Mother's weight gain during pregnancy and its effect on the gene expression of lipoprotein lipase in the placenta

Institutionen för kvinnors och barns hälsa Biomedicinska analytikerprogrammet Examensarbete 15 hp

Mother’s weight gain during

pregnancy and its effect on the gene expression of lipoprotein lipase in the placenta

Nishat Nailah Chowdhury

Examinator: Dick Wågsäter

Institutionen för medicinsk cellbiologi.

Abstract

It has been found in previous studies that there is a correlation between the placenta

regulatory genes and the weight gain of the mother, Body Mass Index (BMI) as well as the

birthweight of the fetus. When the mother gains weight / is overweight, this will affect the

gene expression in the placenta, and in turn this triggers the weight gain of the fetus. The aim

of the study was to investigate the correlation between the lipoprotein lipase gene and the

mother's BMI, weight gain and the child's birth weight by extracting RNA from the placentas

and analysing its quality and concentration. cDNA was generated from RNA using reverse

transcription and gene expression was amplified using real-time PCR. The data from real-time

PCR was used in the comparative Ct-method to calculate a 2˄(-ΔΔCt)-value which represents

the RNA-level of the LPL-gene. Lastly this value was analysed by using the two-statistic

methods, Pearson's rank correlation and Spearman's correlation, which showed that the value

of the correlation coefficient for all the variables was close to the value of zero. The closer the

value is to zero, the weaker the association becomes between the different variables. The

correlation was 0.045, 0.112 and 0.044 for the child's birth weight, mother's BMI respective

weight gain. The results from this study shows that there is no correlation between LPL and

the mother's weight gain, BMI, or the child's birth weight.

Populärvetenskaplig sammanfattning

Bakgrund: I tidigare studier har det visat sig att det finns en koppling mellan gener i

moderkakan och mammans viktuppgång, Body Mass Index (BMI) samt fostrets födelsevikt.

När mamman går upp i vikt / är övervikt, kommer detta att påverka uttrycket av gener i moderkakan och det i sin tur bidrar till viktökning hos fostret. I detta projekt låg fokuset på moderkaka genen Lipoprotein Lipase (LPL).

Syfte: Syftet med detta projekt är att undersöka kopplingen mellan LPL och mammans viktuppgång, BMI samt fostrets födelsevikt.

Metod och material: Från moderkakan renades RNA:t fram för att sedan användas som utgångsmaterial i bland annat reverse transcriptase PCR och real time PCR.

Resultat: Real time PCR användes för att beräkna fram RNA-nivåerna av LPL-genen för att sedan tillämpas i de två statistiska analysmetoderna Pearsons rangkorrelation och Spearmans korrelationstest. Värdet som erhölls från dessa två analyser låg nära noll, ju närmare värdet är noll, desto svagare blir koppling.

Slutsats: Resultatet från denna studie visar att det inte föreligger någon koppling mellan LPL och mammans viktuppgång, BMI samt fostrets födelsevikt.

Keywords

Lipoprotein lipase, weight gain during pregnancy, RNA-extraction, reverse-transcriptase

PCR and real-time PCR.

Introduktion

Placenta

Zygoten är den cellen som bildas när spermien befruktar ägget. Den utvecklas och delar sig och blir till flera celler som efter ca en vecka kommer att ha utvecklats till en blastocyst.

Blastocytens inre cellmassa blir själva fostret och den yttre cellmassan (trophectoderm) vidare utvecklas och blir organet placenta. Organet finns endast i mammans kropp under graviditeten eftersom kroppen gör sig av med den efter förlossningen. Fostret är ständigt beroende av dess närvaro och funktion under hela graviditeten [1]. Synctiotrofoblaster (cellskikt i placentan mellan mammans och fostrets blod) ansvarar för näring- och syretillförsel där placentans mikrovillösa plasmamembran (MVM) är riktad mot mammans blod och basala membranet (BM) är riktad mot fostrets blod. Placentans hormoner ser även till att mammans fettdepåer lagras för att sedan utsöndra detta för fostertillväxt under senare stadie av graviditeten samt omvandla fettet till bröstmjölk för amning [2].

Ett spädbarns kroppsvikt består till stor del ut av fettvävnad och fettet är essentiell för

uppbyggnaden av den mänskliga hjärnan under graviditeten samt att det är en viktig källa för syntes av hormoner. Fostrets kropp kan inte syntetisera tillräckligt med fettsyror, därför kommer majoriteten av dessa fettsyror från modern och transporten sker via diffusion i placentan. Fettsyratransportörer finns både i mammans MVM och i fostrets BM [3].

Innan fettet kan passera placentan, måste triglycerider brytas ner till fettsyror av enzymer. Ett sådant enzym är placentalipoprotein lipas (pLPL). Uttrycken av pLPL-genen sker i

synctiotrofoblasterna och aktiva formen av enzymet pLPL är fastankrad på placentans

mikrovilli, härifrån sker sedan transporten av fettsyror vidare till fostret [4]. När lipiddepåerna

ökar exponentiellt med gestationsåldern (detta sker främst under graviditetens tredje och sista

trimester, mellan vecka 29 och 40) sker det även ett ökat uttryck av pLPL [3].

