TECHNICKÁ UNIVERZITA V LIBERCI
Fakulta mechatroniky a mezioborových inženýrských studií
DIPLOMOVÁ PRÁCE
Liberec 2011 Bc. Božena Hégrová
TECHNICKÁ UNIVERZITA V LIBERCI
Fakulta mechatroniky a mezioborových inženýrských studií
Studijní program: N3942 – Nanotechnologie Studijní obor: 3942T002
– Nanomateriály
Vývoj upravených nanovlákenných nosičů pro kryty ran a tkáňové
inženýrství
Development of modified nanofibrous media for covers of the wound and tissue
engineering
Autor: Bc. Božena Hégrová Akademický rok: 2010/2011
Vedoucí diplomové práce: Ing. Petr Mikeš
3 Prohlášení
Byl jsem informován a seznámen s tím, že na mou diplomovou práci se plně vztahuje zákon č.121/2000 o právu autorském, zejména § 60 (školní dílo).
Beru na vědomí, že TUL má právo na uzavření licenční smlouvy o užití mé DP a prohlašuji, že s o u h l a s í m s případným užitím mé diplomové práce (prodej, zapůjčení apod.).
Jsem si vědom toho, že užít své diplomové práce či poskytnout licenci k jejímu využití mohu jen se souhlasem TUL, která má právo ode mne požadovat přiměřený příspěvek na úhradu nákladů, vynaložených univerzitou na vytvoření díla (až do jejich skutečné výše).
Diplomovou práci jsem vypracoval samostatně s použitím uvedené literatury a na základě konzultací s vedoucím diplomové práce.
Datum
Podpis
4
Poděkování
Zvláštní poděkování bych chtěla věnovat ing. Pavlu Pokornému, ing. Petru Mikešovi, ing. Jiřímu Chvojkovi za technickou pomoc při výrobě zařízení, ing. Lucii Vysloužilové za cenné rady při laboratorní práci a prof. Davidu Lukášovi za vysvětlení fyzikálních jevů spojených s elektrostatickým zvlákňováním a poskytnutí studijních materiálů.
5
Abstrakt
Práce shrnuje poznatky o nových obvazových materiálech se zaměřením na jejich sorpční vlastnosti. Přináší základní informace o tvorbě exsudátu v ráně a jejím hojení.
Dále se zabývá popisem některých polymerů pro výrobu scaffoldů pro kostní implantáty.
Popisuje princip elektrostatického zvlákňování polymerů, fyzikální zákonitosti a parametry tohoto procesu. Vysvětluje jev zvaný elektrický vítr. V experimentální části je popsán vývoj nového zařízení pro výrobu nanovlákenných vrstev s částicemi aktivního uhlí, oxidu hlinitého a hydroxyapatitu. K nahlédnutí jsou snímky z elektronového mikroskopu a přiloženy hodnoty měření adsorpce. Cílem práce je poznatky získané v teoretické i experimentální části shrnout, aby mohly být dále využity pro další výzkum v tkáňovém inženýrství.
Klíčová slova: Obvazový materiál, kostní implantáty, elektrostatické zvlákňování, elektrický vítr, nanovlákna
Abstract
The paper summarizes the findings of new dressing materials, which are focusing on their sorption properties. It provides basic information about the production of exudate in the wound and its healing. Furthermore, it deals with certain polymers to produce scaffolds for bone implants. It describes the principle of electrospinning of polymers, physical laws and parameters of the process, such is for example the explanation of the phenomenon known as wind power. The experimental section denotes with the development of new equipment for production of nanofibrous layers with incorporated particles of activated carbon, alumina and hydroxyapatite. The aim of this work is the knowledge gained in the theoretical and the experimental which can also be used for further research in tissue engineering.
Key words: Dressing material, bone implants, electrostatic spinning, wind power, nanofibers
6
Obsah
Prohlášení 3
Poděkování 4
Abstrakt 5
Seznam obrázků 8
Seznam tabulek 9
Seznam zkratek 10
Úvod 11
1 Kryty ran 12
1.1 Zánět a průběh hojení rány 12
1.2 Exsudát rány a jeho složení 14
1.3 Současná nabídka nových obvazových materiálů 17
1.4 Specifikace nejčastějších sorpčních materiálů v tkáňovém krytí 23
1.5 Adsorpce z kapalné fáze 26
2 Tkáňové nosiče 28
2.1 Požadované vlastnosti tkáňových nosičů 29
2.2 Polymery pro výrobu tkáňových implantátů 29
2.3 Hydroxyapatit v kostních implantátech 33
2.4 Textilní materiály jako tkáňové nosiče 37
7
3 Elektrostatické zvlákňování 38
3.1 Obecné principy elektrostatického zvlákňování 39
3.2 Fyzikální podstata 39
3.3 Ovlivnění procesu 41
3.4 Elektrický vítr 42
4 Vývoj dávkovacího zařízení a funkční nanovlákenné vrstvy metodou
elektrostatického zvlákňování 47
4.1 Popis experimentu 48
4.2 Přístrojové vybavení 48
4.3 Použitý materiál 52
4.4 Síťování PVA 53
4.5 Popis experimentu a funkce řízení 53
4.6 Provedené skupiny experimentů 54
4.7 Průběh experimentů a naměřené parametry 55
4.8 Testy adsorpce 62
4.9 Určení plošné hustoty vzorků 64
5 Zhodnocení výsledků 65
5.1 Elektrostatické zvlákňování 65
5.2 Vyhodnocení testu nasákavosti 66
Závěr 67
Seznam literatury 68
Seznam příloh 72
8
Seznam obrázků
Obr. 1.1 Souhrn navazujících procesů aktivovaných při hojení ran Obr. 1.2 Mechanismus způsobující tvorbu exsudátu
Obr. 1.3 Struktura pokožky
Obr. 1.4 Struktura a působení obvazu s aktivním uhlím a stříbrem
Obr. 1.5 Polštářkové krytí Cerdac Special Cavity s granulemi oxidu hlinitého Obr. 1.6 Funkce obvazu s oxidem hlinitým po přiložení k ráně
Obr. 1.7 Schéma působení bioaktivního preparátu Suprasorb C s kolagenem Obr. 1.8 Filmový obvaz Suprasorb na epitelizující rány
Obr. 1.9 Grassolind® neutral - krytí s pH neutrální mastí Hartmann Obr. 1.10 Funkce HemaGelu na poraněné pokožce
Obr. 1.11 Funkce obvazu Calcium Alginate Dressing
Obr. 2.1 Adheze kožních buněk na PE a PE/Kr/RGD Obr. 2.2 Prostorové schéma polyvinylalkoholu Obr. 2.3 Prostorové schéma polykaprolaktonu
Obr. 2.4 Kostní buňky rostoucí na podkladu z hydroxiapatitové keramické pěny Obr. 2.5 Želatina/hydroxyapatit scaffold
Obr. 2.6 Snímky scaffoldů s kompozitem níže uvedeného složení
Obr. 3.1 Schéma konstrukce zařízení Nanospider Obr. 3.2 Přeplavovací hladinový koaxiální electrospinner
Obr. 4.1 Sestava přeplavovacího spinneru pro elektrostatické zvlákňování Obr. 4.2 Válcovitý kolektor
Obr. 4.3 Schéma funkce dávkovacího zařízení
Obr. 4.5 Snímek z optického mikroskopu: vzorek č. A-3
Obr. 4.6 Snímek z elektronového mikroskopu VEGA Tescan: vzorek č. B-3 Obr. 4.7 Snímek z elektronového mikroskopu VEGA Tescan: vzorek č. C-2 Obr. 4.8 Snímek z elektronového mikroskopu VEGA Tescan: vzorek č. E-3 Obr. 4.9 Snímek z elektronového mikroskopu VEGA Tescan: vzorek č. F-4 Obr. 4.10 Test adsorpce s manganistanem draselným na filtračním papíru Obr. 4.11 Test adsorpce s manganistanem draselným na vyrobených vzorcích Obr. 4.12 Test nasákavosti vzorků v délce 20 minut
9
Seznam tabulek
Tabulka 1 Hlavní fáze běžného procesu léčení poranění Tabulka 2 Parametry procesu zvlákňování pro experiment A-1 Tabulka 3 Parametry procesu zvlákňování pro experiment A-2 Tabulka 4 Parametry procesu zvlákňování pro experiment B Tabulka 5 Parametry procesu zvlákňování pro experiment C Tabulka 6 Parametry procesu zvlákňování pro experiment D Tabulka 7 Parametry procesu zvlákňování pro experiment E Tabulka 8 Parametry procesu zvlákňování pro experiment F Tabulka 9 Soubor vážení pro určení plošné hustoty vzorků
10
Seznam použitých zkratek
Al2O3 oxid hlinitý
Ca5(PO4)3(OH) hydroxyapatit Ca3(PO4)2 apatit
CMC karboxymethylcelulosa DEM dermální ekvivalentní matrice
EM mezibuněčná hmota
FA fluorapatit
FTA field Therapy Accelerator
FHA fluor-hydroxyapatit
HEMA 2-hydroxyethylmethakrylát MRSA staphylococcus aureus MRSE staphylococcus epidermis
PE polyetylén
PET polyetylentereftalát PFTE polytetrafluorethylén
PLA polylaktid
PCL polykaprolakton
PMMA polymetylmetakrylát
PP polypropylén
PS polystyrén
PU polyuretan
PU/nFHA polyesteruretan / nano fluor-hydroxyapatit
SA alginát vápenatý
11
Úvod
Biomedicínský výzkum ve spojení s nanotechnologií prochází velmi bouřlivým rozvojem a lze předpokládat, že právě tato kombinace bude významnou dominantou na poli vědy 21. století. Zdravější populace přináší ekonomický a sociální rozvoj. Nejedná se však pouze o mladé. S rozvojem společnosti a s prodlužujícím se lidským věkem budou růst požadavky na kvalitu života a kvalitnější zdravotní péči. Přinese zároveň nároky na prodloužení pracovní aktivity. Též důstojné stáří vyžaduje aktivní nezávislost jedince.
