Studies of antimicrobial factors in human milk and bacterial colonization
of the newborn
AKADEMISK AVHANDLING
som med vederbörligt tillstånd av Rektorsämbetet vid Umeå Universitet för avläggande av medicine doktorsexamen
kommer att offentligen försvaras i Samhällsvetarhuset, sal D tisdagen den 27 maj 1975 kl. 9.00
av
LEIF GOTHEFORS
med. lic.
Larsson & Co Tryckeri, Umeå 1975
UMEÅ UNIVERSITY MEDICAL DISSERTATIONS
From the Departments of Paediatrics and Clinical Bacteriology, University of Umeå, Umeå, Sweden
Studies of antimicrobial factors in human milk and bacterial colonization
of the newborn
by
LEIF GOTHEFORS
Umeå universitet
Umeå 1975
To t h e m o t h e r s o f my f a m i l y , t h o s e who a r e a n d t h o s e t o be
Th e s t u d i e s w e r e s u p p o r t e d by r e s e a r c h g r a n t s f r o m S w e d i s h M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l ( 1 9 X - 7 6 5 ) , S e m p e r F u n d f o r N u t r i t i o n a l R e s e a r c h , S w e d i s h N u t r i t i o n F o u n d a t i o n , Å h l é n F o u n d a t i o n , K r o n p r i n s e s s a n L o v i s a s f ö r e n i n g f ö r b a r n s j u k v å r d a n d t h e M e d i c a l F a c u l t y , U n i v e r s i t y o f Ume å .
P r i n t e d i n S w e d e n
D. Daddan.
Daddan är en vicemamma, när ej pappan själv kan amma.
Untranslatable saying from Albert Engström:
Pyttans A-B och C-D-lära
3
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T h i s t h e s i s i s b a s e d on t h e f o l l o w i n g c o m m u n i c a t i o n s w h i c h w i l l b e r e f e r r e d t o i n t h e t e x t by t h e i r Roman n u m e r a l s :
I G i n d r a t , J . - J . , G o t h e f o r s , L . , H a n s o n , L . Â . & W i n b e r g , J . : A n t i b o d i e s i n h u ma n m i l k a g a i n s t E . c o l i o f t h e s e r o g r o u p s m o s t c o m m o n l y f o u n d i n n e o n a t a l i n f e c t i o n s . A c t a P a e d i a t r S c a n d , 6 2 : 5 8 7 , 1 9 7 2
I I C a r l s s o n , J . & G o t h e f o r s , L . : T r a n s m i s s i o n o f L a c t o - b a c i l l u s j e n s e n i i a n d L. a c i d o p h i l u s f r o m m o t h e r t o c h i l d a t t h e t i m e o f d e l i v e r y . J C l i n Mi c r o b i o l , 1 9 7 5
I I I G o t h e f o r s , L. & M a r k l u n d , S . : L a c t o p e r o x i d a s e a c t i v i t y i n h u ma n m i l k a n d i n s a l i v a o f n e w b o r n i n f a n t s .
I n f e c t I mmun ( i n p r e s s )
IV G o t h e f o r s . L . , O i l i n g , S . & W i n b e r g , J . : B r e a s t f e e d i n g a n d b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f f a e c a l E. c o l i s t r a i n s . A c t a P a e d i a t r S c a n d ( i n p r e s s )
V C a r l s s o n , B . , G o t h e f o r s , L . , A h l s t e d t , S . , H a n s o n , L . Â .
& W i n b e r g , J . : S t u d i e s o f E s c h e r i c h i a c o l i 0 a n t i g e n s p e c i f i c a n t i b o d i e s i n h u ma n m i l k , m a t e r n a l s e r u m a n d c o r d b l o o d . ( I n m a n u s c r i p t )
VI G o t h e f o r s , L . , C a r l s s o n , B . , A h l s t e d t , S . , H a n s o n , L . Â .
& W i n b e r g , J . : I n f l u e n c e o f m a t e r n a l g u t f l o r a a n d c o l o s t r a l a n d c o r d s e r u m a n t i b o d i e s on p r e s e n c e o f E s c h e r i c h i a c o l i i n f a e c e s o f t h e n e w b o r n i n f a n t . ( I n m a n u s c r i p t )
CONTENTS
1 G e n e r a l s u m m a r y P a g e 7
2 I n f e c t i o n s i n t h e n e w b o r n i n f a n t w i t h 9 E s c h e r i c h i a c o l i
3 P o s s i b l e r o u t e s a n d m e c h a n i s m s o f E . c o l i 10 i n f e c t i o n s i n e a r l y l i f e
4 F a c t o r s i n f l u e n c i n g t h e g u t f l o r a 12
4 . 1 E x t e r n a l f a c t o r s t h a t e f f e c t t h e 12 i n t e s t i n a l f l o r a
4 . 1 . 1 S o u r c e s o f t h e b a c t e r i a l f l o r a 12
4 . 1 . 2 D i e t 12
4 . 1 . 3 D r u g s 14
4 . 2 H o s t f a c t o r s 15
4 . 2 . 1 I n t e s t i n a l s e c r e t i o n s 15
4 . 2 . 1 . 1 S a l i v a I5
4 . 2 . 1 . 2 G a s t r i c a c i d 15
4 . 2 . 1 . 3 E n z y m e s , p r o t e i n s a n d 15 b i l e s a l t s
4 . 2 . 2 T h e i n t e s t i n a l m u c o s a 16
4 . 2 . 3 I m m u n o l o g i c a l m e c h a n i s m s 16
4 . 2 . 3 . 1 T h e o r i g i n o f a n t i b o d i e s i n 16 t h e g u t
4 . 2 . 3 . 2 P o s s i b l e e f f e c t s o f s l g A i n 17 t h e c o n t r o l o f t h e f l o r a a n d
i n f e c t i on
4 . 2 . 4 I n t e s t i n a l m o t i l i t y ^
4 . 3 B a c t e r i a l i n t e r a c t i o n s ^
5
5 Ai m o f t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n P a g e 21
6 Wh i c h i s t h e s o u r c e f o r t h e b a c t e r i a 22 i n t h e g u t o f t h e n e w b o r n i n f a n t ?
6 . 1 E . c o l i 22
Wh a t i s t h e u l t i m a t e f a t e o f t h e E . c o l i i n t h e i n t e s t i n a l t r a c t o f t h e n e w b o r n i n f a n t ?
6 . 2 L a c t o b a c i l l i ^
6 . 3 B i f i d o b a c t e r i a 29
7 C o m p l e m e n t c o m p o n e n t C 3 i n h u ma n m i l k 31
8 T h e 1 a c t o p e r o x i d a s e - t h i o c y a n a t e - h y d r o - 34 g e n p e r o x i de s y s t e m
9 A n t i b o d i e s i n h uma n m i l k ^5
9 . 1 S y n t h e s i s o f a n t i b o d i e s ^
9 . 2 F u n c t i o n o f m i l k a n t i b o d i e s i n t h e 37 g u t
10 C o n c l u s i o n s 38
A c k n o w l e d g e m e n t s 40
R e f e r e n c e s 41
1 GENERAL SUMMARY
T h e p r e s e n t s t u d i e s , w h i c h c a n b e l o o k e d u p o n a s a n a t t e m p t i n t h e f i e l d o f a p p l i e d i m m u n o l o g y , w e r e i n d u c e d b y r e p o r t s on an i n c r e a s i n g f r e q u e n c e o f i n f e c t i o n s i n s m a l l i n f a n t s c a u s e d by G r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a , a n d on t h e p o s s i b l e p r o t e c t i v e e f f e c t s o f h u ma n m i l k i n t h i s c o n n e c t i o n .
A f t e r b i r t h t h e g a s t r o - i n t e s t i n a l t r a c t b e c o m e s c o l o n i z e d b y s e v e r a l b a c t e r i a l s p e c i e s , t h e p r o c e s s b e i n g q u a n t i t a t i v e l y a n d q u a l i t a t i v e l y i n f l u e n c e d b y t h e a c t u a l t y p e o f f e e d i n g . Human u n p r o c e s s e d m i l k i s r i c h i n a n t i m i c r o b i a l f a c t o r s , w h i c h h a v e b e e n s t u d i e d i n v i t r o , b u t c o m p a r a t i v e l y l i t t l e i s k nown a b o u t how t h e s e may i n f l u e n c e t h e c o l o n i z a t i o n p r o c e s s .