Gestationsålder är en term som beskriver graviditetens skede och detta anges i antal veckor, från att graviditeten började till nuvarande graviditetsvecka. Fostrets tillväxt/storlek under denna period mäts med ultraljud och beroende på storlek kan fostren tillhöra ett av tre grupper för gestations ålder. Foster som är underviktiga tillhör ”small for gestational age” (SGA) och överviktiga foster hamnar i gruppen ”large for gestational age” (LGA). Foster som är

normalviktiga tillhör ”appropriate gestational age” (AGA).

Det har visat sig att det finns en koppling mellan mammans och fostrets vikt, ju mer mamman väger och ju högre BMI är desto större är chansen att barnet som födds hamnar i LGA. När mamman går upp i vikt/är överviktig, kommer detta att påverka genuttrycken i placentan och det i sin tur triggar igång viktuppgången hos fostret [5]. Mammans viktuppgång under

graviditeten ökar inte endast fostrets vikt men även i framtiden kan det uppstå hälsorelaterade komplikationer som kardiovaskulära sjukdomar och diabetes samt fetma under barndomen och tonåren. Detta innebär att risken för dödlighet är mycket större för dessa barn [6].

Projektets bakgrund:

Detta projekt var en studie som handlade om viktuppgång under graviditet (även kallad VIGA) i samband med LPL och det var främst mammans viktuppgång som var av intresse.

Tidigare studie har visat att gener (andra än LPL) som uttrycks i placenta har ett samband mellan mammans BMI och viktuppgång samt fostrets födelsevikt. Dessa gener har även visats ha en koppling till fetma senare i livet hos barn som födds överviktiga [7]. Det som var

utmärkande för detta projekt är att alla placentor som hade samlats in (mellan åren 2015–

2019) för LPL-genuttryck hade kommit från graviditeter med planerat kejsarsnitt hos friska

kvinnor (med friska barn). Information från medverkans journaldata (bland annat mammans

BMI och viktuppgång) samt graviditetsutfall (information om barnets vikt och dess födsel)

fanns tillgänglig vid statistiks analys av resultatet.

Projektet utfördes på institutionen för kvinnors och barns hälsa, Uppsala universitet som ligger i Rudbecklaboratoriet. Totalt fanns det 100 placentor tillgängliga i fryst form. RNA:t som under processen tillhandahölls från dessa placentor användes som utgångsmaterial för projektet.

Metodprincip

RNA extraherades från placentorna och kvalitén på det extraherade RNA:t analyserades med Nanodrop och Bioanalyzer. Därefter omvänt transkriberades (reverse transcriptase PCR) RNA till cDNA. Avslutningsvis användes cDNA:t i RT-PCR (real-time PCR) och RNA nivåerna av den utvalda LPL-genen bestämdes med primer och TaqMan probe.

Amplifikations plotten som erhölls från RT-PCR återspeglar genuttrycket och detta resultat låg till grund för den statistiska analysen. Analysen är baserad på delta-delta-CT metoden (2

∆∆Ct

) i real time-PCR och tillämpades för att avgöra om det föreligger någon korrelation mellan LPL-genen och variabler av intresse.

Uttrycken av LPL-genen var av intresse i detta projekt och ett antal kontroller med olika ändamål har använts under processen. En av dessa kontroller är negativ-templat-kontroll (NTC) som detekterar kontamination och primer-dimer bildning (biprodukt från RT-PCR) vilket kan ge falsk positiv resultat. Därför innehöll inte brunnar (i 96-brunnsplatta) med NTC någon cDNA-templat. För detektion av genomisk DNA användes icke-omvänt transkriptas kontroll (no-RT) och för att kontrollera att det överhuvudtaget sker en reaktion användes därför omvänt transkriptas kontroll (RT) [8].

Cytochrome C1 (CYC1) valdes som endogen kontroll och en endogen kontrolls uttryck ska

inte skilja mellan de olika proverna och därför används CYC1-genen för att normalisera

resultatet [9].

NFQ-MGB quencher användes både till LPL samt CYC1 och reporter som användes var FAM och VIC för LPL respektive CYC1. Genom att använda Taq-man prober med två olika reportrar, kan två olika gener (i detta fall LPL och CYC1) detekteras i samma reaktion.

Master mixen som tillbereddes följde två olika assays, singelplex (SP) och multiplex (MP). I SP amplifieras antingen LPL eller CYC1 (en mastermix per gen) men med MP kan två (eller fler gener) amplifieras i en och samma reaktion. Master mixen innehåller även ROX-

referensfärg vars egna fluorscering är konstant under hela RT-PCR amplifieringen och som ser till att normaliserar fluorescenssignaleringen från reportrarna. Denna normaliserade värdet anges som Rn i en amplifikationskurva. [10].

Hypotes och syfte:

Syftet med detta projekt var att undersöka associationen mellan uttrycken av LPL-genen och mammans BMI, viktuppgång respektive barnets födelsevikt.

Min hypotes är att barn som väger mer och har överviktiga mammor, har även placentor som uttrycker mer LPL.

Material och metod

Material:

Studiematerial

Provmaterial som användes var placentor från tidigare VIGA-studien och från dessa placentor extraherades RNA. Det extraherade RNA:t användes som utgångsmaterial till de fyra

metoderna RNA-extraktion, Nanodrop/Bioanalyzer, cDNA-tillverkning och RT-PCR. Det fanns totalt 100 placentor för studien och dessa tillhörde friska mammor med friska barn och samtliga graviditeter hade planerat kejsarsnitt.

