall återanvänds i form av rötrest skapas ett kretslopp av näringsämnen och minskar därmed behovet av fossila bränslen och handelsgödsel. Dessutom är det tillåtet att använda rötrest från biogasanläggningar som gödsel till marker avsedda för ekologisk odling.
Eftersom såväl apatogena bakterier som indikatorbakterier samt patogena bakterier reduceras vid pastöriseringen men sporbildande bakterier överlever (Bagge E. et al. 2005) finns det risk för smittspridning. Detta kan ske då gödsel från gårdar smittade med patogena sporbildande bakterier körs in till en biogasanläggning och rötresten sedan sprids på andra gårdar. I Sverige rekommenderas inte rötrestgödsling på vall eller betesmark på grund av risken för att rötresten återsmittats och förekomsten av sporbildande bakterier, men gärna på odlingsbar mark för stråsäd.
Smittämnen i naturen kan kvarstå i åratal. Vilda djur kan bli en smittreservoar för husdjur och människa. Smittämnen kan transporteras långa sträckor från gödslad mark med till exempel ytvatten, bärgat foder och vektordjur såsom insekter, smågnagare och fåglar. Vid ett sjukdomsutbrott från smittkällor i miljön är smittspårning ofta omöjlig. Ett större
sjukdomsutbrott på grund av att bioavfall använts i jordbruket kan göra kretsloppsprodukter omöjliga att avsätta. Ett förbiseende av denna risk skulle hota attraktionsvärdet av dessa produkter och försvåra hela utvecklingen mot ett kretsloppsamhälle.
Clostridium och Bacillus är två släkten av sporbildande bakterier som överlever både pastöriseringen och rötningen. De växer i antal under gynnsamma förhållanden, men vid ogynnsamma förhållanden bildar de en vilofas, sporer. Som sporer blir bakterierna mycket tåliga bl.a. mot värme och uttorkning och de kan överleva under lång tid. Det är en stor grupp av bakterier där flertalet arter är harmlösa och betraktas mer som normalflora i tarmen, men några arter är mycket patogena. De orsakar bland annat stelkramp, dysenteri och botulism.
Dessa bakterier producerar toxiner under sporuleringen som är ansvarig för utvecklingen av sjukdomen samt förekomsten av de kliniska fynden och i många fall kan det leda till att värddjuret dör. Alla är grampositiva, sporbildande stavar (Lampel K.A. et al. 2004).
Clostridium-familjen innehåller mer än 150 arter som lever vegetativt eller sporform. De lever i många miljöer och ekologiska nischer. De flesta arterna är obligata anaerober men några kan växa under microaerofila förhållanden. Organismerna förekommer i jord, vatten sediment samt i tarmen hos djur och människor och många producerar värdefulla
jäsningsprodukter såsom ättiksyra, aceton och isopropanol. Upp till 40 Clostridium-arter är mer eller mindre patogena och inblandade i flera sjukdomar hos däggdjur, även människor och fåglar.
En känd art är Clostridium prefringens, där vissa serotyper orsakar matförgiftning samt sjukdomar hos djur som lammdysenteri, och pulpkidneydesis. Frasbrand hos nötkreatur orsakas av en infektion med Clostridium chauvoei. Den kännetecknas av ett snabbt
sjukdomsförlopp med nedbrytning och gasbildning i muskelvävnad, kraftig utsvämning av toxiner i blodet samt mycket hög dödlighet. Frasbrand är en anmälningspliktig sjukdom hos idisslare.
Släktet Bacillus växer som strikta aerober eller fakultativa anaerober. Även här är de flesta arter saprofyter och finns på vegetation, i jord, vatten och i luft. Organismerna bildar
endosporer som skiljer sig från vegetativa celler genom att de är mycket refraktiva, mindre mottagliga för färgning och framförallt är de extremt motståndskraftiga mot värme och torka.
Bacillus spp består av mer än 50 olika arter. Tre kända arter är Bacillus anthracis, Bacillus cereus och Bacillus subtilis. Bacillus anthracis är den mest patogena och orsakar mjältbrand.
Bacillus cereus är fakultativt anaerob och förekommer i de flesta miljöer (Lampel KA, et al, 2004). B. cereus kan orsaka flera olika sjukdomar bl.a. matförgiftning som orsakas av två olika enterotoxiner, ett värmestabilt och ett värmelabilt.
De biokemiska metoder som används för typning och antalsbestämning av grampositiva bakterier är bakteriologisk odling, gramfärgning och fermentation.
