• No results found

Effekter av CFTRinh-172, en hämmare av cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, på tolvfingertarmens bikarbonat- och vätskesekretion på sövd råtta

N/A
N/A
Protected

Academic year: 2022

Share "Effekter av CFTRinh-172, en hämmare av cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, på tolvfingertarmens bikarbonat- och vätskesekretion på sövd råtta"

Copied!
15
0
0

Loading.... (view fulltext now)

Full text

(1)

Effekter av CFTR

inh

-172, en hämmare av cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, på tolvfingertarmens bikarbonat- och

vätskesekretion på sövd råtta

Av: Christopher Hagman, Läkarprogrammet termin 11, VT-2011

Under handledning av Olof Nylander, prof. vid Institutionen för neurovetenskap, Fysiologi.

Uppsala universitet

(2)

Innehåll

Introduktion ... 3

Material och Metod ... 5

Kirurgi ... 6

Bestämning av luminal alkalinisering ... 6

Protokoll ... 7

Grupper ... 7

Statistiska analyser ... 8

Resultat ... 8

Effekten på duodenums bikarbonatsekretion ... 8

Vätskeflux ... 10

Diskussion ... 10

Slutsats ... 13

(3)

Introduktion

När det H+-rika maginnehållet töms ner i duodenum är det inte svårt att förstå att någon form av skydd måste finnas för att slemhinnan inte ska skadas av den frätande magsaften. Det är sedan länge välkänt att duodenalslemhinnan utsöndrar bikarbonat (HCO3-), som neutraliserar H+ och i samma veva bildar den väsentligt svagare syran koldioxid samt vatten enligt den välkända reaktionsformeln: HCO3- + H+  H2O + CO2.

Bikarbonat utsöndras från lever, pankreas, gallgång samt duodenum. Sekretionen av bikarbonat från dessa epitelceller sker bl.a. som svar på magsäckens tömning av chymus (Boron and Boulpaep 2005, Ameen, Marino and Salas 2003). Levern, som i flertalet ryggradsdjur utsöndrar sin produkt via gallblåsan, står för den största produktionen och är därmed viktig för alkaliniseringen i duodenum (Ainsworth et al. 1992). Genom att separera utförsgångarna från gallblåsa och pankreas visade man i en studie på sövda grisar att

alkaliniseringen i duodenum inte är beroende av det bikarbonat som utsöndras ifrån pankreas.

Däremot är bikarbonatet ifrån gallblåsan av stor betydelse för duodenums neutraliserande förmåga (Ainsworth et al. 1991). Att bikarbonatmängden ifrån pankreas är försumbar har även noterats hos patienter med en exokrin pankreasinsufficiens där man inte kunnat påvisa någon skillnad i intraduodenalt pH vid jämförelse med friska patienter (Ovesen et al. 1986).

Den proximala delen av duodenum kan inte tillgodogöra sig det bikarbonat som kommer från lever och pankreas då gallgången mynnar något distalt, utan måste producera detta på egen hand. Detta genom en vätskesekretion, rik på bikarbonat, som utsöndras från epitelcellerna i duodenums mukosa, duodenocyterna. . Denna sekretion har visat sig stå under fysiologisk kontroll där nervösa och humorala mekanismer (Flemström et al. 1985b) samt lokalt

producerade faktorer såsom prostaglandiner och serotonin medverkar (Allen and Flemström 2005). Duodenalslemhinnans bikarbonatsekretion ökar som svar på saltsyra och det har visat sig att patienter med duodenalulcus har en lägre basal sekretion samt svarar med en lägre ökning av bikarbonatsekretion vid syraexponering än friska frivilliga. Efter eradikering av Helicobacter pylori ökade ulcuspatienternas duodenala bikarbonatsekretion till normal nivå vilket stöder uppfattningen att denna sekretion spelar en viktig roll i skyddet mot saltsyra (Hogan et al. 1996).

(4)

Från duodenocyterna utsöndras bikarbonatet till lumen dels via apikala Cl-/HCO3- exchangers och dels av cystisk fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR (Allen and

Flemström 2005), den senare en välkänd kloridkanal. Cl-/HCO3- exchangers, där Cl- reabsorberas från tarmlumen i utbyte mot HCO3-