Etik

Etik godkännande från Regionala etikprövningsnämnden i Uppsala för VIGA-studien har fått Dnr. 2014/353 och Dnr. 2015/366. I tillståndet ingår det att placentor får samlas in och utifrån dessa placentor får RNA nivåerna mätas för gener av intresse. Det finns också tillåtelse att hämta medverkarnas journaldata (bland annat mammans BMI och viktuppgång) samt graviditetsutfall (information om barnets vikt och dess födsel). De medverkande har fått information om studien och gett ett skriftligt samtycke.

Metoder:

RNA-extraktion

Samtliga RNA extraktioner skedde med hjälp av RNeasy Mini Kit 250 (QIAGEN Cat.No 74106). Protokollet som ingick i kittet följdes under arbetets gång, dock lades en DNase- behandling till som är ett frivilligt steg.

Samtliga placentabitar lyserades i en 600 µL lösning som bestod av β-Mercaptoethanol (β- ME) och RLT-buffert med hjälp av en MP 24-fast prep (speed 6.0, 40 sekunder). Direkt efter lyseringen centrifugerades lysatet (20 784 g). 250 µL av 70%-ig etanol blandades med supernatanten och denna lysat-etanolblandningen tillsattes i en RNeasy spinkolumn för centrifugering och därefter tillsattes 350µL av RW1-buffert för att återigen centrifugeras. 80 µL av DNase-RDD-buffertblandningen tillsattes för att sedan inkuberas i 15 min och efter inkuberingen tillsattes 350µL av RW1-buffert för att sedan centrifugeras. 500µL av RPE- bufferten tillsattes i två omgångar med centrifugering mellan varje omgång. RNeasy spinkolumnen placerades i en ny 2mL samlingsrör och centrifugerades i högsta hastighet (14 800 rpm). RNA eluerades med 50 µl RNAse-fritt vatten. Eluaten förvarades vid 0C för att sedan delas upp i 6µL (Nanodrop och Bioanalyzer), 10µL (qPCR) och 25µL (RNA-

sekvernsering) volymer och förvarades därefter i -80 C.

Nanodrop

Samtliga RNA-extraktioners koncentration (µg/µL) och absorbanskvot (A260/A280) analyserades med NanoDrop™ 2000/2000c Spectrophotometers.

Bioanalyzer

Till samtliga RNA-extraktioner (6µL portioner) användes Agilent RNA 6000 Nano Reagents Part I (Agilent Technologies, Cat.No. 5067–1511) och extraktionernas RNA integrity number (RIN-värde) analyserades med Agilent 2100 Bioanalyzer.

Reagenserna (Agilent RNA 6000 Nano Dye Concentrate, Agilent RNA 6000 Nano Marker och Agilent RNA 6000 Nano gelmatris-portioner) som skulle användas fick stå i

rumstemperatur under 30 min. 1µL av Dye Concentrate tillsattes i gelmatris-portioner. Gel- färgmixen vortexades samt centrifugerades i en hastighet på 13 000 g under 10 min. Denna gel-färgmix tillsammans med Agilent RNA 6000 Nano Ladder, Agilent RNA 6000 Nano Marker och proverna (portioner av RNA-extraktion) pipetterades i respektive brunnar i ett Nano-Chip enligt ett protokoll. Detta chip vortexades i 1min och placerades sedan i Agilent 2100 Bioanalyzer för analys av RNA-kvalitén.

cDNA-syntes/RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction)

Reagenserna som användes i cDNA-syntesen ingick i Invitrogens SuperScript IV VILO (Thermo Fisher Scientific, Cat.No.11766050).

En gDNA nedbrytnings-reaktionsmix tillbereddes till varje RT och icke-RT kontroll.

Reagenserna som ingick var 1µL 10X ezDNase buffert, 1µLezDNase enzym och RNA-

templat. Sedan tillsattes Nukleas-fritt vatten tills mixens totala volym blev 10µL. Mixen

blandades försiktigt för att sedan inkuberas i 37 C under 2min och därefter centrifugerades

den och lades på is. I gDNA nedbrytnings-reaktionsmixen tillsattes 4µL SuperScript IV VILO

Master mix och 6µL Nukleas-fritt vatten för RT-kontrollen samt 4µl SuperScript IV VILO

No-RT kontroll och 6µL Nukleas-fritt vatten för No-RT-kontrollen. För annealing av primer inkuberades mixen i 25C under 10min. För omvänd transkription inkuberades mixen i 50C under 10min. För inaktivering av enzymer inkuberades mixen i 85C under 5min.

RT-PCR (real-tid polymerase chain reaction)

Reagenserna som användes i RT-PCR-mixen ingick i Applied Biosystem (Thermo Fisher Scientific, Cat.No.11766050).

LPl-genen (Thermo Fisher Scientific, Cat.No. 4331182) hade en FAM-reporter och den endogena kontrollen CYC1 (Thermo Fisher Scientific, Cat.No. 4331182) hade en VIC- reporter. Båda dessa gener hade en gemensam quencher, NFQ-MGB. Företaget anger inte exakt sekvens för primer/prober dock anges exon-exon gränserna 6–7 och 5–6 för LPL respektive CYC1.

