Utsläpp från vägmarkeringar –

Utsläpp från vägmarkeringar –

Toxicitetstest av lakvatten från

vägmarkeringsprodukter med mikroalgen

Raphidocelis subcapitata

Mikaela Österblad

Institutionen för miljövetenskap Examensarbete: 30 hp

Examensämne: Miljövetenskap

Utbildningsprogram: Miljö- och hälsoskydd Hösttermin: 2020

Handledare: Elena Gorokhova och Delilah Lithner

English title: Emissions from road markings - Toxicity tests of leachates from road marking products on the microalgae Raphidocelis subcapitata

3

Sammanfattning

Ackumuleringen av plast och mikroplast i miljön är idag en globalt aktuell fråga. Forskning kring mikroplast och dess påverkan på miljö och biota har ökat kraftigt det senaste decenniet. En av de största utsläppskällorna till mikroplast är slitage från vägtrafiken, speciellt från däck, men mikroplast kan även komma från vägmarkeringar. Vägmarkeringar innehåller plastpolymerer (som bindemedel), fyllnadsmedel, pigment och tillsatsämnen (additiv), och ofta ingår även glaspärlor. Vissa ämnen kan ge en negativ påverkan på människa och miljö. I dagsläget saknas det data för att kunna kartlägga i vilken omfattning vägmarkeringsslitage bidrar till spridning av mikroplaster samt för att bedöma om och hur det skulle kunna påverka miljön och vattenlevande organismer. I detta examensarbete har toxicitetstest av lakvatten från vägmarkeringsprodukter utförts med algen Raphidocelis subcapitata för att studera om de är toxiska samt om det finns någon skillnad mellan olika vägmarkeringsprodukter.

Partiklar från fyra olika typer av vägmarkeringsprodukter (prefabricerad termoplast, varmapplicerad termoplast, vattenbaserad akrylatfärg och 2-komponentsakrylatfärg) genererades och lakades var för sig med skakning i avjoniserat vatten under 24 timmar. Lakvattnen utan partiklar användes sedan till algtillväxthämningstest. Algerna exponerades under 72 timmar för lakvatten i olika koncentrationer, där den högsta motsvarade 100 g vägmarkeringspartiklar per liter, och algtillväxt mättes. Effektmåtten var maximal tillväxthastighet och lag-fas och dessutom analyserades korrelationen mellan dem som ett mått för anpassningseffektivitet. De fyra lakvattnen påverkade lag-fas och/eller tillväxthastighet i olika omfattning och medförde antingen inhibering eller stimulering av algtillväxten. Lakvattnet från den vattenbaserade akrylatfärgen påvisade störst inhibering av tillväxt och var även det mest toxiska eftersom ingen tillväxtanpassning skedde. För övriga lakvatten påvisades olika grad av anpassningseffektivitet av alger vid exponering. Dock krävs mer ingående statistisk utvärdering för att åtskilja de två lakvatten som hade minst påverkan, dvs. från den prefabricerade och den varmapplicerade termoplasten.

Detta är enbart en första studie. Upprepade tester med fler vägmarkeringsprodukter och fler tester med andra organismer, såsom bakterier, kärlväxter, kräftdjur och fisk, krävs för att bättre kunna utreda om och hur olika vägmarkeringar kan påverka biota. För ytterligare studier skulle det vara intressant att utvärdera vilka ämnen i vägmarkeringar som kan påverka miljön och om dessa skulle kunna ersättas med andra, mindre giftiga ämnen.

Nyckelord: Mikroplast, vägmarkeringar, lakvatten, algtillväxthämningstest, mikroalger, algtillväxt, lag-fas, tillväxthastighet, anpassning.

4

Abstract

The accumulation of plastic and microplastics in the environment is a current global issue. Research on microplastics and its impact on the environment and biota has increased rapidly in the last decade. One of the largest sources of microplastics is wear from road traffic, especially tires, but they can also originate from road markings. Road markings contain plastic polymers (as a binder), fillers, pigments, and additives, and often also glass beads. Some substances may have a negative impact on humans and the environment. At present, there are no data to map the extent to which wear from road markings contributes to the emissions of microplastics, or to assess the effect they might cause on the environment and aquatic organisms. In this thesis, toxicity tests on leachates from road marking products were conducted on the alga Raphidocelis

subcapitata to study the effect on the algae and if it differs between the different products.

Particles from four types of road marking products (prefabricated thermoplastic, hot-applied thermoplastic, acrylic water-based paint, and 2-component acrylic paint) were generated and leached separately by shaking in deionized water for 24 hours. The leachates without particles were used in the standard algal growth inhibition tests. The algae were exposed for 72 hours to the leachates in different concentrations, with the highest corresponding to 100 g road marking particles per liter, and algal growth was monitored. Endpoints used were maximum growth rate and lag phase and, in addition, their correlation was analyzed as an indicator for adaptation capacity. The four leachates affected lag phase and/or growth rate to a varying extent and caused inhibition or stimulation of algae growth. Exposure to leachate from the water-based acrylic paint showed most inhibition of growth and was also the most toxic as no growth adaptation was observed. For the other tests, different rates of adaptation efficiency of the algae growth were found. However, more detailed statistical evaluation is needed to differentiate between the two leachates that had the least effect, i.e. the prefabricated and the hot-applied thermoplastic. This is only a first study. More tests with more road marking products and with other organisms, such as bacteria, vascular plants, crustaceans, and fish, are required to better understand if and how different road markings could affect biota. Additionally, an evaluation of what substances in road marking materials may cause effects and whether these can be replaced by other, less toxic substances, would be of interest.

Keywords: Microplastics, road markings, leachate, algae growth inhibition test, microalgae, algae growth, lag phase, growth rate, adaptation.

5

Populärvetenskaplig sammanfattning

Plasttillverkningen har de senaste tio åren ökat kraftigt och en stor del av den plast som vi använder hamnar i miljön, särskilt i haven. Eftersom de flesta plastmaterial bryts ner mycket långsamt finns de kvar länge i miljön, men kan brytas ner till mindre partiklar, så kallad mikroplast. På grund av att det finns så mycket mikroplast i miljön har många studier gjorts för att förstå vilka konsekvenser detta kan få. Stora utsläpp av mikroplast kommer från vägtrafiken, framför allt från däcken som slits vid körning och släpper ifrån sig små gummipartiklar. Vägmarkeringar, vilket är de linjer och symboler som finns på vägarna, bidrar också till utsläpp av mikroplast. De innehåller bland annat plast och kan även innehålla ämnen som kan ha en negativ påverkan på människa, djur och miljö. Det finns dock i dagsläget inga studier om hur mycket som sprids eller om och hur det påverkar olika organismer och därför är det viktigt att undersöka detta vidare.

Syftet med detta arbete var att utföra en studie med vägmarkeringsprodukter för att se om de kan vara giftiga för vattenlevande organismer, i det här fallet alger. Frågor som försökte besvaras var om algers tillväxt påverkas av kemiska ämnen som läcker ut från vägmarkeringsprodukter och om det finns någon skillnad mellan olika vägmarkerings-produkter som testades.

Testerna utfördes med lakvatten från vägmarkeringsprodukter, vilket var vatten som vägmarkeringspartiklar legat och skakat i. Fyra olika typer av vägmarkeringsprodukter testades: varmapplicerad termoplast, förtillverkad termoplast, vattenbaserad plastfärg och kallplastfärg. Algerna exponerades för lakvatten vid olika koncentrationer under tre dagar. För att kunna jämföra tillväxten fanns även ett kontrollprov där algerna fick växa utan lakvatten. Mätning av hur väl algerna anpassade sig till lakvattnet och hur fort de började växa gjordes och jämfördes med kontrollen. Det man kunde se var att lakvattnen från vägmarkeringsprodukterna påverkade algerna olika mycket och på olika sätt, antingen så att tillväxten minskade eller ökade. Det lakvatten där algerna påverkades mest var från den vattenbaserade plastfärgen. Algerna hade ingen möjlighet att anpassa sig bra och deras tillväxt hämmades, vilket innebar att det lakvattnet var det mest giftiga för algerna. Bäst växte algerna i lakvattnen från de två termoplastiska vägmarkeringarna och det var därför de som var minst giftiga.

Då den här typen av studie aldrig gjorts på vägmarkeringar tidigare kan man inte dra några generella slutsatser. Man behöver göra flera studier med fler vägmarkeringsprodukter och med andra typer av organismer för att bättre förstå om och hur de påverkar. Man skulle även kunna undersöka vilka ämnen i vägmarkeringarna som har störst negativ påverkan och om de skulle kunna bytas ut.