, tycks stå för den större delen av den basala HCO3-

utsöndringen i duodenum, åtminstone på råtta. Man har funnit att aktiviteten hos Cl- /HCO3-

exchangers är oberoende av den intracellulära cykliskt adenosin monofosfat (cAMP) nivån (Spiegel et al. 2003). Cl-/HCO3-

exchangers är däremot beroende av luminalt Cl- för att ett utbyte ska kunna ske vilket har påvisats i studier där man noterat en lägre alkalinisering när man eliminerat kloridjonerna i duodenums lumen och dessutom kunnat konstatera att sambandet var koncentrationsberoende (Pihl et al. 2010). Att alkaliniseringen inte avstannade helt i dessa studier talar för att ytterligare transportörer bidrar till att förse duodenallumen med HCO3-

. En av dessa kanaler är troligtvis, som nämnts ovan, CFTR kanalen

Den transmembranösa CFTR kanalens primära uppgift är att fungera som en kloridkanal. I flertalet studier har man kunnat påvisa att kanalen även fungerar som en transportör för bikarbonat (Riordan 2005, Tuo et al. 2009b). Kliniskt är kanalen av stor betydelse vid smitta av Vibrio cholera och Chlostridium difficile då kanalen aktiveras i större utsträckning än normalt och en sekretorisk diarré framkallas för att eliminera patogenet (Thiagarajah and Verkman 2003). Kanalen återfinns i flertalet av kroppens vävnader, framför allt i sådana med sekretorisk funktion såsom pankreas, tarmar, njurar och lungor (Bradbury 1999). Om kanalen är dysfunktionell eller saknas genom medfödd mutation talar man om sjukdomen cystisk fibros, ett tillstånd som innebär minskad vätskesekretion, ökad mukusmängd i lungorna, pankreasinsufficiens samt intestinal obstipation.

I motsats till duodenala Cl-/HCO3-

exchangers, som är permanent tillgängliga i

apikalmembranet, är CFTR-kanalen beroende av den intracellulära cAMP-koncentrationen för att via endosomer förflyttas till och från apikalmembranet. I tunntarmen återfinns CFTR- kanalen främst i de Lieberkühnska kryptorna men ett visst uttryck har även påvisats i villi (Strong, Boehm and Collins 1994). I råttans duodenum har man i tidigare studier noterat, genom att använda CFTR anti-antikroppar samt indirekt immunofluorescens, att CFTR- kanaler i epitelcellerna förflyttas från cytoplasman till apikalmembranet när cAMP nivåerna stiger genom stimulering med exempelvis vasoactive intestinal peptide (VIP). Om VIP- stimuleringen upphör sjunker den intracellulära cAMP nivån och CFTR-kanalerna återvänder till cytoplasman genom endosomtransport (Ameen et al. 1999). Dock står kanalen även för

(5)

delar av den basala tillförseln av HCO3- i duodenum tillsammans med Cl-/HCO3- exchangers.

Detta har visat sig i studier där man vid dysfunktionella eller avsaknad av CFTR-kanaler noterat en sänkning av både den basala och stimulerade HCO3- utsöndringen hos möss respektive människa (Clarke and Harline 1998, Pratha et al. 2000, Hogan et al. 1997).

VIP är en neurotransmitter som återfinns i hjärnan och i det enteriska nervsystemet, ENS.

VIP-immunoreaktivitet har påvisats i både secretomotor och motoriska neuron i ENS. I mag- tarmkanalen har man noterat att exogent VIP stimulerar till ökad bikarbonat- samt

vätskesekretion i duodenum men även relaxerar vaskulär glatt muskulatur i tarm (Flemström, Jedstedt and Nylander 1985a, Nylander, Hällgren and Holm 1993). VIP höjer cAMP

intracellulärt och ökar således proteinkinasaktiviteten i tarmens epitelceller (Laburthe et al.

1979). Detta genom att binda till en receptor på epitelcellernas basolaterala plasmamembran, som leder till aktivering av adenylatcyklas och en ökad produktion av cAMP intracellulärt.

Därefter kan de förhöjda cAMP-nivåerna påverka ett flertal cellulära mekanismer, såsom rekrytering och aktivering av CFTR-kanaler som förflyttas ut till apikalmembranet genom endosomer (Ameen et al. 2003).

I denna in vivo studie på sövd råtta undersöks huruvida en väldokumenterad CFTR inhibitor, CFTRinh-172, hämmar effekten av den VIP inducerade bikarbonat- samt vätskesekretion som sker via CFTR-kanalen. Detta genom att jämföra effekten av VIP på bikarbonat- samt

vätskesekretionen i frånvaro och närvaro av intravenöst eller intraluminalt administrerat CFTRinh-172.