I n a n a t t e m p t o f m a p p i n g s o me o f t h e s e m i l k f a c t o r s a n d t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h o t h e r m a t e r n a l a n d e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s i n e s t a b l i s h i n g t h e n o r m a l f a e c a l f l o r a o f t h e n e w b o r n , we h a v e b e e n a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t :
1. T h e d e l i v e r y i s o f t e n n o t t h e t i m e wh e n m a t e r n a l i n t e s t i n a l b a c t e r i a ( E . c o l i ) a r e t r a n s m i t t e d t o t h e i n f a n t .
2 . O t h e r f a c t o r s t h a n t h e p r e d o m i n a n t E . c o 1 i s e r o t y p e o f t h e m o t h e r o f t e n d e t e r m i n e t h e f l o r a o f t h e i n f a n t ' s f a e c e s d u r i n g t h e f i r s t w e e k s o f l i f e .
3 . L a c t o b a c i l l i ( L. a c i d o p h i l u s a s w e l l a s t h e h i t h e r t o l i t t l e known L . j e n s e n i i ) a r e t r a n s m i t t e d f r o m m o t h e r t o i n f a n t d u r i n g t h e d e l i v e r y , a r e t r a n s i e n t s i n t h e m o u t h o f t h e n e w b o r n , b u t b e c o m e a n e s s e n t i a l p a r t o f t h e i n d i g e n o u s g u t f l o r a d u r i n g t h e f i r s t w e e k .
4 . G r a m - n e g a t i v e s , l i k e E . c o l i , a r e s e l d o m f o u n d on t h e a r e o l a e ma mma e , w h e r e s t a p h y l o c o c c i a r e p r e s e n t i n n u m b e r s o f s o me h u n d r e d s p e r cm .2
7
5 . R e s i d e n t t y p e s o f E . c o 1 i may b e c o m e e s t a b l i s h e d i n n e w b o r n i n f a n t s , a n d s o me o f t h e s e t y p e s a r e l a t e r t r a n s f e r r e d t o t h e m o t h e r .
6 . T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c o m p l e m e n t c o m p o n e n t C 3 i n huma n m i l k i s 5 - 10% o f t h a t i n s e r u m , a l t h o u g h i n e a r l y c o l o s t r u m C 3 may r e a c h t h e s a me l e v e l s a s t h o s e s e e n i n s e r u m . As C 3 i s p r o b a b l y i n a c t i v a t e d by t h e g a s t r i c j u i c e o f t h e n e w b o r n t h e a n t i b a c t e r i a l f u n c t i o n o f m i l k C 3 i n t h e g u t i s d o u b t f u l .
7 . T h e 1 a c t o p e r o x i d a s e s y s t e m , i n c l u d i n g t h i o c y a n a t e a n d i s a v a i l a b l e t o t h e n e w b o r n i n f a n t i n s a l i v a b u t t h e c o n c e n t r a t i o n s o f 1 a c t o p e r o x i d a s e i n h u ma n m i l k i s r a t h e r l o w .
8 . Human c o l o s t r u m i s r i c h i n I gA a n t i b o d i e s a g a i n s t a b r o a d s p e c t r u m o f E . c o l i 0 a n t i g e n . T h e d a i l y p r o d u c t i o n o f t h e s e a n t i b o d i e s i s f a i r l y c o n s t a n t f r o m d e l i v e r y a n d o n w a r d s f o r s e v e r a l m o n t h s . No m a j o r d i f f e r e n c e s i n a n t i b o d y c o n t e n t a r e s e e n d u r i n g a m e a l o r d u r i n g o n e d a y . A l i q u o t s o f m i l k ma y t h e r e f o r e be r e g a r d e d a s r e p r e s e n t a t i v e f o r t h e w h o l e m e a l a n d t h e w h o l e d a y a s f a r a s a n t i b o d i e s a r e c o n c e r n e d .
Th e l e v e l s o f I gA a n t i b o d y i n c o l o s t r u m a r e 10 o r 1 0 0 t i m e s h i g h e r t h a n i n r e l a t e d s e r u m i n d i c a t i n g a n i n t e n s e l o c a l p r o d u c t i o n . E v e n f o r IgM a l i m i t e d p r o d u c t i o n i s s u g g e s t e d w h i l e l o w r a t i o s f o r I gG i n d i c a t e s a p a s s i v e t r a n s f e r f r o m s e r u m t o m i l k .
T h e a n t i b o d i e s a r e r e c o v e r e d i n t h e i n f a n t s t o o l w i t h s t i l l a g g l u t i n a t i n g p r o p e r t i e s .
9 . T h e s e l o c a l a n t i b o d i e s do n o t i n f l u e n c e t h e i n t e s t i n a l l u m i n a l c o l o n i z a t i o n , a s j u d g e d f r o m p r e s e n c e o f E . c o l i s e r o t y p e s i n f a e c e s , b u t may s e l e c t l o w - v i r u l e n t m u t a n t s .
2 I NFECTI ONS IN THE NEWBORN INFANT WITH ESCHERI CHI A COLI
E . c o l i i n f e c t i o n s s t i l l c a u s e n e o n a t a l m o r t a l i t y a n d m o r b i d i t y . Th e i n c i d e n c e o f s e p t i c a e m i a a n d m e n i n g i t i s v a r i e s f r o m 0 . 5 t o 2 p e r 1 . 0 0 0 l i v e b i r t h s ( 8 8 ) w i t h f a t a l i t y r a t e s up t o 50 p e r c e n t ( 5 3 ) . D u r i n g t h e 3 0 ' s h e m o l y t i c s t r e p t o c o c c i w e r e t h e m o s t common c a u s e b u t d u r i n g t h e 5 ( T s a n d 6 ( T s e n t e r i c b a c t e r i a
( e s p . E . c o l i ) b e c a m e p r e d o m i n a n t ( 2 3 , 5 3 , 72 , 7 4 , 8 8 ) . T h e E . c o l i s e r o t y p e s f o u n d i n n e o n a t a l s e p t i c a e m i a a s w e l l a s i n n e o n a t a l UTI a r e o f t e n t h e s a me a s t h o s e f o u n d i n f a e c e s f r o m h e a l t h y c h i l d r e n a n d a d u l t s ( 7 ) . Many o f t h e m h a v e K 1 a n t i g e n s w h i c h m i g h t b e a v i r u l e n c e f a c t o r a n d e x p l a i n t h e s o m e t i m e s h i g h m o r t a l i t y r a t e * ( 3 3 ) .
T h e f r e q u e n c y o f n e o n a t a l s y m p t o m a t i c u r i n a r y t r a c t i n f e c t i o n ( U T I ) may b e i n t h e o r d e r o f 1 - 2 %0 ( 7 ) .
A t h i r d g r o u p o f i n f e c t i o n s r e l a t e d t o e n t e r i c b a c t e r i a i s o f c o u r s e g a s t r o e n t e r i t i s . I n c o u n t r i e s w i t h p o o r s a n i t a r y c o n d i t i o n s t h e m o r b i d i t y f i g u r e s a r e h i g h a n d i n f e c t i o n o f t h e i n t e s t i n a l t r a c t i s a m a j o r c a u s e o f i n f a n t m o r t a l i t y ( 8 4 ) . B e s i d e s S h i g e l i a , S a l m o n e ! l a a n d V i b r i o c h o l e r a , E . c o l i i s t h e m o s t common p a t h o g e n . Th e p r e v a i l i n g c o n c e p t o f e n t e r o - p a t h o g e n i c E . c o 1 i ( EP EC) h a s b e e n c h a l l e n g e d a n d i t now s e e m s p r o b a b l e t h a t ma n y ( m o s t ? ) E . c o l i s e r o t y p e s c a n t a k e up t h e p l a s m i d s c o n t r o l l i n g t h e p r o d u c t i o n o f e n t e r o t o x i n s w h i c h a r e a t l e a s t p a r t l y r e s p o n s i b l e f o r t h e v i r u l e n c e o f t h e m i c r o o r g a n i s m s ( 7 3 ) . H o w e v e r , i n a d d i t i o n t o e n t e r o t o x i n p r o d u c t i o n o t h e r p r o p e r t i e s o f t h e a c t u a l E . c o l i s t r a i n , f o r e x a m p l e a b i l i t y t o a d s o r b t o t h e i n t e s t i n a l e p i t h e l i u m , i n f l u e n c e u p o n t h e e n t e r o p a t h o g e n i c i t y ( 6 8 ) .