6

Innehållsförteckning

1.2 Plast och mikroplast ... 8

1.3 Vägmarkeringar ... 8

2 Material och metod ... 10

2.1 Testorganism ... 10

2.2 Förberedelse inför testen ... 11

2.3 Testmaterial: Vägmarkeringsprodukter och partikelgenerering... 11

2.4 Laktestet ... 12

2.5 Toxicitetstest med alger ... 14

2.6 Partikelkoncentration i lakvatten ... 15

2.7 Dataanalys och statistik ... 15

3 Resultat ... 17

3.1 Prefabricerad termoplast – 2TPPF ... 18

3.2 Varmapplicerad termoplast – 3TPHA ... 18

3.3 Vattenbaserad akrylatfärg – 4ACWP ... 19

3.4 2-komponentakrylatfärg – 5CPAC ... 19

4 Diskussion ... 20

5 Slutsats ... 23

Acknowledgements/tack ... 24

Referenser ... 25

7

1 Inledning

Den globala plastproduktionen har de senaste tio åren ökar kraftigt, från 230 miljoner ton (Plastic Europe, 2010) till 368 miljoner ton år 2019 (Plastic Europe, 2020). Plast är en av de största orsakerna till de globala miljöföroreningarna (Naturvårdsverket, 2021). Man finner plast överallt i miljön och den största delen hamnar till slut i haven. (Napper & Thompson, 2019). Ackumulering och fragmentering av plast i haven har blivit en uppmärksammad fråga (Gambardella m.fl., 2019) och antalet forskningsartiklar rörande mikroplast har under det senaste decenniet ökat exponentiellt (Medrano & Thompson, 2018).

Enligt ett flertal studier och rapporter (Sundt m.fl., 2014; Magnusson m.fl., 2016,

Naturvårdsverket, 2017, Siegfried m.fl., 2017, Andersson-Sköld m.fl., 2020) bedöms däckslitage från vägtrafiken vara en av de största källorna till mikroplastutsläpp. Vägmarkering som utsläppskälla är ett outforskat område och i dagsläget saknas data för att kunna kartlägga i vilken omfattning vägmarkeringsslitage bidrar till spridning av mikroplaster samt bedöma om och hur det skulle kunna påverka miljön. Det finns inte några vetenskapliga studier om hur vägmarkeringspartiklar påverkar organismer och därför är det relevant att undersöka detta för att inbringa kunskap.

Statens väg- och transportforskningsinstitut (VTI) fick i uppdrag av regeringen att (under 2018– 2020) ta fram information och sprida kunskap om utsläpp av mikroplast från vägtrafiken. Inom ramen för regeringsuppdraget upprättades ett samarbete mellan VTI och Institutionen för miljö-vetenskap vid Stockholms universitet för att, i ett delprojekt, undersöka om vägmarkeringar kan vara toxiska för vattenlevande organismer. Utgångspunkten för min masteruppsats är därför detta delprojekt.

1.1 Syfte

Syftet med studien är att, med hjälp av standardiserade ekotoxikologiska tester, studera om lakvatten från olika typer av vägmarkeringsprodukter är toxiska för vattenlevande organismer. För att uppnå syftet genomförs toxicitetstest med lakvatten från olika vägmarkeringsprodukter med algen Raphidocelis subcapitata som testorganism. De frågeställningar som ska försöka besvaras är följande:

• Påverkas algernas tillväxt av exponering för lakvatten från vägmarkeringsprodukter?

• Finns det någon skillnad i toxicitet mellan lakvatten från olika vägmarkeringsprodukter? De lakvatten som genererats för denna studie har inte enbart använts till algtoxicitetstest utan har även skickats till ackrediterade analyslaboratorium för kemisk analys och Microtox-test. De delarna ingår inte i examensarbetet, men har en tydlig koppling till examensarbetet då det är samma lakvatten och den kemiska sammansättningen av lakvattnet innefattas. Resultaten från de kemiska analyserna och Microtox-testen har sammanställts och utvärderats av VTI (Lithner, 2021) och redovisas därför separat. Däremot behandlas de i diskussionen i denna studie.

8 1.2 Plast och mikroplast

Plast är en grupp av material som är uppbyggda av polymerer, vilka utgörs av långa kedjor bestående av monomerer (Kemikalieinspektionen, 2020). På grund av plastens mångsidiga egenskaper har den flera användningsområden. Eftersom de flesta plastmaterial är mycket svårnedbrytbara ackumuleras de i miljön. Nedbrytningstiden kan vara 100–1000 tals år (Statens Offentliga Utredningar, 2017). Nedbrytning av plastmaterial till mindre fragment sker genom naturliga processer under påverkan av till exempel UV-ljus, syretillgång och temperatur (Harmon, 2018). Plastmaterial kan innehålla tillsatsämnen (additiv), för att uppfylla vissa kriterier för funktion, så som termiska, fysikaliska, elektriska eller kemiska egenskaper. Dessa additiv kan till exempel utgöras av flamskyddsmedel, ftalater, fyllnadsmedel, antioxidanter, färg eller mjukgörare. När plasten sprids till miljön kan additiv, eventuella restmonomer och nedbrytningsprodukter, läcka ut från plasten. Plast kan även adsorbera vissa organiska föreningar som finns i omgivningen (Statens Offentliga Utredningar, 2017).

Begreppet mikroplast myntades av Thompson m.fl., där de beskrevs som ”mikroskopiska plastfragment och fibrer” (Thompson m.fl. 2004). Till mikroplast räknas plastpartiklar som är mindre än 5 mm (GESAMP, 2015). För att särskilja de minsta partiklarna sätts ofta en nedre storleksgräns på 1 eller 0,1 µm och de partiklar som är mindre än det kallas då nanoplast (SAPEA, 2018). Mikroplast brukar delas in primär och sekundär mikroplast. Den primära mikroplasten är små plastpartiklar tillverkade i specifik storlek för att användas i produkter, t.ex. skönhetsprodukter. Sekundär mikroplast har genom fragmentering av större plastpartiklar brutits ner till mindre plastpartiklar (Harmon, 2018). Fragmentering av mikroplaster kan ske genom flera olika faktorer, till exempel under påverkan av UV-strålning, mekaniska processer, temperatur och syretillgång (Kalogerakis m.fl., 2017). Mikroplastpartiklar har flera olika spridningsvägar, såsom vatten, luft och mark (Waldschläger, 2020). De partiklar med en högre densitet än vatten sjunker till botten och ackumuleras i sediment medan de partiklar som har en lägre densitet än vatten blir kvar i vattnet (Gunaalan m.fl., 2020). Detta gör att de kan spridas med vindar och strömmar (Shim m.fl. 2018). Mikroplast i sediment kan även återinföras till vattnet genom resuspension (Andersson-Sköld m.fl., 2020). Plast och mikroplast kan misstas för föda och i sin tur vidare upptas mellan trofiska nivåer. I flercelliga organismer, kan mikroplasten även föras vidare till celler, vävnad och organ (Franzellitti m.fl. 2019).

1.3 Vägmarkeringar

Vägmarkeringar finns på vägbanan i form av linjer, upphöjda räfflor eller punkter, symboler och text för att varna och vägleda trafikanter och reglera trafiken. Dessa slits ner vid kontakt med däck (framför allt dubbdäck), och kan även slitas vid plogning (Andersson-Sköld m.fl., 2020) och gatusopning. Eftersom vägmarkeringar innehåller plastpolymerer som bindemedel utgör de en källa till mikroplastutsläpp när vägmarkeringarna slits ner till partiklar (Andersson-Sköld m.fl., 2020). Spridning av däck- och vägslitagepartiklar från vägen sker med avrinningen från vägen vid regn och snösmältning och genom utsläpp till luft, men även med t.ex. snömassor och gatusopningsmassor (Andersson-Sköld m.fl., 2020).

9

Figur 1. T.v. Vägmarkeringar. T.h. Bil som kör på vägmarkeringar vid övergångsställe. Foto: Delilah Lithner.

Det finns olika typer av vägmarkeringsprodukter som innehåller olika typer av plastpolymerer som bindemedel. De produceras som färg, termoplastiska massor eller tejp (Skandinaviska vägmarkeringsföreningen, 2021) och kan delas in i följande grupper (Andersson-Sköld m.fl., 2020):

• Termoplastiska system (varmapplicerade och prefabricerade) • Vattenbaserade färger

• Lösningsmedelsbaserade färger • 2-komponentfärg

• Vägmarkeringstejp (permanent eller tillfällig)

Plastpolymererna utgör enbart en del av vägmarkeringarna. För termoplast och vattenbaserad färg kan andelen exempelvis ligga omkring 15 viktsprocent. Utöver plastpolymerer innehåller vägmarkeringar fyllnadsmedel, pigment och tillsatsämnen (additiv) och det är vanligt att även glaspärlor ingår för att ge reflekterande egenskaper (Andersson-Sköld m.fl., 2020). Vissa ämnen i vägmarkeringar har egenskaper som kan ge en negativ påverkan på människa och miljö (EU, 2018). I en del länder används t.ex. blykromat som pigment till gula vägmarkeringar (men har inte använts i Sverige de senaste 30 åren). Ett tillstånd för att sälja färgpigment av blykromat inom EU har dömts ogiltigt av EU-domstolen men gäller ändå till maj 2022 (Anderberg, 2020). Titandioxid är det vanligaste pigmentet för vita vägmarkeringar (Andersson-Sköld m.fl., 2020). Andra ämnen som ingår är t.ex. mjukgörare (i vissa produkter används t.ex. ftalater) (EU, 2018) och i glaspärlor som tillverkats av återvunnet glas kan det finnas förhöjda halter av t.ex. bly, arsenik och antimon (dos Santos m.fl., 2013). Lösningsmedelsbaserade färger innehåller lösningsmedel och 2-komponentfärger av epoxi innehåller epoxihartser och härdare (Andersson-Sköld m.fl., 2020). Vad som kan läcka ut från vägmarkeringarna och i vilken omfattning är inte känt.