Material och Metod

Sprague-Dawley råttor (250-350 gram) sattes på svält i 18 h innan sövning. Det huvudsakliga skälet till detta är att en tom mage underlättar preparationen av tolvfingertarmen. Därefter sövdes djuret med en intraperitoneal injektion av Inactin®, 120 mg kg-1. Inactin® är ett barbiturat som på råtta åstadkommer en långvarig generell anestesi. Vid tecken på ytlig anestesi (instabilt blodtryck, forcerad andning och reaktion på nyp av tass) gavs extra narkosmedel intravenöst.

(6)

Under hela operationen samt experimentet hölls kroppstemperaturen vid 37 ± 5° C med hjälp av värmeplatta, rektaltermometer och en temperaturregulator.

Kirurgi

Djuret tracheotomerades och ett plaströr, inte längre än djurets egen luftväg, placerades i trachea för att säkerställa spontanandning under experimentet. Vidare kateteriserades femoralis, artär samt ven, med en PE (polyetylen) -50 kateter. Den arteriella katetern kopplades till en tryckgivare och det arteriella blodtrycket registrerades kontinuerligt på en datorskärm med hjälp av Powerlab Chart mjukvara. Katetern i venen användes för injektion av droger.

En laparatomi genomfördes där choledochus lokaliserades och kateteriserades (PE-10) nära duodenalmynningen (2-3 mm). Detta gjordes för att undvika att det duodenala

lumeninnehållet kontaminerades med djurets egna gall- och pankreassekretion (som

innehåller HCO3-). En tub fördes ner i esofagus, genom magsäcken och ut förbi pylorus. Dess läge säkerställdes med en ligatur 2-5 mm distalt om pylorus. 25-35 mm distalt om pylorus diatermeras en strimma av duodenalväggen, klipptes och kanylerades med en PE-320 kateter.

Även dennas kateter säkerställdes med en ligatur. Stor noggrannhet iakttogs för att undvika blödning samt att knyta av viktiga blodkärl. Det kanylerade duodenalsegmentet var cirka 3 cm långt. Den proximala duodenala slangen, som mynnar vid munnen på djuret, kopplades till en peristaltisk pump (Gilson Minipuls) vilket möjliggjorde kontinuerlig perfusion av

duodenalsegmentet med en isoton (154 mM) natriumkloridlösning. Ingångsslangen var kopplad, via ett T-rör, till en tryckgivare vilket möjliggjorde registrering av intraluminalt tryck d.v.s. duodenala kontraktioner. Från den distala duodenala slangen uppsamlades effluat som sedan analyserades med avseende på alkalinitet och vikt. Vid samtliga operationsytor, förutom laparatomin, limmades vävnaden ihop med Histocryl. Bukväggen syddes ihop för att minimera temperatur- samt vätskeförlust.

Bestämning av luminal alkalinisering

Effluatet analyserades med avseende på dess bikarbonatinnehåll genom baktitration till pH 4.90 med 10 mM HCl under kontinuerlig kvävgasbubbling. Det sistnämnda för att säkerställa omrörning av provet samt vädra ut koldioxid som bildas i reaktionen mellan H+ och HCO3-. Kalibrering av pH elektroderna skedde dagligen med två buffertlösningar (pH 4.00 samt pH

(7)

7.00). Volymen titrand (HCl), mätt i µl, som krävdes för att effluatet skulle erhålla pH 4.90, multiplicerat med titrandens koncentration (10 mM) motsvarar mängden bikarbonat i provet.

Efter avslutat experiment mättes tarmsegmentets längd, omkrets samt våtvikt. Tarmarean räknades ut och den luminala alkaliniseringen per tids- och ytenhet kunde bestämmas (µl cm-2 h-1).

Protokoll

Totalt nitton djur, indelat i fyra grupper, inkluderades i denna studie. I samtliga perfunderades duodenum med en isoton natriumkloridlösning med en hastighet på 0.4 ml min-1. Effluatet uppsamlades under totalt 120 minuter i vägda provrör . Provrören byttes var 10 min och utifrån detta beräknades sedan vätske- samt bikarbonatsekretionen genom viktförändring och baktitrering. Även intraluminal tryck (motorik) samt arteriellt blodtryck registreras under studien. Samtliga djur i alla grupper behandlades med en kontinuerlig intravenös infusion (1 ml h-1) av VIP, i en dos på 10 µg kg-1 h-1, vilket inleddes med stegrad infusionshastighet (5 ggr, motsvarande en bolusdos på 0.83 µg kg-1) under den första min av infusionen. Efter en 30 minuters kontrollperiod administreras VIP under 1 h. Därefter stängdes VIP-infusionen av och effluat uppsamlas under ytterligare 30 minuter innan experimentet avslutas. På så sätt fungerade djuren som sina egna kontroller. I de övriga grupperna studerades huruvida CFTRinh-172 samt DMSO (Sanmartín-Suárez et al. 2011) påverkar den VIP-inducerade ökningen av vätske- samt bikarbonatsekretionen.