*
R o b b i n s , J . B . & H a n s o n , L . A . : E s c h e r i c h i a c o l i Kl c a p s u l a r p o l y s a c c h a r i d e a s s o c i a t e d w i t h n e o n a t a l m e n i n g i t i s . N Eng J M e d , 2 9 0 : 1 2 1 6 , 1 9 7 4
9
3 POSSI BLE ROUTES AND MECHANISMS OF E . C OL I I NFECTI ONS IN EARLY LI F E
N e o n a t a l E . c o l i i n f e c t i o n s a r e g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o o c c u r a s i n u t e r o i n f e c t i o n s ( e a r l y r u p t u r e o f m e m b r a n e s a n d l o n g d u r a t i o n o f l a b o r ) o r t h r o u g h t h e u m b i l i c a l s t u m p . H o w e v e r , S i l v e r m a n e t a l . ( 7 2 ) a n d Good e t a l . ( 7 4 ) e a r l y p o i n t e d o u t t h a t n e o n a t a l G r a m - n e g a t i v e i n f e c t i o n s w e r e o f o b s c u r e o r i g i n . T h i s w a s c o n f i r m e d i n r e c e n t s t u d i e s ( 7 , 8 9 ) .
S i n c e n e o n a t a l E . c o l i i n f e c t i o n s o f t e n b e c o m e a p p a r e n t a f e w d a y s a f t e r d e l i v e r y wh e n i n t e s t i n a l c o l o n i z a t i o n o c c u r s a n d s i n c e b r e a s t m i l k s e e m e d t o d i m i n i s h t h e r i s k o f s e p t i c a e m i a i n t h e i n f a n t ( 8 9 ) i t wa s s u g g e s t e d , t h a t h u ma n G r a m - n e g a t i v e i n f e c t i o n s may o c c u r b y t h e g a s t r o - i n t e s t i n a l r o u t e , a s t h e y do i n t h e p i g l e t .
When o n e a t t e m p t s t o u n d e r s t a n d t h e p a t h o g e n e s i s o f n e o n a t a l i n f e c t i o n s w i t h E . c o l i a n d t h e p o s s i b l e p r o t e c t i v e e f f e c t o f m i l k , c o n s i d e r a t i o n o f t h e wa y i n w h i c h t r a d i t i o n a l e n t e r i c p a t h o g e n s p r o d u c e d i s e a s e may b e h e l p f u l . T h i s may o c c u r i n t h r e e d i f f e r e n t w a y s , a s e x e m p l i f i e d by V i b r i o c h o l e r a e , S h i g e l l a a n d S a l m o n e ! 1 a ( 3 6 , 6 8 ) .
V i b r i o c h o l e r a e a t t a c h e s t o m u c o s a l e p i t h e l i u m i n t h e s m a l l i n t e s t i n e w i t h o u t p e n e t r a t i n g i t . T h e r e t h e b a c t e r i a m u l t i p l y a n d r e l e a s e a n e x o t o x i n c a u s i n g o u t p o u r i n g o f w a t e r a n d
e l e c t r o l y t e s . M o s t EPEC s t r a i n s s e e m t o b e h a v e i n a s i m i l a r w a y . A l t h o u g h t h e s e m i c r o o r g a n i s m s c a n p r o d u c e t o x i n s e v e n i f t h e y a r é n o t a t t a c h e d t o m u c o s a l e p i t h e l i a , i t i s o n l y wh e n t h e y a r e s t i c k i n g t o t h e e p i t h e l i u m a n d m u l t i p l y i n g t h e r e t h a t t h e y may p r o d u c e s u f f i c i e n t t o x i n t o b e h a r m f u l t o t h e h o s t .
T h e s e c o n d g r o u p o f p a t h o g e n s i s e x e m p l i f i e d by S h i g e l l a . T h e s e b a c t e r i a f i r s t p r o l i f e r a t e i n t h e u p p e r r e g i o n s o f t h e s m a l l b o w e l , t h e n p e n e t r a t e t h e e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e l a r g e i n t e s t i n e , m u l t i p l y w i t h i n t h e m u c o s a a n d , p e r h a p s , t h e l a m i n a p r o p r i a . T h i s l e a d s t o t h e w e l l k n o w n d e s t r u c t i o n o f a r e a s o f
i n t e s t i n a l e p i t h e l i u m . P n e u m a t o s i s i n t e s t i n a l i s s e e n i n t h e
p r e m a t u r e ma y b e d u e t o a s i m i l a r e f f e c t o f a n E . c o l i a t t a c k . E x p e r i m e n t a l s t u d i e s may s u p p o r t t h i s s u g g e s t i o n ( 5 ) .
T h e S a l m o n e l l a c o n s t i t u t e t h e t h i r d i m p o r t a n t g r o u p o f i n t e s t i n a l p a t h o g e n s . V i r u l e n t s t r a i n s p e n e t r a t e t h e m u c o s a i n t h e d i s t a l i l e u m a n d l a r g e b o w e l b u t w i t h o u t d a m a g e t o t h e e p i t h e l i u m . T h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i s e l i c i t e d i n t h e l a m i n a p r o p r i a b u t t h e b a c t e r i a a r e s p r e a d w i t h b l o o d a n d l y m p h a t o t h e l i v e r w h e r e t h e y m u l t i p l y l e a d i n g t o a s e c o n d a r y b a c t e r e m i a a n d d i s s e m i n a t i o n . T h e E . c o l i s t r a i n s g i v i n g s e p t i c a e m i a m i g h t o p e r a t e i n a s i m i l a r w a y .
To b e a s u c c e s s f u l p a t h o g e n , a p r e r e q u i s i t e o f ma n y m i c r o o r g a n i s m s i s a n a b i l i t y t o a d h e r e t o , a n d s u r v i v e o n , m u c o s a l e p i t h e l i a i n c o m p e t i t i o n w i t h a n i n d i g e n o u s m i c r o b i a l f l o r a . T h e y m u s t t h e n b e a b l e t o p e n e t r a t e i n t o t h e m u c o s a o r a t l e a s t p r o d u c e t o x i c p r o d u c t s t h a t ma y p e n e t r a t e i n t o s u b e p i t h e l i a l t i s s u e s . M e c h a n i s m s t h a t i n t e r f e r e w i t h a t t a c h m e n t a n d p e n e t r a t i o n a b i l i t y may i n v a l i d a t e p o t e n t i a l p a t h o g e n s .
As s e e n f r o m t h i s d i s c u s s i o n t h e i n t e s t i n a l f l o r a o f t h e n e w b o r n i n f a n t may b e o f g r e a t i m p o r t a n c e , n o t o n l y t h r o u g h i t s p h y s i o l o g i c m e t a b o l i c a c t i v i t y ( a l m o s t e q u a l t o t h a t o f t h e l i v e r ) a n d a s a n o b s t a c l e t o d i s e a s e t h r o u g h i t s c o m p e t e t i v e a c t i v i t y b u t s o m e t i m e s a l s o a s a p r e s u m p t i v e c a u s e o f d i s e a s e .
I t i s t h e r e f o r e o f i n t e r e s t t o s t u d y f a c t o r s w h i c h a r e
c o n t r o l l i n g t h i s f l o r a . We o f t e n t e n d t o r e g a r d t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n o f t h e g u t a s a h a r m l e s s m a s s l i v i n g t o g e t h e r i n a l o n g t u b e o f f o o d ( 2 7 ) . On t h e c o n t r a r y , t h e c o n s t a n t s t r u g g l e f o r l i f e , t y p i c a l f o r s o ma n y m i x e d p o p u l a t i o n s , i s n o w h e r e m o r e e v i d e n t t h a n i n t h e g u t . T h e r e i s t h e a n t a g o n i s m b e t w e e n d i f f e r e n t b a c t e r i a b u t t h e r e i s a l s o t h e h o s t s t r i v i n g t o m a i n t a i n t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n i n t h e b a l a n c e t y p i c a l f o r t h e h o s t , a n d t o p r e v e n t b a c t e r i a l i n v a s i o n o f t i s s u e s .
11
4 FACTORS INFLUENCING THE GUT FLORA
B e f o r e t h e r e s u l t s o f t h e a c t u a l i n v e s t i g a t i o n a r e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l s o me d a t a f r o m t h e r e c e n t k n o w l e d g e on t h i s p r o b l e m w i l l b e m e n t i o n e d . D r a s a r a n d H i l l ( 2 2 ) h a v e e x h a u s t i v e l y d i s c u s s e d t h i s a n d t h i s s e c t i o n w i l l f o l l o w t h e i r o u t l i n e s b u t w i t h s p e c i a l e m p h a s i s on t h e s i t u a t i o n o f t h e n e w b o r n i n f a n t .