Den kvantitativa analysen utförs med 1:10 spädningsserie enligt Nordic Committee on Food Analysis (NMKL 91:3:2001). Antalet kolonier räknas för varje spädning och sedan kan antalet bakterier/g bestämmas.
Tryptose-sulphite-cycloserine agar, (TSC), är en kombination av ett diagnostiskt och selektivt medium för isolering av Clostridium spp. D-Cykloserin är ett antibiotikum som hämmar tillväxten av de flesta aeroba och fakultativt anaeroba mikroorganismer medan många Clostridium spp är helt resistenta. I den här studien användes en tillsatts av 4%
Cykloserin för selektion. Vissa Clostridium spp reducerar den i mediet ingående sulfiten till sulfid, denna reagerar med järnsaltet i mediet och sulfitreducerande kolonier blir svartfärgade till följd av järnsulfidbildning. För att kunna selektera fram Clostridium perfringens användes i denna studie ägguleagar där C. prefringens spjälkar lecitin. Kolonierna ser här vita ut pga.
precipitation i det underliggande mediet och bakterien växer anaerobt och har klar hemolys på blodagar. Fastidious anaerobe agar (FAA) är en selektiv anaerob blodagar som också
användes för att selektera fram Clostridium spp.
Bacillus spp odlades fram från icke-selekterande hästblodagar. För att selektera fram Bacillus cereus som växte aerobt med klar hemolys på hästblodagar användes Mossel Cereus selectiv agar (MCS) som är ett selektivt och diagnostiskt medium för påvisande av Bacillus cereus. De växer med stora ojämna kolonier med oregelbunden kant samt med en rosa precipitation i agarn. Kolonierna ser skära ut på grund av färgförändring i det underliggande mediet
Gramfärgning används för att kategorisera bakterier. Beroende på cellväggens
sammansätting har en del bakterier affinitet till basiska färgämnen och andra till sura på det viset kan man selektera bakterierna med hjälp av gramfärgning. Analysen ger grampositiva eller gramnegativa bakterier.
Fermentationstest används för att närmare typa grampositiva stavar. Kolhydrater är för många bakterier den viktigaste energi och kolkällan. Bakterier metaboliserar kolhydrater på olika sätt på grund av deras metaboliska enzymuppsättningar som är karakteristiska för varje genus. Genom att odla en mikroorganism i närvaro av olika kolhydrater och notera vilka av dessa som bryts ner, kan man få en uppfattning om mikroorganismens enzymuppsättning.
Eftersom syror utgör en stor del av slutprodukterna vid de flesta sockerjäsningarna räcker det vanligen med att påvisa den de bildade syrorna med en pH-indikator (Bacillus spp) eller en pH-meter (Clostridium spp) för att få veta om bakterien fermenterar den aktuella sockerarten eller inte. Positivt pH ≤ 5,40 och negativt pH ≥ 5,70 gäller för Clostridium spp.
Vissa bakterier bildar enzymet ureas vilket hydrolyserar urinämnen under bildning av ammoniak och koldioxid. Ammoniaken löser sig i mediet som blir basiskt och den tillsatta indikatorn fenolftalein slår om till rött. Detta påvisas med hjälp av Ureatestet.
En del mikroorganismer bildar enzymet tryptofanas som spjälkar aminosyran tryptofan under bl.a. indolbildning. Indolen påvisas med p-dimetylamino-bensaldehyd som tillsammans
ger ett rödfärgat komplex. Indoltestet hjälper till att typa de mikroorganismer som bildar Tryptofanas. Dessa tester ingår också i fermentationsserien.
För att detektera Clostridium chauvei används Polymerase Chain Reaction, PCR, med C. chauvei- specifika primers. Detta ger en 509bp produkt som är specifik för C. chauvei (Sasaki Y. et al. 2000).
Den här studien ska jämföra antal och art av sporbildande bakterier, så som Clostridium spp och Bacillus spp, före och efter pastörisering och efter rötning. I studien ingår också diskussionen om de sporbildande bakterierna i det inkommande substratet konkurreras ut av floran i rötkammaren.
Det är två biogasanläggningar med storskalig drift som ingår i projektet, K och L, där provtagningarna upprepas med en veckas mellanrum. Sammanlagt 11 provomgångar från biogasanläggning K, där den första provomgången enbart analyserades efter C. chauvei, samt 10 från anläggning L ingick i studien.
En studie har visat att antalet sporbildande bakterier i rötslam inte skiljer sig över säsong, (Bagge E. 2005), därför har val av tidpunkt för projektet inte någon betydelse. Typning och antalsbestämning av sporbildande bakterier kommer att ske med ovan nämnda biokemiska metoder samt molekylärbiologiska metoder, så som PCR och sekvensering.