Grupper

 VIP-gruppen (n=5).

Erhåller endast VIP infusionen och fungerar som kontrollgrupp.

 CFTRinh-172 iv-gruppen (n=4).

Inhibitorn ges som intravenös bolusdos, 2 mg kg-1 löst i 100% DMSO, 10 minuter innan perfusatuppsamlingen startar.

 CFTRinh-172 luminal-gruppen (n=6).

Inhibitorn tillfördes kontinuerligt, 10-5 M, under hela försöket med start 10 minuter innan perfusatuppsamlingen. Inhibitorn löstes i isoton natriumkloridlösning och tillfördes djuret luminalt.

(8)

 DMSO vehikel-gruppen (n=4).

Djuret förbehandlades med en intravenös bolusdos av 100 % DMSO, 2 mg kg-1, 10 minuter innan start av perfusatuppsamling. Denna grupp fungerade som kontrollgrupp till CFTRinh- 172 iv-gruppen för att undersöka huruvida DMSO hade någon egen effekt.

Statistiska analyser

All data uttrycktes som medelvärde ± SEM. Den statistiska signifikansen inom gruppen testades genom att jämföra resultaten före, under och efter infusion av substans (repeated measures, one-way ANOVA med Tukey’s post hoc test). Skillnaden mellan grupperna testades med one-way eller two-way ANOVA med Tukey´s Multiple Comparison test. Alla statistiska analyser utfördes i GraphPad Prism. P-värde < 0.05 ansågs signifikant.

Resultat

Inga djur i studien uppvisade spontan tarmmotorik under experimenten. Det arteriella blodtrycket, som registrerades kontinuerligt under experimenten, visade ingen signifikant skillnad mellan grupperna (Fig. 1).

I samtliga grafer presenteras statistiskt signifikanta värden med hjälp av stjärnmarkeringar (*). Beroende på P- värdets storlek ges mellan en och tre stjärnor där P-värde < 0.001

representerar ***, P-värde < 0.01 representerar ** och P-värde < 0.05 representerar *.

Effekten på duodenums bikarbonatsekretion Vi jämförde VIP-gruppen, kontrollgruppen, med samtliga andra grupper där vi utöver

Figur 1. Grafen visar den arteriella blodtrycksregistreringen för samtliga grupper. Ingen signifikant skillnad kan noteras.

(9)

VIP har behandlat råttorna med med CFTRinh-172 luminalt (A), intravenöst (B) och DMSO intravenöst (C). Då vi har löst CFTRinh-172 i DMSO när den getts intravenöst fann vi det nödvändigt att jämföra DMSO iv-gruppen med CFTRinh- 172 intravenöst-gruppen (D).

Inom varje enskild grupp erhölls en markant ökning (P < 0.001) av duodenums

bikarbonatsekretion som svar på den kontinuerliga VIP-infusion.

I figur 2A visas att luminalt administrerad CFTRinh-172 inte hade någon effekt på den VIP-inducerade ökningen av HCO3-

- sekretionen. När vi istället administrerade CFTRinh-172 intravenöst (2B) noterades en förstärkt ökning av den VIP-inducerade alkaliniseringen, som var statistiskt

signifikant under de 30 första minuterna av VIP-infusionen. Nästan exakt samma resultat erhölls i DMSO vehikel-gruppen (2C), som också uppvisade en statistiskt signifikant ökning av sekretion, relativt VIP-gruppen, under de första 30 minuterna av VIP- infusionen. CFTRinh-172 iv-gruppen uppvisade således ingen tendens till avvikelse när den jämfördes med DMSO vehikel-gruppen (2D). Dessa data talar för att DMSO, och inte CFTRinh-172, förstärker

den VIP-inducerade ökningen av duodenums bikarbonatsekretion.

Figur 2 visar den luminala alkalinisationen i samtliga grupper (A-D) VIP infusionen har fortgått mellan 30 – 90 minuter i försöken.

(10)

Vätskeflux

Vi studerade även det absoluta nettovätskefluxet över duodenalslemhinnan d.v.s. skillnaden mellan

absorption och sekretion. Även här jämförde vi VIP- gruppen, kontrollgruppen, med samtliga andra grupper där vi utöver VIP har behandlat råttorna med CFTRinh- 172 luminalt (Figur 3A), intravenöst (Figur 3B) och DMSO intravenöst (Figur 3C). I figur 3D jämfördes DMSO vehikel-gruppen med CFTRinh-172 iv-gruppen.

