Examensarbete, 15 hp
Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2021
LRIG1 påverkan mot trippel vildtyp-melanom
Maha Hadi
Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk analytikerprogrammet
Examensarbete, 15 hp
Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson ylva.hedberg.fransson@umu.se
Läraropponent:
Ylva Hedberg Fransson
Examinator:
Mari Norgren
Datum för godkännande:
2021 06 15
LRIG1 Influence Against Triple Wild-Type Melanoma
Handledare Ola Billing
Institutionen för kirurgisk och perioperativ vetenskap, Umeå universitet
3
Abstrakt
Ungefär hälften av alla maligna melanom är BRAF-muterade och kan behandlas med BRAF-hämmare.
Trippel-vildtypmelanom saknar mutationer i MAPK/ERK-signalvägen och saknar effektiv behandling.
Genen Leucine-rich repeats and immunoglobilin-like domains 1 (LRIG1) reglerar epidermal growth factor receptor (EGFR), som verkar uppströms om både MAPK/ERK-signalvägen och PI3K/AKT- signalvägen. Hypotesen är att ett högt uttryck av LRIG1 i metastaserat trippel-vildtypmelanom associerar med längre överlevnad. Syftet med denna studie var att undersöka om rekombinant LRIG1 har antiproliferativ effekt mot BRAF-muterad A375 melanom, trippel vildtyp colo-489 och wm-3211 melanomceller. Sekvenseringsdata från metastaser undersöktes och proliferation och proteinuttryck i tre melanomcellinjer testades, där en var BRAF-muterad A375 och två var trippel vildtyp colo-849 och wm3211. Sekvenseringsdatat visade att LRIG1 var generellt högre uttryckt i tumörer med trippel vildtypmelanom än i övriga subtyper. I odlade cancercellinjer upptäcktes att LRIG1 hämmade proliferation något i colo-849 men inte i A375 eller wm3211. LRIG1 hämmade AKT i BRAF-muterade celler, men inte i trippel vildtypceller. Det identifierades inga skillnader på signalering genom MAPK/ERK-signalvägen. Konklusionen av denna studie var att rekombinant LRIG1 inte hade antiproliferativ effekt mot BRAF hämmarens resistenta melanomceller A375 och wm-3211 trippel- vildmelanomceller, men colo-489 melanomceller var känslig.
Nyckelord
Cellkultur, trippel vildtypmelanom, rekombinant LRIG1, EGFR, proliferation, melanomcellinjer
4
Introduktion
Malignt melanom är en hudcancer som utgår från melanocyter, vilket är de celler som bildar melanin.
Incidensen för malignt melanom har ökat under senare år, vilket förmodas bero på en ökad exponering för UV-strålning (1). För att klassificera och främja förståelse av sjukdomar kan
patientdata laddas ned från Cancer Genom Atlas (TCGA). Det är ett forskningsnätverk som samlat in mängder med data från patienter med olika tumörtyper. De databaser som genereras av TCGA innehåller avpersonifierade kliniska patientdata kopplade till sekvenseringsdata och data på proteinuttryck och metylering. Dessa databaser möjliggör kraftfulla analyser av cancergenetik, potentiella biomarkörer och komplexa cancerbiologiska samband (2).