RT-PCR kördes i två omgångar, ett för test-körning av ett prov (prov nr 80 med RT och no- RT kontroll) och ett för samtliga prover (där prov 80 även ingick). Till testkörningen bereddes tre olika mastermixar som vardera hade en total volym på 162µl. Två mastermix var SP (en för LPL och en för CYC1) och en mastermix var MP (innehöll både LPL och CYC1). SP- mastermixen reagenser var 90µL TaqMan® Fast Advanced Master Mix (2✕), 9µL Custom TaqMan® Gene Expression Assay (20✕) LPL respektive CYC1 och 63µL Nukleas-fritt vatten. MP-mastermixen innehöll 90µL TaqMan® Fast Advanced Master Mix (2✕), 9µL Custom TaqMan® Gene Expression Assay (20✕) LPL, 9µL Custom TaqMan® Gene

Expression Assay (20✕) CYC1 och 54µL Nukleas-fritt vatten. Mastermixarna vortexades och centrifugerades.

Volymerna som pipetterades var 18µl PCR-mastermix (SP eller MP) och 2µL prov 80 (med

RT respektive no-RT-kontroll). Endast två brunnar saknade cDNA-templat (prov) eftersom

dessa brunnar hade NTC, istället ersattes det med 2µL RNas-fritt vatten.

I den andra RT-PCR analysen kördes proverna också i duplikat och dessa prover (cDNA- templat) späddes 1:10 (5µl cDNA och 45µl RNas-fritt vatten). RT-PCR-mastermixen

tillbereddes enligt MP och reagenser var 1020µL TaqMan® Fast Advanced Master Mix (2✕), 102µL Custom TaqMan® Gene Expression Assay (20✕) LPL, 102µL Custom TaqMan®

Gene Expression Assay (20✕) CYC1 och 408µL Nukleas-fritt vatten. Denna mix hade en total volym på 1632µL. Mastermixen vortexades och centrifugerades.

Därefter pipetterades 16µl av PCR-mastermixen i varje brunn i en ny 96-brunns-platta tillsammans med 4µl av cDNA-templatet. Här ingick även prov 80 (en brunn med RT och en brunn med no-RT kontroll) samt två brunnar med RNas-fritt vatten.

Plattorna täcktes sedan med aluminiumfolie (p.g.a. reagensernas ljuskänslighet) och

centrifugerades för att få ner innehållen i botten av brunnarna samt för att eliminera eventuella luftbubblor. Slutligen kördes plattorna (test och prov-plattan i varsin omgång) för

amplifieringen i instrumentet StepOnePlus System. Amplifieringen började med en

inkubation på 50C under 2min och sedan aktiverades polymeraset på 95C under 20s. Därefter skedde en denaturering på 95C under 1sek och slutligen var det en annealing på 60C under 20sek. Detta var totalt 40 cykler.

Statistik

Statistiskanalys av Lipoprotein lipas (LPL) och de tre variablerna mammans BMI, viktuppgång samt barnets födelsevikt tillämpades. Medelvärde och standardavvikelse beräknades och normalfördelning alternativ icke-parametrisk fördelning av värdena beräknades med Shapiro-Wilk-testet.

För analys av eventuellt samband mellan lipoprotein lipas (LPL) och mammans BMI

respektive viktuppgång användes Spearmans rangkorrelation. Pearsons korrelation användes

till att analysera om det möjligtvis förekom ett förhållande mellan LPL och barnets födelsevikt. Ett p-värde under 0,05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

Till projektet erhölls totalt 100 placentor dock var det endast 40 extraherade placentor vars resultat användes som grund för den statistiska analysen. Detta beror på resultatet från Bioanalyzern (se nedan Bioanalyzer).

Nanodrop

Med hjälp av Nanodropen kan det extraherade RNA:s koncentration (enhet ug/µL) fås fram samt Absorbans ratio (A260/A280). Det är baserad på Absorbansratio som renheten av RNA:t bedöms efter. En ratio på 2,0 (intervall 1,9 ≤ Abs ratio ≤ 2,2) indikerar att det är ett rent RNA utan kontaminationer av andra partiklar och molekylär. Tabell 1 visar medelkoncentrationen och medel absorbansratio för de 40 extraherade placentorna samt minimum och

maximumvärde för respektive parameter. Medelkoncentrationen av det isolerade RNAt var 118,7 ng/µl (n=40, min=1,5 och max=244,4). Medelabsorbansen var 2,03 (n=40, min=1,9 och max=2,18).

Tabell 1: Samanställning av resultatet från Nanodrop.

Koncentration (µg/µl) Absorbans ration (A260/A280)

Min-värde 1,5 1,9

Max-värde 244,4 2,18

Medelvärde 118,7 2,03

Bioanalyzer

Resultatet från Bioanalyzern tolkas utifrån en bild på gelelektroforesen och ett elektroferogram. Spåren i gelen innehåller en markör tillsammans med själva provet.

Markören användes för att justera proverna och utifrån dess fragment bestäms storleken på RNA-banden.

De prover som apparaten Agilent 2100 Bioanalyzer inte kunde uppskatta kvalitén på, fick ett ogiltigt RIN-värde (RIN N/A) samt en röd markering ovanför gelspåren. N/A betyder att RIN- värdet inte är pålitligt för ett visst prov. RIN-värde har ett intervall från 1 till 10, ju närmare 1 värdet ligger desto mer nedbrutet är RNA:t och ju närmare 10 värdet ligger desto mer intakt är det (över 7 tyder på ett prov med relativt intakt RNA).