I varje enskild grupp gav VIP upphov till en

signifikant ökning av vätskesekretionen (med P-värden

< 0.05 respektive P <0.01). Däremot fann vi ingen statistiskt signifikant skillnad i nettovätskeflux när grupperna jämfördes med varandra. En tendens till sänkt nettovätskeflux kunde dock ses i de djur som behandlats med CFTRinh-172 luminalt (3A) jämfört med kontrollgruppen.

Diskussion

I litteraturen finns flertalet in vivo studier, som visar att CFTRinh-172 är en välfungerande inhibitor av cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (Tuo et al. 2009b, Mizumori et al. 2008, Tuo, Wen and Seidler 2009a, Sonawane et al. 2005, Akiba et al. 2005, Ham et al. 2010). Syftet med denna studie var primärt att bekräfta den inhibitoriska effekten av CFTRinh-172 för att framgent kunna utröna CFTR-kanalens betydelse i regleringen av olika duodenala funktioner. I denna studie användes VIP, en normalt förekommande

Figur 3 visar medelvärdet av samtliga försöks nettovätskesekretion under VIP- infusionen, 30-90 minuter, i de studerade grupperna (A-D). Endast i A kan man notera en tendens till sänkt

nettovätskesekretion.

(11)

neuropeptid in enteriska nervsystemet, för att öka duodenums bikarbonat- och

vätskesekretion. Eftersom VIP stimulerar sekretionen via aktivering av CFTR förväntade vi oss att CFTRinh-172 skulle hämma både bikarbonat- och vätskesekretionen men resultaten visade att CFTRinh-172 i princip var verkningslöst.

Teorin bakom studien är att VIP stimulering, via ökning av intracellulärt cAMP i målcellerna, d.v.s. duodenocyterna ökar CFTR kanalens endosomtransport till apikalmembranet samt aktivering av densamma. Resultatet av detta torde bli en ökad bikarbonattransport uti lumen vilket skapar en elektrisk gradient för uttransport av Na+. Detta i sin tur ökar lumenlösningens osmolalitet vilket åstadkommer sekretion av vatten via enkel osmos. Slutresultatet blir således en ökad bikarbonat- och vätskesekretion. Denna effekt har tidigare noterats på handledarens laboratorium samt även i denna studie vilket således bekräftar tidigare publicerad data.

Effekten av VIP synes även vara reversibel då sekretionen återgår till kontrollnivå 20-30 minuter efter avslutad VIP-infusion. När substansen CFTRinh-172 tillförs försöksdjur skall man enligt teorin kunna notera en utebliven VIP effekt, eller åtminstone en minskad ökning av sekretionen, eftersom CFTR-kanalen hämmas. Den exakta verkningsmekanismen för denna inhibitor har ännu inte kartlagts. Studier talar dock för att substansen verkar direkt på CFTR (Caci et al. 2008) genom att kanalen stabiliseras i ett stängt läge och får således en förlängd stängd fas jämfört med öppen fas (Taddei et al. 2004).

Vid luminal tillförsel av CFTRinh-172 fann vi ingen skillnad mellan denna grupp och kontrollgruppen vad gäller den VIP-inducerade ökningen av vätske- och

bikarbonatsekretionen. Faktum är att ökningen av bikarbonatsekretionen i princip var identisk i CFTRinh-172 som i kontrollgruppen, vilket starkt talar för att CFTR-inhibitorn är

verkningslös. Vi kunde däremot se att den VIP-inducerade ökningen i vätskesekretionen tenderade till att bli lägre i närvaro av luminalt administrerad CFTRinh-172. Fler experiment krävs för att med säkerhet utröna huruvida CFTRinh-172 hämmar den VIP-inducerade vätskesekretionsökningen eller inte.

Paradoxallt sågs en klar tendens till förstärkt bikarbonatsekretion som svar på VIP när djuren förbehandlades med intravenös injektion av CFTRinh-172. Under de 30 första minuterna av VIP-infusionen erhölls en signifikant större ökning av bikarbonatsekretion i de CFTRinh-172 behandlade djuren än i kontrollgruppen. Dessa data styrker uppfattningen att CFTRinh-172 är en klen inhibitor av CFTR. Den förstärkta effekten av VIP på bikarbonatsekretionen sågs

(12)

också i de djur som behandlades med enbart DMSO vilket talar för att DMSO förstärker den VIP-inducerade ökningen av bikarbonatsekretion och att CFTRinh-172 återigen visade sig vara verkningslös.

