Verifiering av metod för dithiothreitolbehandling av
testerytrocyter
Författare: Jonna Gustafsson
Ämne: Biomedicinsk laboratorievetenskap
Examensarbete
Verifiering av metod för dithiothreitolbehandling av testerytrocyter
Jonna Gustafsson
Examensarbete i Biomedicinsk laboratorievetenskap 15 högskolepoäng Filosofie Kandidatexamen
Handledare:
Kim Ekblom, överläkare Klinisk kemi och
Transfusionsmedicin Region Kronoberg Centrallasarettet Växjö 351 85 Växjö
Magnus Ståhle, laboratorieingenjör Institutionen för kemi och biomedicin Linnéuniversitetet
391 82 Kalmar
Examinator:
Per Nilsson, universitetslektor Institutionen för kemi och biomedicin Linnéuniversitetet
391 82 Kalmar
Examensarbetet ingår i Biomedicinska analytikerprogrammet 180 högskolepoäng.
SAMMANFATTNING
Personer som lider av multipelt myelom (MM) behandlas ofta med daratumumab.
Daratumumab fäster till CD38 på erytrocyter vilket leder till problem med
förenlighetsprövning, såsom antikroppsidentifiering och screening. När daratumumab i patientens plasma binder till testerytrocyter, ger det upphov till panreaktivitet.
Dithiothreitol (DTT), ett reduktionsmedel, denaturerar CD38 så
daratumumabantikropparna inte kan binda in och panreaktiviteten motverkas. Genom att DTT-behandla testerytrocyter kan kliniskt viktiga antikroppar påvisas och säkrare blodtransfusioner genomföras. En nackdel med DTT är att även Kell-antigenet bryts ner och anti-Kell kan ej påvisas. Syftet med examensarbetet var att verifiera metoden för DTT- behandling av testerytrocyter utifrån Region Östergötlands metodbeskrivning. I studien ingick totalt 21 plasmaprover från totalt 10 daratumumabbehandlade patienter.
Testerytrocyterna behandlades med DTT enligt hänvisande metodbeskrivning.
Obehandlade samt DTT-behandlade testerytrocyter testades mot plasmaproverna utan tillsatta blodgruppsantikroppar. DTT-behandlade testerytrocyter testades därefter mot plasmaproverna med tillsatt känd antikropp. Resultatet visade på en
daratumumabinterferens mot obehandlade testerytrocyter och en avlägsnad interferens mot DTT-behandlade testerytrocyter. Samtliga tillsatta antikroppar kunde identifieras förutom anti-K vilket var förväntat, samt anti-𝑠̅. Anti-𝑠̅ är främst betydelsefull vid
gravidimmunisering och är därför inte lika viktig i detta sammanhang. Positiva respektive negativa prediktiva värdet (PPV och NPV) utföll 100% respektive 50%. NPV blev sämre på grund av få sanna negativa resultat i studien. Resultatet för positive respektive negative percentage agreement (PPA och NPA) utföll 88,9% respektive 100%. Under studien var hemolys ett problem och vidare studier krävs för att undersöka hållbarheten på DTT- behandlade testerytrocyter. Slutsatsen är att metodbeskrivningen för DTT-behandling av testerytrocyter kan tillämpas med vetskapen att anti-K och anti-𝑠̅ ej kan detekteras.
Nyckelord
Dithiothreitol (DTT), Daratumumab, Testerytrocyter, Metodverifiering
ABSTRACT
People suffering from multiple myeloma are often treaded with daratumumab.
Daratumumab binds to CD38 on red blood cells (RBC) which interferes with compatibility tests, such as antibody identification and screening. Dithiothreitol (DTT), a reducing agent, acts to denature CD38 so daratumumab cannot bind. DTT treatment of RBC reagents make it possible to detect clinically significant antibodies and safer transfusions can be
performed. Anti-K could not be identified because DTT destroyed the antigen. The objective of this study was to verify the method of DTT treatment of RBC reagents based on the method description of the Östergötland region. Untreated and DTT treated RBC reagents, respectively, were tested against plasma samples containing no blood group antibodies. DTT-treated RBC reagents were then tested against the plasma samples with added known antibody. The results showed a daratumumab-interference against untreated RBC reagents and that the interference was eliminated with DTT-treated RBC reagents.
