PLATELIA Candida Ag Plus 1 platta DETEKTION AV CANDIDA MANNAN-ANTIGEN I HUMANT SERUM ELLER PLASMA GENOM IMMUNOENZYMATISK ANALYS

(1)

1

PLATELIA™ Candida Ag Plus

1 platta – 96 62784

DETEKTION AV CANDIDA MANNAN-ANTIGEN I HUMANT SERUM ELLER PLASMA GENOM IMMUNOENZYMATISK ANALYS

881122 – 2013/11

1- AVSEDD ANVÄNDNING

Platelia™ Candida Ag Plus är en immunoenzymatisk mikroplattsanalys av sandwich-typ för detektion av Candida mannan- antigen i humant serum eller plasma.

2- INDIKATIONER FÖR ANVÄNDNING

En diagnos av invasiv candidainfektion måste baseras på en kombination av detektion av antikroppar och detektion av cirkulerande antigener.¹³

Platelia™ Candida Ag Plus (kat.nr 62784) är ett test som, när det används i kombination med Platelia™ Candida Ab Plus (kat.nr 62785), ger möjlighet att ställa en tidig diagnos¹¹ och förbättrar känsligheten i diagnosen, detta som en del av ett totalt diagnostiskt tillvägagångssätt som integrerar kliniska och mykologiska data samt utvärderar verkliga och iatrogena riskfaktorer.^{10, 13, 14} Kombinationen av test är också en väsentlig del av ett biokliniskt system för patientövervakning som underlättar beslut rörande behandling.⁸

3- KLINISK RELEVANS

Candida-infektioner är den vanligaste formen av nosokomiala svampinfektioner. Candidemier utgör den fjärde största orsaken för nosokomial sepsis.^{12, 15 16}

Kliniskt utgör invasiva Candida-infektioner de allvarligaste infektionerna med en dödlighet på mellan 30 och 70 % hos personer med nedsatt immunförsvar. Candida-infektioner är fortfarande svåra att diagnostisera på grund av den dåliga specificiteten i kliniska symtom och odlingarnas låga känslighet. Vanligtvis är det en kombination av data som leder till att diagnosen invasiv candidainfektion ställs och att lämplig behandling kan påbörjas.² I detta sammanhang måste diagnosen systemisk candidainfektion alltid innefatta serologiska samt direkta mykologiska metoder. Det verkar som om detektionen av cirkulerande antigener i serum eller plasma förbättrar Candida-infektionsdiagnosen hos patienter med risk för invasiv Candida-infektion.^{10, 13,}

14 De främsta riskfaktorerna innefattar neutropeni efter cellgiftsbehandling eller immunosuppressiv behandling (onkologi, onko- hematologi, transplantation),^{4, 10} behandling med bredspektrum antibiotika, närvaro av venkatetrar, parenteral nutrition, dialys, implantation av proteser (medicinsk och kirurgisk intensivvårdsavdelning).5, 13, 16

Mannan, en av flera Candida-antigener, är en polysackarid som är icke-kovalent bunden till jästsvampars cellvägg och utgör mer än 7 % av C. albicans torrvikt. Denna antigen verkar vara en av huvudmarkörerna för invasiv candidainfektion.

Regelbunden övervakning av patienter i riskzonen genom en kombination av detektion av mannan-antigenen och anti-mannan- antikroppar utgör ett stöd för diagnos av invasiv Candida-infektion.^{9, 10, 13}

4- TESTPRINCIP

Platelia™ Candida Ag Plus är en immunoenzymatisk mikroplattsanalys av sandwich-typ i ett steg, som används för detektion av mannan-antigen i humant serum eller plasma.

Analysen använder monoklonal (råtta) antikropp EBCA-1, riktad mot Candida  1-5 oligomannosider och har beskrivits i tidigare studier.^{13, 14} Den monoklonala antikroppen EBCA-1 används för att:

 belägga mikroplattans brunnar och binda mannan-antigenen,

 detektera antigenen som är bunden till den sensibiliserade mikroplattan (konjugatreagens: peroxidasmärkt monoklonal antikropp).

Serum- eller plasmaprover värms upp tillsammans med EDTA för att dissociera immunkomplexen och fälla ut serumproteiner som kan störa testet.

De behandlade serum- eller plasmaproverna och konjugatet tillsätts i brunnarna som är belagda med monoklonal antikropp.

Efter inkubering vid 37 °C tvättas remsorna för att avlägsna allt obundet material. Om cirkulerande manna-antigen finns i det humana provet bildas ett komplex: anti-mannan MAb – mannan-Ag – anti-mannan MAb/peroxidas.

Tillsatsen av kromogent substrat som innehåller peroxidas och inkubering i rumstemperatur påvisar de eventuellt bildade komplexen bundna till mikroplattans brunn.

Den enzymatiska reaktionen stoppas när 1-N svavelsyra tillsätts.

Absorbansen (optisk densitet) i prover från människa och kalibrator fastställs med en spektrofotometer som är inställd på våglängden 450/620 nm.

(2)

2 5- REAGENSER

Reagenserna räcker till 96 test i högst 9 satser.

Se instruktionerna som anges på lådan för att ta reda på förvaringsförhållanden och utgångsdatum för reagenserna.

Låt alla reagenser uppnå rumstemperatur (+18-30 °C) före användning. Förvara reagenserna vid +2-8 °C igen direkt efter användningen. Lägg tillbaka alla oanvända remsor/plattor i påsen och förslut den väl. Ta inte bort torkmedlet.