2. MATERIAL OCH METOD
Proverna kom från två biogasanläggningar i Sverige där provtagningarna upprepas med en veckas mellanrum. Det är tre prover från vardera biogasanläggning, ett prov före pastörisering (FP), efter pastörisering (EP) och efter rötning (ER), sammanlagt 63 prover. Proverna har tagits efter anvisningar från en tidigare studie (Bagge E. 2003). Eftersom sporbildande bakterier är okänsliga så kunde proverna skickas med post till laboratoriet i 250ml
kommersiella steriliserad plastburkar. Statens veterinärmedicinska anstalt, (SVA), Uppsala, har levererat de olika medierna om inte annat anges.
2.1 Kvantitativ analys.
Ca 20ml av varje prov överfördes i ett 50ml falkonrör och inkuberades i 65°C vattenbad i 30min för att avdöda eventuella icke sporbildande bakterier.
För kvantitativ analys gjordes en 1:10 spädning i natriumklorid (0,86-0,90%). 10g prov vägdes upp i en påse (Stomacher standard bag, classic 400, stomacher® lab system, Seward.)
och blandades med 90ml natriumklorid (0,86-0,90%). Proverna blandades sedan i stomacher, (Stomacher 400, Laboratory blender, Seward. www.sewardsearch.co.uk), i 30sek på normal hastighet. Vid stomachering homogeniserades proverna och denna lösning användes sedan till en seriespädning i 4-steg. 9ml Peptonsaltvatten, 0,1% (1g Bactopeptan i 1000ml Fysiologisk NaCl) fanns i färdiga spädningskoppar. 1ml lösning blandades i första spädningskoppen därefter togs 1ml från varje spädningssteg till nästa spädningskopp.
2.2 Clostridium spp.
Selekterades och räknades på tryptose-sulphite-cycloserine agar (TSC) enligt NMKL 95;2;1985. Djupspridning från samtliga spädningar gjordes med 1ml prov. Samtidigt gjordes ytspridningar, 0,1ml racklades ut på FAA, från spädning – 1 till – 3 då 0,1ml från spädning – 1 motsvarar ytspridning – 2 osv. FAA och TSC inkuberades anaerobt i 37C i 24tim.
Från TSC renodlades 10 misstänkta Clostridium perfringens på hästblodagar och ägguleagar. Från FAA renodlades alla olika typer av misstänkta Clostridium spp på hästblodagar. Inkuberades sedan anaerobt i 37C i 24tim.
Clostridium perfringens växte med klar hemolys, var lecitinaspositiv samt hade ett karakteristiskt utseende och kunde därmed typas. För de andra misstänkta Clostridium spp noterades koloniutseende och hemolys därefter gramfärgades dessa och fermentationstestades.
2.3 Bacillus spp.
Odlades och räknades på hästblodagar. Ytspridningar gjordes från samma spädningsserie och enligt anvisningar ovan. Direkt odling gjordes från samtliga prover, 10µl inokulerades på hästblodagar. Hästblodagar inkuberades aerobt i 30C i 24tim.
Alla olika typer av misstänkta Bacillus spp renodlades på hästblodagar och MCS. Dessa inkuberades aerobt i 30C i 24tim.
Bacillus cereus växte med klar hemolys, var MCS positiv och kunde därmed typas (NMKL 67:4:1997). För de andra misstänkta Bacillus spp noterades koloniutseende samt hemolys sedan gramfärgades dessa och fermentationstest gjordes.
Alla misstänkta Bacillus spp, Clostridium spp och 2 Clostridium perflingens, från varje prov, frystes in i -20C. 1ml 10% glycerolserumbuljong användes som infrysningsmedium för
att bevara cellernas viabilitet. Cellerna frystes in i 1,0ml vialer (CryoTube™ vials, Nunc™, www.nuncbrand.com).
2.4 Kategorisering med gramfärgning.
Bakterier slammades upp i en liten droppe steril fysiologisk koksaltlösning på ett objektglas. Preparatet torkades och fixerades i låga. Ett snabbrecept användes enligt metodbok för gramfärgning, avdelningen för bakteriologi, SVA, Uppsala.
2.5 Genusbestämning med fermentation.
Bacillus spp inokulerades på en jäsningsserie med glukos, simmons citratagar, arabinos, mannitol, nitrat och Voges-Proskauers reaktion (VP).
Clostridium spp inokulerades på jäsningserie med glukos, maltos, laktos, sackaros, stärkelse, manitol, fruktos, indol, urea, gelatin och eskulin (Boone D.R, Castenhol R.W).