Proto každá inovace, která přispěje ke zlepšení zdravotního stavu každého z nás, by měla být vítána a podporována.
Motivací pro výběr téma tkáňového krytí a kostních implantátů pro diplomovou práci bylo setkání s MUDr. Davidem Lukášem, Ph.D., primářem traumatologického oddělení liberecké nemocnice. Nastínil vize parametrů tkáňových krytí, které by měla splňovat. Jedná se např. o dělitelnost polštářků s aktivním uhlím, neboť cena těchto výrobků je vysoká a jejich plocha mnohdy nebývá při ošetření rány využita. Vynikající adsorpční vlastnosti aktivního uhlí lékaři hojně využívají při léčbě bércových vředů.
Zároveň zmínil finanční náročnost kostních implantátů. V této souvislosti je nutné připomenout úspěšnou spolupráci pracovníků Katedry mechaniky, pevnosti a pružnosti Technické univerzity v Liberci v oblasti počítačového 3D modelování lidských kostí. Podle těchto modelů již bylo vyrobeno několik kostních implantátů, které lékaři z liberecké nemocnice pacientům po úrazech úspěšně voperovali. Tento počin vybízí k výzkumu nové technologie výroby, která by byla pro výrobu 3D modelů použitelná, což by vedlo k velkým finančním úsporám, zkrácení čekací doby na zahraniční implantáty a zmenšení stresové zátěže pacientů. Pracovníci z Katedry netkaných textilií Technické univerzity v Liberci disponují poznatky i dlouholetými praktickými zkušenostmi v oblasti elektrostatického zvlákňování polymerů a vývoje podkladových vrstev pro růst buněčných struktur.
Výsledkem spolupráce s Krajskou nemocnicí v Liberci by mělo být přiblížení těchto nápadů reálné praxi.
Cílem diplomové práce je najít a otestovat novou technologii výroby funkční vrstvy pro tkáňové krytí. V tkáňovém inženýrství by měla přispět k lepší adhezi a růstu buněk na kostních náhradách a dokonalejší modelaci kostních implantátů.
12
Kapitola 1
Kryty ran
K ošetření poranění již staří Egypťané používali plátěná obinadla napuštěná přírodními látkami, které měly přispět k hojení ran. K velkému pokroku ve vývoji obvazů došlo během válek, kdy vojenští chirurgové zaznamenali, že klidový stav přispívá k hojení rány, a naopak časté převazování zvyšuje riziko sepse. [1] V šedesátých letech minulého století zkoumal prof. George Winter vliv vlhkosti na schopnost hojení a tvorbu nové epidermis. Z jeho práce vyplynulo, že ve vlhkém prostředí buňky snáze migrují a nevysychají. Jejich tvorba je až o 40 % rychlejší. [2]
1.1 Zánět a průběh hojení rány
Při poranění pokožky dochází k několika vzájemně se prolínajícím procesům (obr. 1.1, tab. 1), z nichž tvorba zánětu je obrana organizmu proti cizorodým látkám nebo mechanickým traumatům. Složky nespecifického imunitního systému (pozn. - specifické složky jsou získány během života) [3] toto poškození či napadení identifikují, brání jeho šíření a postupně ho likvidují. Po aktivaci makrofágů se rozšíří cévy, čímž se zvýší jejich propustnost. Tkáně jsou zásobeny fibrinogenem a dalšími bílkovinami z krevní plazmy, které svým vysrážením brání postupu infekce. V poškozené tkáni se hromadí neutrofily (mikrofágy), čímž je vyvolána jejich nová tvorba v kostní dřeni.
13 Obr. 1.1: Souhrn navazujících procesů, aktivovaných při hojení ran
(převzato: URGO Laboratories: The complex healing process divided into 3 to 5 phases. UK, 2009)
Fagocyty nejprve přilnou k cizorodému tělesu svojí membránou, následuje vchlipování, které směřuje až k úplnému obklopení. Vzniká fagosom. Fagocyty obklopenou částici rozloží. Mikrofágy jsou běžně přítomné v krvi a v případě zánětu projdou bazální membránou a améboidním pohybem postupují k místu zánětu. Monocyty obsažené v krvi dozrají v tkáni na makrofágy, přičemž několikanásobně zvětší svůj objem, a spolu s mikrofágy pohlcují cizorodý materiál, tzv. fagocytují. Životnost těchto fagocytů je 4 – 6 dní a jsou schopny fagocytovat až 20 bakterií.
Makrofágy někdy bývají vázány na určitý typ tkáně, v jiných případech mají možnost prostupovat do lymfatických uzlin nebo volně se pohybovat mezi tkáněmi. Za svojí několikaměsíční existence zničí až 100 bakterií. Produkují cytosiny, tzv. mediátory zánětu. Odumřelé neutrofily spolu s bakteriemi tvoří hnis. [3,4]
14 Tabulka 1: Hlavní fáze běžného procesu léčení poranění
(převzato, edit.: URGO Laboratories: The 3 main stages of a normal healing process. UK, 2009)
1.2 Exsudát rány a jeho složení
Při zánětu proniká stěnou kapilár do okolních tkání edémová tekutina a bílkoviny (obr. 1.2). Tato tekutina v těle cirkuluje, většina se vrací absorpcí zpět do kapilár a asi desetina vstupuje do lymfatického systému a tím zpět do oběhu. Nadbytek této tekutiny tvoří základ exsudátu v místě zánětu. Exsudát obsahuje zejména vodu, bílé krvinky, mediátory zánětu, enzymy a odpadní látky. V místě poranění plní několik základních funkcí. Při obnově buněk napomáhá jejich migraci a výživě. Svým složením brání vysychání rány a odděluje poškozené a odumřelé buňky od nového epitelu. V případě nadměrné tvorby je však nutné exsudát odstraňovat, aby nebyla poškozována okolní zdravá tkáň a nevznikaly další komplikace. Exsudát svým složením, množstvím, barvou, konzistencí a případným zápachem podává důležité informace o procesech probíhajících v ráně. Proto je vhodné při každé výměně tkáňového krytí alespoň vizuálně tyto parametry sledovat a v závislosti na nich volit nejen způsob léčby, ale i výběr krycího materiálu. [5]
15 Různé druhy zánětů produkují rozdílné exsudáty. Největší produkce exsudátu se tvoří v bércových vředech a při popáleninách. [3,5] Serózní zánět vykazuje vodnatý, tekutý exsudát smísený s hlenem, s malým množstvím fibrinu. Nehnisavý zánět se vyznačuje malým množstvím fibrinogenu. Naopak u hnisavých zánětů je v exsudátu velké množství neutrofilních leukocytů a málo fibrinu. Projevuje se jako flegmona (šířící se neohraničený zánět) či ohraničený absces s fibrinovou bariérou. Pro fibrinózní zánět je typický vláknitý fibrin jako reakce na zanícení, při hojení se mohou vyskytovat srůsty, exsudát bývá zakalený, hustší a ulpívá na povrchu. Gangrenózní zánět je zánět sekundárně změněný např. hnilobou. Odumřelá tkáň a rozvoj infekce v ráně způsobují nepříjemný zápach. [6]
Obr. 1.2: Mechanismus způsobující tvorbu exsudátu (převzato [5])
Růžové zabarvení exsudátu ukazuje na poškození kapilár, zelený na přítomnost bakterií. Přítomnost bílkovin exsudát zahušťuje. Náhlé zvýšení nebo snížení tvorby exsudátu, by mělo být podnětem pro kompletní vyšetření, neboť může být příznakem srdečního onemocnění, jaterního či ledvinového selhání. Má-li být použití obvazového krytí co nejefektivnější, je nezbytný komplexní náhled na stav pacienta, schopnost a ochotu ke spolupráci při léčbě, posouzení stávající léčby a aplikovaného materiálu. Nezbytné je posouzení vlastností exsudátu i spodiny a okraje rány. Tyto faktory umožní správnou volbu léčby, krytí, frekvence výměny, i zvládnutí exsudátu. Vlhké hojení není ve všech případech žádoucí, při některých onemocnění je naopak vytvoření suchého strupu cílem léčby.