10

Enligt Skandinaviska vägmarkeringsföreningen, 2019 (refererad i Andersson-Sköld m.fl., 2020) domineras användningen i Sverige av termoplastiska vägmarkeringar (framför allt varmapplicerad) och näst vanligast är vattenbaserade vägmarkeringsfärg. Lösningsmedels-baserade färger används nästan inte alls och 2-komponentsystem används begränsat på några platser för att färga buss- och cykelfält. Globalt är det istället vattenbaserad och lösningsmedelsbaserad vägmarkeringsfärg som är vanligast och termoplast är näst vanligast (Grand View Research, 2020).

På det statliga svenska vägarna (dvs. exklusive de kommunala vägarna) används grovt uppskattat 15 000 ton vägmarkeringsprodukter per år enligt Skandinaviska vägmarkerings-föreningen (refererad i Andersson-Sköld m.fl., 2020). Globalt var efterfrågan på vägmarkeringar mer än 1,2 miljoner ton år 2014 vilket enligt Grand View Researchs (2016) prognos skulle kunna öka till 1,8 miljoner ton år 2022.

2 Material och metod

2.1 Testorganism

Som testorganism användes den encelliga sötvattengrönalgen Raphidocelis subcapitata (tidigare benämnd Pseudokirchneriella subcapitata och Selenastrum capricornutum). Denna testorganism är standard inom ekotoxikologi (OECD, 2011), då den är snabbväxande, känslig för kemikaliestress men även för förändring i näringstillgång och ljus. Därför är den väl lämpad för att analysera stress på tillväxt, inklusive tester med mikroplast (Gorokhova m.fl., 2020). Alger ympades från en existerande algkultur i laboratoriet och inför varje nytt test ympades nya alger. En mindre mängd algkultur tillsattes tillsammans med MBL (Marine Biology Laboratory algodlingsmedium) (Nichols, 1973) till en autoklaverad e-kolv och förvarades i rums-temperatur, 21 ± 1°C, på ett skakbord (100–125 rpm) med belysning underifrån (140 ± 10 μ E·m−2 s−1). All algkultur som användes till toxicitetstesten växte exponentiellt och var vid testens start max sex dagar.

11 2.2 Förberedelse inför testen

För att avgöra vilken exponeringstid och vilken typ av mikrotiterplatta (cellodlingsplatta) som var bäst för testet utfördes ett förtest med 96 respektive 12 brunnar och exponeringstiden 72 respektive 96 timmar. Efter analys konstaterades att 12 brunnar med exponering under 72 timmar var bäst lämpad, då algerna hade högre tillväxt. Dessutom gjordes ett pilottest som omfattade alla steg med partikelgenerering, laktest och algtoxicitetstest då metoderna testades och förbättringsmöjligheter i försöksupplägget identifierades.

Allt material som användes till testen diskades i en diskmaskin lämpad för rengöring av laboratoriematerial och de kärl som krävde sterilisering autoklaverades i 20 minuter (121 °C)

innan användning. I möjligaste mån användes glaskärl under testens gång för att undvika påverkan från andra plastmaterial. De plastmaterial som användes under testen var plastlock till glasflaskorna, engångspipettspetsar i plast för tillsättning till brunnarna och cellodlingsplattor av polystyrenplast.

MBL, som var anpassat för mikroalger (Nichols, 1973) och liknar de medium som föreslås i OECD-standarden (OECD, 2011) bereddes inför testen. Den användes vid ympning av alger och vid toxicitetstesten med lakvatten. MBL innehåller överskott av näringsämnen för att vara tillräcklig för algerna under hela testet. MBL:en förvarades kallt.

2.3 Testmaterial: Vägmarkeringsprodukter och partikelgenerering

Fem olika vägmarkeringsprodukter testades vid olika tillfällen. Dessa var: • Varmapplicerad termoplastisk vägmarkering (tillverkare a) – 1TPHA

Vit vägmarkering med glaspärlor i. Appliceras på vägen i smält form (2–4 mm tjocklek) och används t.ex. för linjemarkering.

• Prefabricerad termoplastisk vägmarkering – 2TPPF

Vit vägmarkering med glaspärlor i. Färdigutskuren symbol (3 mm tjocklek) (prefabricerad) som läggs på vägbeläggningen och smälts fast med hjälp av en gasbrännare.

• Varmapplicerad termoplastisk vägmarkering (tillverkare b) – 3TPHA Samma typ som 1TPHA, men från en annan tillverkare, se beskrivning ovan. • Vattenbaserad akrylatfärg – 4ACWP

Vit vattenbaserad färg utan glaspärlor. Sprutas på vägen i ett tunt skikt och används t.ex. för linjemarkering.

• Tvåkomponent akrylatfärg (även kallad kallplast) – 5CPAC.

Röd färg utan glaspärlor men med sand för ökat grepp. Den består av två komponenter: en bas (med akrylharts) som blandas med en härdare före applicering och används för att färga stora fält, t.ex. cykelbanor.

12

Vägmarkeringsprodukter erhölls från olika tillverkare och entreprenörer i form av kuber, plattor, flytande färg i plåtburk och härdad färg i plåthink (se Tabell 1). Den flytande akrylatfärgen (4ACWP) hälldes i stora glaspetriskålar (i ett 3 mm tjockt lager) och fick torka i flera veckor. Trots att samtliga produkter hade härdat innan partiklarna genererades var de en aning semiflexibla. Partiklarna genererades för hand av VTI med hjälp av kniv, sax eller håljärn (skölp) av rostfritt stål eller kolstål, vilket styrdes av vad som var möjligt att använda för respektive produkt, se Tabell 1. Vid partikelgenereringen användes polyetenhandskar. Partikelstorleken varierade något, men var i genomsnitt mindre än 4 mm, förutom för prov 4ACWP där en del partiklar var något större, se Figur 3.

Figur 3. Genererade vägmarkeringspartiklar. 1TPHA och 3TPHA: Varmapplicerad termoplast. 2TPPF: Prefabricerad termoplast. 4ACWP: Vattenbaserad akrylatfärg. 5CPAC: 2-komponent akrylatfärg. Foto: Delilah Lithner.

2.4 Laktestet

Lakning av vägmarkeringarna utfördes i enlighet med EN 12457–2 (Europeiska kommissionen för standardisering, CEN, 2002), som är standardiserat enstegs-laktest där partiklar mindre än 4 mm lakas med skakning i avjoniserat vatten (MilliQ) under 24 timmar vid 20 ± 2 °C. Den här typen av laktest används exempelvis för att studera ett materials påverkan på miljön eller karaktärisera ett avfall. Syftet med skakningen är att påskynda utlakningen för att förkorta testtiden.

13

Tabell 1. Testade vägmarkeringsprodukter, deras form och storlek före partikelgenerering, verktyg som

använts för partikelgenerering samt partikelstorlek efter generering.

Vägmarkeringsprodukt Form & storlek före partikelgenerering

Verktyg som partiklar genererades med

Partikel-storlek

1TPHA –

Termoplast (varmapplicerad)

Kub (70x70x70 mm) Kniv av kolstål resp. rostfritt stål, samt sax av rostfritt stål

ca 4 mm

2TPPF –

Termoplast (prefabricerad)

Platta (3x500x500 mm) Sax av rostfritt stål ca 4mm

3TPHA – Termoplast (varmapplicerad) Kub (70x70x70 mm) Håljärn (skölp) av kolstål ca 4 mm 4ACWP – Vattenburen akrylatfärg Skikt (170 mm i diameter, 3 mm tjock) Sax av rostfritt stål 4–10 mm 5CPAC – Tvåkomponent akrylatfärg Cylinder (300 mm i diameter, 120 mm hög) Håljärn (skölp) av kolstål > 4 mm

Lakningen genomfördes i borosilikatglasflaskor (Fisher) med polypropenlock i två olika koncentrationer. Den ena L/S-kvoten (dvs. förhållandet mellan vätska och fast material) var 10 l/kg (L/S 10; vilket motsvarar 100 g/l) och den andra L/S-kvoten var 5 l/kg (L/S 5; vilket motsvarar 200 g/l). För L/S 10 användes två 1-liters flaskor med 80 g vägmarkeringspartiklar och 800 ml MilliQ-vatten (dvs. 100 g/l) i varje flaska och för L/S 5 användes en 100 ml glasflaska med 16 g vägmarkeringspartiklar och 80 ml MilliQ-vatten (dvs. 200 g/l). För att förbättra partiklarnas rörelse under skakning fylldes inte flaskorna helt. Luftutrymmet var cirka 200 ml för 1 litersflaskorna (19%) och cirka 40 ml i 100 ml glasflaskan (38%). Kontrollen, med enbart MilliQ-vatten, hanterades på samma sätt (800 ml MilliQ i en likadan 1-liters borosilikat-glasflaska) och skakades samtidigt med lakvattnen för att utesluta eventuella effekter av lakningsproceduren eller av MilliQ-vattnet. Lakningen utfördes med kontinuerlig skakning under 24 h på skakbord (Edmund Bühler GmbH SM-30), 125 rpm, vid ca 20 ±2°C. Glasflaskorna skakades i horisontellt läge för mest effektiv rörelse av partiklar.