Ett antal kolonier, ca 10µl, slammades upp i ett serumbuljongrör. Substratet blandades med en pastörpipett därefter droppades, ca 4 droppar, i varje rör för de olika
jäsningsbuljongerna och de sista dropparna på hästblodagar för kontroll. En bakteriekultur inokulerades på ytan av Simmons citratagar.
Jäsningsrören och hästblodagar för Bacillus spp inkuberades i 37C i 24tim, med undantag av VP röret som inkuberades i 48tim. Jäsningsrören och hästblodagar för Clostridium spp inkuberades anaerobt i 37C i 24tim.
Jäsningstesten analyserades med hjälp av pH-indikator och pH-meter som var kalibrerad vid pH 4,01 och 7,0 vid 25C.
Fermentationsresultaten jämfördes sedan med Bergeýs Manual of systematic Bacteriology (Boone D.R, Castenhol R.W) för att kunna bestämma art av bakterie. De
misstänkta Bacillus spp och Clostridium spp som inte kunde typas skulle närmare identifieras med hjälp av PCR och sekvensering. DNA preparerades för PCR genom cell-lysering med hjälp av koklysat. Denna produkt användes sedan vid PCR för att därefter sekvenseras.
2.6 C. chauvoei.
För att detektera C. chauvoei användes endast PCR, med två specifika primers som medför att sekvensering inte behövs. Lägsta detektionsgränsen, LOD (Limit of Detection), i den här metoden är 200cfu/g (Bagge E. in manuscript).
Av samtliga prover gjordes en 1:2 H2Oblandning genom att 5g vägdes upp i en
kommersiell 50ml plastkopp med lock, till detta tillsattes 10ml natriumklorid (0,86-0,90%), koppen förslöts och skakades väl. Detta fick stå en halvtimme för att slammet ska sjunka till botten, bakterierna håller sig då flytande vilket är viktigt för att analysmaterialet ska innehålla så få inhiberande ämnen som möjligt. Av ytvattnet togs sedan 3ml i 8ml falkonrör. Dessa sattes i 65°C vattenbad ca 10min för att avdöda icke sporbildande bakterier. Substratet
odlades sedan ut, ca en blå ögla 10µl, på FAA plattor och inkuberades anaerobt, 48tim i 37C, därefter gjordes koklysat.
2.6.1 DNA preparation (koklysat).
Ett antal kolonier, ca en blå ögla 10µl, slammades upp i 500ml PBS (0,01M pH7,0 filtrerad 0,2u utan Ca och Mg) i ett 1,5ml eppendorfrör med lock och lås. Blandningen centrifugerades i 10min vid 14x103 rpm. Supernatanten pipetterades bort och pelleten resuspenderades i 500ml PBS och cetrifugerades på nytt i 10min vid 14x103 rpm. All PBS pipetterades bort och pelleten resuspenderades med 250ml vatten. Eppendorfröret förslöts väl och kokades i 20min och kyldes sedan direkt på is. De preparerade proverna förvarades i - 20C tills PCR-analys utfördes.
2.6.2 Beredning av C. chauvoei proverna till PCR.
Mastermixen blandades i ett renrum i en UV-bänk enligt följande (de volymer som anges gäller per DNA-prov och ska alltså multipliceras med det antal DNA-prov som ska
analyseras). 35,8µl milliQvatten, 5µl buffert (utan Mg2+), 5µl 2,5mM MgCl2, 1µl 0,2nM dNTP, 0,5µl 10µM, IGSC4 (GAA TTA AAA CAA CTT TAT TAA CAA ATG), 0,5µl 10µM,23UPCH (GGA TCA GAA CTC TAA ACC TTT CT), (Thermo Electron Corporation, www.thermo.com.biopolymers) plus 0,2µl Taq polymerase, (AmliTaqGold with GeneAmp lotn G11816).
48μl mastermix pipetterades till provbrunnar med tillhörande lock, (8caps/strips, Mico Amp, www.appliedbiosystems.com), och 2μl templat tillsattes. 1µl tillsattes av den positiva kontrollen, framställd av en positiv Clostridium Chauvoei stam från kliniskt fall (Sasaki Y. et a. 2000), plus 1µl milliQvatten samt 2µl av den negativa kontrollen, milliQvatten, tillsattes.
En preparation av mastermix för provmängd 5µl gjordes också. Mastermixen blandades efter samma protokoll med skillnaden att milliQvatten mängden minskades till 32,8µl. 45µl
mastermix pipetterades till provbrunnar och 5µl templat som först var spädd 1:10 tillsattes.