V takovém případě bývají voleny propustné obvazy umožňující odpařování vlhkosti.
16 Zvýšení vlhkosti v ráně lze dosáhnout použitím méně savých obvazů, delší časovou prodlevou mezi výměnou nebo dodáním fyziologického roztoku. Pro snížení vlhkosti naopak použijeme savější krytí, zvýšíme frekvenci výměny, přidáme sekundární krytí nebo změníme typ obvazu. [3,5] Obvazové krytí musí zajišťovat nejen adsorpci, popř. absorpci.
U krytí založeném na absorpci sice dochází ke zvýšenému odsávání exsudátu než při adsorpci, zároveň ale existuje riziko zpětného znečištění rány při mechanickém namáhání obvazu. Při adsorpci k tomuto jevu nedochází. Další alternativou je navázání exsudátu nebo jeho složky na absorbát za současného vzniku gelu. Tento způsob se využívá i u dětských plen. Tkáňové krytí s aktivním uhlím snižuje zápach. Krytí se stříbrem nebo jódem působí antimikrobiálně. Je nutné zajistit také snadnou výměnu, nebolestivou a nedestruktivní vzhledem k tvořícímu se epitelu. Problémy mohou způsobovat i alergické reakce. [5,6]
Tvorba exsudátu v závislosti na hloubce rány
Dermis, neboli škára, je vrstva pokožky a pojivová tkáň, bohatá mimo jiné na vlákna, která dodávají pleti pružnost a sílu. Přechod mezi škárou a vrchní ochrannou vrstvou je ostře oddělen „zubovitou“ morfologií obou úrovní, která dodává tomuto spojení pevnost. V úzkém kontaktu s výše uvedenými úrovněmi je též podkoží, tuková kluzná vrstva, jejíž hlavní úlohou je nejen ukládání, ale též transformace tuků a vody (obr. 1.3).
Obr. 1.3: Struktura pokožky
(převzato, edit.: URGO Laboratories: Skin: The Dermis, Epidermis, Hypodermis. UK, 2009)
17 Proces exsudace, nebo-li uvolňování tekutin do tkáně (krvácení, ronění, tvoření výpotku), je ovlivněno mírou poškození výše uvedené struktury pokožky. Pokud je poškozena pouze svrchní ochranná vrstva, zpravidla nedochází k exsudaci. V případě odírání na hranici epidermis/dermis již dochází k exsudaci, avšak pouze v izolovaných místech, přičemž u hlubší rány s kompletní rupturou dermální/epidermální vrstvy je výtok zesílen, což je specifické například pro popáleniny druhého stupně. Zároveň je třeba rozlišovat mezi akutním a chronickým poraněním tkáně.
Krycí obvazy chrání tuto poraněnou tkáň před infekcí a vnějšími vlivy. Mechanickou ochranu zpravidla poskytuje vrstva gázy fixovaná obinadlem, náplastí apod. [1] Přiložená gáza však brání existenci vlhkého prostředí, navíc adheruje k hojící se ráně. Proto je v posledních letech preferováno používání nových materialů, které zajistí nejen vlhkost, stálou optimální teplotu kolem 37 °C, ale i stabilní pH prostředí. Každé odhalení rány zastavuje hojení na několik hodin, proto se interval výměny obvazu prodlužuje až na sedm dní v závislosti na možnostech moderních materiálů. [2]
Nezanedbatelný přínos při použití nových obvazových krytí je nejen ve zkrácené době hojení, což mnohdy znamená i zkrácení doby hospitalizace a snížení nákladů, ale nastává i zlepšení psychického stavu pacienta. [1,2]
1.3 Současná nabídka nových obvazových materiálů
Nové obvazové materiály jsou zatříděny do skupin, jejich užití závisí na indikaci a specifických vlastnostech obvazu. Významné zastoupení na českém trhu má firma JOHNSON & JOHNSON. V jejím sortimentu najdeme netkanou textilii Actisorb plus s aktivním uhlím a se stříbrem, která pohlcuje zápach a ničí mikroorganizmy. Jedná se výrobek s pevně daným rozměrem 10,5 x 10,5 cm, popř. 19,5 x 10,5 cm, který je dále nedělitelný (obr. 1.4).
18 Obr. 1.4: Struktura a působení obvazu s aktivním uhlím a stříbrem (převzato [8])
Od stejné firmy je také neadhezivní hydropolymerové krytí Tielle Xtra, Topper* ad.
Různé neadhezivní mřížky v tkané i netkané variantě s různou velikostí otvorů mohou být impregnovány silikonem, speciální vazelínou nebo parafínem, např. N-A*Ultra a ADAPTIC*. [7,8] Slouží jako podklad pod sekundární savé krytí. Místo aktivního uhlí firma Cerdak Co., USA používá biokeramiku, polštářkové krytí s náplní mikrogranulí Al2O3 s využitím absorpce i adsorpce (obr. 1.5) s názvem Cerdak Special Cavity. [9] Absorpce se uplatní mezi granulemi oxidu hlinitého a adsorpce navázáním na jejich povrch (obr. 1.6).
Velikost granulí se pohybuje mezi 0,3 - 1 mm. [10]
19
Obr. 1.5: Polštářkové krytí Cerdak Obr. 1.6: Sací síla Cerdak Special Cavity Special Cavity (převzato: ACARE. Cerdak: Sací síla. Praha, 2005) (převzato: ACARE. Cerdak: léčba ran
pomocí biokeramiky.Praha, 2005)
Perspektivní jsou obvazy s různými příměsemi, které zabraňují infekci, čistí ránu nebo zajišťují potřebnou vlhkost při hojení. Jedná se např. o algináty, což jsou přípravky z mořských řas, které ve vlhkém prostředí rosolovatí. [7]
Kvalitní vlhké a zároveň výrazně sorpční materiály jsou předpokladem pro úspěšné zhojení zejména bércových vředů a dekubitů. Bércový vřed je chronické kožní onemocnění, které zasahuje hluboko do podkoží a vyžaduje speciální způsob léčby. U bércového vředu dochází k poruše funkce kůže i její struktury. Léčba je možná pouze výstavbou nové tkáně v místě postižení. Nejčastějším důvodem vzniku bývá vaskulární problém. [11,12]
Léčba bércových vředů se zaměřuje na konzervativní a chirurgicko-plastickou část. Očekávat se dá výskyt bakterií, virů i plísní. V první fázi lze použít klasickou léčbu, alternativou je tzv. moderní krytí. Nejprve je nutné ránu vyčistit a zbavit odumřelé tkáně.
Tradičně přípravky UC 7, framykoinovou mastí, zásypy a tinkturami, růžovým roztokem hypermanganu, borovou vodu, atd. Obsahují ale příměsové látky, jejichž přítomnost v ráně a jejím okolí může vyvolat nežádoucí reakce. Při granulaci se aplikuje borová vaselina, kafrová mast. Při tvorbě nového epitelu lze podpořit hojení mastným tylem s bílou vaselinou. Z moderních krytí je vhodné zahájit léčbu použitím hydrogelů, alginátových krytí, krytí s aktivním uhlím a gelů, pro zajištění vlhkého hojení též hydrokoloidní přípravky.