Ett stort problem i denna studie har varit att CFTRinh-172 är extremt svårlöslig i vatten. I likhet med vad som gjorts i andra studier (Akiba et al. 2005, Ham et al. 2010, Mizumori et al.

2008, Mizumori, Akiba and Kaunitz 2009, Sonawane et al. 2005) var vi således tvungna att lösa inhibitorn i 100% DMSO . Till skillnad från ovan omnämnda studierna administrerades CFTR-inhibitorn intravenöst och dessutom i en högre koncentration (2 mg kg-1) än vad som testats tidigare. I denna studie gavs CFTRinh-172 även intraluminalt i en koncentration (10 µM) som i andra studier visats sig ha effekt. Vi har däremot inte kunnat påvisa den teoretiska och tidigare dokumenterade effekten av CFTRinh-172.

En tänkbar förklaringsmodell till den uteblivna effekten av CFTRinh-172 skulle vara att inhibitorn faller ut och kristalliseras när den kommer i kontakt med blodplasma.

Koncentrationen av substansen i blodplasma skulle således bli för låg för att kunna påverka målcellerna. Den luminala CFTRinh-172 lösningen verkar dock vara förhållandevis stabil vilket gör det osannolikt att den uteblivna effekten beror på att den faller ut i tarmlumen. Att substansen CFTRinh-172 skulle vara en icke fungerande inhibitor i in vivo studier kan då tänkas vara en alternativ förklaringsmodell.

Ytterligare en förklaringsmodell till resultaten skulle vara att VIP, utöver sin

väldokumenterade effekt på CFTR-kanalen, stimulerar en hittills okänd HCO3--kanal i duodenalepitelet. Antag vidare att CFTRinh-172 har en väsentligt sämre affinitet till denna HCO3-

-kanal än till den ”klassiska” CFTR. Då skulle, åtminstone i teorin, effekten av en fungerande CFTRinh-172 minska, alternativt utebli, på grund av denna okända kanals

uppreglering och kompensatoriska verkan på vätske- och/eller bikarbonatsekretionen. Det är dock rimligt att anta att om ett sådant förhållande verkligen existerade skulle CFTRinh-172 trots allt ge upphov till en viss sänkning av vätske- och/eller bikarbonatsekretionen i

jämförelse med kontrollgruppen. Av intresse i sammanhanget är att luminal administrering av CFTRinh-172 tenderade till att minska den VIP-inducerade vätskesekretionen. Däremot erhölls ingen skillnad vad gäller den VIP-inducerade ökningen av bikarbonatsekretionen. Det finns åtminstone två tänkbara förklaringar till detta. Metoden för mätning av vätskeflux är inte lika säker som den för bestämning av luminal alkalinisering vilket gör att spridning av

(13)

vätskefluxdata blir högre och osäkerheten därmed större. Fler experiment behöver således göras för att säkerställa huruvida CFTRinh-172 påverkar vätskeflux eller inte. Den andra förklaringen är att VIP aktiverar både CFTR och HCO3--kanalen, där aktivering av CFTR enbart leder till sekretion av NaCl medan aktivering av den hypotetiska HCO3-

-kanalen leder till ökad NaHCO3 sekretion. Om CFTRinh-172 bara påverkar CFTR skulle

bikarbonatsekretionen inte påverkas. I sammanhanget ska även noteras att DMSO verkar potentiera den VIP-inducerade ökningen av luminal alkalinisering. Vi har ingen förklaring till detta fenomen men DMSO kan fungera som en ”scavanger” av fria radikaler. Det är således möjligt att operationstraumat ökar bildningen av dessa radikaler vilket skulle kunna försämra affiniteten av VIP till sin receptor och/eller minska ökningen av intracellulära

signalsubstanser (exempelvis cAMP) och därmed ge upphov till sämre effekt av VIP på bikarbonatsekretionen.

Slutsats

I litteraturen beskrivs CFTRinh-172 som en välfungerande och effektiv inhibitor av CFTR- kanalen (Tuo et al. 2009b, Mizumori et al. 2008, Tuo et al. 2009a, Sonawane et al. 2005, Akiba et al. 2005, Ham et al. 2010). Vi har studerat effekten av CFTRinh-172 båda under luminal och intravenös administration och har funnit att substansen inte uppfyller sitt rykte om att vara en potent inhibitor av CFTR.

Dessa spridda uppfattningar om substansens verkan talar för att ytterligare forskning behövs på CFTRinh-172 för att få klarhet i dess egentliga effekter.