Figur 4. T.v. Uppsättning av lakningsflaskor per vägmarkeringsprodukt med vägmarkeringspartiklar och MilliQ-vatten samt en kontrollflaska med enbart MilliQ. T.h. Skakning av lakningsflaskor på skakbord. Foto: Delilah Lithner.

14

När lakningen var klar fick partiklarna i lakvattnen sedimentera i 15 minuter till 2 timmar beroende på mängd suspenderade partiklar. Lakvattnet hälldes genom ett polyamidfilter med hög genomsläpplighet för att ta bort partiklarna. För test 4ACWP och 5CPAC användes två polyamidfilter eftersom dessa lakvatten var grumliga. Lakvattnet från de två 1 litersflaskorna hälldes ihop till en 2 liters e-kolv och 100 ml flaskan hälldes till en 100 ml e-kolv. Filtrerat lakvatten från både L/S10 och L/S5 användes till algtoxicitetstestet. Konduktivitet och pH mättes. Lakvattnet från L/S 10 (100 g/l) skickades även till ackrediterat analyslaboratorium för kemiska analyser (metaller och screening av S-VOC) samt Microtox-test med bakterier. Dessa beskrivs separat av Lithner (2021).

2.5 Toxicitetstest med alger

I testet studerades tillväxt av alger i enlighet med OECD (2011) Test nr 201. Tolv-brunnars mikrotiterplatta (Sarstedt AG & Co) användes för testen. Beredning av plattorna skedde under sterila förhållanden i en steril bänk (Laminar flow clean bench) för att undvika kontaminering. Den initiala algdensiteten (antal celler/ml) av algspädningen beräknades i en cellräknare (Bio-Rad Automated Cell Counter) för att se om det fanns tillräckligt med celler vid testens start. För samtliga vägmarkeringsprodukter testades lakvattenkoncentrationerna: 100 g/l, 50 g/l, 25 g/l och 12,5 g/l. För vägmarkering 5CPAC testades även två lägre koncentrationer, 6,25 g/l och 0,625 g/l. Anledningen till detta var att denna produkt enligt säkerhetsdatabladet innehöll flera farliga ämnen och att produkten, vid partikelgenerering samt lakningsmomentet, hade en mycket stark kemikalielukt. Varje lakvattenkoncentration testades om nio replikat. För de två högsta koncentrationerna, 100 g/l och 50 g/l, tillsattes endast lakvatten och för koncentrationer under 50 g/l späddes lakvattnet med MilliQ i brunnarna för att erhålla önskad koncentration. Ett kontrolltest om nio replikat med endast MilliQ användes som referens för algernas tillväxt. Algspädning (en del algkultur och tio delar MBL) blandades i en 200–300 ml autoklaverad e-kolv och tillsattes även till de första nio brunnarna i samtliga plattor. Tre blankprov testades även för varje lakvattenkoncentration och kontroll. I blanktesten tillsattes inga alger, se Figur 5. Syftet med blankproven är att vid mätning få ett värde för alla tillsatta ämnen förutom alger och sedan subtrahera medelvärdet för blankproven. Man får då ett värde för endast algerna, vilket representerar algabundans.

Då algerna behöver näring för att kunna tillväxa under testet användes en del algodlingsmedium (MBL) och en del lakvatten (i olika koncentrationer) vid exponeringen. Detta innebar att den högsta lakvattenkoncentration som algerna exponerades för motsvarade 100 g vägmarkeringspartiklar/l, dvs. hälften av lakvattenkoncentrationen från L/S 5-lakningen (200 g/l). Till övriga koncentrationer som testades (dvs. ≤ 50 g/l) användes lakvatten från L/S 10-lakningen (100 g/l).

15

Figur. 5. Uppsättning av mikrotiterplattor. Testkoncentrationer om nio replikat med tre blankprov (utan alger) samt kontrolltest om nio replikat med tre blankprov (utan alger). Foto: Mikaela Österblad.

Under exponeringen placerades plattorna på ett skakbord i rumstemperatur 20 ± 2 °C med fluorescerande belysning underifrån (140 ± 10 μ E·m−2 s−1). För att undvika avdunstning från brunnarna fästes fuktat filterpapper i locken och byttes vid behov. Exponeringstiden var 72 timmar med sju mättillfällen. För mätning av fluorescens (klorofyllfluorescens) och absorbans användes en mikroplattläsare (FLUOstar Optima, BMG Labtech Germany). De filter som användes var excitation 440–80, emission 640–80 för fluorescens och A620 för absorbans. Mätning av fluorescens genomfördes under samtliga test för prover och kontroller. Absorbans (optisk densitet) mättes för vägmarkeringsprodukterna 2TPPF och 3TPHA, men avbröts för 4ACWP och 5CPAC, då partikelkoncentrationen från lakvattnet gjorde att absorbansvärdena var svåra att tolka. Eftersom variationen var för stor vid mätning av absorbans, resulterade det i att osäkerhetsfaktorn blev för stor. Absorbansmätningarna kunde därför inte användas för dataanalys.

2.6 Partikelkoncentration i lakvatten

För lakvattnet från vägmarkeringarna 4ACWP och 5CPAC, utfördes ett partikeltest med Spectrex partikelräknare, då dessa lakvatten var lite grumliga när de tillsattes till brunnarna. Absorbansmätningarna påvisade att lakvattnen hade en betydligt högre partikelkoncentration än de andra två lakvattnen. Beräkning av partikelstorleken och partikelkoncentration gjordes för lakvattnen för att bekräfta förekomst av partiklar och estimera en eventuell partikeleffekt på algernas tillväxt vid tolkning av resultaten utifrån publicerade rapporter. För resultat från partikeltestet, se Bilaga 1.

2.7 Dataanalys och statistik

Värdena för fluorescens-mätningarna bearbetades i Excel för att få en överblick av algtillväxten för varje vägmarkeringsprodukts koncentration och kontroll. Mätvärdena logaritmerades i Excel och användes tillsammans med sina timangivelser i en tillväxtmodell av Baranyi och

16

Roberts (1994) med hjälp av DMfit-mjukvaran i Combase plattform (ComBase Team, 2020). I DMfit erhölls en tillväxtkurva som ett diagram med värden för lag-fasen (dvs. fördröjningsfas) och den maximala tillväxthastigheten (dvs. hur fort algerna förökar sig under den exponentiella tillväxtfasen) med tillhörande standardfel (SE). Resultaten för lag-fas och maximal tillväxthastighet användes som effektmått (endpoints) för att analysera algernas tillväxt. Dessutom användes en positiv korrelation mellan lag-fasen och den maximala tillväxthastigheten som en indikation på algernas förmåga att anpassa sig till den nya miljön de exponeras i (Andriukonis & Gorokhova, 2017).

För att utvärdera hur väl tillväxtmodellen sammanfattar sambandet mellan oberoende (tid) och beroende (logkoncentration av algfluorescens) variabler användes R2-värden. R2 varierar från 0 till 1 och anger hur stor andel av variationen i den beroende variabeln som modellen kan förklara. Värdet 1 innebär att modellen förklarar 100 procent av variationen i den oberoende variabeln och 0 förklarar inte någon variation alls.

Utifrån standardfelens variation för den maximala tillväxthastigheten och lag-fasen beräknades 95%-konfidensintervallen för att avgöra om det fanns någon statistiskt signifikant skillnad mellan koncentrationerna och kontrollen. Konfidensintervallen kan påvisa om det finns statistiskt signifikanta skillnader med 95% sannolikhet mellan två olika parametrar. Om konfidensintervallen för två medelvärden inte överlappar varandra finns det en signifikant skillnad (Statistiska Centralbyrån, 2020). För att avgöra om det fanns något samband mellan de olika parametrarna som mättes (lag-fas och maximal tillväxthastighet) utfördes ett korrelationstest mellan koncentrationerna för de olika testen. Vid uträkning av korrelation ser man till hur väl de två parametrarna är linjärt relaterade till varandra och korrelationskoefficienten benämns med ett R2_{-värdet som varierar från -1 (absolut negativ} korrelation) till +1 (absolut positiv korrelation) (JMP, 2020). För att vidare kunna avgöra hur stark den linjära korrelationen är används följande intervall: 0 till ±0,3 = svagt positiv/negativ, ±0,3 till ±0,7 = medelstarkt positiv/negativ och ±0,7 till ±1,0 = starkt positiv/negativ korrelation (DM Stat 1, 2020).