[11,12,13] Samolepící hydrokoloidní obvazy na popáleniny, dekubity a bércové vředy snižují bolest v ráně. Poskytují ochranný obal proti vysychání, umožňují mytí nebo sprchování a brání šíření patogenů. Zkracují dobu léčby až o 40 %. Snižují se náklady na převazování rány. [14,15,16] Z nabídky výrobků se jedná např. o produkty firmy 3M
20 Company, Minnesota. 3M Tegaderm Alginate vlákenný materiál z alginátu má vysokou absorpční schopnost a zároveň zajišťuje vlhké hojení. Po absorpci se alginátová složka přemění v gel. Varianta se stříbrem 3M Tegaderm Ag má antibakteriální účinky, 3M Tegaderm Hydrocolloid navíc umožňuje vizuální kontrolu rány, neboť je částečně transparentní. Podobné výrobky nabízí firma Lohmann &Rauscher. Další skupinou jsou bioaktivní preparáty Suprasorb C s kolagenem (obr. 1.7) na podporu hojení a zajištění vlhkosti v ráně nebo filmové obvazy Suprasorb F (obr. 1.8) na epitelizující rány a polyuretanové membrány. Fólie je propustná pro vodní páry a kyslík, nepropouští však bakterie, adheruje k pokožce, nikoli k ráně. [11,12]
Obr. 1.7: Schéma působení bioaktivního preparátu Obr. 1.8: Filmový obvaz Suprasorb C s kolagenem Suprasorb F na epitelizující rány (převzato: ACTIVA Healthcare. Suprasorb C. UK, 2011) (převzato: SURGICAL House.
SUPRASORB F. Leederville WA, 2006)
Další skupinou jsou bioaktivní preparáty Suprasorb C s kolagenem (obr. 1.7) na podporu hojení a zajištění vlhkosti v ráně nebo filmové obvazy Suprasorb F (obr. 1.8) na epitelizující rány a polyuretanové membrány. Aby rána nebyla při výměně krytí traumatizována, používají se měkké silikony s vrstvou Safetac nebo přímo neadhezivní obvazy. [2,11] Jedná se o pletené nebo tkané mřížky, u nichž malá kontaktní plocha s ránou usnadňuje následné odstranění. Tvar síťky zamezuje hromadění exsudátu v ráně.
Silikonový povrch či speciální vazelína zamezí přilepení obvazu na ránu. Při dělení obvazu nesmí docházet ke třepení a uvolnění vláken,která by se dostala do rány. [2,11]
21 Obr. 1.9:Grassolind® neutral - krytí s pH neutrální mastí Hartmann
(převzato: Stücker-MEDESIGN GmbH. Salbenkompressen. Holzwickede, 2011)
Firma Hartmann dodává na trh mastný tyl z bavlny s bílou vazelínou pod značkou Grassolind neutral (obr. 1.9). Přístup kyslíku, odtok exsudátu i aplikaci léčiv zajišťují velká oka. Bílá vazelína na ránu neadheruje.
Chirurgicko-plastická část léčby bércových vředů zahrnuje aplikaci kožních štěpů, sklerotizaci varixů v okolí bércového vředu, fasciotomii, arteriální bypass, atd.
Léčbu podporuje chůze, rehabilitační gymnastika, kompresivní terapie. [11] Moderní krytí vykazuje lepší výsledky při hojení rány a vzhledem ke zkrácení doby léčby i úsporu nákladů. Test bezpečnostni a účinnosti filmového obvazu při léčbě dekubitů probíhal 28 dní s výměnou obvazů alespoň jednou týdně. Subjektivní zlepšení stavu pacienta nastalo v 61 % případů, v ostatních případech se vyskytlo zarudnutí kůže, rozšíření rány nebo infekce. Přesto lze konstatovat, že tento typ obvazů lze doporučit pro efektivní zvládání exsudátu a mírnění bolesti, chrání okolní kůži a podporuje hojení dekubitů. [17]
Pro hojení dekubitů a bércových vředů lze využít také elektrické pole. Ránu s fibroblasty a kožním kolagenem typu I lze nahradit dermální ekvivalentní matricí (DEM) a zkoumat in vitro za působení elektrického pole, které je podobné endogennímu prostředí rány. Po osmi dnech byla určena vodivost vzorků DEM. Vzorky byly umístěny mezi dvě elektrody Ag/AgCl do komory s růstovým agarem a 12 hodin se nechal působit střídavý proud s rozpětím 18 – 1000 mV při frekvenci 10 – 100 Hz. Měřením profilace bylo zjištěno, že její nárůst je optimální při napětí 37 – 50 mV a frekvenci 10 Hz. [18]
22 V jiném případě ze dvou stran kolem rány umístíme elektrody a využijeme stejnosměrný proud. Vzniklé elektrostatické pole má příznivý účinek na hojení, tato metoda je však invazivní. Nově se zkoumá vliv kombinace elektrického a magnetického pole na migraci buněk při hojení. Při pokusech in vitro byly lidské epidermální keratinocyty udržovány v růstovém roztoku. Bezprostředně po zranění v délce 1 hodiny, a následně s periodou každých 24 hodin, bylo využito působení terapie FTA (Advatech Corp.), a to po dobu 4 dnů. Ve stejných intervalech probíhalo měření růstu buněčné kultury.
Z mikroskopických měření přístrojem Zeiss Axiovert 200 se zabudovaným fotoaparátem byly získány snímky a pomocí software AxioVision 3.0 analyzovány za účelem měření vzdálenosti mezi novými buňkami. Hodnotilo se procento zaplnění prostoru rány novými buňkami v závislosti na čase a bylo zjištěno, že metoda FTA tento proces výrazně urychluje. K zacelení rány došlo 6 dní po zranění, tj. o 3 dny dříve, než se zhojila rána bez působení FTA. [19]
Obr. 1.10:Funkce HemaGelu na poraněné pokožce (převzato: HEMAGEL. How HemaGel Works?. CR, 2010)
Jako velmi zajímavý produkt vyvinutý Ústavem Makromolekulární chemie AV ČR se jeví HemaGel (obr. 1.10). I když se nejedná přímo o obvazový materiál, měl by parametry moderního tkáňového krytí splňovat. Hydrofilní methakrylátový gel na bázi síťovaného kopolymeru 2-hydroxyethylmethakrylátu (HEMA) se stericky stíněnými aminoskupinami v polymerových vazbách zajišťuje optimální pH, snižuje bolestivost, zabraňuje přilepení, čistí ránu a umožňuje mokré hojení dodáním vlhkosti. Gel se aplikuje přímo do vyčištěné rány, kde nabobtná, a po cca 24 hodinách se odstraní setřením.
23 Postačí lehké sekundární krytí. Výrobek je patentován od roku 1997. Základem je polymer hema, který je společný také pro měkké kontaktní čočky vynalezené prof. Wichterlem. [20]
1.4 Specifikace nejčastějších sorpčních materiálů v tkáňovém krytí
Uhlík
Uhlík je v přírodě základním stavebním prvkem živých organizmů, součástí velkého množství organických i anorganických látek, vyskytuje se v zemské kůře, ve vodě i ve vzduchu. Svým zastoupením je nejrozšířenějším prvkem na Zemi. Uhlík je alotropní, k základním známým modifikacím grafitu a uhlíku přibyly fullereny, uhlíkové nanotrubice, uhlíková nanopěna apod. Nezastupitelnou úlohu má uhlík v energetice, chemickém průmyslu, stavebnictví, strojírenství, automobilovém průmyslu, sanacích, k čištění vody i vzduchu, jako moderátor v jaderných reaktorech a mnoha dalších aplikacích. Amorfní uhlík se využívá jako tzv. aktivní uhlí také v medicíně. [21,22,23]
Výroba aktivovaného uhlí začíná výběrem suroviny živočišného či rostlinného původu. Při výrobě živočišného uhlí se živočišné tkáně (např. kůže, kosti, šlachy) karbonizují při teplotě vyšší než 800 °C. Dle použitého materiálu je odvozen i název, např.
kostní či krevní uhlí. V nařízení č. 1774/2002 Evropského parlamentu a Rady ze 3. října 2002, stanovujícím zdravotnické předpisy týkající se vedlejších živočišných produktů, neurčených pro lidskou potřebu, jsou stanoveny kategorie materiálů a jejich ekvivalentů, které lze pro výrobu použít, aby se zamezilo šíření chorob a minimalizovala se rizika přenosu původců přenosné spongiformní encefalopatie zvířat léčivými přípravky (TSE - Transmissible Spongiform Encephalopathy). Rostlinné aktivované uhlí se vyrábí nejčastěji ze dřeva, lignitu, pilin, skořápek kokosových ořechů nebo rašeliny. Nejprve při teplotě cca 300 °C dochází k vypařování zbytkové vlhkosti a odstranění nežádoucích těkavých složek.