4 . 1 E x t e r n a l f a c t o r s t h a t e f f e c t t h e i n t e s t i n a l f l o r a
4 . 1 . 1 S o u r c e s o f t h e b a c t e r i a l f l o r a
T h e f o e t u s i n u t e r o i s p r e s u m a b l y s t e r i l e ( 2 1 ) b u t w i l l a t b i r t h b e c o m e c o n t a m i n a t e d w i t h t h e m i c r o b i a l f l o r a o f t h e r e c t o v a g i n a l r e g i o n o f t h e m o t h e r ( 3 9 , 6 3 ) . O t h e r o r g a n i s m s a r e a d d e d , p r e s u m a b l y f r o m t h e e n v i r o n m e n t , a n d f r o m t h i s m i x t u r e t h e n o r m a l f l o r a i s e s t a b l i s h e d . Th e m o u t h f l o r a t h e n c o n s i s t s o f p r e d o m i n a n t l y G r a m - p o s i t i v e o r g a n i s m s , c o n s i d e r e d a s l a r g e l y n o n - p a t h o g e n i c , a n d t h e c o l o n i c f l o r a o f a n a e r o b e s s u c h a s Bi f i d o b a c t e r i urn a n d B a c t e r o i d e s a n d f a c u l t a t i v e
a n a e r o b i c G r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m s s u c h a s E . c o l i a n d K 1 e b s i e l l a . A n u m b e r o f a n i m a l s s t u d i e d ( c a l v e s , p i g l e t s , k i t t e n s , r a b b i t s , r a t s a n d ma n ) a r e c o l o n i z e d i n t h e i r b o w e l i n a n a l m o s t i d e n t i c a l wa y ( 8 6 ) . I n m o s t s p e c i e s E . c o 1 i i s o n e o f t h e f i r s t
o r g a n i s m s t o a p p e a r i n t h e g u t , a n d t h e f a e c e s o f t h e da ms h a s b e e n s u g g e s t e d t o b e t h e s o u r c e o f t h e s e o r g a n i s m s ( 1 7 ) .
I n a d u l t l i f e c o n t a m i n a t i o n f u n c t i o n s o n l y a s a me a n o f
a c q u i r i n g new s t r a i n s o f b a c t e r i a , b u t i n t h e n e o n a t a l p e r i o d i t s e e m s v e r y i m p o r t a n t i n e s t a b l i s h i n g t h e f l o r a , a l t h o u g h r a t h e r l i t t l e i s known a b o u t t h i s .
4 . 1 . 2 D i e t
D i e t h a s b e e n c o n s i d e r e d t o b e o n e i m p o r t a n t f a c t o r i n t h e c o n t r o l o f t h e f l o r a o f t h e l a r g e i n t e s t i n e , b u t e x p e r i m e n t s i n a d u l t s i n t h i s f i e l d h a v e g i v e n a m b i g u o u s r e s u l t s ( 2 2 ) .
Table1. Compositionoftheintestinalfloraofbreast-andbottle-fedinfants andadults
3
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13
D i f f e r e n c e s a r e d e m o n s t r a b l e b e t w e e n g r o u p s o f a d u l t p e o p l e l i v i n g on d i f f e r e n t d i e t s i n d i f f e r e n t p a r t s o f t h e w o r l d : f o r e x a m p l e t h e " w e s t e r n " t y p e o f d i e t g i v e s m o r e o f B a c t e r o i d e s a n d f e w e r e n t e r o c o c c i t h a n t h e l a r g e l y v e g e t a r i a n d i e t i n U g a n d a a n d S o u t h I n d i a ( 2 2 ) . On t h e o t h e r h a n d a t t e m p t s t o c h a n g e t h e c o m p o s i t i o n o f t h e f l o r a by v a r i a t i o n s i n d i e t h a v e , i n g e n e r a l , b e e n u n s u c c e s s f u l ( 4 , 2 2 , 3 9 , 5 8 , 9 0 ) .
A c c o r d i n g t o D r a s a r a n d H i l l ( 2 2 ) t h e c o l o n b a c t e r i a a r e p r o b a b l y m a i n l y l i v i n g on g u t s e c r e t i o n s a n d t h e p r o d u c t s f r o m s h e d
c e l l s f r o m t h e m u c o s a , r a t h e r t h a n on u n a b s o r b e d r e s i d u e s o f t h e d i e t . T h e n o r m a l l y v e r y e f f i c i e n t a b s o r b t i o n o f t h e m a j o r d i e t a r y c o m p o n e n t s may a l s o a c c o u n t f o r t h e s m a l l e f f e c t o f d i e t a r y c h a n g e s on t h e f l o r a i n a d u l t ma n .
D u r i n g i n f a n c y , h o w e v e r , t h e r e i s no d o u b t t h a t d i e t i n f l u e n c e s t h e g u t f l o r a , a s i s r e a d i l y s h o w n by a c o m p a r i s o n o f b r e a s t f e d a n d b o t t l e f e d i n f a n t s . S i n c e t h e b e g i n n i n g o f t h i s c e n t u r y i t h a s b e e n known t h a t f a e c e s f r o m b r e a s t f e d i n f a n t s i s
d o m i n a t e d b y b i f i d o b a c t e r i a a n d c o n t a i n s o n l y l o w n u m b e r s o f E . c o l i ( T a b l e 1) ( 1 0 , 3 9 ) . I n f a e c e s f r o m b o t t l e f e d i n f a n t s h i g h e r n u m b e r s o f E . c o 1 i a n d r e l a t i v e l y f e w b i f i d o b a c t e r i a a r e f o u n d . A n o t h e r i m p o r t a n t d i f f e r e n c e i s t h e r e d u c t i o n o r e v e n a b s e n c e o f p u t r e f a c t i v e b a c t e r i a i n i n f a n t s k e p t on b r e a s t m i l k ( 3 9 ) . D i f f e r e n t f a c t o r s i n m i l k t h u s s e e m t o i n f l u e n c e t h e c o m p o s i t i o n o f t h e b a c t e r i a l f l o r a . Some o f t h e s e w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r o n .
4 . 1 . 3 D r u g s
I n t e r e s t i n t h e e f f e c t s o f a n t i b i o t i c s on t h e g u t f l o r a h a s c e n t r e d a r o u n d t h e p o s s i b i l i t y t o s t i m u l a t e t h e g r o w t h o f f a r m a n i m a l s , a n d t h e p r o f y l a c t i c u s e i n b o w e l s u r g e r y . T h e i n c r e a s i n g - a n d s o m e t i m e s a l s o i n d i s c r i m i n a t e - u s e o f b r o a d
s p e c t r u m a n t i b i o t i c s i s b e l i e v e d t o b e o n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t f a c t o r s c a u s i n g t h e i n c r e a s e i n R - f a c t o r m e d i a t e d m u l t i p l e d r u g r e s i s t a n c e i n e n t e r o b a c t e r i a .
I n n e w b o r n i n f a n t s a d m i n i s t r a t i o n o f a n t i b i o t i c s may i n t e r f e r e
w i t h t h e c o l o n i z a t i o n p r o c e s s . T h e r i s k o f s e l e c t i n g r e s i s t a n t s t r a i n s , e s p e c i a l l y i n i n f a n t s b o r n i n h o s p i t a l , i s o b v i o u s : o t h e r p o s s i b l e u n t o w a r d e f f e c t s h a v e n o t b e e n e x a m i n e d .
4 . 2 H o s t f a c t o r s
4 . 2 . 1 I n t e s t i n a l s e c r e t i o n s
4 . 2 . 1 . 1 S a l i v a
M i c r o - o r g a n i s m s i n t r o d u c e d i n t o t h e m o u t h a r e c o n s t a n t l y t r a n s p o r t e d i n s a l i v a t o w a r d s t h e p h a r y n x a n d s w a l l o w e d . T h i s m e c h a n i s m i s p r o b a b l y o n e m a i n f a c t o r w h i c h l i m i t s t h e m i c r o b i a l p o p u l a t i o n o f t h e m o u t h . B u t s a l i v a a l s o c o n t a i n s a n t i b a c t e r i a l f a c t o r s , t h e r o l e o f w h i c h i s d i f f i c u l t t o e s t i m a t e . M o s t o f t h e w o r k i n t h i s f i e l d h a s b e e n c a r r i e d o u t on s i n g l e f a c t o r s i n v i t r o . E v e n t u a l e f f e c t s on t h e b a c t e r i a l f l o r a f u r t h e r down i n t h e g u t a r e u n k n o w n .