Ainsworth, M. A., L. Ladegaard, P. Svendsen, P. Cantor, O. Olsen & O. B. Schaffalitzky de Muckadell (1991) Pancreatic, hepatic, and duodenal mucosal bicarbonate secretion during infusion of secretin and cholecystokinin. Evidence of the

importance of hepatic bicarbonate in the neutralization of acid in the duodenum of anaesthetized pigs. Scand J Gastroenterol, 26, 1035-41.

Ainsworth, M. A., P. Svendsen, L. Ladegaard, P. Cantor, O. Olsen & O. B. Schaffalitzky de Muckadell (1992) Relative importance of pancreatic, hepatic, and mucosal bicarbonate in duodenal neutralization of acid in anaesthetized pigs. Scand J Gastroenterol, 27, 343-9.

(14)

Akiba, Y., M. Jung, S. Ouk & J. D. Kaunitz (2005) A novel small molecule CFTR

inhibitor attenuates HCO3- secretion and duodenal ulcer formation in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 289, G753-9.

Allen, A. & G. Flemström (2005) Gastroduodenal mucus bicarbonate barrier:

protection against acid and pepsin. Am J Physiol Cell Physiol, 288, C1-19.

Ameen, N. A., C. Marino & P. J. Salas (2003) cAMP-dependent exocytosis and vesicle traffic regulate CFTR and fluid transport in rat jejunum in vivo. Am J Physiol Cell Physiol, 284, C429-38.

Ameen, N. A., B. Martensson, L. Bourguinon, C. Marino, J. Isenberg & G. E.

McLaughlin (1999) CFTR channel insertion to the apical surface in rat duodenal villus epithelial cells is upregulated by VIP in vivo. J Cell Sci, 112 ( Pt 6), 887-94.

Boron, W. & E. Boulpaep. 2005. Medical physiology. Elsevier saunders.

Bradbury, N. A. (1999) Intracellular CFTR: localization and function. Physiol Rev, 79, S175-91.

Caci, E., A. Caputo, A. Hinzpeter, N. Arous, P. Fanen, N. Sonawane, A. S. Verkman, R.

Ravazzolo, O. Zegarra-Moran & L. J. Galietta (2008) Evidence for direct CFTR inhibition by CFTR(inh)-172 based on Arg347 mutagenesis. Biochem J, 413, 135- 42.

Clarke, L. L. & M. C. Harline (1998) Dual role of CFTR in cAMP-stimulated HCO3- secretion across murine duodenum. Am J Physiol, 274, G718-26.

Flemström, G., G. Jedstedt & O. Nylander (1985a) Effects of some opiates and vasoactive intestinal peptide (VIP) on duodenal surface epithelial bicarbonate secretion in the rat. Scand J Gastroenterol Suppl, 110, 49-53.

Flemström, G., O. Nylander, L. Fändriks, C. Jönsson & D. Delbro (1985b) Regulation of bicarbonate secretion by gastroduodenal mucosa. Gastroenterol Clin Biol, 9, 16-9.

Ham, M., M. Mizumori, C. Watanabe, J. H. Wang, T. Inoue, T. Nakano, P. H. Guth, E.

Engel, J. D. Kaunitz & Y. Akiba (2010) Endogenous luminal surface adenosine signaling regulates duodenal bicarbonate secretion in rats. J Pharmacol Exp Ther, 335, 607-13.

Hogan, D. L., D. L. Crombie, J. I. Isenberg, P. Svendsen, O. B. Schaffalitzky de Muckadell & M. A. Ainsworth (1997) Acid-stimulated duodenal bicarbonate secretion involves a CFTR-mediated transport pathway in mice.

Gastroenterology, 113, 533-41.

Hogan, D. L., R. C. Rapier, A. Dreilinger, M. A. Koss, P. M. Basuk, W. M. Weinstein, L.

M. Nyberg & J. I. Isenberg (1996) Duodenal bicarbonate secretion: eradication of Helicobacter pylori and duodenal structure and function in humans.

Gastroenterology, 110, 705-16.

Laburthe, M., P. Mangeat, G. Marchis-Mouren & G. Rosselin (1979) Activation of cyclic AMP-dependent protein kinases by vasoactive intestinal peptide (VIP) in isolated intestinal epithelial cells from rat. Life Sci, 25, 1931-7.

Mizumori, M., Y. Akiba & J. D. Kaunitz (2009) Lubiprostone stimulates duodenal bicarbonate secretion in rats. Dig Dis Sci, 54, 2063-9.

Mizumori, M., Y. Choi, P. H. Guth, E. Engel, J. D. Kaunitz & Y. Akiba (2008) CFTR inhibition augments NHE3 activity during luminal high CO2 exposure in rat duodenal mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 294, G1318-27.