Tumörerna vid malignt melanom uppkommer genom onkogena mutationer i arvsmassan, beroende på vilka mutationer det är som driver tumören delas tumörerna in i fyra subtyper. Den genomiska
klassificeringen i de fyra subtyperna av melanom är baserat på mönstret för mutationer i generna BRAF, RAS och NF1. Mutationer i dessa gener driver på signalering genom RAS-RAF-MEK- MAPK/ERK (MAPK/ERK)-signalvägen. Det finns även en fjärde subtyp av melanom som saknar mutationer i dessa gener, trippel vildtyp (3). MAPK/ERK-signalvägen utgår från cellmembranet och aktiveras av tillväxtfaktorer från cellens utsida. I cellmembranet sitter receptortyrosinkinaser (RTK) som kan binda till dessa tillväxtfaktorer och aktivera signalvägen inuti cellen. Ett sådant RTK är epidermal growth factor receptor (EGFR) som styr tillsammans med sina ligander regleringen av flera cellulära processer såsom cellcykel, differentiering, migrering, metabolism och överlevnad. Därför spelar EGFR en viktig roll i utvecklingen av olika cancerformer och är ett attraktivt mål för riktad terapi (4). I de normala cellerna finns EGFR men proteinets överuttrycks i flera cancerformer. EGFR- aktivering spelar också en roll i resistens mot kemoterapi och strålbehandling i tumörceller. Många ansträngningar har riktats mot att utveckla cancerläkemedel som kan störa EGFR-aktivitet. De vanligaste farmakologiska metoderna för att hämma EGFR har varit att utveckla monoklonala antikroppar (5). Nedströms om EGFR skickas signaler vidare till cellkärnan genom kinaser i MAPK/ERK-signalvägen. Dessa nedströms signalmolekyler spelar därför också en viktig roll i
tumörgenes. Förstärkt signalering genom MAPK/ERK-signalvägen kan orsakas av onormal aktivering av RTK eller aktiverande mutationer i RAS- eller RAF-gener. Dessa vägar anses därför vara potentiella terapeutiska mål för cancerbehandling (4).
BRAF är ett tyrosinkinas nedströms om EGFR och RAS i MAPK/ERK-signalvägen och har till uppgift att reglera gener som styr celldelning samt apoptos. BRAF-mutationer är vanligast i positionen V600 och den vanligaste onkogena förändringen är substitutionen V600E (2). BRAF-kinashämmaren vemurafenib (PLX4032) är ett godkänt läkemedel mot metastaserat melanom med BRAF V600E- mutationen och den har bra effekt hos mer än 50% av patienterna (6). Den tidiga utvecklingen av läkemedelsresistens påverkar dock behandlingens framgång. Resistens kan uppkomma på flera sätt:
antingen genom att tumörceller överuttrycker BRAF eller genom att de överuttrycker receptor- tyrosinkinaser (RTK) eller deras ligander uppströms om BRAF 7, (8). Tumörer kan även uppnå resistens genom ökad signalering i PI3K-AKT-signalvägen (9). PI3K-AKT-signalering kan tryckas ner i
5
resistenta melanom genom att behandlas med IGF-1R/PI3K- och MEK-hämmare och inducera död i BRAF-hämmarresistenta celler.
Leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains (LRIG) är en familj av transmembran- proteiner som innehåller de tre medlemmarna LRIG1, LRIG2 och LRIG3. LRIG1 fungerar som en tumörsuppressor och som en prognostisk markör i många tumörtyper. LRIG1 hämmar (EGFR) genom att främja nedbrytning av EGFR i lysosomen (10). Den delen av LRIG1 som sitter utanför
cellmembranet, ektodomänen, kan avspjälkas och bidra till att trycka ner cancercells proliferation både in vitro och in vivo (11, 12).
LRIG1 nedregleras i melanom, både under tidig tumörutveckling och under utveckling av BRAF- hämmarens resistenta celler (13). Celler som förlorar LRIG1, antingen genom gen-knockout eller under resistensutveckling blir känsliga för behandling med rekombinant LRIG1. Flera observationer tyder på att LRIG1-tumörundertryckning är beroende av MAPK/ERK-signalering; LRIG1 reglerar flera RTK uppströms om MAPK och PI3K/AKT, såsom EGFR (10). Överlevnadsfördelarna hos
melanompatienter från LRIG1 beror på EGFR-nivåer och att överlevnadsvinsten från högt LRIG1 går förlorad i BRAF- och RAS-muterade undertyper hos melanompatienter (13). Rekombinant LRIG1 har en hämmande effekt på proliferation i BRAF-muterade melanomceller som blivit resistenta mot BRAF-hämmare.