Antalet extraherade placentor minskades från 100 vilket beror på att en del placentor fick ett RIN N/A. Det i sin tur gjorde att det inte fanns tillräckligt många placentor för den statistiska analysen. Detta kompenserades med att en del placentor med RIN-värde på minst 5 också inkluderades (idealiskt ska endast prover med ett RIN på 7 användas) vilket i slutändan resulterade i att endast 40 placentors värden användes för den statistiska analysen.

Ett annat sätt att bedöma kvalitén hos RNA är efter dess rRNA-ratio värde som bestäms efter förhållandet ([28s/18s]) mellan de ribosomala subenheterna 18s och 28s. Ett värde som är högre än 2 anses vara indikation på intakt RNA. Tabell 2 visar medel-RIN-värdet och medel- [28s/18s] -ration för de 40 extraherade placentorna samt minimum och maximumvärde för respektive parameter. RIN-värdet av det isolerade RNA var 3,4 (n=40, min=1,5 och max=244,4). Medel-[28s/18s] -ration värdet var 1,3 (n=40, min=0,1 och max=3,6).

Tabell 2: Samanställning av Bioanalyzer.

RIN-värde [28s/18s] -ration

Min-värde 1 0,0

Max-värde 7,6 3,6

Medelvärde 3,4 1,3

Figurerna 1 och 2 nedan visar elektroferogram (där fluorescensenheter FU är angiven på y- axeln och på x-axeln är tid i enhet s angiven) för 2 olika prover tillsammans med respektive gelspår. Prov nr 4 Prov nr 4 som hade det högsta RIN-värdena ut av samtliga prover visas i figur 1 och i figur 2 visas prov nr30 som hade lägst RIN-värde.

Figur 1: Elektroferogram tillsammans med gelspår från gelelektroforesen för prov nr 4.

Provet har ett RIN-värde på 7,60 och [28s/18s] = 2,9.

Figur 2: Figuren visar en elektroferogram tillsammans med gelspår från gelelektroforesen för prov nr 30. Provet har ett RIN-värde på 1 och [28s/18s] = 0,0.

RT-PCR (real-time polymerase chain reaction)

Som tidigare nämnt är det genen LPL vars uttryck som var av intresse och kontroller som användes vid denna RT-PCR var CYC1, NTC, no-RT och RT. Det utfördes två omgångar av RT-PCR, det första var en test-körning av prov nr 80 och den andra analysen var för samtliga prover. Kontroller och prover kördes i duplikat.

Resultatet från RT-PCR visas som en amplifikationskurva och i denna kurva plottas ΔRn (y- axeln) mot antal cykler (x-axeln). Rn är det värdet som erhålls när ROX-referensfärgen normaliserar reportens fluorescenssignalering. Detta värde minus ”baseline” (PCR-cykler där reportens fluorescering ökas men ligger under instrumentets gräns för detektion) ger ΔRn.

data är relativt utspridd och att de där med inte ligger ut efter en linjär kurva Amplifikations-

plotten för test-analysen presenteras nedan i två figurer. Figur 3 visar plottningen över single

plex (SP) och multi plex (MP) för generna LPL och CYC1. Plottningen över NTC samt prov 80 med no-RT och RT-kontroll samt NTC visas i figur 4.

Figur 3: Amplifikations plot för test-körning. C-kurvan visar SP för LPL med RT-kontroll, E-

kurvan visar SP för CYC1 med RT-kontroll och G-kurvan visar MP för LPL och CYC1 med

RT-kontroll.

Figur 4: Amplifikations-plot för test-körning. Gröna kurvan representerar prov 80 med RT- kontroll och den gula visar prov 80 med no-RT-kontroll. Den svarta kurvan visar icke-templat kontrollen (NTC).

Statistisk analys

Under RT-PCR (real-tid polymerase chain reaction) binder proben specifikt mellan forward och reverse primern till PCR-produkten. Polymeraset förlänger primern och replikerar templatet. Polymeraset klyver proben och vilket leder till att reportrarna (FAC och VIC) frigörs från quenchern (NFQ-MGB). Fluorescensintensiteten hos reporterfärgen (ROX-

referensfärg) kommer då att öka och detta upprepas i varje cykel. När antalet cykler ökar, ökar också den detekterade fluorescensen. Fluorescensen passerar ett godtyckligt tröskelvärde, även kallad Ct-värdet och detta värde motsvarar antal tröskelcykeler. Denna tröskelcykel är omvänt proportionell mot den ursprungliga expressionsnivån för genen av intresse (i detta fall LPL), ju lägre Ct-värdet blir för genen desto mer av genen finns det i provet. Detta Ct-värde kan sedan användas i den s.k. ΔΔCt-metoden. Skillnaden mellan Ct-värdena (ΔCt) för genen av intresse (LPL) och hushållsgenen (CYC1) beräknas för varje prov och därefter beräknas också skillnaden i ΔCt-värden (ΔΔCt) mellan proven och kontrollerna.

Genuttrycksförändringen hos genen av intresse (LPL) mellan proven och kontrollerna är då lika med 2˄(-ΔΔCt) vilket även reflekterar genens RNA-nivåer i proven.