Komponent Innehåll Mängd

R1 Microplate Mikrobrunnsremsplatta:

- 96 brunnar (12 remsor med 8 brunnar var) belagda med EBCA- 1 anti-mannan monoklonal antikropp

1

R2 Concentrated Washing Solution (20x)

Koncentrerad tvättlösning (20 x):

- Tris-NaCl-buffert (pH 7,4) - 2%Tween^® 20

- Konserveringsmedel: 0,04% ProClin™300

1 x 70 ml

R3 Calibrator 0

Kalibrator 0 pg/ml (färdig att använda):

- Tris-NaCl-Trehalos-buffert, innehåller ingen renad Candida albicans mannan

1 x 2,0 ml

R4a Calibrator 62.5

Kalibrator 62,5 pg/ml (färdig att använda):

- Tris-NaCl-Trehalos-buffert - Renad Candida albicans mannan

1 x 2,0 ml

R4b Calibrator 125

1 x 2,0 ml

R4c Calibrator 250

1 x 2,0 ml

R4d Calibrator 500

1 x 2,0 ml

R0 Negative Control

Negativ kontroll

- Humant serum negativt för mannan - Konserveringsmedel: 0,3 % ProClin™ 300

2 x 1,5 ml

R5 Positive Control Positivt kontrollserum:

- Humant serum som innehåller mannan - Konserveringsmedel: 0,15% ProClin™300

2 x 1,5 ml

R6 Conjugate

Konjugat (färdig att använda):

- Anti-mannan monoklonal antikropp/peroxidasmärkt - Bromokresolrött

1 x 17 ml

R7 Sample Treatment Solution

Provbehandlingslösning (färdig att använda):

- EDTA-syralösning, utan konserveringsmedel 1 x 10,5 ml

R9 Chromogen TMB Kromogen TMB-lösning (färdig att använda):

- Lösning av 3,3’,5,5’-tetrametylbensidin (< 0,1%), H2O2 (<1,0%) 1 x 28 ml

R10 Stopping Solution Stopplösning (färdig att använda):

- 1 N svavelsyra 1 x 28 ml

(3)

3 6- VARNINGAR VID ANVÄNDNING

1. Endast för in vitro-diagnostisk användning.

2. Endast för professionellt bruk.

3. Vi rekommenderar inte att detta testkit används för andra prover än humant serum eller plasma.

4. R0 negativt kontrollserum och R5 positivt kontrollserum har preparerats med har preparerats med humant serum som har testats med CE-märkta test och befunnits vara negativt för anti-HIV-1-, anti-HIV-2- och anti-HCV-antikroppar samt HBs- antigen. Trots detta ska alla reagenserna hanteras som potentiellt smittsamma. Alla tester ska utföras med de försiktighetsåtgärder som rekommenderas enligt OSHA-normen för blodburna patogener, biosäkerhetsnivå 2 eller i enlighet med andra lämpliga biosäkerhetsmetoder.

5. Använd skyddskläder inklusive labbrock, ögon- och ansiktsskydd och engångshandskar (handskar i syntetiskt material utan latex rekommenderas) och hantera reagenserna och patientproverna i enlighet med god laboratoriesed (GLP). Tvätta händerna noggrant efter ett test.

6. Pipettera inte med munnen.

7. Rök, drick och ät inte i områden där prover eller reagenser hanteras.

8. Undvik stänk från prover och lösningar.

9. Biologiskt spill som inte innehåller syra ska torkas upp noggrant med ett effektivt desinfektionsmedel. Desinfektionsmedel som kan användas är (men är inte begränsade till) en lösning av 10 % blekmedel (0,5 % lösning natriumhypoklorit), 70 % etanol eller 0,5 % Wescodyne Plus™. Material som används för att torka upp spill kan behöva hanteras som miljöfarligt avfall.

VARNING: Placera inte lösningar som innehåller blekmedel i autoklaven.

10. Spill som innehåller syra ska absorberas (torkas upp) eller neutraliseras med natriumbikarbonat och området bör sköljas och torkas. I de fall där spillet innehåller miljöfarliga material bör området tvättas med ett kemiskt desinfektionsmedel.

11. Kassera alla prover och allt material som använts i testet som potentiellt smittsamma. Kemiskt och miljöfarligt avfall ska hanteras enligt alla gällande regler för avfallshantering.

12. Mer information om risk- och försiktighetsinformation för vissa kemiska komponenter i testkitet hittar du på etiketterna och i den information som finns sist i bruksanvisningen. Säkerhetsdatabladet (SDS) finns tillgängligt på www.bio-rad.com.

7- FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER VID ANVÄNDNING

1. FRYSTA SERUM- ELLER PLASMAPROVER SOM FÖRVARAS UNDER OKÄNDA FÖRHÅLLANDEN KAN GE FELAKTIGT POSITIVA RESULTAT PÅ GRUND AV ATT DE SMITTATS MED SVAMP OCH/ELLER BAKTERIER.

2. Använd inte testet eller någon av reagenserna efter sista förbrukningsdatum.

3. Reagenser från testkit med olika satsnummer får inte blandas, med undantag för tvättlösningen (R2, märkning* 20x grönfärgad), kromogen (R9, märkning* TMB turkosfärgad) och stopplösningen (R10, märkning* 1 N rödfärgad), under förutsättning att reagenserna som används är helt likvärdiga och kommer från en och samma sats inom en bestämd serie.

OBS: Tvättlösningen (R2, märkning* 20x grönfärgad), kromogen (R9, märkning* TMB turkosfärgad) och stopplösningen (R10, märkning* 1 N rödfärgad), under förutsättning att reagenserna som används är helt likvärdiga och kommer från en och samma sats inom en bestämd serie.

OBS: Tvättlösning (R2, märkning* 20x grönfärgad) får inte blandas med tvättlösning (R2, märkning* 10x blåfärgad) från Bio-Rads reagenskit.

* på flaskans etikett

4. Se till att alla reagenser har rumstemperatur (+18-30 °C) i minst 30 minuter före användning.

5. Använd helst engångsmaterial. Då detta inte är möjligt, använd glasvaror som är ordentligt tvättade och sköljda med destillerat vatten.