All antibodies could be identified, except anti-K and anti-𝑠̅. Anti-𝑠̅ is particularly important in pregnancy immunization and is therefore not as important in this context. Positive and negative predictive values (PPV and NPV) were 100% and 50% respectively. NPV was low due to few true negative results in this study. The result for positive and negative percentage agreement (PPA and NPA) was 88,9% and 100% respectively. During the study, hemolysis was a problem and further studies are needed to investigate the
sustainability of RBCs. The conclusion is that the method description for DTT treatment of RBC reagents can be applied with the knowledge that anti-K and anti-𝑠̅ cannot be detected.
Keywords
Dithiothreitol (DTT), Daratumumab, RBC reagents, method verification
FÖRKORTNINGAR
ADCC Antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet ADCP Antikroppsberoende cellulär fagocytos AGT Antiglobulin geltest
AHG Antihumant globulin DAT Direkt antiglobulintest
CDC Komplement-beroende cytotoxicitet DTT Dithiothreitol
IAT Indirekt antiglobulintest IgG Immunoglobulin G IgM Immunoglobulin M
LISS “Low ionic strength solution”
NPA ”Negative percentage agreement”
NPV Negativt prediktivt värde PBS Fosfatbuffrad koksaltlösning PPA ”Positive percentage agreement”
PPV Positivt prediktivt värde
Innehållsförteckning
INTRODUKTION 1
Blodgruppsantikroppar 1
Testerytrocyter 2
Coombs test 3
Avläsning och agglutinationsgradering 5
Daratumumab 5
Dithiothreitol 6
Metodvalidering/verifiering 7
Syfte 7
MATERIAL OCH METODER 8 Val av metod 8
Provmaterial 8
Förberedelser Provmaterial 8
Beredning av fosfatbuffrad koksaltlösning, PBS 9 Beredning av Dithiothreitol (DTT) 9 Tining, tvättning och beredning av 0,8% Testerytrocyter 9 Apparatur och tillbehör 10
Utförande 10
DTT-behandling av 0,8% Testerytrocyter 10 Kvalitetskontroll 10 Antikroppsutredning 11 Statistik 11
Etik 12
RESULTAT 13 Kvalitetskontroll av testerytrocyter 13
Antikroppsutredning 16
Statistik 18
DISKUSSION 18
SLUTSATS 23
TACKORD 24
Referenser 25
INTRODUKTION
Varje substans som immunförsvaret kan reagera mot karaktäriseras som ett antigen. På ytan av alla kroppens celler yttrycks olika antigen. Immunförsvaret reagerar normalt inte på kroppens egna antigen, men skulle ett främmande antigen hamna i kroppen triggas en attack från immunförsvaret (1). En blodgrupp definieras som ett antigen på ytan av en erytrocyt. Antigenet utgörs av proteiner, glykoproteiner eller glykolipider beroende på vilket blodgruppssystem som används. Antigenet bildar endast en blodgrupp om det finns en specifik alloantikropp som kan detektera antigenet. En alloantikropp reagerar på främmande antigen, dvs. på antigen som inte uttrycks på individens egna celler (2).
Erytrocyternas yta är täckta med olika antigener och vilka som uttrycks beror på
genuppsättningen. Hittills har 350 erytrocytantigener upptäckts och de kategoriseras i olika system. Ett blodgruppssystem består av antigener som styrs av en enda gen, eller två närliggande gener utan någon påvisbar rekombination (3). Totalt finns idag 38 registrerade blodgruppssystem och dessa styrs av totalt 45 gener (4).