Následně zahřátím na cca 900 °C a s přídavkem hydroxidů, uhličitanů nebo vodní páry dochází k oxidaci a vzniku pórů. Vznikne velká adsorpční plocha povrchu vzhledem k malému objemu charakterizovaná hodnotou specifického povrchu. Způsobem výroby a
24 volbou vstupní suroviny lze tuto hodnotu ovlivnit, pohybuje se v rozmezí od 350 do 2000 m2.g-1. Pórovitá struktura je schopna zachytit plynné i kapalné adsorbáty na svém povrchu Van der Waalsovými silami. Možné je i impregnování stříbrem aj. Vstupní surovina předurčuje následné využití aktivovaného uhlí, neboť na ní zavisí jeho mechanické vlastnosti i samočistící schopnost. Aktivované uhlí může být práškové, granulované nebo zrnité. V medicíně se aktivované uhlí využívá nejčastěji při detoxikaci organizmu, střevních obtížích a při otravách. Ve vodě je nerozpustné, bez chuti a bez zápachu. Nevstřebává se do krevního oběhu a není pro organizmus v doporučeném množství toxický. Mezi nové aplikace posledních let se řadí využití aktivovaného uhlí ve výrobcích pro tkáňové krytí.
Uhlíková vlákna se používají na výrobu srdečních chlopní. [21,22,23]
Oxid hlinitý
Oxid hlinitý (Al2O3) je bělavý krystalický prášek různé zrnitosti, který se vyrábí dehydratací hydroxidu hlinitého z přírodního bauxitu i jinými postupy. V přírodě je obsažen v korundu. Vykazuje zcela vyjímečné mechanické vlastnosti jako je tvrdost, pevnost, abrazivost, žáruvzdornost, chemická odolnost, a proto se objevuje zejména v aplikacích ve strojírenství, stavebnictví a chemickém průmyslu. Setkat se s ním však můžeme taktéž v medicíně, neboť je jedním ze základních oxidů konstrukční keramiky, a jako sorpční materiál v tkáňovém krytí.
Biokeramika s Al2O3 může být ve variantě bioinertní nebo bioaktivní. Bioinertní při kontaktu s živou tkání nevyvolává zánětlivé reakce a využívá se na klouby, kostní implantáty a zubní implantáty. Bioaktivní keramika je založena na hydroxyapatitu Ca5(PO4)3(OH) a apatitu Ca3(PO4)2. Vyrábějí se jako porézní fosforečnany k rekonstrukci kostí, neboť jimi dobře prorůstá kostní tkáň. Bioaktivní skla s biogenním fosforem srůstají s kostní nebo měkkou tkání a jsou používána jako výplň po nádorech. Z bioinertního skla bez fosforu se vyrábějí čočky lidského oka při postižení šedým zákalem. Síťovací přísady vytvářejí příčné vazby mezi makromolekulami. [24]
25 Alginát
Polysacharid alginát je přírodní látka, která se vyskytuje v mořských řasách.
Řasám poskytuje pevnost a pružnost a umožňuje regulovat obsah vody. Využití přirozené struktury řas se nabízí pro výrobu vláken z alginátových izomerů. Výroba je možná i pomocí bakterií. Alginát se používá k odstranění pálení žáhy, v potravinářském i textilním průmyslu. Využívá se pro svou schopnost změny struktury na gel. Ve struktuře alginátu se střídají nepravidelně dvě skupiny molekul. Manuráty (M) a gulunoráty (G). Vlákna vyrobená z manurátů, která jsou extrahovaná z listů mořské řasy, lépe vyhovují jako náplň obvazů, neboť ionty vápníku jsou snadněji nahraditelné ionty sodíku. Extrahováním ze stonků mořské řady se získá gulunorát, vápník je silně vázán a proces výměny iontů při absorpci exsudátu je pomalý. [25]
Kombinace alginátu se stříbrem
Stříbro má antibakteriální účinky i proti Staphylococcus aureus (MRSA) i Staphylococcus epidermis (MRSE) a Escherichia Coli. Stříbro není pro lidský organizmus toxické a bakterie nejsou vůči němu rezistentní.
Obr. 1.11: Funkce obvazu Calcium Alginate Dressing (převzato: AMS Group plc. Mode of Action. Winsford, Cheshire, UK, 2010)
Vědci z Advanced Medical Solution z Velké Británie využili jeho mimořádných vlastností a v kombinaci s alginátem z mořské řasy vytvořili obvaz pro léčbu bércových vředů (obr. 1.11). Výrobek je patentovaný a vyrábí se v Evropě i v USA. Stříbro s alginátem vápenatým (SA) ve směsi s karboxymethylcelulosou (CMC) má proti
26 samotným složkám směsi řadu výhod. Delší čas pro nutnou výměnu, snížení riziko macerace, rychlejší hojení ran, menší zjizvení, přísun vápníku do rány, netraumatické odstraňování krytí. Obvazy mají vysokou pevnost ve vlhkém stavu a udržují stav vlhkého hojení. Snižují riziko infekce na delší čas a v ráně po obvazu nezůstávají žádné nežádoucí zbytky. Prokazatelně zmenšují plochu rány. [25] Stříbro hraje stále častější roli v oblasti péče o hnisavé rány. Do alginátových obvazů mohou být začleněny drobné částečky stříbra a hydrogen fosforečnanu sodného. Obvaz zůstane bílý a navíc bude trvale uvolňovat ionty stříbra při kontaktu s exsudátem, čímž zajistí vysoce účinnou bariéru proti bakteriím. [26]
Při výrobě obvazů se nejčastěji uplatňují přírodní materiály bavlna a celulóza, ze syntetických polyamid a polyester, ale i polypropylen a polyuretan. Původní metody tkaní a pletení bývají často doplněny nebo nahrazeny vrstvami netkaných textilií.
Na moderní obvazové materiály jsou kladeny stále vyšší nároky. Musejí být netoxické, respektovat fyziologické procesy v ráně a podporovat hojení, nezpůsobovat alergické reakce, nepodléhat změnám při sterilizaci a umožnit uživatelský komfort za přiměřené finanční náklady. [7]
1.5 Adsorpce z kapalné fáze
Proces adsorpce z kapalné fáze je zachycení částic kapalné fáze na povrchu tuhé fáze Van der Waalsovými silami. Jedná se o fyzikální proces. Na rozhraní dvou různých fází se skokově mění vlastnosti. V této přechodové oblasti neodpovídá složení látky ani jedné látce z původních fází. Dochází k vzájemným interakcím a výsledkem může být zvýšení koncentrace některé složky rozhraní. Rozdíl této koncentrace značí adsorpci.
Adsorbované množství objemové nebo hmotnostní se vztahuje na jednotku hmotnosti adsorbentu nebo jednotku povrchu. Zásadní význam má velikost a kvalita povrchu adsorbentu. Proto jsou jako adsorbenty používány práškovité a pórovité látky. Adsorbent je látka, na jejímž povrchu dochází k navázání adsorbátu.
Adsorpce je popisována adsorpčními izobarami, tj závislostí adsorbovaného množství na teplotě při konstantním tlaku. Může být popsána i adsorpčními izotermami, tj.
závislostí adsorbovaného množství na tlaku při konstantní teplotě pro plynné látky, nebo závislostí adsorbovaného množství na koncentraci roztoku. Platí, že adsorbované
27 množství klesá s rostoucí teplotou. Závislost adsorbovaného množství a na koncentraci roztoku c lze vyjádřit empirickým vztahem, Freundlichovou izotermou
cn
k
a= . (1.1)
k a n < 1 jsou konstanty. Z naměřených hodnot experimentu se tyto konstanty dopočítají a závislost se vynese do grafu. Pro kapalnou fázi je ve vzorci uvedena jako nezávisle proměnná koncentrace, v případě plynné fáze by vztah zahrnoval parciální tlak.
Adsorpce probíhá velmi rychle, ale vazebné interakce jsou slabé. Adsorpce je exotermní reakce, při zpětném ději, desorpci, je nutné dodat teplo. Proto čištění aktivního uhlí probíhá nejčastěji termickým rozkladem navázaného adsorbátu. Jiným vyjádřením procesu adsorpce je Langmuirova izoterma,
p k
p a k
c k c a k
a 1 .
. .
1 .
max
max = +
= + (1.2)
odvozena za podmínek, že vzniká maximálně monovrstva adsorbátu, a rychlost adsorpce je rovna rychlosti desorpce. Energie povrchu je ve všech místech stejná. Ve vztahu je amax
maximální množství adsorbované látky v monovrstvě, k je adsorpční koeficient. Vztah je opět platný i pro roztoky záměnou tlaku za koncentraci. S rostoucím tlakem, popř.
koncentrací roste adsorbované množství. [27]
28
Kapitola 2
Tkáňové nosiče
Tkáňové inženýrství je multioborový předmět zaměřený na regenerativní medicínu.