6. Kontrollera noggrannheten för pipetterna och all annan utrustning, samt att all utrustning fungerar korrekt.

7. Rekonstituera eller späd reagensen R2 noggrant för att undvika kontaminering.

8. Den enzymatiska reaktionen är mycket känslig för metaller och metalljoner. Ingen metall får komma i kontakt med konjugat- eller substratlösningen.

9. Använd separata pipettspetsar vid pipettering av kalibratorer, kontroller och patientprover för att undvika kontaminering.

10. Följ det rekommenderade antalet tvättcykler och se till att alla brunnar är helt fyllda och därefter helt tömda för att brunnarna ska vara tvättade på rätt sätt. Tvättningen måste utföras med en mikroplattstvättanordning.

11. Se till att mikroplattan inte hinner torka efter tvättproceduren innan reagenser har hällts i.

(4)

4 12. Använd inte samma behållare för konjugat- och framkallningslösning.

13. Undvik att utsätta kromogen TMB-lösning för starkt ljus vid förvaring och inkubation. Låt inte kromogenlösningen komma i kontakt med oxiderande medel.

14. Kromogenlösningen (R9) måste vara färglös. Om lösningen blir blå tyder det på att reagensen inte kan användas utan måste kastas.

15. Undvik all kontakt mellan stopplösningen och oxiderande medel, metall eller metalljoner.

16. Häll inte tillbaka oanvänt konjugat i originalbehållaren.

8- BEREDNING OCH FÖRVARING AV REAGENS Mikrobrunnsremsplatta (R1)

Varje platthållare innehållande 12 remsor är förpackad i en påse. Klipp upp påsen under förseglingen med en sax. Öppna påsen och ta ut platthållaren. Lägg tillbaka platthållaren med oanvända remsor i originalförpackningen. Återslut påsen ordentligt och förvara vid +2-8 °C.

När den vakuumförpackade påsen har öppnats är mikrobrunnsremsorna hållbara i 8 veckor vid förvaring i +2-8 °C i den tätt förslutna originalpåsen i närvaro av torkmedel.

Tvättlösning (R2)

Bered arbetstvättlösning genom att späda den koncentrerade tvättlösningen 20 gånger med destillerat vatten: 50 ml R2 i 950 ml destillerat vatten.

(Använd 400 ml av arbetstvättlösning för en hel platta med 12 remsor, icke räknat dödvolymen för utrustningen som används).

Efter spädning kan arbetstvättlösningen förvaras i 14 dagar vid +2-30 °C.

När den koncentrerade tvättlösningen har öppnats och förvaras vid +2-30 °C är den hållbar till det sista förbrukningsdatumet på etiketten, om den inte kontamineras.

Kalibrator 0 (R3), Kalibrator 62,5 (R4a), Kalibrator 125 (R4b), Kalibrator 250 (R4c), Kalibrator 500 (R4d):

Kalibratorerna är färdiga för användning.

Efter att de har öppnats är dessa reagenser hållbara i 8 veckor, om de förvaras i +2-8 °C utan att kontamineras.

Negativt kontrollserum (R0), Positivt kontrollserum (R5):

Det negativa kontrollserumet (R0) och det positiva kontrollserumet måste, liksom patientprover, värmebehandlas med EDTA- syralösning (R7) för att på så sätt också vara en kontroll av den behandlingen.

Efter att den har öppnats är reagenserna hållbara i 8 veckor, om de förvaras i +2-8 °C utan att kontamineras.

Konjugat (R6), Provbehandlingslösning (R7), Kromogen TMB-lösning (R9):

Dessa reagenser är färdiga för användning.

Efter att de har öppnats är dessa reagenser hållbara i 8 veckor, om de förvaras i +2-8 °C utan att kontamineras.

Stopplösning (R10):

Denna reagens är färdig för användning.

Efter att den har öppnats är denna reagens hållbar till det sista förbrukningsdatumet på etiketten, om den inte kontamineras.

9- PROVER

1. Testen utförs på prover av serum eller plasma insamlade med antikoagulantia såsom EDTA, heparin eller citrat.

2. Följ följande riktlinjer för värmebehandling, bearbetning och lagring av blodprov:

- Ta blodprov enligt gällande laboratorierutiner.

- Tillåt serumprover att koagulera fullständigt innan centrifugering.

- Se till att rören alltid är stängda.

- Separera serumet eller plasman efter centrifugering och förvara i ett slutet provrör.

- Proverna kan förvaras vid +2-8 °C om testet utförs inom 5 dagar.

- Om testet inte utförs inom 5 dagar ska proverna frysas vid -20 °C (eller -80 °C).

- Serum- och plasmaprover kan frysas/tinas maximalt 5 gånger. Proverna ska blandas ordentligt efter upptining och innan testet utförs.

3. Resultaten påverkas inte av prover som innehåller 60 g/l humant albumin eller 120 g/l totala proteiner eller 200 mg/l okonjugerad bilirubin eller 200 mg/l konjugerad bilirubin, lipemiska prover som innehåller motsvarande 30 g/l triolein (triglycerid) eller 5 g/l kolesterol eller hemolyserade prover som innehåller 2 g/l hemoglobin.

4. Värm inte på proverna.

(5)

5 10- METOD

Material som ingår Se avsnittet REAGENSER.

Nödvändigt men ej bifogat material

1. Sterilt destillerat eller avjoniserat vatten för spädning av koncentrerad tvättlösning.

2. Absorberande papper.

3. Engångshandskar.

4. Skyddsglasögon.

5. Natriumhypoklorit (blekmedel) och natriumbikarbonat.

6. Automatiska eller halvautomatiska, justerbara eller förinställda, pipetter eller multipipetter för mätning och fördelning av 10 μl till 1 000 μl samt 1 ml, 2 ml och 10 ml.