För att öka förståelsen för MAPK/ERK-signalering och PI3K-AKT-signalering detekteras proteiner som avspeglar de här signalvägarna med western blot. Det är en metod som användas vid detektion av specifika proteiner med antikroppar. Proteinerna denatureras och separeras med elektrofores i en polyakrylamidgel, där stora proteiner förflyttar sig långsammare än mindre proteiner. Efter separationen överförs proteinerna från polyakrylamidgelen med elektrisk spänning till ett
polyvinylidenfluoridmembran som blockeras med en blocklösning för att förhindra att antikroppar binder in ospecifikt till membranet. När blockningen är klar, inkuberas membranet med
primärantikroppen som binder till ett specifikt målprotein. Överflödiga antikroppar tvättas bort med tvättlösning. Sedan appliceras den sekundära antikroppen som binder till den primära antikroppens artspecifika IgG-domän. Sekundära antikroppar kopplade till fluorescerande peptider möjliggör samtidig detektion av flera proteiner på samma membran (14).
Malignt melanom är den allvarligaste formen av hudcancer som ökar mest i dagens samhälle. Den beror oftast på att exponering till solen. Solen har en effekt som ger oss värme och hjälper oss att reglera vår dygnsrytm samt gör kroppen bildar D-vitamin. Däremot det har också en negativ effekt, då mycket tid i solen ökar risken för flera typer av hudcancer. Risken är större i länder där solen är starkare än vad den är i Sverige. Det gäller särskilt vid resan utomlands under den svenska vintern då individen inte har varit i solen på länge. Att få ett cancerbesked kan göra att den drabbade individen hamnar i kris eftersom sjukdomen kan upptäckas vid en vanlig hälsoundersökning, då individen kan vara helt oförberedda (15). Syftet med denna studie var att undersöka om rekombinant LRIG1 har anti-proliferativ effekt mot den BRAF-muterade cellinjen A375 och två cellinjer av trippel vildtyp colo- 849 och wm-3211.
6
Material och metoder
Cellinjer
I denna studie användes tre olika cellinjer, den BRAF-muterade cellinjen, A375 (gåva från Gustave Roussy, Villejuif, Frankrike), och två cellinjer av subtypen trippel vildtyp, colo-849 (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) och wm3211 (Rockland Immunochemicals, Inc. Limerick, PA, MA), vilka båda saknar mutationer i BRAF, RAS och NF1. A375 odlades i DMEM innehållande+ 10% FBS. Colo- 849 odlades i RPMI med 10% FBS och wm3211 odlades i Tumor Specialized Media (80% MCDB-153 medium, 18% Leibovitz’s L-15 medium, 1,68 mM CaCl2, 2% FBS).
Bioinformatik
Ett dataset med avidentifierade kliniska data, genuttrycksdata och mutationsdata från 481 melanom- patienter laddades ner från TCGA i april 2021, exklusionskriterierna var samma som använts tidigare (13). Datasetet över patienterna exkluderade genuttryck, överlevnad eller “days to submitted
specimen”, neoadjuvant behandling, annan malignitet under uppföljningstiden, uppföljningstid <60 dagar,utan ny tumör under uppföljningstiden samt avliden och provtyp “additional metastasis”, “solid tissue normal” eller “missing”. Det slutgiltiga datasetet innehöll endast data från patienter som sorterades utifrån mutationsdata till de av subtyperna och innehöll 93 BRAF-muterade patienter, 69 RAS-muterade patienter, 25 NF1-muterade patienter och 28 trippel vildtyp patienter. Två
melanomcellinjer av typen trippel vildtyp colo-849 och wm-3211 identifierades med mutationsdata från cBioPortal (www.cbioportal.org).
Beredning av lysat
Celler tvättades två gånger i iskall 1xPBS och lyserades i 5 min i Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer) med proteas- och fosfatashämmare (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
Lysatet samlades och överfördes till epp-rör. Sedan placerades lysatet på skak under 30 min vid 4°C.
Proverna centrifugerades vid 4°C/14 000 g i 10 min och supernatanten överfördes till nya rör.
Proteinkoncentration mättes med Bicinchoninic syra metoden (BCA).