Využívá znalostí zejména biologie, medicíny, fyziky a chemie k obnově či náhradě poškozených tkání. Základem je tvorba tkáňového nosiče, na který se nanesou živé buňky, a celá struktura se následně implantuje na místo poškozené tkáně. Tkáňový nosič zastupuje mezibuněčnou hmotu (EM), která je stavební jednotkou tkáně. [28,29] Složená je z polysacharidů a proteinů, které produkují buňky, a je pro ně mechanickou oporou.
Ovlivňuje jejich vývoj a podle svého složení je charakteristická pro každý jednotlivý druh tkáně. Buňky se neustále obměňují, a přesto zůstává organizace tkáně zachována. To je možné jen díky buněčné komunikaci, selektivní buněčné adhezi a buněčné paměti.
Buněčná komunikace prostřednictvím signálů specializovaných buněk zajišťuje, že buňky vznikají pouze tam, kde jsou třeba. [30,31] Adheze mezi buňkami je možná pouze u buněk stejného typu a tím je zabráněno jejich promíchání. Buněčná paměť nese informaci o charakteru buňky, takže z ní mohou vznikat nové buňky jen stejného typu.
Kostní pojivová tkáň obsahuje buňky osteoblasty, osteofyty, osteoklasty a EM.
Vláknitá EM je zastoupena z 90 % kolagenem a z 10 % proteoglykany. Osteoblasty vytvářejí kolagenní vlákna a amorfní EM. Glykoproteiny navazují vápník a EM mineralizují zejména fosforečnanem a uhličitanem vápenatým. [30,31]
29
2.1 Požadované vlastnosti tkáňových nosičů
Pro začlenění matrice do lidského těla je vhodné použít materiál netoxický, který bude organizmem dobře snášen, a nebude vyvolávat odmítavé reakce imunitního systému nebo alergii, tj. biokompatibilní, což je vlastnost zejména přírodních materiálů. Jsou též biodegradabilní a buňky se na ně přirozeně navazují. Opakovaná příprava s přesně definovanými parametry bývá však u přírodních materiálů obtížná. Tento nedostatek nevykazují syntetické nosiče, v průběhu výroby se dá přesně definovat jejich složení i budoucí vlastnosti. Porézní tkáňové nosiče umožňují adhezi buněk a růst tkání. Vykazovat musí i odolnost vůči změnám vnitřního prostředí. Proto by měl být co nejvíce podobný extracelulární matrix. Podle typu tkáně, kterou se snažíme nahradit, je nutné volit i druh materiálu, aby byla splněna potřebná pevnost, elasticita, dlouhodobá stabilita.
V neposlední řadě by měl být cenově dostupný a musí splňovat normy pro lékařské aplikace. [7,28] Požadavek na matrici může být též biodegradabilita, tj. postupné vstřebávání organizmem a nahrazování novými vlastními tělními buňkami. V takovém případě se uplatní náhrada z polylaktidu (PLA), který degraduje na kyselinu mléčnou.
Enzymy, které takový materiál odbourávají, by měly být stejné, jako enzymy rozkládající skutečnou tkáň. Ústav Makromolekulární chemie a další ústavy Akademie věd ČR spolu s 1. Lékařskou fakultou Univerzity Karlovy i s ústavy v zahraničí hledají různé modifikace pro co nejlepší adhezi, růst a diferenciaci buněk. Podle zjištěných poznatků nastavují parametry pro požadované konstrukční materiály. [29]
2.2 Polymery na výrobu tkáňových implantátů
Tkáňový nosič je vyráběn nejčastěji z polymerů, pro medicínské využití lze volit biodegradabilní polylaktáty a polyglykoly, z nebiodegradabilních nejčastěji polyetylén (PE), polypropylén (PP), polystyrén (PS), polytetrafluorethylén (PFTE) a silikony. Zajímavé jsou také z hlediska příznivé ceny a dobrých mechanických vlastností. Hodí se na výrobu umělých cév, kůže, srdečních chlopní, kostí a chrupavek. Povrch polymeru lze fyzikálně či chemicky modifikovat, zlepšit adhezi buněk a podpořit jejich růst, a tím rozšířit jejich medicínské využití. [24]
30 Obr. 2.1: Adheze kožních buněk na PE a PE/Kr/RGD (převzato: [24])
Často se jedná o polymetylmetakrylát (PMMA), ale byly vyvinuty i materiály nové.
Dacron pro náhrady cév je speciální vlákenná forma polyetylentereftalátu (PET) a následně je z ní spletena cévní trubice. Elasticitu umožňuje krepovatá struktura. [29]
Polymery se zpracovávají do netkaných textilií nebo kompozitů, v současnosti se výrazně uplaňuje metoda elektrostatického zvlákňování. [28]
Biodegradovatelné polymery PVA a PCL obsahují makromolekuly uhlíku, kyslíku a vodíku. Jedná se o organické látky, které se rozkládají působením mikroorganizmů za vzniku CO2, vody a biomasy. Fyzikální vlastnosti jsou dány násobností řetězce a uspořádáním. Hydrolýzou se původní sloučenina přemění působením vody. Biodegradací se uhlík a vodík tzv. uhlíkovým a vodíkovým řetězcem vrací zpět do přírody. [32]
Polyvinylalkohol
Polyvinylalkohol (obr. 2.2) patří do skupiny aromatických polyesterů. Aromatická, tj. cyklická struktura, odolává hydrolýze, proto se polyvinylalkohol (PVA) vyrábí ve dvou krocích. V prvním kroku polymerace vinylacetátu a následuje hydrolýza na polyvinylalkohol. V tomto stavu je již možná biodegradace polymeru. Využívá se ve stavebnictví, papírenství, chemickém průmyslu apod. [32] V medicíně se používá jako umělé slzy. [3] Pro zvlákňování se PVA převádí do roztoku destilovanou vodou.
31 Obr. 2.2: Prostorové schéma polyvinylalkoholu
Polykaprolakton
Polykaprolakton (PCL) je synteticky vyráběný minerální alifatický polyester (obr.
2.3). Polyestery mají v řetězci začleněnou esterovou vazbu. Ohebnost násobné skupiny CH2 umožňuje přístup vody a tím hydrolýzu. Minerální alifatický polyester je vyroben z ropy polymerací s přítomným katalyzátorem a nemá cyklický řetězec. V medicíně se uplatňuje jako nosič s funkcí postupného uvolňování léčiv. [3] Pro zvlákňování se PCL ředí dichlormetanem s methanolem v poměru 3:1.
Obr. 2.3: Prostorové schéma polykaprolaktonu
32 Tkáňový nosič by měl umožňovat migraci buněk a usnadnit jejich růst. Jedním z parametrů je i velikost pórů nosiče. Právě tímto parametrem u PCL se zabývají výzkumníci z Department of Biomedical Engineering, University of Michigan. Testovali scaffoldy s velikostí pórů 350, 550 a 800 µm. Z pokusů na myších vyplynulo, že velikost pórů byla rozhodující pouze v prvních čtyřech týdnech po vložení nosiče, ale již po osmi týdnech se tyto rozdíly potřely. Pro polymer PLC má velikost pórů scaffoldu v rozpětí 350 - 800 µm omezený vliv na růst buněk. [33]
Rybí želatina
Želatina je přírodní bílkovina složená z aminokyselin. Získává se vařením a následnou extrakcí hovězích a vepřových kůží, kostí a šlach, což jsou tkáně bohaté na kolagen. Jinou variantou je získávání želatiny z ryb. Zahřátím se želatina rozpouští a ochlazením rosolovatí. Této schopnosti se využívá v různých odvětvích průmyslu, zejména v potravinářství, při výrobě fotografií, ve farmacii a nyní se objevují i možnosti jejího využití v medicíně. [34]
Fyzikální a chemické vlastnosti rybí želatiny získané z kůží kaprovitých ryb (Labeo rohita, Cyprinus Carpio) zkoumali v Central Institute of Fisheries Technology, Cochin, Kerala v Indii. Zjištěná výnosnost želatiny sněhobílého vzhledu se světlou texturou byla 12 – 13 % Z parametrů viskozity, pevnosti, bodu tání a obsahu kyselin a tuků vyplynulo, že tato surovina je plnohodnotnou náhradou běžných typů hovězí a vepřové želatiny. [35]
V Subarctic Agricultural Research Unit v Kodiacu na Aljašce a v Bioproduct Chemistry and Engineering Research Unit v Albany, USA nalezli využití želatiny z aljašské ryby tresky tmavé pro výrobu scaffoldu smícháním s kyselinou polymléčnou (PLA) z cukrové kukuřice a testují využití pro kostní náhrady a plastickou chirurgii. Pro zvlákňování směsi polymerů zvolili electrospinning a vytvářejí nanovlákna, která se seskupují v souvislou, mléčně bílou vrstvu. Ta je podkladem pro růst živočišných buněk.