Nylander, O., A. Hällgren & L. Holm (1993) Duodenal mucosal alkaline secretion, permeability, and blood flow. Am J Physiol, 265, G1029-38.

Ovesen, L., F. Bendtsen, U. Tage-Jensen, N. T. Pedersen, B. R. Gram & S. J. Rune (1986) Intraluminal pH in the stomach, duodenum, and proximal jejunum in

(15)

normal subjects and patients with exocrine pancreatic insufficiency.

Gastroenterology, 90, 958-62.

Pihl, L., M. Sjöblom, U. Seidler, J. Sedin & O. Nylander (2010) Motility-induced but not vasoactive intestinal peptide-induced increase in luminal alkalinization in rat duodenum is dependent on luminal Cl(-). Acta Physiol (Oxf), 200, 181-91.

Pratha, V. S., D. L. Hogan, B. A. Martensson, J. Bernard, R. Zhou & J. I. Isenberg (2000) Identification of transport abnormalities in duodenal mucosa and duodenal enterocytes from patients with cystic fibrosis. Gastroenterology, 118, 1051-60.

Riordan, J. R. (2005) Assembly of functional CFTR chloride channels. Annu Rev Physiol, 67, 701-18.

Sanmartín-Suárez, C., R. Soto-Otero, I. Sánchez-Sellero & E. Méndez-Álvarez (2011) Antioxidant properties of dimethyl sulfoxide and its viability as a solvent in the evaluation of neuroprotective antioxidants. J Pharmacol Toxicol Methods, 63, 209-15.

Sonawane, N. D., C. Muanprasat, R. Nagatani, Y. Song & A. S. Verkman (2005) In vivo pharmacology and antidiarrheal efficacy of a thiazolidinone CFTR inhibitor in rodents. J Pharm Sci, 94, 134-43.

Spiegel, S., M. Phillipper, H. Rossmann, B. Riederer, M. Gregor & U. Seidler (2003) Independence of apical Cl-/HCO3- exchange and anion conductance in duodenal HCO3- secretion. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 285, G887-97.

Strong, T. V., K. Boehm & F. S. Collins (1994) Localization of cystic fibrosis

transmembrane conductance regulator mRNA in the human gastrointestinal tract by in situ hybridization. J Clin Invest, 93, 347-54.

Taddei, A., C. Folli, O. Zegarra-Moran, P. Fanen, A. S. Verkman & L. J. Galietta (2004) Altered channel gating mechanism for CFTR inhibition by a high-affinity

thiazolidinone blocker. FEBS Lett, 558, 52-6.

Thiagarajah, J. R. & A. S. Verkman (2003) CFTR pharmacology and its role in intestinal fluid secretion. Curr Opin Pharmacol, 3, 594-9.

Tuo, B., G. Wen & U. Seidler (2009a) Differential activation of the HCO(3)(-)

conductance through the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator anion channel by genistein and forskolin in murine duodenum. Br J Pharmacol, 158, 1313-21.

Tuo, B., G. Wen, Y. Zhang, X. Liu, X. Wang & H. Dong (2009b) Involvement of

phosphatidylinositol 3-kinase in cAMP- and cGMP-induced duodenal epithelial CFTR activation in mice. Am J Physiol Cell Physiol, 297, C503-15.

References

Related documents

Det praktiska huvudbidraget med studien, sett till hur de anställda påverkas genom användandet av digital HR, är att organisationer i sin helhet skulle gynnas av att satsa

Engagemang och samskapande i symbios kan leda till samskapande av värde för samtliga inblandade aktörer. Studien ämnar att undersöka hur och varför företag

CFTR mutations and elevated sweat chlorides are common in infertile men with congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD). Aim: To address issues of importance for

age, 2) to find out if men with CBAVD, CFTR mutations and intermediate or elevated sweat chloride concentrations have evidence of early airway disease, 3) to analyze outcome of

Därefter skickades handlingen till Länsstyrelsen för att ta beslut om projektet kommer medföra betydande miljöpåverkan eller inte.. Deras bedömning är att projektet inte

Long-term treatment with the macrolide antibiotic azithromycin (AZM) improved clinical parameters and lung function in CF patients and increased Cl - transport in CF

Young adult patients with CF, who have regular physical exercise as part of the treatment, showed mainly muscular strength comparable to that of healthy control subjects, a

Material: Stor bägare, spatel, ättika eller vatten, stearinljus.. Riskbedömning: Ättika är en syra och därför frätande,