Western blot
Lysaten späddes till 1 µg/µL med mQ-vatten och 4x Laemmli-buffert (BioRad, Hercules, MA).
Proteinextrakten denaturerades på värmeblock i 5 min, 95°C. Polyakrylamidgeler med 4–15% Mini- protean® TGX™ Precast Protein Gel (Bio-Rad) monterades och 20 µg lysat applicerades i varje brunn, varpå proteiner separerades under elektrofores i running buffert (VWR International AB, Stockholm, Sverige) i 200 V under 35 min. Därefter överfördes proteinerna till PVDF-membran (BioRad) med en BioRad turbo transfer-maskin i 7 min. Membranen skars till och blockerades i blocklösning (50% TBS- T, 50% Li-Cor TBS block (Li-Cor Biosciences, Lincoln, MA)) under 60 min i rumstemperatur (RT) på skak. Membranen inkuberades med primärantikropp över natten vid 4°C på skak. De primära anti- kropparna var kanin anti-LRIG1 (Agrisera, Vännäs, Sverige), 1:1000; mu anti-aktin (Abcam, Cambridge, Storbritannien), 1:3000; kanin-anti-phospho-EGFR, 1:1000; kanin anti-phospho-AKT, 1:1000; och kanin anti phospho-ERK1/2, 1:2000 (Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA).
7
Membranen tvättades fyra gångar i 10 min vid RT i TBS-T och inkuberades sedan med sekundära antikroppar i en tim vid RT med försiktig skakning. De sekundära antikropparna var goat anti-kanin CW800, 1:5000; och goat anti-mouse RD680, 1:15 000 (Li-Cor Biosciences, Lincoln, MA). Efter ytterligare en tvätt i TBS-T enligt ovan visualiserades proteinband med Azure c600 (Azure Biosystems, Dublin, MA). Kvantifiering av band angavs som proteinuttryck delat med aktin för varje cellinje och sedan normaliserat mot indikerad kontroll.
Cellproliferation
Cellinjerna odlades på flaskor till cirka 80% konfluens, varpå de lossades med trypsin och räknades.
Celler såddes ut i triplikat i 96-hålsplattor med densiteten 3 000 celler per brunn för A375 cellinjen eller 6 000 celler per brunn för COLO-849 och WM3211 cellinjer. Därefter inkuberades de i 4 tim i 37°C. Under tiden förbereddes testmedium, som inkuberades i 30 min vid 37°C. Testmediet innehöll antingen 5 ug/mL rekombinant LRIG1 eller 5 ug/mL kontrollpeptid His-MBP-Strep eller endast nytt odlingsmedium. När cellerna blev fasta i brunnarna, sögs gammalt medium bort och testmedium tillsattes. Cellerna inkuberades i testmedium i 72 tim vid 37°C. Efter det tillsattes 8 uL WST-1-reagens (Sigma-Aldrich Sweden AB, Stockholm, Sverige) per brunn, följt av inkubering i 4 tim och avläsning vid våglängden 450 nm.
Statistik
Alla statistiska analyser gjordes i programmet GraphPad Prism, version 9.1.0. Skillnader i LRIG1 mRNA-uttryck mellan metastasvävnad från patienter med olika subtyper av melanom testades med ett tvåsidigt Student’s t-test mellan gruppen trippel-vildtyppatienter och övriga, sammanpoolade grupper.
Normalisering i proliferationsexperimentet gjordes separat för varje enskild cellinje genom att dela alla värden med medelvärdet för obehandlade celler. Cellproliferation testades med ett tvåsidigt Anova med Tukey’s fler jämförelsetest. Signifikansnivåer: *p < 0,05; **p < 0,01; ****p < 0.0001.
Etiska överväganden
Inget material och ingen metod som användes i denna studie krävde etiskt godkännande. De TCGA- data som användes innehåller endast avpersonifierade data, som inte går att koppla till individer.