Neočekávají se alergické reakce, neboť PLA se již dnes běžně pro implantáty používá.[36]
Scaffold vyrobený z orientovaných kolagenových vláken by měl vytvořit osově orientované pórovité kanály. Ty by umožňovaly regeneraci např. nervů a míchy a dále by fyzicky podporovaly růst nervových spojení. Vylepšení se dá očekávat, pokud bude kolagen smíchaný s růstovými faktory a exogenními buňkami. Směrování vláken
33 kolagenu se dá dosáhnout jednosměrným zmrazením a následným sušením. Hloubka zmrazení a koncentrace kolagenu určuje velikost pórů. [37]
2.3 Hydroxyapatit v kostních implantátech
Hydroxyapatit (HA) je minerál s fosforem a vápníkem, který se přirozeně vyskytuje v zubech a v kostní tkáni. Je tudíž biokompatibilní a nebiodegradabilní (obr. 2.4). Zubům a kostem poskytuje tvrdost a odolnost proti různým druhům namáhání. Přírodní minerál mívá hnědé, žluté nebo zelené zabarvení. Uměle vyrobený prášek hydroxyapatitu je čistě bílý. Odolává teplotám do 800 °C. Používá se na výrobu biokeramiky v ortopedii a stomatologii. Nově se zkouší kombinace s polymerní matricí pro výrobu scaffoldů. [24]
Obr. 2.4: Kostní buňky rostoucí na podkladu Obr. 2.5: Želatina/hydroxyapatit scaffold z hydroxyapatitové keramické pěny (převzato: AZAMI Mahmoud. SEM of fabricated (převzato: BINNER, Jon. Human long bone cell gelatin/hydroxiapatite scaffold. Amirkabir growing on the surface of a hydroxiapatite University of Technology, 2010) ceramic foam. IPTME, Loughborough, 2003)
Metoda rapid prototyping (RP), což je plazmová depozice hydroxyapatitu na scaffold z PLGA, dává nové možnosti v tkáňovém inženýrství. Porovnáním adheze a růstu osteoblastů na tomto scaffoldu s růstem buněk na agaru s kyselinou hyaluronovou a hydroxyapatitem byly získány poznatky o možnosti aplikace takto upravených nosičů.
Vykazovaly nejvyšší míru buněčné proliferace lidských osteoblastů. Zatím nebyly zkoumány mechanické vlastnosti těchto nosičů. [38]
34 V případě kostních defektů lze využít i biodegradabilní polymer ve spojení s keramickým materiálem (obr. 2.5). Unikátní je však varianta injekční. Je minimálně invazivní a podstatně jednodušší než metody in vitro. Lze také snáz vyplnit nepravidelný tvar chybějící kosti. Mikročástice kyseliny polyamidové-glykolové (PLGA) jsou potaženy hydroxyapatitem smíchaným s osteoblasty. PLGA v těle se rozkládá hydrolýzou na kyselinu mléčnou a kyselinu glykolovou, což jsou běžné tělní produkty. Apatit smíchaný s osteoblasty zůstane v místě aplikace a umožní rychlý růst kostní tkáně. Funkčnost této metody byla potvrzena na myších již po šesti týdnech. [39]
Vědci z National Taiwan University and University Hospital, Taipei se věnují zkoumání kombinace kyseliny polymléčné (PLLA) v kombinaci s rhBMP2 (rekombinantní humánní kostní morfogenetický protein-2; recombinant human bone morphogenetic protein-2) pro kostní scaffoldy. Tento tkáňový nosič zajišťuje řízené uvolňování proteinu, který pozitivně ovlivňuje přijetí nosiče organizmem a podporuje rychlou migraci a tvorbu buněk. [40]
Pro zvýšení vzájemné interakce mezi kostní výplní a kostní tkání se osvědčilo povrch implantátu z polyvinylalkohol-hydrogelu (PVA-H) pokrýt amorfním hydroxyapatitem pomocí pulsního laseru. Vzniká tenký film HA tloušťky cca 300 nm. Proliferace osteoblastů a diferenciace buněk byla výrazně vyšší než u HA na vlastní kostní tkáni. [41]
Hydroxyapatit je minerální složka kostí, je vysoce biokompatibilní a cenově dostupný. Zároveň kolagen je hlavní strukturální protein. Proto byl vyroben scaffold z vysoce porézního HA a do něj začleněn kolagen pro zlepšení biologických vlastností nosiče. Na základě zkoumání elektronovým mikroskopem, infračervenu spektroskopií a energetickou disperzní spektroskopií vzorků in vivo i in vitro bylo zjištěno, že prokazují lepší růst osteoblasty na tomto nosiči, než na samotném nosiči HA. [42]
Scaffold z nano-hydroxyapatitu kombinovaný s chitosanem s vysokou pórovitostí podporuje výrazněji růst buněk a jejich morfologii než čistý chitosan. Částice nano- hydroxyapatitu jsou chemicky navázány na skelet, který neumožňuje jejich rozptyl do okolní tkáně. [43]
V případě kovových kostních implantátů je nutná úprava povrchu. Jednou z možností je nanášení vrstvy porézní keramiky nano-oxidu hlinitého. Po nanesení se
35 provede eloxování v kyselině fosforečné a povrch získá pórovitou strukturu. Ve střihu vykazovala mechanická měření hodnoty nad 10MPa a v pevnosti v tahu dokonce 20 MPa.
Na této vrstvě s nanopóry dochází k normální aktivitě osteoblastů. [44]
Kvalita implantátů roste v závislosti na nových poznatcích vědy. V současné době je v oblasti kloubních implantátů vysoce oceňován polymer UHMWPE (Ultra-High Molecular Weight Polyethylene) na výrobu umělé kloubní jamky. Vykazuje dobré kluzné vlastnosti, ale podléhá otěru, neboť klouby jsou mimořádně zatěžovány. Nejenže dochází ke ztenčení materiálu a opotřebení kloubu, ale v okolních tkáních mohou odštěpené částice způsobovat zánětlivé reakce. Polymer UHMWPE (Mw = 150 000) je material s vysokou molekulovou hmotností a jejím sesíťováním lze výrazně snížit otěr kloubní jamky. Nejprve je nutné implantát vystavit gama záření, pak tepelně modifikovat, čímž dojde k odstranění zbytkových radikálů po ozařování, a závěrem sterilizovat. Životnost takto upraveného implantátu se pohybuje okolo 20 let. Ústav Makromolekulární chemie Akademie věd ČR má patent na výrobní postup tohoto polymeru, nyní probíhají klinické testy a na českém trhu by se měl brzy tento výrobek objevit. [45]
Počet dárců kostních štěpů je limitován, proto se hledají alternativní postupy. Implantáty kostní tkáně vyžadují 3D porézní nosič, zárodečné nebo zralé buňky a odpovídající růstový faktor. Hojně se využívají biologicky rozložitelné polymery. Polyuretan (PU) je jedním z nejvíce biokompatibilních materiálů a používá se jako dočasná extracelulární matrice v inženýrství kostní tkáně. Hlavní problém spočívá v nedostatku bioaktivních skupin. Řešením je mísení polyuretanu s bioaktivními keramickými částicemi jako je fosforečnan vápenatý nebo s hydroxyapatitem (HA). Tato kombinace by mohla zlepšit biologickou aktivitu a zvýšit mechanické vlastnosti porézních scaffoldů. [46]
Hydroxyapatit (CA10(PO4)6(OH)2) vzbudil velký zájem jako materiál pro implantáty zubů a kostí vzhledem k podobnosti své krystalografie a chemického složení s lidskými tvrdými tkáněmi. Ve většině případů je rozpustnost HA důležitým faktorem, neboť vyvolává biologické aktivity. Fluorapatit (FA) s chemickým vzorcem CA10(PO4)6(F)2 je méně rozpustnostný než HA, ale má vyšší chemickou a strukturní stabilitu. Kromě toho fluor zvyšuje mineralizaci a krystalizaci látek fosforečnanu vápenatého při kostní regeneraci.
36 Obr. 2.6: Snímky scaffoldů s kompozitem níže uvedeného složení (převzato [46])
A) PU–0% FHA; B) PU–5% FHA;
C) PU–10% FHA; D) PU–20% FHA.