7. 1,5 ml polypropen-mikrocentrifugrör med lufttäta lock som tål värme upp till 120 °C (värmeblock) eller 100 °C (kokande vattenbad):

 Rör med skruvlock: 1,5 ml koniska rör, Bio-Rad kat.nr 224-0010 eller motsvarande.

ELLER

 Rör med snäpplock: EZ-mikroprovrör, 1,5 ml, Bio-Rad kat.nr 223-9480 eller motsvarande.

8. Lockspärrar till mikrorör (VWR kat.nr 6054001 eller motsvarande). Dessa spärrar försluter rör med snäpplock säkert så att locken inte öppnas vid temperatur- och tryckändringar. Ett litet handtag gör att rören enkelt kan lyftas ur värmeblock eller kokande vattenbad utan risk för brännskador.

9. Laboratoriebänkcentrifug för 1,5 ml polypropenrör som kan nå 10 000 g.

10. Om värmeblock används för att behandla serumprover:

 Värmeblock. Följande värmeblocksmodeller rekommenderas:

- Blockmodell 1: Grant kat.nr QBD1 (VWR kat.nr 460-0074) - Blockmodell 2: Grant kat.nr QBD2 (VWR kat.nr 460-0076)

 Block för värmeblock. Båda värmeblocken (QBD1 och QBD2) måste användas med Grant-block kat.nr QB-E1 (VWR- kat.nr 460-8517).

Om ett kokande vattenbad används för behandling av serumprover:

 Flytande mikrocentrifugrack

 Kokande vattenbad termostatiskt inställbar på 100 °C 11. Graderade provrör för 25 ml, 50 ml, 100 ml och 1 000 ml.

12. Behållare för miljöfarligt avfall.

13. Vortexblandare.

14. Mikroplattsinkubator termostatiskt inställbar på 37 ± 1 °C.

15. Automatisk eller halvautomatisk tvättanordning för mikroplattor(*).

16. Avläsare för mikroplattor med 450 nm och 620 nm filter(*).

(*) Kontakta oss för detaljerad information om utrustning som rekommenderats av vår tekniska tjänst.

Behandling av prover

Det negativa kontrollserumet (R0) och det positiva kontrollerserumet (R5) måste behandlas samtidigt med alla patientproverna genom att tillsätta 100 μl provbehandlingslösning (R7). Kalibratorlösningarna R3, R4a, R4b, R4c och R4d, som är färdiga för användning, behöver inte genomgå denna behandling.

1. Pipettera 300 µl av varje prov, av det negativa kontrollserumet (R0) och det positiva kontrollserumet (R5) i separata 1,5 ml polypropenrör.

2. Tillsätt 100 µl provbehandlingslösning (R7) i varje rör.

3. Blanda rören noga genom att skaka kraftigt eller genom att använda vortexapparat. Förslut röret noga för att förhindra att det öppnas då det värms. Gör inte hål i locket.

4. Värmeblock:

Värm rören i 6 minuter i ett värmeblock vid 120 °C. Rören måste placeras i blocket först när den angivna temperaturen har nåtts.(*)

ELLER Vattenbad:

Om kokande vattenbad används: Värm rören i 3 minuter vid 100 ºC. (*)

5. Ta försiktigt ut de heta rören från värmeblocket eller vattenbadet och placera dem i en centrifug. Centrifugera rören vid 10 000 g i 10 minuter.

6. Supernatanten används för detektion av mannan-antigen. Testa supernatanterna med följande metod. När serumet eller plasman har värmebehandlats måste testet utföras inom två timmar.

(*) Det är viktigt att följa den föreskrivna temperaturen och tiden samt att använda de rekommenderade materialen för att testet ska lyckas. Förlita dig inte på temperaturen som utrustningen visar, utan kontrollera att temperaturen följer specifikationerna genom att använda en kalibrerad termometer som sätts in i ett rör med mineralolja: 120 °C måste uppnås i röret i ett värmeblock och 100 °C i ett kokande vattenbad.

(6)

6 OBSERVERA!

 Alla prover som behandlas enligt detta förfarande kan användas för att utföra Platelia™ Aspergillus EIA-testet, eftersom provbehandlingsmetoderna är identiska för de två testen.

 Förvara inte prover (negativ kontroll, positiv kontroll eller prov) efter värmebehandling.

EIA-metod

Följ anvisningarna noga.

Tillämpa god laboratoriesed.

 Se till att alla reagenser har rumstemperatur (18-30 °C) i minst 30 minuter före användning.

 Använd alla kalibratorer samt det negativa och positiva kontrollserumet vid varje serie för att validera testresultatet.

Gör på följande sätt:

1. Förbered ett diagram för identifiering av kalibratorer, negativ kontroll, positiv kontroll och prover enligt följande schema:

- A1: Positivt kontrollserum R5 (supernatant från behandlat kontrollserum) - B1: Kalibrator 500 pg/ml (R4d)

- C1: Kalibrator 250 pg/ml (R4c) - D1: Kalibrator 125 pg/ml (R4b) - E1: Kalibrator 62,5 pg/ml (R4a) - F1: Kalibrator 0 pg/ml (R3)

- G1: Negativ kontroll R0 (supernatant från det behandlade provet)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A R5 S2 S10

B R4d S3 S11

C R4c S4

D R4b S5

E R4a S6

F R3 S7

G R0 S8

H S1 S9

2. Ta ut platthållaren och mikrobrunnsremsorna (R1) ur påsen. Lägg tillbaka remsor som inte ska användas i påsen med torkmedel och förslut påsen väl.

3. Pipettera 100 μl supernatant från det behandlade provet och från de behandlade kontrollserumen R0 och R5 i de respektive brunnarna.

4. Pipettera sedan 100 μl av R4d, R4c, R4b, R4a och R3 enligt plattschemat.

OBS: Tillsättningen av kalibratorlösningarna kan i detta skede kontrolleras eftersom det uppstår en färg-gradient från orange (R4d) till ljusgul (R3).