Tabell 3 visar medel-2˄(-ΔΔCt) -värdet för LPL-genen hos de 40 extraherade placentorna och standardavvikelse samt minimum och maximumvärde. Medel-2˄(-ΔΔCt) -värdet för LPL- genen var 0,99 (n=40, min=0,03 och max=5,89).

Tabell 3: Samanställning av min, max och medelvärde samt standardavvikelse för LPL-genen.

2˄(-ΔΔCt) = LPL

Min-värde 0,03

Max-värde 5,89

Medelvärde 0,99

Standardavvikelse 0,49

2˄(-ΔΔCt) -värdet för varje prov plottades mot respektive födelsevikt (figur 5), mammans BMI (figur 6) samt viktuppgång (figur 7) i en så kallas scatter plot. Plottningen visar att det inte förekommer någon linjärkurva eftersom data är relativt utspridd.

Figur 5: Scatter ploting för 40 prover mellan LPL-genen (2^-ΔΔCt) på x-axeln och barnets

födelsevikt (enhet g) på y-axeln.

Figur 6: Scatter ploting för 40 prover mellan mammans BMI (kg/m2) på x-axeln och LPL- genen (2^-ΔΔCt) på y-axeln.

Figur 7: Scatter plotingför 40 prover mellan mammans viktuppgång (kg) på x-axeln och LPL- genen (2^-ΔΔCt) på y-axeln.

Resultatet från RT-PCR (2^-ΔΔCt värdena) tillsammans med information från medverkarnas journaldata och graviditetsutfall användes som underlag för statistisk analys av eventuell korrelation mellan LPL och de tre variablerna mammans BMI, viktuppgång och barnets födelsevikt. Den beräknade data presenteras i tabell 4.

Shapiro-Wilk-testet användes för att avgöra om variablerna var normalfördelade eller inte

(icke-parametriska). Testet förkastar noll hypotesen när p <0,05. I tabell 3 visas vilka av

variablerna som var normalfördelade (NF) respektive icke-parametriska (IP) tillsammans med beräknad p-värde.

Valet av korrelationstest berodde på om variablerna var normalfördelade eller inte. På den variabeln (ut av mammans BMI, viktuppgång och barnets födelsevikt) som var

normalfördelade tillämpades Pearsons korrelations test och Spearsons rangkorrelationstest användes på icke-parametriska variabler. Även detta presenteras i tabell 4.

Spearmans rangkorrelations koefficient r

för två variabler av intresse (i detta fall mellan LPL och BMI respektive viktuppgång) kan ha ett värde mellan +1 (positiv korrelation) och -1 (negativ korrelation) där ett värde på 0 betyder att det inte föreligger något samband. Ju närmare 0 värdet ligger desto mer tyder det på att det är ett svagare samband mellan

variablerna. Samma princip gäller Pearsons korrelationskoefficient r. Tabell 4 visar även de tre olika variablernas korrelationskoefficient som reflekterar dess förhållande till LPL-genen.

Korrelationsvärdena för respektive variabel ligger relativt nära 0 vilket i sin tur innebär att det inte föreligger något samband mellan dessa variabler och LPL-genen.

Tabell 4: Resultat från Shapiro-Wilk-testet och val av korrelationstest för variablerna barnets födelsevikt, mammans BMI och viktuppgång samt resultat från Pearsons rangkorrelation och Spearmans korrelationstest som visar om det föreligger någon eventuell samband mellan variabler av intresse och LPL-genen.

Variabel p-värde NF/IP Korrelationstest

för LPL

r

Födelsevikt 0,969 NF Pearsons 0,045

BMI 0,000 IP Spearmans 0,112

Viktuppgång 0,056 IP Spearmans 0,044

Diskussion

Till VIGA-studien hade 100 placentor initialt samlats in från friska kvinnor med planerat kejsarsnitt (mellan åren 2015 och 2017) för undersökning av uttrycket av genen LPL i dessa placentor. Projektet gick ut på att ta reda på om det fanns någon korrelation mellan LPL och mammans BMI, viktuppgång och barnets födelsevikt. Detta gjordes genom extraktion av RNA från medverkarnas placentor. Arbetet bestod av att kontrollera renheten och kvalitén hos RNA:t med Nanodrop respektive Bioanalyzer för att sedan omvänt transkribera (reverse transcriptase polymerase chain reaction) RNA:t till cDNA. RNA-nivåerna bestämdes med RT-PCR med hjälp av ΔΔCt-metoden och avslutningsvis användes Spearmans

rangkorrelations test samt Pearsons korrelationstest för påvisning av eventuell korrelation.

Under projektets gång fanns den stora fördelen att färdiga extraktions-kit med tillhörande protokoll användes för att för att utföra samtliga metoder. Dock fanns det en del steg som krävde mer noggrannhet och precision vilket sedan reflekterades i resultatet.

För att undvika kontamination som till exempel DNA i RNA-extraktionen tillsattes DNase- enzym (vilket var ett frivilligt steg som ingick i kittets protokoll) vars funktion är att bryta ner DNA:t i provet [11]. Om DNA (eller eventuellt andra molekylära partiklar) finns med i provet kan Nanodropen reagera på detta eftersom den mäter renheten hos RNA:t baserat

absorbansration (A260/A280) samt koncentrationen (µg/µL) [12].