Také FHA je chemicky podobný s částí fosforečnanu vápenatého v kostní tkáni a tvoří silné chemické vazby s kostí, má srovnatelnou biokompatibilitu a bioaktivitu s čistým HA. Rozptýlením částic nano-fluorhydroxyapatitu na polyuretanové matrici lze získat porézní kompozit polyesteruretan / nano fluor-hydroxyapatit (PU/nFHA).
Výroba testovacích vzorků proběhla ve třech krocích. Nejprve syntéza nFHA prášku metodou sol-gel ze směsi 50 % hmotnostních HA a 50 % hmotnostních FA.
Následovala syntéza polyuretanu. Výroba kompozitu z polyuretanové pěny s obsahem 5, 10 a 20 % (hm) nFHA (obr. 2.6). Roztok PU v dioxanu s nFHA se míchá po dobu 30 minut a pak se rychle ochladí na 5 °C. Suší se mrazem ve vakuu 0,1 mbar a dosouší při 40 °C
37 ve vakuové sušárně. Výsledkem je prášek nFHA s velikostí částic menších než 100 nm s krystalickou strukturou.
Scaffold vykazoval vzájemně propojené a homogenní póry velikosti 50 - 250 µm.
Výsledky získané v tomto výzkumu ukázaly, že pórovitost a průměrná velikosti pórů se snížila se zvýšeným procentem nFHA. Vzhledem k morfologickým, fyzikálním a mechanickým vlastnostem má scaffold s vyšším poměrem nFHA vhodný potenciál pro využití při regeneraci tkání. [46]
2.4 Textilní materiály
Biokompatibilní materiály mohou být vyrobeny také z textilních vláken. Lze vytvářet struktury jedno, dvou i třírozměrné a upravit je podle druhu použití změnou výrobního material, použitou technikou nebo povrchovou úpravou. [7] Jsou schopné zajistit dobrou pevnost, pružnost i pórovitost.
38
Kapitola 3
Elektrostatické zvlákňování
Proces elektrostatického zvlákňování byl prvně popsán ve 30. letech minulého stolení, patentovat si jej nechal v roce 1934 Antonín Formhals. Použil acetát celulózy a polymer zvlákňoval mezi dvěma elektrodami. Aceton sloužil jako rozpouštědlo, při procesu se vypařil, a zůstala jen velmi jemná vlákna celulózy. [47]
Elektrostatické zvlákňování je děj, při kterém z roztoku nebo taveniny polymeru působením elektrostatických sil vznikají vlákna, jejichž průměr je v rozsahu desítek až stovek nanometrů. Proces funguje s různými druhy polymerů. Vzniklá vlákna se mohou využít pro biologické aplikace, filtraci, elektroniku, řízené dávkování léčiv a jiné. [48]
Elektrostatické zvlákňování má několik variant uspořádání výrobního zařízení. Nejčastěji se jedná o zvlákňování z jehly, z tyčky, s horizontálním nebo vertikálním uspořádáním, produkce však je velmi pomalá. Tyto postupy nejsou průmyslově využitelné.
Při elektrostatickém zvlákňování lze do roztoku polymeru vmíchat další částice, což může negativně ovlivnit zvláknitelnost. Navíc jsou tyto částice v polymeru po zvláknění uzavřeny a jejich využití omezeno. S výhodou lze ale tento postup použít u biodegradabilních polymerních vláknen, kde plní funkci nosiče léčiv. Další variantou je koaxiální zvlákňování, tj. vytváření dvouvrstvých vláken. Výhodou je, že vnitřní vrstva mohou být různé částice nebo i nezvláknitelné roztoky a disperze. [49,50]
39
3.1 Princip elektrostatického zvlákňování
Při jehlovém zvlákňování je přivedeno elektrického napětí na jehlu a kolektor v řádech kilovoltů. Intenzita vzniklého elektrické pole poruší soudržnost kapky polymerního roztoku, který je z jehly vytlačován, vytvoří se Taylorův kužel s následným vypuzením elektricky nabitého proudu polymeru, dochází k dloužení vlákna bičováním a odpařování rozpouštědla. Jednotlivá tenká vlákna dopadají na kolektor a vytvářejí nanovlákennou vrstvu. Při zvlákňování z volné hladiny je rotující váleček smáčen roztokem polymeru a Taylorovy kužely vznikají na válečku v místě s optimální intenzitou elektrického pole.
[48,49]
3.2 Hladinové zvlákňování
Metoda Nanospider
Zvlákňování z volné hladiny má výrazně vyšší produktivitu než kapilární metody.
Jediným zástupcem pro komerční produkci je výroba metodou Nanospider (obr 3.1), která byla vyvinuta na Katedře netkaných textilií Technické univerzity v Liberci. Metodou Nanospider lze vyrábět velmi kvalitní netkané textilie s průměrem vláken 200 – 500 nm, které se využívají zejména pro zdravotnictví a pro filtrace, ve stavebnictví a mnoha jiných oborech. Metoda Nanospider byla patentována. Prodej a další vývoj zajišťuje firma Elmarco s. r. o. [47,48]
Ve zvlákňovaném roztoku polymeru se otáčí elektricky nabitý váleček s vrstvou polymeru na povrchu, z kterého vznikají Taylorovy kužely, a z nich následně nanovlákna, ukládající se na kolektor. Kolektor a váleček tvoří opačně nabité elektrody, mezi kterými vzniká elektrostatické pole. [47,49]
Při zvlákňování polymerů je nutné brát zřetel na používání toxických rozpouštědel, která mohou negativně ovlivnit zdraví. Lze volit polymery rozpustné ve vodě nebo využívat uzavřené pracovní boxy. [47]
40
1. polymerní roztok 2. váleček ø20 mm 3. kryt zařízení 4. podkladová textilie 5. naviják
6. servomotor Siemens UD0607 7. pohon válečku
8. zdroj napětí a proudu 9. vzduchová pumpa Leister 10. vzduchové potrubí 11. automat Teco 12. multimetr
Obr. 3.1: Schéma konstrukce zařízení Nanospider
Přeplavovací spinner
Přeplavovací spinner (obr. 3.2) využívá podobného tvaru kapalinového tělesa pro vznik nestability jako metoda Nanospider. Místo válečku je použita elektricky nabitá přeplavovací kovová hrana. Množství přitékajícího polymeru a tvar hrany určuje tvar kapalinového tělesa, na jehož povrchu dochází k hladinovým nestabilitám a vzniku Taylorových kuželů. Maximální hodnota elektrostatického pole na povrchu kapalinového tělesa je nepřímo úměrná jeho poloměru.
Zařízení je tvořeno třemi vzájemně spojenými rovnoběžnými deskami, prostřední deska je kovová. První komora se naplní přiváděnou kapalinou. Do druhé vtéká již v tenké vrstvě a přes kovovou hranu vytváří charakteristické kapalinové těleso. Na jeho povrchu nastává elektrostatické zvlákňování a nespotřebovaná kapalina odtéká volně mimo spinner. [38]
41 Obr. 3.2: Přeplavovací hladinový koaxiální electrospinner,
(1) přívod vnitřní komory, (2) přívod vnější komory.
(převzato: [38])
3.3 Ovlivnění procesu elektrostatického zvlákňování polymerů
Mezi nejdůležitější parametry, které ovlivňují proces elektrostatického zvlákňování polymerů, patří intenzita elektrického pole a elektrického napětí, vzdálenost a pohyb kolektoru, teplota a vlhkost vzduchu, koncentrace a viskozita polymeru, rychlost vypařování rozpouštědla. [47]
Zvýšením průchodu elektrického proudu dochází k přenosu vyššího objemu polymeru. Při zvýšení elektrického napětí vzniká perličkový efekt ve vláknech a roste průměr vláken. Zvýšená koncentrace roztoku znamená vyšší viskozitu polymeru, méně perličkových efektů a větší průměr vláken, která se deformují do plochých vláken. Rychlost dopadu na kolektor se snižuje, takže dochází k vyššímu odpaření rozpouštědla, a vlákna uložená na kolektoru jsou sušší. Vyšší molekulová hmotnost polymeru má stejný dopad jako vyšší koncentrace. Povrchové napětí polymeru je závislé na volbě rozpouštědla.
Nižší povrchové napětí omezuje vznik perličkového efektu. Při větší vzdálenosti kolektoru od kapiláry dochází delší dobu k bičování proudu polymeru, tím se vlákna dlouží a zároveň zmenšují svůj průměr. Při malé vzdálenosti vznikají kapky. [47,50]