Det viktigaste blodgruppsystemet inom transfusionsmedicin är ABO-systemet följt av Rh- systemet. Transfusion av icke ABO-kompatibla erytrocyter leder nästan alltid till
transfusionsreaktion (2).
När ett främmande blodgruppsantigen hamnar i blodcirkulationen, exempelvis vid blodtransfusion, triggas en reaktion från immunförsvaret att producera alloantikroppar specifikt mot detta antigen (1). Tillsammans med typning av ABO-gruppen är screening för icke naturliga antikroppar det viktigaste inför blodtransfusion för att säkerställa att kompatibla erytrocyter transfunderas (3).
Blodgruppsantikroppar
Erytrocytantikroppar, alloantikroppar riktade mot främmande antigen på erytrocyter, utgörs av reguljära samt irreguljära antikroppar. Reguljära antikroppar kallas även för naturliga antikroppar och de förekommer inom ABO-systemet. Människor utan antigen A respektive B på eytrocyternas yta har reguljära antikroppar mot dessa. Irreguljära
antikroppar däremot förekommer inte naturligt i kroppen utan bildas vid immunisering.
Immunisering uppkommer vid blodtransfusion, graviditet eller vid förlossning då
erytrocyter med främmande ytantigen hamnar i blodbanan och triggar igång immunförsvaret (2).
Ett primärt svar från immunförsvaret aktiveras om det är första gången oförenliga erytrocyter påträffas i blodbanan. Det produceras immunogobulin M (IgM) några dagar efter erytrocyterna hamnat i blodbanan. Immunförsvaret, specifikt B-cellerna, övergår därefter till att producera immunoglobulin G (IgG) och det har bildas irreguljära antikroppar som kommer cirkulera i plasman (5).
De reguljära antikropparna utgörs nästan uteslutet av IgM, men irreguljära antikroppar däremot utgörs främst av IgG (2). Strukturen för IgM är en pentamer, se figur 1, och dess storlek är väldigt stor, vilket medför att molekylen kan brygga flera erytrocyter trots Z- potentialen. Z-potentialen mellan erytrocyter är en elektrisk potential som uppstår av erytrocyternas negativt laddade ytor. Dessa laddningar motverkar interaktion mellan erytrocyter (6). IgM kan därför direkt agglutinera erytrocyter. IgM antikroppar reagerar bäst vid 20˚C, men kan även reagera vid 37 ℃. IgG antikroppen är en monomer som inte kan överbrygga Z-potentialen mellan erytrocyterna och kan inte direkt agglutinera (7). För agglutination med IgG krävs då en teknik som tillämpar antihumant globulin (AHG).
Under centrifugering främjar AHG agglutination genom att binda till IgG-antikropparna som bundit till antigenerna på erytrocyterna. IgG reagerar optimalt vid 37˚C (2, 7).
Figur 1: Strukturen hos immunoglobulin M (IgM) respektive G (IgG).
Illustration: Jonna Gustafsson
Testerytrocyter
För att kunna ge förenliga erytrocyter till patienter med irreguljära alloantikroppar krävs att antikropparna detekteras och identifieras. Med antikroppscreening fångas många av de kliniskt viktiga antikropparna och med antikroppsidentifiering kan de också klassas. Till analyserna används testerytrocyter som är erytrocyter från blodgivare med blodgrupp O.
Testerytrocyter har en specifik fenotyp för olika antigen på erytrocyternas yta (8).
Testerytrocyter började användas ungefär 1945 i samband med att metoden indirekt Coombs test, även kallat indirekt antiglobulintest (IAT), utvecklats. Bakom metoden stod Robert Coombs, vars namn blev omnämnt som uppfinnaren bakom antiglobulintestet (9). I sin tur finns det olika tester som tillämpar IAT-tekniken; den vanligaste är antiglobulin geltest (AGT). AGT kom till Europa under 80-talet och det är det mest sensitiva testet för att detektera alloantikroppar i plasman (9, 10).