Genom ett urval baserat på RIN-värde som erhölls från Bioanalyzern valdes 40 prover ut av

100 extraherade för att omvänt transkriberas till cDNA. Prover som exkluderades fick ett

ogiltigt RIN-värde s.k. RIN N/A. Detta innebär att RNA:t i provet var så pass nedbrutet att

apparaten inte kunde uppskatta något värde. En annan (mindre lämpligt) bedömning av kvalitén hos RNA kan göras utifrån förhållandet [28s/18s]. Detta förhållande utgår från rRNA. Det extraherade RNA:t består endast av 3% mRNA men det innehåller även rRNA som finns i betydligt större mängder (mer än 80%). Majoriteten av rRNA:t består i sin tur av subenheterna 18s och 28s, förhållandet [28s/18s] mellan dessa subenheter antas reflektera hur väl intakt det extraherade RNA:t är i provet. Det som måste tas till hänsyn är att ett högt värde på [28s/18s] inte korresponderar med ett högt RIN-värde. Ett prov vars [28s/18s] ligger högt över 2 kan ha ett RIN-värde som är lägre än 7 vilket innebär att RNA:t trots allt inte är tillräckligt intakt [14].

För att bestämma RNA-nivåerna av LPL-genen användes ΔΔCt-metoden. Med hjälp av denna metod beräknades 2˄(-ΔΔCt) -värdet vilket motsvarar RNA-nivåerna av LPL-genen. Figur 5, 6 och 7 visar Scatter plotning av 40 prover och hur LPL förhåller sig till de tre variablerna (barnets födelsevikt, mammans BMI respektive mammans viktuppgång). Något som måste tas till hänsyn är att det är mammans BMI och viktuppgång som kan ha en eventuell påverkan på uttrycket av LPL men LPL-uttrycket kan påverka barnets födelsevikt. Dock visade

uträkningen och plottningen att det inte föreligger någon eventuell trend som tyder på att ökning av variablerna också leder till ökad LPL. Detta kan avläsas i Scatter plotningen som visar att data är relativt utspridd och att de där med inte ligger ut efter en linjär kurva.

För att ytterligare analysera resultatet från ett statistiskt perspektiv användes två

korrelationstester, Spearmans rangkorrelation och Pearsons korrelationstest. Spearmans är en icke-parametrisk statistisk metod som användes för LPL-uttrycken och mammans BMI respektive viktuppgång och Pearsons är en metod för normalfördelning vilket användes för LPL och barnets födelsevikt. Uträkningen visade att ingen av variablernas

korrelationskoefficient ligger i närheten av värdet för eventuellt samband.

Där med kan slutsatsen dras utifrån Ct-metoden och den statistiska analysen att det inte föreligger något samband mellan lipoprotein lipas och de tre variablerna mammans viktuppgång, BMI och barnets födelsevikt [15].

Trots att LPL har en avgörande roll i att bryta ner triglycerid till fettsyror vilket möjliggör att dessa fettsyror kan passera placentan och gå vidare till fostret, har det visat sig i detta projekt att uttrycket av genen inte har någon signifikant roll för mammans viktuppgång och BMI eller barnets födelsevikt. Det kan vara en ren slump att ingen korrelation var påvisbar men det finns också en möjlighet att detta resultat berodde på ett antal avgörande faktorer, allt ifrån preanalytiska till analytiska felkällor, som har gjort att utfallet blev som det blev.

Eftersom utgångsmaterialet var RNA, vilket är en instabil molekyl, är det självklart att placentorna som samlades in i början av insamlingsåren hade möjligtvis blivit mer nedbrutna än de som samlades in på senare år. Kvalitén på placentorna har antagligen också påverkats av hur snabbt de togs emot efter förlossningen samt hur/på vilket sätt de förvarades innan de nådde laboratoriet.

En ytterligare viktig aspekt är att det endast var 40 placentor utav av totalt 100 som valdes till cDNA-syntes (reverse transcriptase PCR) och vidare till RT-PCR (real-tid PCR). Som

tidigare nämnt kan det vara ren slump att just dessa 40 placentor inte visade någon korrelation mellan LPL och variabler av intresse. Därför kan metoden testas ytterligare en gång på dessa 40 prover för att se om de uppvisar samma resultat.

Detta projekts resultat har jämförts med en tidigare studie [16] av LPL-genen som visar att det

finns ett samband mellan LPL-uttrycket i placentor och fetthalten hos nyfödda barn dock

hittades inget samband till mammans BMI. Denna studie hade endast hälften så många

placentor (totalt 20) jämfört med projektet som jag fick utföra (totalt 40). Det är även värt att

påpeka att placentor som användes i mitt projekt kommer från friska mammor med friska

barn, vilket inte framgår från denna studie. Där emot var det en regelbunden kontroll av bland annat mammans fria fettsyror, insulin och glukoshalt i studien vilket kan ha gett ett bättre underlag för att avgöra om någon samband föreligger eller inte. Av denna anledning krävs det ytterligare undersökningar i detta ämnesområde med en större mängd provmaterial och

möjligtvis liknande kontroller av mammans hälsotillstånd under graviditeten för att säkerställa att resultatet i mitt projekt är representativ eller inte.