5. Blanda innehållet i rör R6 genom att vända det flera gånger före användning.

Vid användning av en flerkanalspipett, sug enbart upp den volym som krävs för serien, 2,5 ml för två remsor med 8 brunnar.

6. Tillsätt 100 μl konjugatlösning (R6) i varje brunn.

7. Täck mikroplattan med självhäftande folie. Se till att hela ytan är täckt och vattentät.

8. Inkubera omedelbart mikroplattan i en torr mikroplattsinkubator i 90 ± 10 minuter vid 37 °C (±1 °C).

9. Bered arbetstvättlösningen (se avsnitt 8).

10. Ta bort den självhäftande folien. Aspirera innehållet i alla brunnar i en avfallsbehållare för miljöfarligt avfall (som innehåller natriumhypoklorit). Tvätta plattan 5 gånger med en mikroplattstvättanordning (använd 800 µl arbetstvättlösning). Efter den sista tvättningen ska mikroplattan vändas upp och ner och slås med lätta slag mot det absorberande papperet för att få bort resterande vätska.

11. Tillsätt snabbt 200 µl kromogenlösning (R9) i varje brunn, undvik starkt ljus.

12. Inkubera mikroplattan i mörker vid +19-25 °C i 30 ± 5 minuter.

Använd inte självhäftande folie i detta inkuberingssteg.

13. Tillsätt 100 µI stopplösning (R10) i varje brunn. Använd samma ordningsföljd och samma fördelningshastighet för fördelning som för kromogenlösningen. Blanda väl.

14. Torka noga av botten på varje platta.

15. Läs av den optiska densiteten i varje brunn vid 450 nm (referensfilter med 620 nm).

Mikroplattorna måste läsas av inom 30 minuter efter att stopplösning tillsatts (remsorna måste alltid förvaras skyddade för ljus före avläsning).

16. Se till att det finns en korrelation mellan avläsningen och plattschemat innan resultaten noteras.

(7)

7 11- KVALITETSKONTROLL (VALIDERINGSKRITERIER)

Använd kalibratorerna och kontrollerna på varje mikroplatta i varje test. Följande kriterier måste uppfyllas för att validera testproceduren:

Värde för optisk densitet:

OD R4a > 0,280 OD R0 < OD R4a Kvoter:

OD R4a/OD R3 > 1,25 OD R4b/OD R4a > 1,15 OD R4c/OD R4b > 1,15 OD R4d/OD R4c > 1,20

Mannan-koncentration i det positiva kontrollserumet R5:

R5-koncentration måste vara lika med koncentrationen som indikeras på flaskan ± 30 %.

12- UTVÄRDERING AV RESULTATEN Fastställande av kalibreringskurvan

Kalibreringskurvan ritas med 5 intervallpunkter (kalibratorer) 0 pg/ml, 62,5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml och 500 pg/ml.

Rita kalibreringskurvan [OD = funktion (pg/ml)] genom att på den vertikala axeln (Y-axeln) markera OD från kalibratorerna R3, R4a, R4b, R4c och R4d och sedan markera på den horisontella axeln (x-axeln) deras respektive koncentration i pg/ml.

Försök att uppnå en kurva som sammanbinder de olika intervallpunkterna.

Bestämning av mannan-koncentrationen (pg/ml) i testproverna

Kalibreringskurvan kan användas för att bestämma koncentrationen av mannan-antigen, uttryckt i pg/ml, för varje testprov.

Utvärdering av resultaten

 Prover med en mannan-koncentration som är mindre än 62,5 pg/ml (C < 62,5) betraktas som "negativa" med avseende på förekomst av mannan-antigen.

 Prover med en mannan-koncentration mellan 62,5 och 125 pg/ml (62,5  C < 125) betraktas som "medelhöga" med avseende på förekomst av mannan-antigen.

 Prover med en mannan-koncentration som är högre än eller lika med 125 pg/ml (C ≥ 125) betraktas som "positiva" med avseende på förekomst av mannan-antigen.

 Intervallpunkterna som används för att rita kalibreringskurvan medger ingen exakt bestämning av koncentrationer som är högre än 500 pg/ml.

För att få mer exakt bestämning av koncentrationen i starkt positiva prov måste testet göras en gång till när supernatanten av det behandlade provet (ny behandling) har spätts till 1:5 med den utspädda arbetstvättlösningen (R2) (se avsnitt 8).

Koncentrationen i det starkt positiva provet räknas ut genom att multiplicera den erhållna titern med 5.

Ett ”medelhögt” resultat kan bekräftas på ett nytt patientprov som tas inom några få veckor efter det prov som gett upphov till den medelhöga koncentrationen.

13- TESTETS BEGRÄNSNINGAR

1. Ett negativt test kan inte utesluta diagnosen invasiv candidainfektion på grund av den väldigt låga koncentrationen och den snabba elimineringen av mannan under infektion.

Diagnosen invasiv candidainfektion kan endast ställas efter att hänsyn har tagits till kliniska, terapeutiska, radiologiska, cytologiska, direkt mykologiska och serologiska argument, där varje enskild komponent bör tolkas med försiktighet.

2. Ett negativt mannan-antigentest måste även utvärderas mot bakgrund av resultaten av anti-mannan-antikroppstester. Även om invasiv candidainfektion finns är antigenen svårare att upptäcka hos patienter som testats positiva för anti-mannan- antikroppar (se avsnitt 15- Prestanda).

3. Detektionsprestandan av mannan-antigen i serum eller plasma beror på hur många test som utförts på patienten.

Regelbunden övervakning av högriskpatienter och screening med avseende på anti-mannan-antikroppar rekommenderas för att öka testets känslighet och för att nå en tidig positiv reaktion.