1µl tillsattes av den positiva kontrollen plus 4µl milliQvatten samt 5µl av den negativa kontrollen tillsattes.
2.6.3 PCR.
Den PCR-maskin som användes var MJ Research, PTC-200 Peltier Thermal Cycler.
Programmet hade en initial denaturering vid 95C i 5min detta följdes av 30 cykler med denaturering vid 94C i 1min, 1min annealing vid 54C och extension vid 72C i 7min.
(Sasaki Y. et al. 2000). PCR produkterna analyserades med hjälp av gelelektrofores.
2.6.4 Gelelektrofores.
Gelen förberedes genom att 3g agaros (-NA) och 200ml 1xTBE buffert kokades tills agarosen löst sig. Sedan tillsattes 10µl etidiumbromid till 0,5µg/ml. När gelen svalnat till 60C hälldes den ut på geltråget med 2 kamrar i vågrät position. 2µl av Gel loding solution enligt metodbok för gramfärgning, avdelningen för bakteriologi, SVA, Uppsala, blandades med 5µl av reaktionsvolymen och sattes på gelen, den översta raden brunnar för 2µl blandningen och den undre raden brunnar till 1:10 proverna.
Gelelektroforesen kördes vid 90V i ca 20min. Sedan sköljdes gelplattan av med
avjoniserat vatten och lades på UV-ljusbord och kort togs med en polaroidkamera. Analysen påvisade närvaro eller frånvaro av C. chauvoei amplimerer.
3. RESULTAT
Den kvantitativa analysen visar att många sporbildande bakterier överlever processen i en biogasanläggning. Både patogena och normala miljöflorabakterier kunde detekteras,
sammanlagt noterades 173 olika Colstridium spp samt 113 olika Bacillus spp. Dessa grupperades efter genus.
3.1 Clostridium spp.
Antalet Clostridium spp var ungefär lika i råsubstratet, dvs. före pastörisering. I proverna från biogasanläggning L reduceras antalet Clostridium spp mer efter pastörisering och rötning, se Fig 1.
0 1 2 3 4 5 6
KFP LFP KEP LEP KER LER Biogas.anl.
prov log10 cfu/g
Fig 1. Jämförelse av medelvärde i antal Clostridium spp vid båda biogasanläggningarna och de olika provtagningstillfällena, FP (före pastörisering), EP (efter pastörisering) och ER (efter rötning).
Ett återkommande antal av C. aurantibutyricum, C. bifermentans samt
C. butyricum detekterades från råsubstrat genom hygieniseringssteget samt efter rötning.
C. tetani och C. sordelli detekterades efter pastörisering respektive i råsubstrat. C. novy fanns i det inkommande råsubstratet vid två tillfällen.
De Clostridium spp som inte kunde typas med hjälp av jäsningsserie ska vidare typas genom sekvensering Tabell 1.
Tabell 1. Visar resultat av genusbestämning av Clostridium spp samt i vilket prov de förekom FP (före pastörisering), EP (efter pastörisering) och ER (efter rötning). I S-grupperna ingår de bakterier som ska vidare till sekvensering.
Grupperna 1-5representerar Clostridium spp som fermenterar på samma sätt.
I gruppen S10 ingår Clostridium spp där fermentationen inte stämde överens med de andra S-grupperna.
FP EP ER
C. tetani 1
C. sordelli 2
C. novy 2
C. aurantibutyricum 8 3
C. tyrobutyricum 1
C. butyricum 3 5
C. bifermentans 7 2 5
C. sardiniensis 1 1
C. limosum 1
C. formicoaceticum 1
C. perenne 1
C. oceanicum 1
C. nalenominatum 2
C. durum 1 1
C. celatum 1
C. glycolicum 1
C. barati 1 1
C. acetobutylicum 1
C. paraputrificum 3
S1 1 2 1
S2 4 5
S3 1 3
S4 2 1
S5 2 1
S6 1 1
S7 2
S8 1 1
S9 1 1
S10 (samlingsgrupp) 9 7 14
Antalet C. tetani kunde bestämmas till 2log10cfu/g, C. sordelli till 2log10cfu/g medans antalet C. novy var 2log10cfu/g respektive 3log10cfu/g i de två prover där bakterien påträffades.
Antalet C. perfringens visade sig vara lite högre vid biogasanläggning K före pastörisering. Men vid jämförelse med biogasanläggning L så reduceras antalet C.
perfringens, efter rötning, till ungefär samma antal vid de båda anläggningarna, se Fig 2.