4 . 2 . 1 . 2 G a s t r i c a c i d
T h e " f i r s t l i n e o f d e f e n c e " , o t h e r t h a n p e r s o n a l h y g i e n e , p r e s u m a b l y c o n s i s t s o f t h e s t r o n g l y a c i d i c e n v i r o n m e n t i n t h e s t o m a c h . A l l p a t h o g e n i c e n t e r i c b a c t e r i a a p p e a r t o b e q u i t e s u s c e p t i b l e t o l o w pH a n d ma n y s w a l l o w e d o r g a n i s m s a r e n o t v i a b l e wh e n t h e y r e a c h t h e s m a l l b o w e l ( 2 2 , 8 4 ) . S a l m o n e l l o s i s i s m o r e common i n p a t i e n t s w i t h a c h l o r h y d r i a o r g a s t r i c r e s e c t i o n ( 3 1 ) a n d e v e n i n e p i d e m i c s o f c h o l e r a , p a t i e n t s w i t h l o w c o n c e n t r a t i o n s o f g a s t r i c h y d r o c h l o r i c a c i d a r e m o r e e a s i l y i n f e c t e d ( 6 7 ) .
Th e l o w g a s t r i c a c i d i t y i n t h e n e w b o r n ( 2 , 5 2 ) a n d t h e h i g h b u f f e r i n g c a p a c i t y o f m i l k ( 1 4 ) c r e a t e a s i t u a t i o n f o r t h e b r e a s t f e d i n f a n t , a n d s t i l l m o r e t h e b o t t l e f e d o n e , w h i c h i s s i m i l a r t o t h a t f o r a n a c h l o r h y d r i c a d u l t .
4 . 2 . 1 . 3 E n z y m e s , p r o t e i n s a n d b i l e s a l t s
T h e r e i s no e v i d e n c e t h a t p a n c r e a t i c j u i c e , l y s o z y m e o r o t h e r
15
i n v i t r o a n t i b a c t e r i a l s u b s t a n c e s c a n d e s t r o y i n t e s t i n a l b a c t e r i a ( 2 1 , 2 2 , 8 4 ) . I n t e s t i n a l j u i c e s a s w e l l a s h u ma n m i l k h a v e b e e n f o u n d t o c o n t a i n a p r o t e i n known a s l a c t o f e r r i n , w h i c h h a s a n e x t r e m e a f f i n i t y f o r i r o n ; i t e x e r t s a b a c t e r i o s t a t i c e f f e c t by d e p r i v i n g t h e e n v i r o n m e n t o f i o n i z e d i r o n , a n d u n d e r e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s i t h a s b e e n f o u n d t o b e e f f e c t i v e i n r e s t r i c t i n g t h e g r o w t h o f s o me b a c t e r i a ( 1 5 ) . I t s e f f e c t a g a i n s t i n t e s t i n a l p a t h o g e n s i s u n k n o w n .
E v e n i f w h o l e b i l e c a n s t i m u l a t e t h e g r o w t h o f B a c t e r o i d e s f r a g i 1 i s a n d i n h i b i t s o me g r a m - p o s i t i v e b a c t e r i a i n v i t r o , i t s r o l e i n t h e e s t a b l i s h m e n t o f t h e b o w e l f l o r a r e m a i n s t o b e e l u c i d a t e d .
4 . 2 . 2 Th e i n t e s t i n a l m u c o s a
T h e i n t e s t i n a l f l o r a i s p r e v e n t e d f r o m g e t t i n g a c c e s s t o b o d y t i s s u e s b y t h e m u c o s a l b a r r i e r . A s u c c e s s f u l p a t h o g e n m u s t c o p e w i t h a n i n d i g e n o u s m i c r o b i a l p o p u l a t i o n on t h e m u c o s a . L i t t l e
i s known a b o u t t h i s f l o r a i n m a n , a l t h o u g h t h e r e a r e s o me e v i d e n c e f o r c o l o n i z a t i o n o f t h e h u ma n i n t e s t i n a l w a l l ( 2 2 , 3 6 ) . M i c r o s c o p y h a s r e v e a l e d l a r g e a m o u n t s o f s p i r o c h e t e s , s o f a r n o t p o s s i b l e t o c u l t i v a t e , i n t h e c r y p t s o f L i e b e r k ü h n ( G u s t a f s s o n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .
4 . 2 . 3 I m m u n o l o g i c a l m e c h a n i s m s
4 . 2 . 3 . 1 T h e o r i g i n o f a n t i b o d i e s i n t h e g u t
I n t e s t i n a l a n t i b o d i e s may r e a c h t h e l u m e n b y t r a n s u d a t i o n f r o m t h e s e r u m , b y l o c a l s y n t h e s i s o r b y f o o d , i . e . c o l o s t r u m a n d hu ma n m i l k . A l t h o u g h t h e r e i s e v i d e n c e t h a t t r a n s u d a t i o n i n t o t h e g u t i s a n i m p o r t a n t r o u t e i n t h e c a t a b o l i s m o f s e r u m
g l o b u l i n s ( 7 1 ) , t h e a c t u a l i n t e r e s t i s f o c u s e d on t h e i m p o r t a n c e o f l o c a l l y p r o d u c e d a n t i b o d i e s .
Th e i n t e s t i n a l t i s s u e s a r e h e a v i l y l o a d e d w i t h l y m p h o i d c e l l s a n d c o u l d b e c o n s i d e r e d a s t h e d o m i n a t i n g i m m u n o l o g i c a l o r g a n o f t h e b o d y ( 8 4 ) . W h i l e t h e m e s e n t e r i c l y m p h n o d e s y s t e m a n d
t h e P e y e r ' s p a t c h e s h a v e b e e n s h o w n t o r e s t r i c t t h e s p r e a d o f S a l m o n e ! l a e - i n f e c t i o n s a n d t o c o n t r i b u t e t o t h e p o o l o f s e r u m i m m u n o g l o b u l i n s ( 1 6 , 1 8 , 7 6 ) , t h e p l a s m a c e l l s o f t h e l a m i n a p r o p r i a a r e i n v o l v e d i n t h e p r o d u c t i o n o f l o c a l a n t i b o d i e s . I g A i s t h e g r e a t e s t c o m p o n e n t o f t h e i m m u n o g l o b u l i n s i n t h e i n t e s t i n a l s e c r e t i o n s .
I gA c e l l p r e c u r s o r s f r o m P e y e r ' s p a t c h e s r a n d o m l y l o d g e i n t i s s u e s t h r o u g h o u t t h e b o d y , b u t p r o l i f e r a t e o n l y i n g l a n d u l a r s t r u c t u r e s . Some l o c a l m a c r o m o l e c u l e s , s u c h a s t h e s e c r e t o r y c o m p o n e n t ( S C ) , m i g h t c a u s e t h e m t o l o s e t h e i r m i g r a t o r y
p r o p e r t y a n d s t i m u l a t e t h e s e c e l l s . T h i s w i l l r e s u l t i n a h i g h p r o p o r t i o n o f s l g A - p r o d u c i n g c e l l s i n g l a n d u l a r s t r u c t u r e s ( 1 9 ) .
I t a l s o s e e m s e s s e n t i a l t o c o n s i d e r t h e r o l e o f c o l o s t r u m , m i l k a n d p o s s i b l y s a l i v a i n t h i s c o n t e x t . I n s o me a n i m a l s , e . g . c o ws a n d p i g s , t h e r e i s n o t r a n s p l a c e n t a l p a s s a g e o f a n t i b o d y a n d t h e a n i m a l a b s o r b s a n t i b o d y f r o m c o l o s t r u m i n t h e f i r s t f e w h o u r s o f l i f e . I n t h e a b s e n c e o f c o l o s t r u m t h e a n i m a l s a r e s u s c e p t i b l e t o s e p t i c a e m i c i l l n e s s d u e t o E . c o l i . I n o t h e r s p e c i e s , l i k e man a n d m o n k e y , t h e r e i s a p r e n a t a l t r a n s f e r o f h u m o r a l i m m u n i t y f r o m m o t h e r t o o f f s p r i n g t h r o u g h t h e p l a c e n t a a n d n o s i g n i f i c a n t u p t a k e o f m i l k a n t i b o d i e s f r o m t h e g u t h a s b e e n d e t e c t e d ( 7 9 ) . T h e h u ma n m i l k i s r i c h i n s l g A w i t h
p r o p e r t i e s a l l o w i n g p a s s a g e t h r o u g h t h e g a s t r o - i n t e s t i n a l t r a c t w i t h r e t a i n e d a c t i v i t y ( 4 5 ) . T h u s i n a d d i t i o n t o t r a n s p l a c e n t a l t r a n s f e r o f h u m o r a l a n t i b o d i e s t h e h u ma n i n f a n t i s p r o v i d e d w i t h a l o c a l l y a c t i n g d e f e n c e s y s t e m b y m i l k .