Sekvenseringsdata som användes var endast normaliserade reads per transkript och sekvens avseende några specifika mutationer. Dessa data går inte att använda som specifika gensignaturer för att spåra tillbaka till en specifik individ. Andra metoder som användes angränsar inte till något som kräver etiskt godkännande. I det övergripande projektet finns ett etiskt godkännande från den regionala etikkommittén i Umeå (DNR 2015-436 415-31M) för insamling och användande av kliniska data och vävnad. Inga kliniska data eller vävnader insamlade i Umeå användes i denna studie.
8
Resultat
mRNA LRIG1-uttryck melanomsubtyper
När proverna från 216 melanompatienter delades upp i subtyper efter mutationsprofil, ingick 93 BRAF-muterade, 69 RAS-muterade, 25 NF1-muterade och 28 trippel-vildtyp. Vid jämförelse av LRIG1 mRNA-uttryck mellan de fyra melanom subtyperna, var det signifikant högre i metastasvävnad från trippel vildtypmelanom jämfört med övriga subtyper (Fig. 1).
Cellproliferation för de tre cellinjer
Tre melanomcellinjer exponerades för rekombinant LRIG1 för att testa om det kunde undertrycka proliferation av melanomceller. Proliferationen sjönk närcolo-849 behandlades med rekombinant LRIG1 vid 2 ug/mL och reducerades ännu mer vid 5 ug/mL , medan så inte var fallet i A375 eller wm3211. WM3211 stimulerades signifikant av både kontrollproteinpreppen och LRIG1-preppen (Fig.
2).
Proteinsdetektion med western blot
Western blot-analys utfördes på melanomcellinjerna A375, colo-849 och wm-3211 för att detektera LRIG1-, EGFR-, p-Erk- och p-AKT- protein. LRIG1 uttrycket var lågt (Fig. 3A) och P-EGFR kunde inte detekteras i någon cellinje (Fig.3B). Western blot som visade fosforylerat ERK från alla cellinjer misslyckades (Fig. 3C) medan de erhållna resultaten på P-ERK i colo-849 visade ett starkt band (Fig.
3D).
P-AKT-proteinet i colo-849 cellinjen som behandlades med rekombinant LRIG1 och den andra som inte behandlades med rekombinant LRIG1 gav ett starkt band. Mycket svaga band detekterades i wm- 3211 melanomcellinjen i både LRIG1-behandlade och kontrollbehandlade celler. Vad gäller resultaten av A375 gav celler som behandlades med rekombinant LRIG svagare band än de celler som inte behandlades med rekombinant LRIG1 (Fig. 3E, F).
9
Diskussion
Mycket talar för att LRIG1 har en viktig funktion i tumörutveckling i huden. Tidigare studie har visat att keratinocyt hyperproliferation som associeras med förlust av LRIG1 liknar en fenotyp som beskrivs i LRIG1 knockout möss (16). LRIG1-uttryck minskas med keratinocyt hyperproliferation i nevi vävnad, liknande det som tidigare observerades i hudskador vid psoriasis (17). Detta kan vara relevant för tidig melanomutveckling i huden, eftersom keratinocyter är kända för att undertrycka melanocyt-
proliferation och migrering genom cell-cell kontakter och parakrin reglering av RTK-signalering (1).
Hypotesen i detta arbete var att rekombinant LRIG1 kunde fungera som ett antiproliferativ protein mot trippel vildtypmelanomceller. Behandling med rekombinant LRIG1 verkade undertrycka
proliferation något i trippel vildtypcellinjen colo-849 vid behandling med 2 och 5 g/mL rekombinant LRIG1. I den andra trippel vildtypcellinjen wm-3211 verkade kontrollpeptid stimulera celler till ökad proliferation på samma sätt som proteinextrakt som innehöll rekombinant LRIG1. Därför var det svårt att bedöma om rekombinant LRIG1 hade en verklig effekt på proliferation i WM3211-celler eller inte. I BRAF-muterade A375-celler var proliferationen inte påverkad av vare sig kontrollpeptid eller LRIG1.
Även om bara en av de två melanomcellinjerna av subtypen trippel vildtyp svarade på behandling med minskad proliferation är resultatet intressant.