0 1 2 3 4 5 6
KFP LFP KEP LEP KER LER Biogas.anl.
prov log10 cfu/g
Fig 2. Jämförelse av medelvärde i antal C. perfringens vid de olika
biogasanläggningarna och provtagningstillfällen,FP (före pastörisering), EP (efter pastörisering) och ER (efter rötning).
3.2 Bacillus spp.
Antalet Bacillus spp var lika i proverna före pastörisering. Ingen nämnvärd reducering av Bacillus spp kan noteras, se Fig 3.
0 1 2 3 4 5 6
KFP LFP KEP LEP KER LER Biogas.anl.
prov log10 cfu/g
Fig 3. Jämförelse av medelvärde i antal Bacillus spp vid båda biogasanläggningarna och de olika provtagningstillfällena, FP (före pastörisering), EP (efter pastörisering) och ER (efter rötning).
Antalet Bacillus spp som kunde bestämmas med avseende på genus var 13st och den största andelen var B. polymyxa. Dessa kunde följas från råsubstrat genom
hygieniseringsteget samt efter rötning. Före pastörisering hittades B. licheniformis men antalet var få.
Bacillus Cereus kunde typas vid fyra tillfällen och de detekterades i råsubstrat, efter pastörisering samt efter rötning.
De övriga Bacillus spp har delats in i 21 grupper efter fermentations egenskaper och dessa ska typas vidare genom sekvensering.
3.3 C. chauvoei.
Två prov visade positivt resultat vid analysen av C. Chauvoei. Båda proverna togs vid biogasanläggningen K före pastörisering, se Fig 4.
Fig 4. Visar gelelektrofores av ett positivt prov med C. chauvoei vid ett KFP prov (K före pastörisering).
Första brunnen är storleksmarkören andra brunnen visar KFP prov och sista brunnen är den positiva kontrollen.
Den övre raden är 2µl DNA-mall och den undre raden brunnar är 5µl 1:10 DNA-mall.
4. DISKUSSION
De biokemiska metoderna som användes i den här studien har påvisat patogena och icke patogena bakterier. Vissa av dessa bakterier kan ställa till stora som små problem och är därför inte önskvärda i en djurbesättning.
Ett oväntat fynd var C. tetani som påträffades EP (Tabell 1). Denna bakterie producerar tetanustoxin som orsakar sårinfektioner och kan leda till stelkramp. Tetanustoxin är en av de tre giftigaste substanser som känns till. Kontamination av en djurbesättning kan få förödande konsekvenser då stelkramp orsakar hög dödlighet. Att C. tetani påträffades efter pastörisering är intressant och måste beaktas.
C. bifermentans orsakar sårinfektioner och typades vid ett flertal tillfällen och kunde följas genom hela processen (Tabell 1).
C. novy och C. sordelli kan orsaka gasgangrän en inflammation med utbredd vävnadsdöd och riklig gasbildning. C. novy och C. sordelli påträffades ett par gånger före pastörisering (Tabell1). Kanske hygieniseringssteget fungerade men mer troligt är att floran i rötkammaren konkurrerar ut de patogena bakterierna.
I en inledande studie har normalflora av sporbildare i kogödsel undersökts. Den vanligaste sporbildaren i gödseln var Clostridium perfringens, som hittades i 57 av 97 faecesprover från boskapen (Bagge E. et al. 2004). En anledning till ett ökat antal C. perfringens i råsubstratet vid biogasanläggning K, i den här studien (Fig 2), kan vara att de har större andel gödsel i råsubstratet. Antalet Clostridium perfringens, som kvantitativt visats i Fig 2, uppfyller minimikriterier för att kunna typa C. perfringens. Dessa minimikriterier är klar hemolys på blodagar, lecitinaspositiv samt ett karakteristiskt utseende. Fermentationsanalysen gav fler C.
perfringens, som inte uppfyller alla dessa minimikriterier.
C. butyricum, som påträffades vid ett flertal tillfällen, och C. tyrobutyricum, som endast påvisades en gång FP (Tabell 1), är bakterier som bland annat förstör osten om den skulle kontaminera mjölken. Dessa är inte patogena bakterier utan de orsakar främst praktiska problem samt ekonomiska förluster inom osttillverkningsindustrin.
C. aurantibutyricum kunde också typas vid ett flertal tillfällen (Tabell 1), och ett
dendrogram visade att bakterien inte var nära släkt med C. butyricum eller C. tyrobutyricum (Collins M.D. et al. 1994).