4. Proceduren för Platelia™ Candida Ag Plus och utvärderingen av resultaten måste följas när prover analyseras med avseende på förekomst av mannan-antigen. Användaren av detta test rekommenderas att läsa den medföljande instruktionen noga innan testet genomförs. Testanvisningarna måste följas mycket noga, i synnerhet när det gäller pipettering av prover och reagenser, tvättning av plattor och tider vid inkubation.

5. Om anvisningarna inte följs vid tillsättning av prover eller reagenser kan det resultera i ett falskt negativt testresultat.

Upprepad testning av ytterligare prover bör övervägas om det finns klinisk misstanke om invasiv candidainfektion eller misstanke om felaktig testning.

(8)

8 6. Kontaminering av negativa patientprovbrunnar från brunnar med positiv kontroll, kalibratorer eller patientprover är möjlig om innehållet i en brunn kommer över till en annan på grund av oförsiktig hantering av mikroplattan eller dålig pipetteringsteknik när reagenser tillsätts.

7. Prestandan av Platelia™ Candida Ag Plus har inte utvärderats på serum- eller plasmaprover från neonatala eller pediatriska patienter.

8. Prestandan av Platelia™ Candida Ag Plus har inte utvärderats för en manuell avläsning och/eller visuell bestämning av resultaten.

9. En korsreaktion har observerats hos patienter som fick en infusion med vissa satser av plasmaexpanderare med hydroxyetylstärkelse (till exempel Hesteril® 6 %), som används vid behandling av blodcirkulationsproblem; hypovolemi, hemorragisk chock och septisk chock.

10. Falskt positiva resultat har observerats när proverna innehållit halter av humant gammaglobulin ≥ 60 g/l samt för vissa prover som testats reaktiva för antikroppar mot anti-toxoplasma.

14- FÖRVÄNTADE VÄRDEN

Prevalensen av Candida mannan-antigenen mätt med testet Platelia™ Candida Ag Plus har utvärderats på en panel av 613 prover från 51 holländska patienter (Plats 1 – Nederländerna) som lagts in på sjukhus för intensiv cellgiftsbehandling av cancer (hematologiska maligniteter hos 49 patienter och icke-hematologisk cancer hos 2 patienter).

Utav 613 prover var 88 positiva och 51 medelhöga, dvs. en prevalens på 88/613 = 14,4 % [KI 95 %: 11,7-17,4 %] om de medelhöga resultaten anses negativa, och 139/613 = 22,7 % [KI 95 %: 19,4-26,2 %] om de medelhöga resultaten anses positiva. Avseende patienterna, utav 51 testade, har 23 påvisat minst ett positivt prov och 14 påvisat minst ett medelhögt prov utan något positivt prov, dvs. en prevalens på 23/51 = 45,1 % [KI 95 %: 31,1-59,7 %] om de medelhöga resultaten betraktas som negativa och 37/51 = 72,6 % [KI 95 %: 58,3-84,1 %] om de medelhöga resultaten betraktas som positiva.

Utav dessa 51 patienter, har 30 (388 prover) inte påvisat någon dokumenterad invasiv candidainfektion. Utav dessa har 20 koloniserats av jäst (12 av Candida albicans, 7 av Candida albicans förenad med en annan art av Candida och 1 koloniserad av åtminstone en art av Candida non albicans).

Fyra av dessa patienter uppvisade kliniska symtom och en ytlig candidainfektion som påvisades mikrobiologiskt. Allvarliga slemhinneskador sågs hos 24 av patienterna.

Av de 388 proverna har 41 visat sig vara positiva och 43 medelhöga, dvs. en prevalens på 41/388 = 10,6 % [KI 95 %: 7,7-14,1

%] om de medelhöga resultaten anses negativa och 84/388 = 21,7 % [KI 95 %: 17,7-26,1%] om de medelhöga resultaten anses positiva. Med avseende på patienterna, utav 30 test, har 10 innehållit minst ett positivt prov och 11 innehållit minst ett medelhögt men utan något positivt, dvs. en prevalens på 10/30 = 33,3 % [KI 95 %: 17,3-52,8 %] om de medelhöga resultaten betraktas som negativa och 21/30 = 70,0 % [KI 95 %: 50,6-85,3 %] om de medelhöga resultaten betraktas som positiva.

15- PRESTANDA

A. Reproducerbarhetsstudier

 Variabilitet inom testet (repeterbarhet):

För att utvärdera repeterbarheten inom testet, har 5 prover (två negativa och tre positiva) testats 32 gånger i en och samma serie. Koncentrationen i pg/ml bestämdes för varje prov. Medelkoncentrationen, standardavvikelsen (SD) och variationskoefficienten (CV%) för varje prov anges i tabellen nedan:

Variabilitet inom testet (repeterbarhet)

N=32 Negativt prov Mycket negativt prov

Svagt positivt prov

Medelhögt positivt prov

Mycket positivt prov Medelkoncentrationer

(pg/ml) 25,1 54,8 63,7 154,1 261,8

SD 4,11 5,20 4,27 8,01 16,93

CV% 16,3% 9,5% 6,7% 5,2% 6,5%

 Variabilitet mellan tester (reproducerbarhet):

För att utvärdera reproducerbarheten mellan tester har fem prover (två negativa och tre positiva) testats två gånger var, i två serier per dag, under en period av totalt 20 dagar. Koncentrationen i pg/ml har bestämts för varje prov.