17

3 Resultat

Nedan presenteras resultaten för lag-fas och maximal tillväxthastighet från fluorescens-mätningarna samt korrelation mellan dem. För den ena varmapplicerade termoplastiska vägmarkeringen, 1TPHA, erhölls inga resultat från testet då ingen algtillväxt i varken kontrollen eller i lakvattenkoncentrationerna kunde observeras. Denna vägmarkeringsprodukt beskrivs därför inte vidare. Då absorbansvärdena kunde påverkas av partiklar i varierande grad för alla tester, hade de större osäkerhet än fluorescensmätningarna och rapporteras därför inte.

I Figur 6 visas en sammanställning av alla testers effektmått och i Figur 7 visas korrelationen. Därefter presenteras resultaten separat för varje vägmarkeringsprodukt.

Figur. 6. Lag-fas och maximal tillväxthastighet för kontrollen och de olika lakvattenkoncentrationerna med felmarginaler. A) prefabricerad termoplast, B) varmapplicerad termoplast, C) vattenbaserad akrylatfärg, D) 2-komponent akrylatfärg.

*

*

18

Figur 7. Korrelationsdiagram för samtliga tester. Linjen visar sambandet mellan lag-fas och maximal

tillväxthastighet. A) prefabricerad termoplast, B) varmapplicerad termoplast, C) vattenbaserad akrylatfärg, D) 2-komponent akrylatfärg. För diagram C visas korrelation för alla data inklusive 50 g/l exponering med tillväxt som inte skiljer sig signifikant från 0 (streckad linje) och med lågt R2 för tillväxtmodellen, samt korrelation för behandlingar med pålitliga modeller (0, 12.5, och 25 g/l; heldragen linje).

3.1 Prefabricerad termoplast – 2TPPF

Fluorescens-mätningarna över tid för alger som exponerades för lakvatten från den prefabricerade termoplasten och kontrollen förklarades väl av tillväxtmodellen (R2 _{> 0,98, alla} koncentrationer). För den lägsta koncentrationen, 12,5 g/l, var både lag-fas och maximal tillväxthastighet signifikant lägre jämfört med kontrollen (Figur 6A), vilket indikerar att anpassningsperioden var kortare men tillväxten inte var lika hög som i kontrollen. För övriga koncentrationer, 100 g/l och 50 g/l och 25 g/l, fanns det inga signifikanta skillnader gentemot kontrollen. Av resultat från korrelationstestet framgick att det fanns en måttligt positiv korrelation mellan lag-fas och tillväxt (R2 = 0,57; Figur 7A). Det innebar att när lag-fasens längd ökade, ökade den maximala tillväxthastigheten vilket tyder på att anpassning för lakvattnet har skett i algpopulationen.

3.2 Varmapplicerad termoplast – 3TPHA

Fluorescens-mätningarna över tid för alger som exponerades för lakvatten från den varmapplicerade termoplasten och kontrollen förklarades väl av tillväxtmodellen (R2 _{> 0,98,} alla koncentrationer). Det fanns en signifikant skillnad för koncentrationerna 25 g/l och 100 g/l

19

med både längre lag-fas och högre maximal tillväxthastighet jämfört med kontrollen (Figur 6B), vilket indikerar att anpassningsperioden var längre men att algerna växte snabbare efter anpassningen jämfört med kontrollen. För koncentrationerna 12,5 g/l och 50 g/l fanns det inga signifikanta skillnader gentemot kontrollen. Av resultat från korrelationstestet framgick det att det fanns en stark positiv korrelation mellan lag-fas och tillväxt (R2 = 0,98; Figur 7B). Det innebar att när lag-fasens längd ökade, ökade den maximala tillväxthastigheten vilket tyder på att anpassning till lakvattnet har skett i algpopulationen.

3.3 Vattenbaserad akrylatfärg – 4ACWP

Fluorescensens-mätningarna över tid för alger som exponerades för lakvatten från den vattenbaserade akrylfärgen förklarades väl av tillväxtmodellen för koncentrationerna 25 g/l och 12,5 g/l och kontrollen (R2 > 0,87) medan den för koncentrationen 100 g/l var lägre (R2 < 0,68) och ingen lag-fas kunde beräknas. I koncentrationen 50 g/l registrerades ingen tillväxt vilket ledde till ett väldigt lågt R2 = 0,02, vilket innebar att det inte fanns något samband mellan algkoncentration och tid. Därför har den behandlingen har inte tagits med i responsanalysen. Koncentrationsberoende respons observerades för alla andra koncentrationer (0, 12,5, 25 och 100 g/l) för tillväxthastighet med en signifikant skillnad mellan kontrollen och koncentrationerna 25 g/l och 100 g/l (Figur 6C). I koncentrationerna 12,5 och 25 g/l fanns en signifikant längre lag-fas jämfört med kontrollen och längre lag-fas följdes av en lägre maximal tillväxthastighet (Figur 7C). Av resultat från korrelationstestet framgick att det fanns en måttlig negativ korrelation mellan tillväxthastighet och lag-fas när alla koncentrationer övervägdes (R2 = -0,33; Figur 7C). Men när endast tillförlitliga modeller (dvs. R2 >0,7) inkluderades blev den negativa korrelationen starkare (R2 = -0,89; Figur 7C). Det innebar att när lag-fasens längd ökade, minskade även den maximala tillväxthastigheten vilket tyder på att ingen anpassning till lakvattnet har skett i algpopulationen.

3.4 2-komponentakrylatfärg – 5CPAC

Fluorescensens utveckling över tid för alger som exponerades för lakvatten från 2-komponents-akrylatfärgen och kontrollen förklarades generellt bra av tillväxtmodellen (R2 _{varierade mellan} 0,74–0,99 i olika koncentrationer). För alla koncentrationer, förutom 0,625 g/l, fanns det en signifikant skillnad för lag-fas, som var längre gentemot kontrollen (Figur 6D). För den maximala tillväxthastigheten observerades en bifasisk respons med ett signifikant lägre värde i koncentration 0,625 g/l och signifikant högre värde i 6,25 g/l gentemot kontrollen. Av resultat från korrelationstestet framgick att det fanns en måttligt positiv korrelation mellan

tillväxthastighet och lag-fas (R2 =0.43; Figur 7D). Det innebar att när lag-fasens längd ökade, ökade även den maximala tillväxthastigheten vilket tyder på att anpassning till lakvattnet har skett i algpopulationen.

20

4 Diskussion

Toxicitetstudier i form av algtillväxthämningstest med lakvatten från vägmarkeringar har inte tidigare utförts. Vid analys av resultat utifrån denna studie kan man se att lakvattnen från de fyra vägmarkeringarna i olika omfattning påverkade lag-fas och/eller tillväxthastighet, vilket medförde hämning eller stimulering av algtillväxten (Tabell 2).

Tabell 2. Sammanfattning av de observerade effekterna för alla testmaterial. I tabellen redogörs de två effektmåttens avvikelser från kontrollen för att kunna avgöra vilken typ av effekt vägmarkeringstyperna har på algtillväxten.

Där man kan observera störst anpassningseffektivitet av algtillväxten är för lakvatten från varmapplicerad termoplast (3TPHA). Det finns en väldigt stark positiv korrelation mellan lag-fasen och den maximala tillväxthastigheten med ett R2-värde på 0,98. Algerna har en stor möjlighet att kompensera för lag-fasens längd genom selektiv överlevnad av celler som är mer toleranta och har hög tillväxthastighet i denna miljö. Anpassningseffektiviteten för test 2TPPF och 5CPAC är relativt hög med ett R2-värdepå0,57 respektive 0,43. Det visar på att algerna i viss utsträckning kan anpassa sig under lag-fasen och tillväxa efter den. I det fall där ingen anpassning kan påvisas är för test 4ACWP. Korrelationen är starkt negativ med ett R2_-värdepå -0,89. Algernas anpassningsförmåga är hämmad och det finns inte tillräckligt toleranta celler för att föröka sig efter lag-fas genom en ökad tillväxt i denna miljö.

För att fastställa de olika testernas toxicitet var det nödvändigt att initialt redogöra för hur effektintervallen skilde sig mellan test 4ACWP och 5CPAC. Detta med hänsyn till att 5CPAC innefattade lägre testkoncentrationer än de andra testen och det endast är möjligt att jämföra tillväxt för alger som exponerades för koncentrationerna 12,5 och 25 g/l. I Figur 8 visas avvikelser från kontroll för koncentrationerna 12,5 g/l och 25 g/l för 4ACWP och 5CPAC. Resultaten visar att exponering för 4ACWP orsakade mer tillväxthämning än för 5CPAC vid samma koncentrationer. Det som även framgår från Tabell 2, påvisar 4ACWP, den vattenbaserade akrylatfärgen, den största effekten för både lag-fas och maximal

Material Maximal tillväxthastig-het, % avvikelse från kontroll: min-max Lag-fas, % avvikelse från kontroll: min-max Minsta exponering (g/l) vid vilken en signifikant avvikelse registrerades Stimulering (↑) eller hämning (↓) av tillväxt Fysiologisk anpassning under test: Ja/Nej, R2 Figur

2TPPF -11% till +5% -45% till -4% 12,5 ↑↓ Ja, R2 _{= 0,57 6A, 7A}

3TPHA +2 till +20% +20 till +84% 25 ↓ Ja, R2 _{= 0,98 6B, 7B}

4ACWP -42 till -7% +80 till +136% 12.5 ↓ Nej, R2 _{= -0,89 6C, 7C}

21

tillväxthastighet och hämmande effekter sker för båda effektmåtten vid den lägsta koncentrationen, 12,5 g/l. 4ACWP 5CPAC -50 0 50 100 150 12.5 g/l Vägmarkering P e rc e n t a v v ik e ls e f rå n k o n tr o ll Max tillväxt Lag-fas 4ACWP 5CPAC 25 g/l Vägmarkering

Figur 8. Jämförelse av de observerade effekterna (min-max för lag-fas och maximalt tillväxt) för test 4ACWP (vattenbaserad akrylatfärg) och 5CPAC (2-komponentakrylatfärg).