B. cereus orsakar juverinfektion och matförgiftning hos människan, (Christiansson A.
1999), och denna hittades vid alla tre provtagningsställena (Tabell 1). B. licheniformis som
påträffades ett fåtal gånger (Tabell 1) kan orsaka abort och mastit hos ko och får (Quinn P.J.
et al. 2000).
Den här studiens molekylärbiologiska analys av C. chauvoei gav två positiva resultat, vid biogasanläggning K före pastörisering (Fig 4). Dessa prover gav ingen uppföljningsmöjlighet då de positiva proverna var före pastörisering detta kan kanske ha att göra med att råsubstratet innehöll slakteriavfall eller liknande med C. chauvoei-positiva kadaver. C. chauvoei kan sedan ha avdödats under hygieniseringssteget eller mest sannolikt är att den har konkurrerats ut vid rötning. Att C. chauvoei inte kunde detekteras på blodagar samt med jäsningstest kan bero på att den växer långsammare än övrig flora på blodagar .
Biokemiskt typades 2/3 av bakterierna och 1/3 kommer att sekvenseras. De
molekylärbiologiska metoderna kan ge möjlighet till fynd av nya arter och typer av bakterier.
PCR är ett enkelt sätt att detektera bakterier om man har rena bakteriekolonier men dessa provmatriser innehåller många komponenter som kan verka inhiberande på PCR- analysen.
Lipider, salter, proteiner, fett, kolesterol, DNA och metalljoner är komponenter som kan en inhiberande effekt på PCR- analysen. Provmatrisen innehåller samtliga genom att det i råsubstratet finns avfall från slakterier, restauranger, läkemedelsindustrier samt skörderester.
Detta kan försvåra framrening av DNA, mycket DNA från andra bakterier som inte renas bort helt kan dessutom påverka PCR- analysens känslighet och specificitet (Löfström C. et al.
2004). Genom att använda specifika primers, så som dem för C. chauvoei, förbättras analysen men PCR- analys med Clostridium spp och Bacillus spp primers kan däremot ge opålitliga eller utesluta resultat.
Svärmning och överväxt på plattorna kan vara ett problem när bakterier som växer
långsammare än övrig flora, så som C. chauvoei och C. tetani, ska detekteras då dessa lätt blir utkonkurrerade. Detta kan vara en anledning till varför C. tetani endast påträffades en gång.
Redovisningen av Clostridium spp visar endast kvantitativt resultat från TSC då FAA ofta var överväxt och/eller oläsliga. Odlingarna från spädningsserien – 1 på FAA och hästblodagar togs bort, efter en tid in i projektet, då det ofta var överväxt och oläsliga odlingar från dessa spädningar. Direkt odlingarna på FAA och hästblodagar togs också bort då det inte gav några nya resultat i jämförelse med odlingarna från spädningsserien.
En faktor som påverkar resultaten är torrsubstanshalten då den minskas från 7-10% i råsubstratet till 4-6% i rötresterna (Bagge E. et al. 2005). Detta bör beaktas vid resultatanalys
då proverna efter rötning är mer utspädda och därmed finns ett högre antal än vad som kvantitativt har visats.
Clostridium spp typades biokemiskt och de bakterier som inte kunde genusbestämmas kommer att typas med hjälp utav sekvensering. Även otypade Bacillus spp kommer att genusbestämmas med sekvensering.
Intressanta resultat av sekvenseringsgrupperna väntar då det är många bakterier EP och ER som ska sekvenseras (Tabell 1). Detta kan ge en viss aning om floran i rötkammaren utkonkurrerar de patogena bakterierna men det krävs också vidare studier för att kunna avgöra detta.
Bacillus spp fermentationstestet typade främst patogena bakterier. Det är en anledning till att det är en stor grupp av Bacillus spp som behöver typas med sekvensering eftersom
råsubstratet och rötresterna innehåller många Bacillus spp som ingår i den normala miljöfloran.
Jordbruksanvändningen utgör den största delen av användning för biogödsel. Pastörisering och rötning sker i slutna system och möjlighet till kontroll är bra. Men som den här studien har visat överlever patogena och icke patogena bakterier som inte är önskvärda i en
djurbesättning. Alternativet skulle vara att avdöda alla bakterier genom sterilisering men en sådan reningsmetod kräver många och långa processer som bidrar till att det är orealistiskt ur en praktisk synvinkel samt att det inte är ekonomiskt försvarbart.
Gödsel sprids ofta på åkermark och detta kan sprida patogener på samma sätt som biogas rötrester. Den betydande skillnaden är dock att gödslet oftast sprids på den egna gården där djuren oftast har samma antal och samma typ av sporbildande bakterier i faeces (Bagge E. et al. 2004). Rötresterna har en större geografisk spridning och därmed större risk att
kontaminera flertalet lantbruk.