Spekulativt, skulle andra egenskaper förutom avsaknad av mutationer som aktiverar MAPK/ERK- signalvägen kunna ha betydelse för effekten av rekombinant LRIG1. Möjligen skulle colo-849
exempelvis kunna vara mer beroende av signalering genom AKT. I enlighet med det resonemanget var det tydligt att nivån av phosphorylerat AKT var högre i colo-849 än i wm-3211. Däremot sågs ingen tydlig reduktion av phosphorylerat AKT när colo-849 behandlades med rekombinant LRIG1. I det ena experimentet gick nivån upp något och i det andra experimentet gick nivån ner något. Det är möjligt att en reduktion i phosphorylerat AKT låg bakom den minskade proliferationen i colo-849 vid behandling med rekombinant LRIG1. Upprepade försök behövs för att kunna visa att LRIG1 har en verklig och reproducerbar effekt på proliferation i dessa celler. Andra typer av försök med
kombinationsbehandling med AKT-hämmare behövs för att kunna visa eller avfärda att effekten i så fall går genom AKT.
I denna studie var de detekterade proteinnivåerna av LRIG1 i melanomcellinjer för låga för att kunna kvantifieras. Därför kunde inte potentiella associationer mellan cellproliferation och uttryck av LRIG1- protein undersökas. På samma sätt kunde inte phospho-EGFR-protein detekteras, kvantifieras eller testas för associering med proliferation i någon cellinje. Dessa negativa resultat kan ha berott på att LRIG1 och phospho-EGFR-proteinnivåerna var lågt uttryckta i cellinjerna eller på att
antikroppsinfärgningarna inte fungerade. Det har visats att nivåerna av LRIG1 sjunker under utveckling av melanom, från normal hud till nevus och från nevus till melanom (13). Den
extracellullära ektodomänen av LRIG1 kan spjälkas av från cellmembran in vitro och in vivo (11) och framrenad rekombinant ektodomän fungerar som ett antiproliferativ protein mot BRAF-hämmar resistent melanom. Dessutom verkar LRIG1 ha betydelse för överlevnad i trippel vildtypmelanom patienter (13).
10
Resultaten för P-EGFR från samtliga cellinjer gav hög bakgrund och för att optimera denna detektion är det lämpligt att testa olika blocklösningar. Det kan hända att banden skulle ha framkommit om andra antikropptyper testades och proteinets massa som applicerades i gelen ökades. P-ERK signalen var stark i alla cellinjer, men påverkades inte av rekombinant LRIG1. Det verkar således inte kunna påverka MAPK/ERK-signalering i varken A375, colo-849 eller i WM3211. Detta överensstämmer med tidigare studier på A375-celler (13), men inte i någon trippel vildtypmelanomlinje. Det visades även tidigare att LRIG1 kan hämma fosforylering av AKT i BRAF-muterade celler (13). I denna studie bekräftades att rekombinant LRIG1 hämmade fosforylering av AKT i BRAF-muterade celler. Däremot sågs ingen liknande effekt i trippel-vildtypmelanomceller.
Fördelen av denna studie var att den gav värdefull information samt grunder för hur forsknings- processen planeras. Under arbetets gång uppkom vissa förhinder med cellodling, där celltillväxten ibland var oväntat låg. Den optimala celltätheten för vidare användning för proliferations test och western blot var 80%. Om celltätheten blev mindre än 80% kunde celler inte användas och behövde då odlas vidare tills den nådde en lämplig nivå. Däremot krävdes det att cellinjerna sattes om vid högre än 80% täthet. Ett annat problem som uppstod i studien var att ett par western blots misslyckades på grund av polymerisesringsfel i polyakrylamidgelen. Detta ledde till att proteiner inte migrerade som de skulle under elektrofores och att proteinkvantifiering i de fallen inte var möjlig.