4 . 2 . 3 . 2 P o s s i b l e e f f e c t s o f s l g A i n t h e c o n t r o l o f t h e f l o r a a n d i n f e c t i o n
A w i d e v a r i e t y o f a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t b o t h b a c t e r i a a n d v i r u s e s h a s b e e n d e s c r i b e d i n b i o l o g i c a l s e c r e t i o n s , i n c l u d i n g c o l o s t r u m a n d i n t e s t i n a l j u i c e . I t i s a l s o e s t a b l i s h e d t h a t b r e a s t f e d h u ma n i n f a n t s h a v e a l o w e r i n c i d e n c e o f e n t e r i c i n f e c t i o n s w i t h E . c o l i ( 4 9 . 5 4 * 5 5 . 7 7 , 7 8 ) a n d S a l m o n e l l a / S h i g e l l a ( 5 4 ) a n d p o s s i b l y l e s s s e p t i c a e m i c i l l n e s s e s ( 8 9 ) t h a n b o t t l e f e d i n f a n t s .
17
H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m o f t h i s p r o t e c t i o n i s s t i l l a m a t t e r o f s p e c u l a t i o n , b u t i t i s p o s s i b l e t h a t a n t i b o d i e s , p a r t i c u l a r l y s l g A , c o n t r i b u t e .
A b a c t e r i c i d a l e f f e c t o f a n t i b o d y u s u a l l y r e q u i r e s t h e c o m b i n e d e f f e c t w i t h t h e c o m p l e m e n t s y s t e m , b u t I gA d o e s n o t a c t i v a t e t h e c o m p l e m e n t i n t h e c l a s s i c a l m a n n e r . Th e p o t e n t i a t i n g e f f e c t o f l y s o z y m e i n t h e b a c t e r i c i d a l e f f e c t o f I gA a n d c o m p l e m e n t ( 1 ) i s n o t c o n c l u s i v e l y e s t a b l i s h e d ( 8 4 ) .
R e c e n t e v i d e n c e s u g g e s t t h a t I gA a c t i v a t e s t h e c o m p l e m e n t s y s t e m on t h e a l t e r n a t e p a t h w a y ( 3 8 ) b u t i t a p p e a r s t h a t t h e r e a c t i o n i s n o t c o m p l e t e d a n d l y t i c e f f e c t s on t h e b a c t e r i a l c e l l m e m b r a n e s a r e n o t l i k e l y t o o c c u r ( 8 4 ) .
I gA ma y a l s o a c t a s a n o p s o n i n , r e n d e r i n g b a c t e r i a m o r e a v a i l a b l e f o r p h a g o c y t o s i s ( 8 3 ) . I n t h e g u t t h i s s y s t e m p r e s u p p o s e s p h a g o c y t e s i n t h e i n t e s t i n a l w a l l a n d l u m e n , b u t t h e r e i s t o d a y n o c o n v i n c i n g e v i d e n c e t h a t s u c h c e l l s a r e a c t i v e i n t h e s e s i t e s ( 8 4 ) .
s l g A ma y b e m o r e e f f i c i e n t i n a g g l u t i n a t i n g b a c t e r i a t h a n s e r u m I gA b e c a u s e o f i t s d i m e r i c s t r u c t u r e . When b a c t e r i a a r e r e m o v e d f r o m t h e b o w e l by p e r i s t a l s i s , a g g r e g a t i o n may h a s t e n t h i s p r o c e s s ( 7 1 ) . C o a t i n g o f b a c t e r i a w i t h I gA may a l s o p r e v e n t t h e i r a d h e r e n c e t o t h e m u c o s a a n d p r e v e n t t h e g r o w t h o f t h o s e b a c t e r i a w h i c h do a d h e r e ( 2 6 ) .
O t h e r p o s s i b i l i t i e s e x i s t , f o r e x a m p l e s e l e c t i o n o f l e s s p a t h o g e n m u t a n t s . T h i s w i l l b e e x a m i n e d i n p a p e r I V.
4 . 2 . 4 I n t e s t i n a l m o t i l i t y
T h e i n t e s t i n a l m o t i l i t y h a s a c l e a n s i n g r o l e a n d p r o b a b l y p a r t l y a c c o u n t s f o r t h e r e l a t i v e l a c k o f b a c t e r i a i n t h e u p p e r r e g i o n o f t h e g u t . I n a v a r i e t y o f d i s e a s e s , s u c h a s s c l e r o d e r m a , d i a b e t i c n e u r o p a t h y , g a s t r e c t o m y p l u s B i l l r o t h I I a n a s t o m o s i s a n d s t r i c t u r e s d u e t o C r o h n ' s d i s e a s e ( 3 6 , 6 1 ) , t h e p e r i s t a l s i s i s r e d u c e d a n d a c o l o n i c f l o r a p r o l i f e r a t e s i n t h e u p p e r r e g i o n s
o f t h e i n t e s t i n e , a l t h o u g h n o t d e r i v e d b y r e t r o g r a d e s p r e a d f r o m t h e l a r g e i n t e s t i n e ( 2 2 ) .
I f a n o r g a n i s m i s t o e s t a b l i s h i t s e l f a s a p e r m a n e n t i n h a b i t a n t o f a p a r t i c u l a r i n t e s t i n a l r e g i o n i t m u s t m u l t i p l y f a s t e r t h a n i t i s r e m o v e d b y t h e r y t h m i c m o v e m e n t o f f o o d f r o m o n e e n d o f t h e g u t t o t h e o t h e r . A n o t h e r wa y f o r b a c t e r i a t o h o l d t h e i r own p o s i t i o n a g a i n s t t h e p e r i s t a l t i c f l o w i s t o a t t a c h t o t h e i n t e s t i n a l w a l l . I n e n t e r i c i n f e c t i o n s d u e t o i n v a s i v e p a t h o g e n s ( c f 3) d i a r r h o e a t h u s ma y b e a p r o t e c t i v e m e c h a n i s m l i m i t i n g t h e t i m e o f c o n t a c t b e t w e e n t h e i n v a d i n g b a c t e r i a a n d t h e e p i t h e l i a l c e l l . I n t e r f e r e n c e w i t h d i a r r h o e a w i t h o p i u m a l k a l o i d s may c a u s e a m o r e s e v e r e d i s e a s e b y a l l o w i n g i n c r e a s e d i n t e s t i n a l i n v a s i o n ( 6 1 ) .
I n b o t t l e f e d i n f a n t s t h e p a s s a g e t i m e t h r o u g h t h e s m a l l i n t e s t i n e o f t h e r e l a t i v e l y b u l k y m a t e r i a l ma y b e p r o l o n g e d c o m p a r e d w i t h t h e p a s s a g e o f t h e f l u i d h u ma n m i l k w i t h a l o w t e n d e n c y t o c u r d . Th e i m p o r t a n c e o f t h i s d i f f e r e n c e w i t h r e g a r d t o t h e d i f f e r e n c e s i n f r e q u e n c y o f d i a r r h o e a l d i s e a s e may b e w o r t h c o n s i d e r i n g .
4 . 3 B a c t e r i a l i n t e r a c t i o n s
I n f a e c e s t h e n u m b e r s o f p r e d o m i n a n t a n a e r o b e s s h o w l i t t l e v a r i a t i o n i n r e p e a t e d s a m p l e s . S t u d i e s o f t h e v a r i a t i o n i n p r e d o m i n a n t E . c o l i s e r o t y p e d e m o n s t r a t e t h e p r e s e n c e o f
" r e s i d e n t " a n d " t r a n s i e n t " s t r a i n s i n s u c c e s i v e s a m p l e s ( 7 0 ) .