Arbetet med genuttryck kommer fortskrida med att det extraherade RNA:t kommer att bli RNA-sekvenserat (RNA-seq). Med hjälp av RNA-seq kan RNA kvantifieras för att sedan profileras. Målet med RNA-seq är att identifiera de olika skillnaden i uttryck hos gener som regleras tillsammans. Det provmaterial som jag har tagit fram (extraktioner av RNA) för RNA-seq tillsammans med den resultat som jag har erhållit under projektet, är ytterst viktig för att förstå varför utfallet blev ”ingen korrelation”. Därför tycker jag att mitt resultat är värdefull för framtida forskning eftersom det kan användas som ett underlag för studier relaterad till samma ämnesområde.

Tillkännagivande

Jag vill först och främst tacka mina två handledare Susanne Lager och Theodora Kunovac Kallak vid kvinnor och barns hälsa i Rudbecklaboratoriet vid Uppsala universitet för en kunskapsgivande och lärorik tid. Stort tack till min opponentgrupp under examensarbetet, Trife Iftikhari och Jens Ärlig, för kritisk granskning av min rapport samt för en bra kommunikation under arbetets gång.

Referenser

[1] Burton GJ and Jauniaux E. Development of the Human Placenta and Fetal Heart: Synergic

or Independent? Front Physiol. 2018 Apr 12; 9: 373.

[2] Burton GJ and Fowden AL. The Placenta: A Multifaceted, Transient Organ. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015 Mar 5; 370(1663)

[3] Qiao L, Guo Z, Bosco C, Guidotti S, Wang Y, Wang M, Parast M, Schaack J, Hay WW Jr, Moore TR and Shao J. Maternal High-Fat Feeding Increases Placental Lipoprotein Lipase Activity by Reducing SIRT1 Expression in Mice. Diabetes. 2015 Sep; 64(9): 3111–3120.

[4] Perazzolo S, Hirschmugl B, Wadsack C, Desoye G, Lewis RM and Sengers BG. The Influence of Placental Metabolism on Fatty Acid Transfer to the Fetus. J Lipid Res. 2017 Feb;

58(2): 443–454

[5] Robillard PR, Dekker G, Boukerrou M, Le Moullec N and Hulseyf TC. Relationship Between Pre-Pregnancy Maternal BMI and Optimal Weight Gain in Singleton Pregnancies.

Heliyon. 2018 May 10; 4(5): e00615.

[6] Chen PY, Chu A, Liao WW, Rubbi L, Janzen C, Hsu FM, Thamotharan S, Ganguly A, Lam L, Montoya D, Pellegrini M, Devaskar SU. Prenatal Growth Patterns and Birthweight Are Associated with Differential DNA Methylation and Gene Expression of Cardiometabolic Risk Genes in Human Placentas: A Discovery-Based Approach. Reprod Sci. 2018

Apr;25(4):523-539

[7] Cox B, Tsamou M, Vrijens K, Neven KY, Winckelmans E, de Kok TM, Plusquin M and Nawrot TS. A Co-expression Analysis of the Placental Transcriptome in Association with Maternal Pre-pregnancy BMI and Newborn Birth Weight. Front Genet. 2019 Apr; 10: 354.

[8] Ruiz-Villalba A,a, van Pelt-Verkuil E, Gunst QD, Ruijter JM and van den Hoff MJB.

Amplification of nonspecific products in quantitative polymerase chain reactions (qPCR).

Biomol Detect Quantif. 2017 Dec; 14: 7–18.

[9] Vaiphei ST, Keppen J, Nongrum S, Chaubey RC, Kma L and Sharan RN. Evaluation of endogenous control gene(s) for gene expression studies in human blood exposed to

Co γ- rays ex vivo. J Radiat Res. 2015 Jan; 56(1): 177–185.

[10] Parker J, Fowler N, Walmsley ML, Schmidt T, Scharrer J, Kowaleski J, Grimes T, Hoyos S and Chen J. Analytical Sensitivity Comparison between Singleplex Real-Time PCR and a Multiplex PCR Platform for Detecting Respiratory Viruses. PLoS One. 2015 Nov; 10 (11): e0143164.

[11] Varela-Ramirez A, Abendroth J, Mejia AA, Phan IQ, Lorimer DD, Edwards TE and Aguilera RJ. Structure of acid deoxyribonuclease. Nucleic Acids Res. 2017 Jun 2; 45(10):

6217–6227.

[12] Desjardins P and Conklin D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J Vis Exp. 2010 Nov 22; (45): 2565.

[13] Khetan D, Gupta N, Chaudhary R and Shukla JS. Comparison of UV spectrometry and fluorometry-based methods for quantification of cell-free DNA in red cell components. Asian J Transfus Sci. 2019 Dec 3; 13(2): 95–99.

[14] Schroeder A, Mueller O, Stocker S, Salowsky R, Leiber M, Gassmann M, Lightfoot S, Menzel W, Granzow M and Ragg T. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol. 2006 Jan 31; 7: 3.

[15] Akoglu H. User's guide to correlation coefficients. Turk J Emerg Med. 2018 Sep; 18(3):

91–93.

[16] Heerwagen MJR, Gumina DL, Hernandez TL, Van Pelt RE, Kramer AW, Janssen RC,

Jensen DR, Powell TL, Friedman JE, Winn VD, Barbour LA. Placental lipoprotein lipase

activity is positively associated with newborn adiposity. Elsevier Ltd. 2018 Apr; 64:53-60.