Vägmarkeringarna kan rangordnas efter ökande toxicitet enligt följande: 2TPPF = 3TPHA < 5CPAC och < 4ACWP. Vid en jämförelse mellan 4ACWP och 5CPAC samt analys av effektsammanfattningens avvikelseintervall i Figur 8 framgår att 4ACWP uppvisar störst effekt på algernas tillväxt gentemot kontrollen och ingen tillväxtanpassning har skett; därför var det mest toxiskt. Test 5CPAC påvisar längre lag-fas vid koncentrationerna 12,5 och 25g/l gentemot test 2TPPF och 3TPHA, vilket indikerar att lakvattnet var mer toxiskt. Trots att test 3TPHA har en högre anpassningseffektivitet genom högre maximal tillväxthastighet under den exponentiella fasen har 2TPPF kortare lag-fas i förhållande till 3TPHA och är därför det material som indikerar minst toxisk effekt på algerna. Dock är det möjligt att 3TPHA har lika låg toxicitet som 2TPPF, detta med hänsyn till långsiktiga effekter och därför särskiljs de testen inte i rangordningen ovan. Ytterligare statistisk utvärdering är nödvändig för att åtskilja dessa vid bedömning av toxicitet.

Vad som orsakat den bifasiska responsen som kunde påvisas för de lägsta koncentrationerna i test 5CPAC är svårt att veta. En anledning kan vara att vissa ämnen som finns i lakvattnet kan ha bidragit till denna effekt, då det finns ämnen som orsakar mer effekt vid en lägre koncentration. Om lägre koncentrationer skulle testats för de andra vägmarkeringsprodukterna, kanske även de hade påvisat en sådan effekt.

För alla test, utom för 4ACWP, påvisades en stimulering vid högre koncentrationer, vilket skulle kunna tolkas som att en hormetisk effekt har skett. Det är svårt att ange exakta orsaker

22

till denna effekt. En teori kan vara att algerna som utsattes för stress vid de högre koncentrationerna kan använda substanser som skyddar mot stressen och som produceras i överflöd för tillväxtökning. En hormetisk effekt kunde påvisas i en studie gjord av Bauer m.fl., (2017) där mikroalgen Chlorella kessleri exponerades för magnetfält. Algerna producerade mer stressprotein och antioxidanter, vilket kan vara en anledning till en stimulering av tillväxten. Liknande studier med lakvatten från olika plastmaterial har genomförts. Till exempel utförde Capolupo m.fl. (2020) en toxicitetsstudie med lakvatten från bildäck (CTR) och olika typer av termoplaster (PET, PVC, polypropenen och polystyren) på sötvattenalgen Raphidocelis

supcapitata och marina algen Skeletonema costatum samt på musslan M. galloprovincialis.

CTR påvisade mest toxicitet på sötvattenalgen med EC50 vid 0,5% (0,4 g/l) och för marina algen var polypropen och PVC mest toxiskt med EC50 vid 18% (14,4 g/l) respektive 19% (15,2 g/l). De effektmått där mest toxicitet påvisades för musslan var utveckling (tidigt stadie), rörlighet och överlevnad vid exponering för CTR och PVC, med lägst EC50 för utveckling vid 2,22% (1,8 g/l). Tetu m.fl. (2019) utförde en studie med lakvatten från två av de vanligaste plastmaterialen, HDPE och PVC, på bakterien Prochlorococcus. Resultatet visade på inhibering av tillväxt vid halter från 1,6 g/l för HDPE och 0,125 g/l för PVC, vilket är i samma storleksordning som i denna studie. I en studie gjord av Bejgarn m.fl. (2015) testades lakvatten (exponering före och efter artificiell bestrålning) från 21 olika typer av kommersiella plastprodukter på kräftdjuret Nitocra spinipes. Av resultaten framgick att åtta av plastmaterialen påvisade akut toxicitet före och/eller efter bestrålning. Störst toxicitet innan bestrålning visade ABS/PC med LC50 vid 15 g/l och högsta toxicitet efter bestrålning påvisade PVC och polypropen med LC50 vid 21 g/l. I andra studier av Lithner m.fl, (2009; 2012) testades lakvatten från 58 olika plastprodukter och plastmaterial. Resultaten visade på akut toxicitet för kräftdjuret Daphnia magna framför allt från produkter av mjukgjord PVC, polyuretan och epoxi vid halter från 2 g/l.

Vid partikeltestet som genomfördes i den här studien på lakvatten 4ACWP och 5CPAC konstaterades att koncentrationen av partiklar var låg i förhållande till de koncentrationer som enligt Reichelt & Gorokhova (2019) orsakar tillväxthämning på alger och de flesta partiklarna var för stora för att påverka algceller (Reichelt & Gorokhova, 2019), se bilaga 1. Det går därför att anta att partikeleffekten var obefintlig och effekter vid testen inte kommer från partiklarna i lakvattnet utan lakvattnet i sig. Det är därför intressant att fokusera på den kemiska sammansättningen.

I den sammanställning och utvärdering av resultat från Microtox-test, metallanalyser och S-VOC-analyser som utförts av Lithner (2021) på lakvattnen som användes för algtoxicitets-testen, gjordes även jämförelser med resultaten från den här studien. Störst påverkan på bakterien Vibrio fischeri påvisade lakvattnet från den vattenbaserade akrylatfärgen (4ACWP) med EC50 vid 4,7 g/l. Även 2-komponentsakrylatfägen (5CPAC) visade på toxicitet med EC50 vid 16 g/l. Enbart en liten påverkan på bakterien sågs vid högsta testkoncentrationen (100 g/l) för lakvatten från den varmapplicerade termoplastiska vägmarkeringen (3TPHA). Detta följer i stora drag resultaten från toxicitetstesterna med algerna. För lakvattnet från den prefabricerade termoplastiska vägmarkeringsprodukten (2TPPF) var det en viss skillnad där EC50 påvisades

23

för Vibrio fischeri vid 13 g/l, medan algtesterna vid motsvarande koncentration visade tillväxthämning på bara 11% (Figur 6A).

Analyserna av metaller (uppmätta som löst halt) visade flest och högst metallhalter i lakvatten från den vattenbaserade akrylatfärgen (4ACWP), vilket även var det lakvatten som hade mest toxisk effekt för både alger och bakterier (Lithner, 2021).

Näst högst metallhalter hade lakvattnet från 2-komponentakrylatfärgen (5ACWP), vilket även var det som påvisade toxiska effekter för både alger och bakterier. Metallhalterna i lakvattnen från de termoplastiska vägmarkeringarna (2TPPF och 3TPHA) var låga, vilket eventuellt skulle kunna vara en bidragande orsak till att algerna inte påverkades särskilt mycket av dessa lakvatten. Även de uppskattade koncentrationerna av halvflyktiga organiska ämnena var lägst för lakvattnen från de termoplastiska vägmarkeringarna.

För den vattenbaserade akrylatfärgen (4ACWP) skulle det, på grund av den flytande färgens mycket höga pH (pH cirka 10), enligt Lithner (2021), eventuellt finnas en risk att provet kontaminerats av något ämne från de material som provet kommit i kontakt med.

S-VOC-screeninganalyserna som redovisas i Lithner (2021) påvisade flest träffar på halvflyktiga organiska föreningar (S-VOC) för lakvatten från 2-komponentakrylatfärgen (5CPAC), medan det lägsta antalet påträffades för den vattenbaserade akrylatfärgen (4ACWP) och den prefabricerade termoplastiska vägmarkeringen (2PFTP). 2-komponentakrylatfärgen var även den produkt som hade en extremt stark och påträngande kemikalielukt med flyktiga och/eller halvflyktiga ämnen som avgick till luften. Lukten avtog successivt under testets gång. Av Lithner (2021) framgår att en halvflyktig organisk förening som påträffades i höga uppskattade koncentrationer, och även skulle finnas enligt säkerhetsdatabladet, var butyl-akrylat. Det ämnet eller andra halvflyktiga ämnen skulle kunna vara en bidragande faktor till det tog lång tid innan algerna började tillväxa i lakvatten från 5CPAC. Av de ämnen som identifierades i de olika lakvattnen fanns det en del som är klassificerade som akut och/eller kroniskt giftiga för vattenlevande organismer. Flera S-VOC påträffades i lakvatten från mer än en vägmarkeringsprodukt. Flest lika träffar hade de termoplastiska vägmarkeringarna, vilket hade förväntats då de produkterna är lika varandra.