Sammanfattningsvis visade studien att uttrycket av LRIG1 var högt i metastaserat trippel vildtyp- melanom och att rekombinant LRIG1 inte hade antiproliferativ effekt mot varken den melanom- cellinjen A375 eller mot wm-3211 melanomcellinjen. Viss effekt sågs dock vid behandling av colo-849- melanomcellinjer med rekombinant LRIG1, men kunde inte kopplas till förändrad signalering nedströms om EGFR. Konklusionen av studien var att rekombinant LRIG1 hämmar proliferation i colo-849-celler och aktivering av AKT i BRAF-muterade A375-celler.
11
Referenser
1. Wang JX, Fukunaga-Kalabis M, Herlyn M. Crosstalk in skin: melanocytes, keratinocytes, stem cells, and melanoma. J Cell Commun Signal. 2016;10(3):191-6. DOI: 10.1007/s12079-016-0349-3.
2. Hutter C, Zenklusen JC. The cancer genome atlas: creating lasting value beyond its data. Cell.
2018;173(2):283-5. DOI: 10.1016/j.cell.2018.03.042.
3. Cancer Genome Atlas Network. Genomic classification of cutaneous melanoma. Cell.
2015;161(7):1681-96. DOI: 10.1016/j.cell.2015.05.044.
4. Santarpia L, Lippman SM, El-Naggar AK. Targeting the MAPK-RAS-RAF signaling pathway in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 2012;16(1):103-19. DOI:
10.1517/14728222.2011.645805.
5. Herbst RS. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int J Radiat Oncol Biol Phys.
2004;59(2 Suppl):21-6. DOI: 10.1016/j.ijrobp.2003.11.041.
6. Chapman PB, Hauschild A, Robert C, Haanen JB, Ascierto P, Larkin J, et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N Engl J Med. 2011;364:2507-16.
DOI: 10.1056/NEJMoa1103782.
7. Poulikakos PI, Persaud Y, Janakiraman M, Kong X, Ng C, Moriceau G, et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature.
2011;480(7377):387-90. DOI: 10.1038/nature10662.
8. Obenauf AC, Zou Y, Ji AL, Vanharanta S, Shu W, Shi H, et al. Therapy-induced tumour
secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 2015;520(7547):368-72. DOI:
10.1038/nature14336.
9. Villanueva J, Vultur A, Lee JT, Somasundaram R, Fukunaga-Kalabis M, Cipolla AK, et al.
Acquired resistance to BRAF inhibitors mediated by a RAF kinase switch in melanoma can be overcome by cotargeting MEK and IGF-1R/PI3K. Cancer Cell. 2010;18(6):683-95. DOI:
10.1016/j.ccr.2010.11.023.
10. Simion C, Cedano-Prieto ME, Sweeney C. The LRIG family: enigmatic regulators of growth factor receptor signaling. Endocr Relat Cancer. 2014;21(6):R431-443. DOI: 10.1530/ERC-14-0179.
11. Johansson M, Oudin A, Tiemann K, Bernard A, Golebiewska A, Keunen O, et al. The soluble form of the tumor suppressor Lrig1 potently inhibits in vivo glioma growth irrespective of EGF receptor status. Neuro-Oncol. 2013;15(9):1200-11. DOI: 10.1093/neuonc/not054.
12. Goldoni S, Iozzo RA, Kay P, Campbell S, McQuillan A, Agnew C, et al. A soluble ectodomain of LRIG1 inhibits cancer cell growth by attenuating basal and ligand-dependent EGFR activity.
Oncogene. 2007;26(3):368-81. DOI: 10.1038/sj.onc.1209803.
13. Billing O, Holmgren Y, Nosek D, Hedman H, Hemmingsson O. LRIG1 is a conserved EGFR regulator involved in melanoma development, survival and treatment resistance. Oncogene; 2021.
14. Kurien BT, Scofield RH. Western blotting: an introduction. Methods Mol Biol Clifton NJ.
2015;1312:17–30.
15. 1177.se. Huden och ögonen kan skadas, Lite sol är nyttigt
https://www.1177.se/liv--halsa/sunda-vanor/sa-skyddar-du-dig-mot-solen/ (2021-04-23)
16. Suzuki Y, Miura H, Tanemura A, Kobayashi K, Kondoh G, Sano S, et al. Targeted disruption of LIG-1 gene results in psoriasiform epidermal hyperplasia. FEBS Lett. 2002;521(1-3):67-71.