En studie har visat att efterföljande hantering kan försämra kvalitén på rötresterna, att den kan återsmittas under transport från anläggningarna (Ekvall A. et al. 2005). Vissa tekniska problem, såsom adekvat invändig rengöring av tankar på de bilar som transporterar både råsubstrat in till anläggningarna och rötrest tillbaka till gårdarna, kvarstår att lösa, för att förhindra återkontamination av rötresten (Bagge E. et al. 2005). En lösning som den ena biogasanläggningen har arbetat fram är delade fack i tanken på bilen.
Den här studien visar att patogena och icke patogena sporbildande bakterier överlever processerna i biogasanläggningar. Dock behövs fortsatta undersökningar för att bestämma huruvida fynden av antalet bakterier är tillräckligt för att det ska vara risk för smitta vid spridning av rötrester.
Studier på anaerob rötning i laboratorisk skala, med inympning av patogena sporbildande bakterier, kommer också att utföras. Detta för att utvärdera om de patogena bakterierna blir utkonkurrerade i rötkammaren.
ACKNOWLEDGEMENTS
Jag vill tacka mina handledare samt mina opponenter, Jelena Bijelovic och Luis Eduardo Sanchez Lecaros.
Ett särskilt tack vill jag ge till Elisabeth Bagge för handledning vid laboratoriearbete och för all hjälp med utformningen av detta arbete.
Jag vill också tacka all personal på Avdelningen för bakteriologi på SVA för en trevlig period.
5. REFERENSER
Bagge E. 2001, Organiskt avfall som gödningsmedel: Finns det risk för återinfektion efter hygienbehandling?. Biologik 3, 8-12
Bagge E. 2003, Hygien i rötrest från svenska biogasanläggningar. Nytt om biogas 4, 8-9 Bagge E. Johansson K.E. Persson M. Albihn A. 2004, Sporbildande bakterier i gödsel från nötkreatur. SVA-vet 3, 4-5
Bagge E. Sahlström L. Albihn A. 2005, The effect of hygienic treatment on the microbial flora of biowaste at biogas plants. Water Resear 39, 4879-4886
Bagge E. C. chauvoei in bovine faeces, pasturage soil and digested residues. In manuscript Boone D.R. Castenhol R.W. Bergeýs Manual of systematic Bacteriology, volyme one first edition.
Christiansson A. Bertilsson J. Svensson B. 1999, Bacillus cereus in raw milk: Factors affecting the contamination of milk during the grazing period. Journal of Dairy Science 82, 305-314
Collins M.D. Lawson P.A. Willems A. Cordoba J.J. Fernandez-Garayzabal J. Garcia P. Cai J.
Hippe H. Farrow J.A.E. 1994, The Phylogeny of the genus Clostridium: Proposal of Five New Genera and Eleven New Species Combination. International journal of systematic
bacteriology 44(4), 812-826
Ekvall A. Albihn A. Bagge E. Norin E. 2005, Effektivitet av fordonsdesinfektion för transport av rötrest. BMm Borås, SP Rapport 2005:1,
Lampel K.A. Dyer D. Kornegay L. Orlandi P.A. 2004., Detection of Bacillus spores using PCR and FTA filters. Journal of food protection 67(5), 1036-1038
Larsen H.E. Munch B. Schlundt J. 1994, Use of Indicators for monitoring the reduction of Pathogens in animal waste treated in biogas plants. Zentralbl Hyg Umweltemed 195(5-6), 544-555
Löfström C. Knutsson R. Engdahl A. Rådström P. 2004, Rapid and specific detection of Salmonella spp. in animal feed samples by PCR after culture enrichment. Applied and environmental microbiology 70, 69-75
Sahlström L. 2003, A review of survival of pathogenic bacteria in organic waste used in biogas plants. Bioresource Technology 87, 161-166
Sahlström L. Aspan A. Bagge E. Danielsson-Tham M.L. Albihn A. 2004, Bacterial pathogen incidences in sludge from Swedish sewage treatment plants. Water Research 38, 1989-1994 Sasaki Y. Yamamoto K. Kojima A. Tetsuka Y. Norimatsu M. Tamura Y. 2000, Rapid and direct detection of Clostridium chauvoei by PCR of the 16S-23S rDNA spacer region and partial 23S rDNA sequences. Journal of Veterinary Medicine Science 62(12), 1275-1281
Quinn P.J. Carter M.E Markey B. Carter G.R. 2000, Clinical veterinary microbiology, MOSBY