5 Slutsats

Algtillväxthämningstest med lakvatten från vägmarkeringar har tidigare aldrig utförts och det går därför inte att dra några generella slutsatser från dessa test. Det krävs mer tester med fler vägmarkeringsprodukter och med andra organismer, såsom bakterier, kärlväxter, kräftdjur och fisk, då olika arter är olika känsliga för exponering. I den här studien kunde man se effekter på algtillväxten vid exponering av lakvattnen och att de varierade mellan de olika vägmarkeringsprodukterna. Med de statistiska analyserna som användes var det dock inte möjligt att avgöra vilket av test 2TPPF och 3TPHA sompåvisade lägst toxicitet. Därför behövs en mer ingående statistisk utvärdering för att åtskilja dessa vid bedömning av toxicitet, vilket även kan vara lämpligt vid andra studier. För framtida studier kan det även vara intressant att

24

undersöka vad det är för ämnen som orsakar effekter och om dessa kan bytas ut till andra, mindre toxiska ämnen. För de vägmarkeringsprodukter som påvisade störst effekt vid lägsta lakvattenkoncentration skulle det dessutom vara intressant att utföra ett ytterligare test, enligt samma standard, med lägre koncentrationer, för att se om effekter skulle uppkomma vid lägre koncentrationer.

Acknowledgements/tack

Detta examensarbete avslutar ett tvåårigt masterprogram i Miljö- och hälsoskydd vid Stockholms universitet. Studien har finansierats av VTI, inom ramen för regeringsuppdraget om mikroplast från vägtrafiken. Den utfördes tillsammans med VTI på Institutionen för miljövetenskap, vid Stockholms universitet.

Det har varit en ära att få delta i detta projekt, då det är den första toxicitetsstudien med vägmarkeringsprodukter. Denna del av min utbildning har varit mycket lärorik och den kunskap jag fått under projektets gång har gett mig en ökad förståelse för forskningsområdet och hur arbetet är utformat i laborativ miljö.

Jag vill börja med att tacka alla på Stockholms universitet som involverat sig i projektet. Sandra Lage, för allt stöd under den experimentella delen av studien och som instruerade mig i grunderna för laborativt arbete och till Sophia Reichelt för hennes hjälp under en del av experimentet. Ett varmt tack till Sandra Lücke Johansson och Birgitta Liewenborg, för ert engagemang kring alla mina frågor, stora som små, under den experimentella delen.

Sist, men inte minst, vill jag tacka mina handledare, Delilah Lithner från VTI och Elena Gorokhova från Stockholms universitet. Med en outtröttlig hjälpsamhet som jag inte kan vara nog tacksam för, vägledde de mig under hela projektet, från den experimentella delen till uppsatsskrivandet. Deras expertis och stöd har varit ovärderlig och utan dem skulle detta inte ha varit möjligt!

25

Referenser

Anderberg, B. (2020). Slutpunkt för blykromater i färg inom ett par år. Aktuell hållbarhet. Publicerad: 2020-08-19. https://www.aktuellhallbarhet.se/miljo/kemikalier/slutpunkt-for-blykromater-i-farg-inom-ett-par-ar/

Andersson-Sköld, Y., Gustafsson, M., Johannesson, M., Järlskog, I., Lithner, D., Polukarova, M. & Strömvall, A-M. (2020). Microplastics from tyre and road wear - A literature review. Statens väg- och transportforskningsinstitut. DOI: 10.13140/RG.2.2.34478.54083

Andriukonis, E. & Gorokhova, E. (2017). Kinetic 15N-isotope effects on algal growth.

Scientific Reports 7, 1-9. https://doi.org/10.1038/srep44181

Baranyi, J. & Roberts, T. A. (1994). A dynamic approach to predicting bacterial growth in food. International Journal of Food Microbiology, 23 (3-4), 277-294.

https://doi.org/10.1016/0168-1605(94)90157-0

Bauer, L. M., Costa, J. A. V., da Rosa, A. P. C. & Santos, L. O. (2017). Growth stimulation and synthesis of lipids, pigments and antioxidants with magnetic fields in Chlorella kessleri cultivations. Bioresource Technology 244, 1425–1432.

https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.06.036

Bejgarn, S., MacLeod, M., Bogdal, C., & Breitholtz, M. (2015). Toxicity of leachate from weathering plastics: An exploratory screening study with Nitocra spinipes. Chemosphere 132, 114-119. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2015.03.010

ComBase Team. (2020). ComBase: A WebResource for Quantitative and Predictive Food Microbiology. University of Tasmania; USDA Agricultural Research Service.

https://www.combase.cc/index.php/en/

Capolupo, M., Sørensen, L., Jayasena, K.D.R. & Booth, A. M. (2020) Chemical composition and ecotoxicity of plastic and car tire rubber leachates to aquatic organisms. Water Research

169, 1-11. https://doi.org/10.1016/j.watres.2019.115270

DM Stat-1. (2021-01-16) The Correlation Coefficient Defined. http://www.dmstat1.com/res/TheCorrelationCoefficientDefined.html

dos Santos, É. J., Herrmann, A. B., Prado, S. K., Fantin, E. B., dos Santos, V. W., de Oliveira, A. V. M. & Curtius, A. J. (2013). Determination of toxic elements in glass beads used for pavement marking by ICP OES. Microchemical Journal 108: 233–238.

https://doi.org/10.1016/j.microc.2012.11.003

Europeiska kommissionen för standardisering, CEN (2002). EN 12457-2 Characterisation of waste – Leaching – Compliance test for leaching of granular waste materials and sludges – Part 2: One stage batch test at a liquid to solid ratio of 10l/kg for materials with particle size below 4 mm (with or without size reduction).

Franzellitti, S., Canesi, L., Auguste, M., Wathsala, H.G.R. & Fabbri, E. (2019) Microplastic exposure and effects in aquatic organisms: A physiological perspective. Environmental

26

Gambardella, C., Piazza, V., Albentosa, M., Bebianno, M. -J., Cardoso, C., Faimali, M., Garaventa, F., Garrido, S., González, S., Pérez, S., Sendrac, M. & Beiras, R. (2019) Microplastics do not affect standard ecotoxicological endpoints in marine unicellular

organisms. Marine Pollution Bulletin 143, 140–143. DOI: 10.1016/j.marpolbul.2019.04.055 GESAMP (2015). “Sources, fate and effects of microplastics in the marine environment: a global assessment” (Kershaw, P. J., ed.). (IMO/FAO/UNESCO

IOC/UNIDO/WMO/IAEA/UN/UNEP/UNDP Rep. Stud. GESAMP No. 90. https://ec.europa.eu/environment/marine/good-environmental-status/descriptor-10/pdf/GESAMP_microplastics%20full%20study.pdf

Gorokhova, E., Ek, K. & Reichelt, S. (2020) Algal Growth at Environmentally Relevant Concentrations of Suspended Solids: Implications for Microplastic Hazard Assessment.

Frontiers in Environmental Science, 8, 1-13. https://doi.org/10.3389/fenvs.2020.551075

Grand View Research. (2016). Polymer modified bitumen market worth $13.34Bn by 2022. Tillgänglig (2021-01-19): https://www.grandviewresearch.com/press-release/global-polymer-modified-bitumen-market

Grand View Research. (2020). Traffic road marking coatings: Market estimates to 2025. Bulk

chemicals. Grand View Research, Inc., USA.