17. Karlsson T, Mark EB, Henriksson R, Hedman H. Redistribution of LRIG proteins in psoriasis. J Invest Dermatol. 2008;128:1192–5.
12 L
Figur 1. Jämförelse av LRIG1 uttryck nivån mellan de fyra melanomsubtypererna BRAF, RAS, NF1 och trippelvildtyp. Normaliserad RNA-sekvenseringsdata från patientmetastaser i TCGA. Enheten för sekvenseringsdatat är log2 (”Fragments Per kilo base of transcript per million mapped reads upper quartile” [FPKM-UQ]+1)
RAS BRAF NF1 trippel
vildtyp
10 12 14 16 18 20 22
UttryckavLRIG1mRNA (log2[fpkm-uq+1])
Subtyp av melanom P = 0,0120 Pp = 0,0120
13
Figur 2. Förhållande mellan de tre cellinjerna A375, colo-489 eller wm-3211 som växte med eller utan tillsats av indikerad koncentration av kontrollpeptiden His-MBP-Strep (kontroll) eller rekombinant LRIG1 (sLRIG1). Normaliserad wst-1 intensitet indikerar cellproliferation. Analysen utfördes med triplikat. Proliferation mättes i ett tvåsidigt Anova med Tukeys flera jämförelsetest mellan
obehandlade celler och behandlade celler i varje cellinje. *p < 0,05; **p < 0,01; ****p < 0.0001.
0 µg/mL kontroll sLRIG1
2 µg /mL 5 µg/mL
** *************
A375 COLO-849 WM3211
0.0 0.5 1.0 1.5
Proliferering (normaliseradWST-signal)
14
Figur 3. Proteinextrakt från cellinjerna A375, colo-489 eller wm-3211 förutom Fig. D och F som visar proteinextrakt från bara colo-489 cellinjer. Den gröna signalen visar LRIG1, P-EGFR, P-ERK eller P- AKT medan den röda signalen indikerar till aktin som detekterades med mus anti-aktin 1:3000 på alla cellinjer. Immunodetektion för proteiner A) LRIG1 med kanin anti-LRIG1 1:1000, B) P-EGFR ~140 kDa med kanin-anti-p-EGFR, 1:1000. C) P-ERK från samtliga cellinjer med kanin anti p-ERK 1:2000, D) P-ERK på lysat från colo-849 med kanin anti p-ERK1/2, 1:2000. E) P-AKT av alla cellinjer med kanin anti-p-AKT, 1:1000.F) P-AKT på lysat av colo-489 med kanin anti-p-AKT, 1:1000.
LRIG1
actin kontroll
sLRIG1
170 130 kDa
A B
100 170
130 kDa
100 70
55 40
+ - + - + -
+ - + - +
-
A375 COLO-849 WM3211 kontroll + - + - + -
+ - + - +
sLRIG1 -
A375 COLO-849 WM3211
40 phospho- 55
Erk1/2 actin
phospho-Erk1/2 /actin (relativ proteinnivå)
kontroll sLRIG1
55 40 kDa
phospho- Erk1/2
A B
kontroll + - + - + -
+ - + - +
sLRIG1 -
A375 COLO-849WM3211
actin
0.00.5 1.0 C D
55 70 40 phospho-
AKT actin phospho-
AKT actin
phospho-AKT /actin (relativ proteinnivå) phospho-AKT /actin (relativ proteinnivå)
kontroll sLRIG1
kontroll + - + - + -
+ - + - +
sLRIG1 - kDa
55 70 40 kDa A375 COLO-849WM3211
A B
0.00.5
1.0 0.00.51.0
Phosphor- Erk1/2
~125 kDa
F
150 100
55 40
E
Phosphor- AKT
~60 kDa Phosphor-
AKT
~60 kDa LRIG1
~140kDa
B