Medelkoncentrationen, standardavvikelsen (SD) och variationskoefficienten (CV%) för varje prov anges i tabellen nedan:

(9)

9 Variabilitet mellan tester (reproducerbarhet):

N=80 Negativt prov Mycket negativt prov

Svagt positivt prov

Medelhögt positivt prov

Mycket positivt prov Medelkoncentrationer

(pg/ml) 24,1 55,0 70,0 161,6 264,9

SD 6,99 11,47 14,50 30,07 38,62

CV% 29,0% 20,8% 20,7% 18,6% 14,6%

B. Korsreaktioner

Patologi Antal testade prover Antal positiva resultat

Antal medelhöga resultat

Aspergillus 10 0 1

Anti-ds DNA-antikroppar 10 0 0

Positiva ANA 10 0 0

Myelom IgG och IgM 20 0 1

Anti-Toxoplasma IgG 10 3 1

Humana anti-mus-antikroppar 10 0 0

Reumatoid faktor 10 0 0

C. Linearitet

Lineariteten av testet Platelia™ Candida Ag Plus har upprättats mellan 20 och 470 pg/ml från spädningsundersökningar som gjorts på 4 positiva prov.

D. Kliniska studier

Prestandan av testet Platelia™ Candida Ag Plus har utvärderats på 3 platser med totalt 852 prover från 505 patienter.

KÄNSLIGHET

Känsligheten för testet Platelia™ Candida Ag Plus har utvärderats på en panel av 436 prover från 89 patienter från 2 sjukhus i Nederländerna och i Frankrike. Fördelningen av proverna är den följande:

 Plats 1 (Nederländerna): 225 prover från 21 holländska patienter inlagda på en onko-hematologisk avdelning för intensiv cellgiftsbehandling av hematologiska maligniteter (19 fall) eller icke-hematologisk cancer (2 fall) eventuellt följt av transplantation av hematopoetiska stamceller. Alla patienterna hade en invasiv candidainfektion som påvisades mikrobiologiskt med minst en positiv odling med avseende på Candida (blododling eller odling av vanligtvis sterilt vävnadsprov).¹⁷

 Plats 2 (Frankrike): 211 prover från 68 franska patienter inlagda på olika intensivvårdsavdelningar eller onko-hematologiska avdelningar och med invasiv candidainfektion som påvisats mikrobiologiskt med minst en positiv odling med avseende på Candida spp.

OBS: Panelerna med prover som använts för dessa två studier kom från patienter vars blodprov tagits mellan 1999 och 2007. Den relativa stabiliteten av mannan-antigenen och anti-mannan-antikroppen i dessa prov under frystiden, samt efter varje frysning/upptining, gör att de presenterade resultaten är beroende av konserveringstillståndet av den testade panelen. Känslighetsvärdena som bestämts inom ramen för retrospektiva kliniska studier kan därför vara lägre än de som uppnåtts vid prospektiva kliniska studier som utförts på nyligen tagna prover.

Resultat från Plats 1

De 21 nederländska patienterna var inlagda på sjukhus för intensiv cellgiftsbehandling av hematologiska maligniteter (akut myeloisk leukemi, akut lymfatisk leukemi, kronisk lymfatisk leukemi, myelom, myelodysplastiskt syndrom, aplastisk anemi, eller non-Hodgkins lymfom) eller icke-hematologisk cancer, eventuellt följt av transplantation av hematopoetiska stamceller.¹⁷

Dessa 21 patienter utvecklade en invasiv candidainfektion som kunde påvisas mikrobiologiskt med minst en positiv odling av Candida spp. (blododling eller odling av vanligtvis sterilt vävnadsprov). Statusen för dessa patienter, avseende närvaron av den specifika Candida mannan-antigenen, som detekteras med testet Platelia™ Candida Ag Plus, anses som positivt när minst ett av patientproverna är positivt.

I avsaknad av positivt prov anses statusen vara medelhög om minst ett patientprov är medelhögt, eller negativ om alla patientproven är negativa.¹⁷

(10)

10 Patientkategori

Resultat från Platelia™ Candida Ag Plus Antal patienter (antal prover) Känslighet

(medelhöga resultat anses

negativa)

Känslighet (medelhöga resultat anses

positiva) Positiv Medelhö

g Negativ 21 patienter (225 prover) som visar minst en positiv

odling av Candida spp. 13 (47) 3 (8) 5 (170)

61,9 % 95% KI [38,4-81,9%]

76,2 % 95% KI [52,8-91,8%]

Parallellt med testet Platelia™ Candida Ag Plus har dessa prover också testats för närvaro av anti-mannan-antikroppen med kitet Platelia™ Candida Ab Plus⁹. Statusen för patienten för närvaro av mannan-antigenen för Candida eller Candida anti- mannan-antikroppar anses som positiv om minst ett av de två testerna är positiv. I avsaknad av ett positivt test anses statusen som medelhög om minst ett av de två proverna är medelhöga eller som negativ om de två proverna är negativa.

Patientkategori

Kombination av resultat från Platelia™ Candida Ag Plus och Platelia^TM Candida Ab Plus

Antal patienter (antal prover) Känslighet (medelhöga resultat anses

negativa)

g Negativ 21 patienter (225 prover) som visar minst en positiv

odling av Candida spp. 15 (98) 4 (34) 2 (93)

71,4 % 95% KI [47,8-88,7%]

90,5 % 95% KI [69,6-98,8%]

Resultat från Plats 2

De 68 franska patienterna som ingår i denna studie var inlagda på olika intensivvårdsavdelningar (kirurgi, transplantation, brännskador, trauma, lungvård, m.m.) eller onko-hematologiska avdelningar (hematologiska maligniteter). Alla utvecklade en invasiv candidainfektion som kunde påvisas mikrobiologiskt med minst en positiv blododling av Candida (albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei eller tropicalis)^{6, 7, 14} dagarna före eller efter att det studerade blodprovet tagits. Blodproven togs i genomsnitt 6 dagar efter det första blodprovet med positivt resultat av Candida, (som minst 61 dagar innan, som mest 67 dagar efter). Statusen för dessa patienter, avseende närvaron av den specifika Candida mannan-antigenen, som detekteras med testet Platelia™ Candida Ag Plus, anses som positivt när minst ett av patientproverna är positivt. I avsaknad av positivt prov anses statusen vara medelhög om minst ett patientprov är medelhögt, eller negativ om alla patientproven är negativa.