Gunaalan, K., Fabbri, E., & Capolupo, M. (2020). The hidden threat of plastic leachates: A critical review on their impacts on aquatic organisms. Water Research, 184, 1-15.

https://doi.org/10.1016/j.watres.2020.116170

Harmon, M. S. (2018) The Effects of Microplastic Pollution on Aquatic Organisms. Zeng, E. Y. (Red.), Microplastic Contamination in Aquatic Environments: An Emerging Matter of

Environmental Urgency (s. 249-270) https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813747-5.00008-4

JMP - Statistical Discovery from SAS. (2021-01-07) What is correlation.

https://www.jmp.com/en_au/statistics-knowledge-portal/what-is-correlation.html

Kalogerakis, N., Karkanorachaki, K., Kalogerakis, G. C., Triantafyllidi, E. I., Gotsis, A. D., Partsinevelos, P., & Fava, F. (2017) Microplastics Generation: Onset of Fragmentation of Polyethylene Films in Marine Environment Mesocosms. Frontiers in Marine Science. 4 (84), 1-15. https://doi.org/10.3389/fmars.2017.00084

Kaps, R. & Dodd, N. (2018) Development of the EU Green Public Procurement (GPP)

Criteria for Paints, Varnishes and Road Markings. Technical Report with final criteria.

doi:10.2760/236335, JRC110563.

https://ec.europa.eu/environment/gpp/pdf/Technical%20Report%20for%20Paints%20Varnish es%20and%20Road%20Markings%20(FINAL).pdf

Kemikalieinspektionen. (2020-11-22). Det här är plast. https://www.kemi.se/kemikalier-i-vardagen/kemikaliesmarta-val/material-och-amnen/plast/det-har-ar-plast

Lithner, D. (2021). Toxicitetstest och kemiska analyser på lakvatten från olika typer av

27

Lithner, D., Damberg, J., Dave, G. & Larsson, Å. (2009). Leachates from plastic consumer products – Screening for toxicity with Daphnia magna. Chemosphere 74, 1195-1200. https://doi.org/10.1016/j.chemosphere.2008.11.022

Lithner, D., Nordensvan, I. & Dave, G. (2012). Comparative acute toxicity of leachates from plastic products made of polypropylene, polyethylene, PVC, acrylonitrilebutadiene- styrene and epoxy to Daphnia magna. Environmental Science and Pollution Research, 19, 1763-1772. https://doi.org/10.1007/s11356-011-0663-5

Magnusson, K., Eliasson, K., Fråne, A., Haikonen, K., Hultén, J., Olshammar, M., Stadmark, J. & Voisin, A. (2016) Swedish sources and pathways for microplastics to the marine

environment A review of existing data. Svenska Miljöinstitutet.

https://www.ivl.se/download/18.7e136029152c7d48c205d8/1457342560947/C183+Sources+ o%20f+microplastic_160307_D.pdf

Medrano, D. E. & Thompson, R. (2018) Occurrence, Fate, and Effect of Microplastics in Freshwater Systems. Zeng, E, -Y (Red), Microplastic Contamination in Aquatic

Environments. (s. 95-132) https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813747-5.00004-7

Napper, I. E. & Thompson, R. C. (2019) Marine Plastic Pollution: Other Than Microplastic. Letcher, T, -M., Vallero, D, -A. (Red.), Waste. A Handbook for Management (2 uppl., s. 425-442) https://doi.org/10.1016/B978-0-12-815060-3.00022-0

Naturvårdsverket. (2017). Mikroplaster. Redovisning av regeringsuppdrag om källor till

mikroplaster och förslag på åtgärder för minskade utsläpp i Sverige. (Rapport 6772)

https://www.naturvardsverket.se/Documents/publikationer6400/978-91-620-6772-4.pdf?pid=20662

Naturvårdsverket. (2021-01-23) Nedskräpning av plast.

https://www.naturvardsverket.se/Miljoarbete-i-samhallet/Miljoarbete-i-Sverige/Uppdelat-efter-omrade/Plast/Plastens-miljoeffekter/Nedskrapning-av-plast/

Nichols, H. W. (1973). Growth media - freshwater. Stein J. R. (red.), Handbook of

Phycological Methods. Cambridge University Press, New York, (s. 16-17).

http://seniorbiology.com/MBL_medium_csiro.pdf

OECD. (2011). Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test,

OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, Effects on Biotic Systems.OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264069923-en

Plastic Europe. (2021-01-21). An analysis of European plastics production, demand and

waste data.

https://www.plasticseurope.org/en/resources/publications/4312-plastics-facts-2020

Plastic Europe. (2021-01-21). Plastics – the Facts 2010 An analysis of European plastics

production, demand and recovery for 2009.

28

Reichelt, S. & Gorokhova, E. (2020). Micro- and Nanoplastic Exposure Effects in Microalgae: A Meta-Analysis of Standard Growth Inhibition Tests. Froniers in

Environmental Science, 8, 1-17. https://doi.org/10.3389/fenvs.2020.00131

SAPEA, Science Advice for Policy by European Academies (2018). A Scientific perspective

on microplastics in nature and society. Evidence Review Report No. 4

https://www.sapea.info/wp-content/uploads/report.pdf

Shim, W. J., Hong, S. H. & Eo, S. Marine Microplastics: Abundance, Distribution, and Composition. - (2018) Zeng, E, -Y (Red), Microplastic Contamination in Aquatic

Environments: An Emerging Matter of Environmental Urgency (s. 1-26)

https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813747-5.00001-1

Siegfried, M., Koelmans, A. A., Besseling, E. & Kroeze, C. (2017). Export of microplastics from land to sea. A modelling approach. Water Research 127, 249–257.

https://doi.org/10.1016/j.watres.2017.10.011

Skandinaviska vägmarkeringsföreningen. (2021-01-19). Om vägmarkering. http://www.svmf.nu/index.php/om-vagmarkering/

Statens Offentliga Utredningar. (2018). Nedskräpning och nedbrytning av plast i miljön,

Delredovisning från Utredningen om hållbara plastmaterial. (M 2017:06)

https://www.regeringen.se/49592d/contentassets/a709b3731d1542479a4d76cec9ba6d63/delre dovisning-fran-utredaren-mars-2018.pdf

Statistiska Centralbyrån. (2021-01-07). Tolkning av felmarginaler.

https://www.scb.se/contentassets/191a23c90f344a8290110c3d13a435b6/tolkning-av-felmarginaler.pdf

Sundt, P., Schulze, P-E. & Syversen, F. (2014) Sources of microplastics-pollution to the

marine environment. Norwegian Environment Agency, Miljødirektoaret.

https://www.miljodirektoratet.no/globalassets/publikasjoner/m321/m321.pdf

Tetu, S. G., Sarker, I., Schrameyer, V., Pickford, R., Elbourne, L. D. H., Moore, L. R. & Paulsen, I. T. Plastic leachates impair growth and oxygen production in Prochlorococcus, the ocean’s most abundant photosynthetic bacteria. Communications Biology 2 (184), 1-9. https://doi.org/10.1038/s42003-019-0410-x

Thompson, R. C., Olsen, Y., Mitchell, R. P., Davis, A., Rowland, S. J., John, A. W. G., McGonigle, D. & Russell, A. E. (2004) Lost at Sea: Where Is All the Plastic? Science. 304

(5672), 838. DOI:10.1126/science.1094559

Zalasiewicz, J., Gabbott. S. & Waters, C. N. (2019) Plastic Waste: How Plastics Have Become Part of the Earth’s Geological Cycle. Letcher, T, -M. & Vallero, D, -A. (Red.),

Waste. A Handbook for Management (2 uppl., s. 443-452)

https://doi.org/10.1016/B978-0-12-815060-3.00023-2

Welden, N. (2019) Microplastics: Emerging Contaminants Requiring Multilevel

Management. Letcher, T, -M. & Vallero, D, -A. (Red.), Waste. A Handbook for Management (2 uppl., s. 405–424) https://doi.org/10.1016/B978-0-12-815060-3.00021-9

29

Bilaga 1 - Particle size distribution measurements

The particle size distribution (PSD) characterizes the relationship between particle abundance and size. Laser diffraction measurements are commonly used to measure PSD in suspended sediments because the measurement process is less disturbing to the aggregates than other methods (Serra et al. 2001). The measurement principle is based on the light scattering by passing a rotating laser beam through the glass wall and focusing the near-angle light pulses from the laser beam/particle collisions onto the photodetector; the collision rate is then converted into particle count and size data.

Laser particle counter (Spectrex, model PC-2000, Redwood City, USA) with integrated counting mode (32 bins) in the 1-100 µm range was used to measure PSD in all test mixtures. The instrument performance was verified daily using a standard (4.2 µm polystyrene spheres in an alcohol/freon liquid) and standard blank provided by the manufacturer and/or particle-free water. Testing replicate samples of the polymer and kaolin standards showed that the between-replicate variation of particle counts was less than 6 % for <10 µm range and less than 3 % for < 60 µm range.

GRADISTAT program, version 8.0 (Blott and Pye 2001) was used to analyze PSD data according to the method by Folk and Ward (Folk and Ward 1957). We calculated mean and median (D50) particle sizes, mode particle size for non-unimodal distributions, particle size which 10 % of the sample is below (D10), particle size which 90 % of the sample is above (D90). Other parameters, such as sample sorting (σ), skewness, and kurtosis were not calculated, because they are not reliable for multimodal spectra.

30

Table S1. Particle size distribution parameters calculated by GRADISTAT for stock

suspensions of 4ACWP and 5CPAC. Three technical replicates were obtained for each spectrum and averaged by the instrument software. See Figure S1 for the visualization of the spectra.

Distribution parameters, μm Material 4ACWP 5CPAC

Concentration, mg/L 8.2 18.3 Sample type Multimodal Multimodal

MODE 1 46.50 95.00 MODE 2 31.50 61.00 MODE 3 21.50 D10 21.27 36.12 MEDIAN or D50 41.99 92.20 D90 51.33 97.60 (D90 / D10) 2.413 2.702 (D90 - D10) 30.06 61.48 (D75 / D25) 1.539 1.728 (D75 - D25) 16.73 40.24

31

Figure S1. Particle size distributions in the leachates of the test materials used in the

experiments. Only materials with high background absorbance levels indicating presence of particulates were analyzed for PSD. See Table S1 for the spectral parameters.