M o s t a t t e m p t s t o i m p l a n t b a c t e r i a i n t h e i n t e s t i n e h a v e f a i l e d ( 1 3 , 5 6 , 6 0 , 7 0 ) , p r e s u m a b l y d u e t o t h e e x p e r i m e n t a l s i t u a t i o n . Th e b a c t e r i a i n t h e i n t e s t i n e a r e a d a p t e d t o g r o w t h e r e , w h e r e a s f r e s h l y i n t r o d u c e d s t r a i n s - o f t e n o f l a b o r a t o r y o r i g i n -
r e q u i r e t i m e t o a d a p t t o t h e c o n d i t i o n s p r e v a i l i n g i n t h e g u t ( 2 2 , 3 6 ) .
Th e b a c t e r i a l f l o r a o f t h e g u t o p p o s e s a n i n v a d e r i n d i f f e r e n t w a y s s u c h a s c o m p e t i t i o n f o r s p a c e a n d n u t r i e n t s a n d p r o d u c t i o n o f a n t i b a c t e r i a l s u b s t a n c e s . Many i n t e s t i n a l b a c t e r i a p r o d u c e v o l a t i l e a c i d s s u c h a s a c e t i c a n d b u t y r i c a c i d i n c o n c e n t r a t i o n s s u f f i c i e n t t o i n h i b i t g r o w t h o f v i r u l e n t e n t e r i c p a t h o g e n s (9*
5 0 ) . 1 9
Taib l e 2 . F a c t o r s i n h u ma n m i l k o f p o s s i b l e i m p o r t a n c e f o r m i c r o b i a l d e f e n c e
A n t i s t a p h y l o c o c c a l f a c t o r
2 ~ b i n d i n g p r o t e i n C 3 a n d C 4
G r o w t h f a c t o r o f b i f i d o b a c t e r i a L a c t o f e r r i n
L a c t o p e r o x i d a s L e u k o c y t e s L y s o z y m e
S e c r e t o r y I gA a n d o t h e r i m m u n o g l o b u l i n e s S p e c i a l p h y s i c o - c h e m i c a l p r o p e r t i e s
5 AIM OF THE PRESENT I NVESTI GATI ON
As o u t l i n e d a b o v e , a l a r g e n u m b e r o f f a c t o r s ma y i n f l u e n c e t h e c o m p o s i t i o n o f t h e i n t e s t i n a l f l o r a o f t h e n e w b o r n . When o n e a t t e m p t s t o e x a m i n e t h i s c o m p l e x s y s t e m b o t h m i c r o b i a l a n d h o s t f a c t o r s m u s t b e c o n s i d e r e d .
S i n c e i n c e r t a i n i n s t a n c e s c o l o n i z a t i o n o f t h e g u t may b e a f o r e r u n n e r o f i n f e c t i o n , o n e a i m o f t h i s w o r k h a s b e e n t o s t u d y t h e i n t e s t i n a l c o l o n i z a t i o n o f h e a l t h y n e w b o r n s w i t h a e r o b i c a l l y g r o w i n g b a c t e r i a , t h e i r b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s a n d how t h e y r e l a t e t o m a t e r n a l f a e c a l f l o r a .
One t y p e o f d i e t w i t h c a p a c i t y t o i n f l u e n c e t h e f l o r a i n t h e a c t u a l a g e , i s h u ma n m i l k , c o n t a i n i n g s e v e r a l f a c t o r s w h i c h may h a v e a n t i m i c r o b i a l e f f e c t s ( T a b l e 2 ) .
A n o t h e r a i m wa s t h u s t o s t u d y t h e p r e s e n c e o f t wo m i l k c o m p o n e n t s h i t h e r t o l i t t l e s t u d i e d , b u t o f t e n m e n t i o n e d i n t h i s c o n n e c t i o n : t h e c o m p l e m e n t f a c t o r C 3 a n d t h e l a c t o - p e r o x i d a s e s y s t e m , i n c l u d i n g t h i o c y a n a t e a n d H2Û2 *
A l t h o u g h muc h w o r k h a s b e e n ma d e on t h e i m m u n o l o g i c a l p a r t o f t h i s p r o b l e m , d a t a on t h e i mmu n e m e c h a n i s m s p r o t e c t i n g t h e n e w b o r n f r o m E . c o 1 i i n f e c t i o n s a r e f e w ( 8 4 ) .
T h e f i n a l a i m o f my s t u d y wa s t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r t h e E . c o l i c o l o n i z a t i o n o f t h e n e w b o r n i s i n f l u e n c e d by E . c o l i - a n t i b o d i e s o f d i f f e r e n t I g - c l a s s e s , t r a n s f e r r e d by p l a c e n t a a n d b y b r e a s t m i l k .
21
6 WHICH I S THE SOURCE FOR THE BACTERIA IN THE GUT OF THE NEWBORN INFANT?
D u r i n g b r e a s t f e e d i n g a s t a b l e m i c r o f l o r a i s d e v e l o p e d i n t h e c o l o n a n d t h e f a e c e s w i t h i n 4 d a y s : u s u a l l y m o r e t h a n 99% o f t h e c u l t i v a b l e f l o r a c o n s i s t s o f t h e a n a e r o b i c B i f i d o b a c t e r i u m b i f i d u s ( e a r l i e r n a me d L a c t o b a c i l l u s b i f i d u s ) , o f t e n d o m i n a t e d b y a s p e c i a l t y p e , D IV ( 3 9 ) . U s u a l l y l e s s t h a n 1% o f t h e f a e c a l f l o r a c o n s i s t s o f c o l i f o r m s , e n t e r o c o c c i a n d a e r o b i c l a c t o b a c i l l i . An a l r e a d y m e n t i o n e d a n d i m p o r t a n t f a c t i s t h e l o w n u m b e r s o r e v e n t h e a b s e n c e o f p u t r e f a c t i v e b a c t e r i a i n c l u d i n g B a c t e r o i d e s , Cl o s t r i d i urn, P r o t e u s a n d o t h e r s .
P u t r e f a c t i o n o c c u r s w i t h i n t r o d u c t i o n o f c o w ' s m i l k i n t h e d i e t . A n y h o w , t h e b i f i d u s g r o u p s t i l l r e m a i n s a c o n s i d e r a b l e p a r t o f t h e c u l t i v a b l e f l o r a , b u t t h e " b a c t e r o i d e s g r o u p " i s e q u a l i n n u m b e r t o , o r o u t n u m b e r , t h e b i f i d u s g r o u p . Th e f a c u l t a t i v e a n a e r o b e s l i k e c o l i f o r m s , s t r e p t o c o c c i a n d l a c t o b a c i l l i c o m p r i s e s a m i n o r i t y o f 5% o r l e s s ( 3 9 ) .
When l o o k i n g f o r t h e s o u r c e o f a l l t h e s e b a c t e r i a t h e i n t e r e s t h a s b e e n f o c u s e d on E . c o l i a s a common p a t h o g e n a n d t h e a n a e r o b i c a n d a e r o b i c l a c t o b a c i l l i a s b e i n g a d o m i n a n t p a r t o f t h e f l o r a .
6 . 1 E . c o l i
L i t t l e i s known a b o u t t h e s o u r c e s f r o m w h i c h t h e n o r m a l n e w b o r n a c q u i r e s h i s f a e c a l E . c o l i ( 1 7 ) . G a r e a u f o u n d t h a t 25% o f
i n v e s t i g a t e d n e o n a t e s h a d m a t e r n a l f a e c a l E . c o l i s e r o t y p e s ( 2 9 ) w h i l e B e t t e l h e i m r e c e n t l y r e p o r t e d t h a t a m a j o r i t y o f b a b i e s w e r e a p p a r e n t l y c o l o n i z e d by t h i s r o u t e ( 8 ) . T h e r e l e v a n c e o f t h e s e f i n d i n g s a r e h o w e v e r d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t , s i n c e i n n e i t h e r o f t h e s t u d i e s wa s t h e d o m i n a n t E . c o l i s e r o t y p e i n m o t h e r a n d i n f a n t s o u g h t .
I f t h e c o l o n i z a t i o n o f t h e i n f a n t i s d e t e r m i n e d o n l y b y t h e e x p o s i t i o n f o r m a t e r n a l s t r a i n s i t i s r e a s o n a b l e t o a s s u m e t h a t t h e d o m i n a t i n g E . c o l i s e r o t y p e a l s o w i l l d o m i n a t e i n t h e i n f a n t .
T a b l e 3 .