Patientkategori

Resultat från Platelia™ Candida Ag Plus Antal patienter (antal prover) Känslighet

negativa)

g Negativ 68 patienter (211 prover) som visar minst en

positiv blododling av Candida spp. 35 (86) 7 (14) 26 (111)

51,5%

95% KI [39,0-63,8%]

61,8%

95% KI [49,2-73,3%]

- varav 34 av C. albicans (113 prover) 22 (55) 6 (12) 6 (46) 64,7%

95% KI [46,5-80,3%]

82,5%

95% KI [65,5-93,2%]

- varav 15 av C. parapsilosis (37 prover) 2 (3) 1 (1) 12 (33)

13,3%

95% KI [1,7-40,5%]

20,0%

95% KI [4,3-48,1%]

- varav 12 av C. glabrata (32 prover) 7 (13) 0 (0) 5 (19)

58,3%

95% KI [27,7-84,8%]

66,7%

95% KI [34,9-90,1%]

- varav 4 av C. tropicalis (19 prover) 4 (15) 0 (1) 0 (3) 100,0% * 100,0% *

- varav 2 av C. krusei (8 prover) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% *

- varav 1 av C. norvegensis (2 prover) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% *

*: Konfidensintervallet på 95 % har inte kunnat beräknas på grund av ett för litet antal prover.

(11)

11 Parallellt med testet Platelia™ Candida Ag Plus har dessa prover också testats för närvaro av anti-mannan-antikroppen med kitet Platelia™ Candida Ab Plus⁹. Statusen för patienten för närvaro av mannan-antigenen för Candida eller Candida anti- mannan-antikroppar anses som positiv om minst ett av de två testerna är positiv. I avsaknad av ett positivt test anses statusen som medelhög om minst ett av de två proverna är medelhöga eller som negativ om de två proverna är negativa.

Patientkategori

Kombination av resultat från Platelia™ Candida Ag Plus och Platelia^TM Candida Ab Plus

Antal patienter (antal prover) Känslighet (medelhöga resultat anses

negativa)

g Negativ 68 patienter (211 prover) som visar minst en positiv

blododling av Candida spp. 48 (122) 8 (40) 12 (49)

70,6%

95% KI [58,3-81,0%]

82,4%

95% KI [71,2-90,5%]

- varav 34 av C. albicans (113 prover) 28 (74) 2 (22) 4 (17)

82,4%

95% KI [65,5-93,2%]

88,2%

95% KI [72,6-96,7%]

- varav 15 av C. parapsilosis (37 prover) 5 (7) 6 (15) 4 (15)

33,3%

95% KI [11,8-61,6%]

73,3%

95% KI [44,9-92,2%]

- varav 12 av C. glabrata (32 prover) 11 (24) 0 (3) 1 (5) 91,7%

95% KI [61,5-99,8%]

91,7%

95% KI [61,5-99,8%]

- varav 4 av C. tropicalis (19 prover) 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100,0% * 100,0% *

- varav 2 av C. krusei (8 prover) 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0,0% * 0,0% *

- varav 1 av C. norvegensis (2 prover) 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0,0% * 0,0% *

*: Konfidensintervallet på 95 % har inte kunnat beräknas på grund av ett för litet antal prover.

SPECIFICITET

Specificiteten har bestämts på en panel av 416 prover från 2 platser i Frankrike med följande fördelning:

• Plats 1: 200 prover från 200 franska patienter som kontrolleras för toxoplasmos under graviditet och inte visar några kliniska symptom på infektion med Candida.

• Plats 2: 216 prover från 216 franska blodgivare.

Patientkategori

Resultat från Platelia™ Candida Ag Plus Antal patienter (antal prover) Specificitet

positiva)

Specificitet (medelhöga resultat anses

negativa) Positiv Medelhö

g Negativ 200 gravida kvinnor (200 prover) som kontrolleras

för toxoplasmos 3 2 195 97,5 %

95% KI [94,3-99,2%]

98,5 % 95% KI [95,7-99,7%]

216 blodgivare (216 prover) 1 1 214

99,1 % 95% KI [96,7-99,9%]

99,5 % 95% KI [97,5-100%]

16- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL

Alla reagenser är tillverkade i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje sats genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om den överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskild sats sparas hos Bio-Rad.

(12)

12 17- REFERENSER

1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U. 2007. Comparative evaluation of (1,3)- beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candida species specific snPCR in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103): p. 1-9.

2- Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F., Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D., Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag, D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J. 2002. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p. 7–14.

3- Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J. 2005. Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43(No. S): p.

65-84.

4- Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom, U. 2009. Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candida infections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p. 606-615.

5- Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M., Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti, M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J. 2009. Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p. 55–62.

6- Nucci, M., , Colombo, A.L. 2007. Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p.

77–82.

7- Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G. 2008. Experience with the Platelia™ Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p. 377-397.

8- Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F., Edwards, J.E.Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner, L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D. 2009. Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p. 503–535.

9- Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S. 2002. Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p. 455–460.

10- Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T., Marchetti, O. 2005. Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 51: p. 95–101.

11- Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R. 1998. The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p. 781–788.

12- Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R. 2009. Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p. 443–

451.

13- Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D., Poulain, D. 2002. Combined detection of mannanaemia and antimannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p. 433–442.

14- Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M., Bonnin, A., Poulain, D. 2003.

Contribution of the Platelia™ Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalisinfection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p. 4551–4558.

15- Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure, O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R. 2004. Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p.

317–322.

16- Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P., Samonis, G., Falagas, M. E. 2009. Candidaemia:

incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immunocompetent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p.

289–292.

17- Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A., Verweij, P. E. 2009. Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p. 380-386.

(13)

13

(14)

14

(15)

15 Bio-Rad

3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette – France

Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/11

Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881122

www.bio-rad.com