B a c t e r i a f o u n d i n m o t h e r s a n d i n f a n t s a t t h e t i m e o f d e l i v e r y
D e l i v e r y ________________ M o t h e r ________________ I n f a n t
n o + , m o u t h
r e c t u m v a g i n a
E . c o l i L. c a s e i
L. a c i d o p h i l u s H e t e r o f e r m . 1 a c t o b , E . c o l i
C o r y n e b a c t e r i a S t a p h , a u r e u s
E . c o l i ( NT, 0 1) K l e b s i e l l a E n t e r o c o c c i L. j e n s e n i i L. c a s e i
S t a p h , a l b u s E . c o l i
a - s t r e p t o c o c c i E n t e r o c o c c i L. a c i d o p h i l u s E . c o l i
S t a p h , a l b u s L. j e n s e n i i
E . c o l i ( 0 2 8 ) S t a p h , a u r e u s L. j e n s e n i i E . c o l i K l e b s i e l l a S t a p h , a l b u s L. j e n s e n i i
S t a p h , a l b u s S t a p h , a u r e u s L. a c i d o p h i l u s H e t e r o f e r m . 1 a c t o b .
L. a c i d o p h i l u s S t a p h , a l b u s
C o r y n e b a c t e r i a S t a p h , a l b u s
L. j e n s e n i i S t a p h , a l b u s
L. a c i d o p h i l u s
L. j e n s e n i i L. a c i d o p h i l u s
C o r y n e b a c t e r i a L. j e n s e n i i
S t a p h , a u r e u s L . j e n s e n i i
L. a c i d o p h i l u s S t a p h , a l b u s
Mi c r o c o c c i L. j e n s e n i i
E . c o l i ' ( NT, 0 5 1 )
S t a p h , a l b u s S t a p h , a l b u s a - s t r e p t o c o c c i L. a c i d o p h i l u s
S t a p h , a l b u s L . j e n s e n i i L. a c i d o p h i l u s C a n d i da a l b i c a n s E . c o l i ( 0 2 8 )
L. j e n s e n i i
S t a p h , a u r e u s L. j e n s e n i i
H e t e r o f e r m . 1 a c t o b ,
L. a c i d o p h i l u s L. a c i d o p h i l u s
23
D e l i v e r y no
M o t h e r
r e c t u m v a g i n a
I n f a n t mo u t h
10
11
12
13
E . c o l i ( 0 7 5 ) a - s t r e p t o c o c c i L. c a s e i
E . c o l i ( 0 8) S t a p h , a l b u s L. c a s e i L. p l a n t a r u m
E . c o l i ( 0 1) L. a c i d o p h i l u s L. j e n s e n i i L. c a s e i
E . c o l i ( 0 1 1 7 ) a - s t r e p t o c o c c i E n t e r o c o c c i L. s a l i v a r i us H e t e r o f e r m . 1 a c t o b .
S t a p h , a l b u s S t a p h , a u r e u s a - s t r e p t o c o c c i C o r y n e b a c t e r i a
L. j e n s e n i i
S t a p h , a l b u s
a - s t r e p t o c o c c i
a - s t r e p t o c o c c i
S t a p h , a l b u s
C o r y n e b a c t e r i a
E . c o l i ( 0 7 5 )
S t a p h , a l b u s E . c o l i ( 0 8) S t a p h , a l b u s
S t a p h , a u r e u s E . c o l i ( 0 1)
S t a p h , a l b u s E . c o l i ( 0 1 1 7 ) a - s t r e p t o c o c c i
S t a p h , a l b u s S t a p h , a l b u s S t a p h , a u r e u s
B u t , i f o t h e r f a c t o r s i n f l u e n c e on t h e p r o c e s s o f s e l e c t i o n , t h i s c o r r e l a t i o n w i l l b e l e s s c l o s e .
An a t t e m p t t o a n a l y z e f a c t o r s g o v e r n i n g t h e i n t e s t i n a l c o l o n i z a t i o n o f t h e n e w b o r n m u s t t h e r e f o r e t a k e i n t o a c c o u n t a l s o
" q u a n t i t a t i v e ' 1 a s p e c t s o f t h e p r o c e s s .
When s u c h a s t u d y wa s p e r f o r m e d ( V I ) i t wa s f o u n d t h a t i n o n l y f i v e o u t o f 2 9 c a s e s i n v e s t i g a t e d E . c o l i o f i d e n t i c a l 0 g r o u p s w e r e f o u n d i n m o t h e r s b e f o r e d e l i v e r y a n d i n t h e i r i n f a n t s s o o n a f t e r b i r t h , p r e s u m a b l y e x a m p l e s o f t r a n s m i s s i o n o f b a c t e r i a f r o m m o t h e r t o i n f a n t . I n 12 c a s e s m o t h e r a n d i n f a n t n e v e r h a d a n y d o m i n a t i n g f a e c a l g r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m s i n common d u r i n g t h e s e v e r a l w e e k s t h e y w e r e f o l l o w e d . T h u s , o t h e r f a c t o r s t h a n t h e d o m i n a t i n g E . c o l i f l o r a o f t h e m o t h e r u s u a l l y d e c i d e w h i c h s t r a i n w i l l b e t h e d o m i n a t i n g o n e i n t h e i n f a n t ' s f a e c e s .
T h e r o l e o f t h e f o o d i n t h e s e l e c t i o n o f E . c o l i s t r a i n s , w h i c h wa s n o t s t u d i e d i n t h e a b o v e m e n t i o n e d p a p e r s , w i l l b e d e a l t w i t h i n s e c t i o n 9 . 2 .
T h e t r a n s f e r o f E . c o l i f r o m m o t h e r s t o i n f a n t wa s i n v e s t i g a t e d b y s t u d i e s o f t h e p r e s e n c e o f E . c o l i - a n d s o me o t h e r s p e c i e s - i n t h e r e c t u m a n d v a g i n a o f t h e m o t h e r a n d t h e mo u t h o f t h e i n f a n t i m m e d i a t e l y a f t e r d e l i v e r y ( T a b l e 3) ( U n p u b l i s h e d ) .
F o r t h i s s t u d y I u s e d t h e m a t e r i a l d e s c r i b e d i n p a p e r I I . Th e s p e c i m e n s w e r e c u l t u r e d on b l o o d a g a r a n d l a c t o s e b r o m t h y m o l - b l u e a g a r p l a t e s . A c c o r d i n g t o d i f f e r e n c e s i n m o r p h o l o g y
c o l o n i e s w e r e p i c k e d a n d s u b c u l t u r e d a n d t h e s t r a i n s s o i s o l a t e d w e r e i d e n t i f i e d a s d e s c r i b e d i n p a p e r s I I a n d V.
E. c o l i w e r e f o u n d i n t h e r e c t u m i n 11 o f 13 m o t h e r s b u t n e v e r i n t h e v a g i n a ( T a b l e 3 ) . E . c o l i o f t h e s a me 0 g r o u p a s i n t h e m a t e r n a l r e c t u m w e r e f o u n d i n t h e m o u t h o f t h e i n f a n t s i n f i v e c a s e s . S i m i l a r f i n d i n g s w e r e r e p o r t e d b y B e t t e l h e i m ( 8 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e i n f a n t s ' E . c o l i o r g a n i s m s a r e n o t n e c e s s a r i l y o b t a i n e d d u r i n g d e l i v e r y .
25
T a b l e 4 . Nu mb e r o f s t a p h y l o c o c c i p e r cm o s k i n a r e a , o f t h e n i p p l e
Ti me S t a p h , a u r e u s
m e d i a n a n d r a n g e
S t a p h , a l b u s m e d i a n a n d r a n g e
A n t e n a t a l c l i n i c 3 1 6 7 5 3
4 2 - 1 0 9 5 3 1 - 5 5 8 4
( 3 / 2 2 ) ( 2 2 / 2 2 )
N u r s e r y w a r d :
B e f o r e n u r s i n g 2 6 2 1 9 8
10 - - 1 0 . 0 0 0 12 - - 1 0 . 0 0 0
( 7 / 1 6 ) ( 1 1 / 1 6 )
A f t e r n u r s i n g 1 05 1 2 8
1 0 - 1 6 8 5 1 0 - 1 7 9 1
( 7 / 2 0 ) ( 1 8 / 2 0 )
Nu mb e r o f p o s i t i v e s p e c i m e n s a n d o f i n d i v i d u a l s i n v e s t i g a t e d a r e g i v e n i n b r a c k e t s