För att detektera en antikropp med testerytrocyter ska dessa testerytrocyter komma från minst åtta blodgivare enligt riktlinjer från svensk förening för klinisk immunologi och transfusionsmedicin. För att identifiera en kliniskt betydelsefull antikropp krävs att två testerytrocyter är antigenpositiva respektive antigennegativa mot erytrocytantikroppen. Det betyder att det krävs två testerytrocyter som saknar antigenet respektive uttrycker antigenet för den specifika antikroppen (8). En sammanställning av ett flertal testerytrocyter som alla uttrycker olika antigen ger upphov till en panel vars mönster möjliggör identifiering av kliniskt viktiga antikroppar (8, 11).
Coombs test
Coombs test, även kallat för indirekt antiglobulintest, används för detektion av antikroppar genom att utnyttja anti-humant globulin som ger upphov till agglutination. Antiglobulintest är antingen direkt antiglobulintest (DAT) eller indirekt antiglobulintest (IAT) (10, 12).
DAT används för att detektera inbundna antikroppar eller komplementfaktor C3 på erytrocyternas yta för att bl.a. påvisa autoimmun hemolytisk anemi. För att istället detektera cirkulerande antikroppar i plasman används IAT. Vid IAT avlägsnas plasman från blodprovet som sedan testas mot testerytrocyter med känd antigenicitet. Till detta adderas AHG för agglutination. En agglutination, positivt resultat, betyder att en antikropp finns närvarande i plasman (10, 12).
Olika metoder har utvecklats som tillämpar antiglobulintekniken. Det hittills känsligaste testet för att detektera erytrocytantikroppar i plasman är antiglobulin geltest (AGT). Detta test använder sig av mikrorör fyllda med gel, buffert och eventuellt reagens. För
tillämpning av AGT med antiglobulinteknik innehåller gelen antiglobulin. Vid andra tester kan gelen innehålla andra reagenser såsom anti-A respektive -B för blodgruppering (10, 13).
Vid användning av kolonnagglutination, exempelvis AGT, tillämpas ofta så kallade gelkort. Dessa består av reaktionsbrunnar som övergår till en kolonn. Kolonnerna kan vara fyllda med glaskulor eller gel; dextran-akrylamid (10, 14).
Antiglobulin geltest (AGT) presenterades 1988 i Europa. Till AGT används ett gelmikrorör som innehåller anti-IgG, dvs. AHG. Till reaktionsbrunnen tillsätts 25 mikroliter plasma eller serum samt 50 mikroliter 0,8% erytrocytsuspension.
Suspensionen består av testerytrocyter löst i ”low ionic strength solution” (LISS) (10).
Denna lösning bidrar till att fria joner som kan påverka resultatet reduceras (2). Schematisk bild av AGT med IAT framgår i figur 2. Under 15 minuter inkuberas lösningen i 37 ℃ och därefter centrifugeras de i ungefär 70g (10).
Vid en negativ reaktion, passerar erytrocyterna gelkolonnen och det bildas en pellet. Vid positiva reaktioner däremot, på grund av stora agglutinationsaggregat, fastnar erytrocyterna i gelen. Sedan sin tillämpning i Europa 1988 har antiglobulina geltester visat sig vara en känslig analys samt lätt att utföra (10, 13).
Figur 2: Schematisk bild som beskriver IAT i form av antiglobulin gel test (AGT). Plasma och erytrocyter tillsätts i reaktionsbrunnen och lösningen får efter inkubering centrifugeras ner i gelkolonnen som är fylld med buffert och antihumant globulin.
Illustration: Jonna Gustafsson
För agglutination krävs att fördelningen mellan antigen och antikropp är optimal. Ett överskott av antigen kan dämpa en agglutination, därför är ett överskott av antikroppar att föredra (2).
Avläsning och agglutinationsgradering
För avläsning placeras gelkorten mot en väl belyst bakgrund. Reaktionerna avläses makroskopiskt med graderingarna negativt, 1+, 2+, 3+ och 4+. Vid negativa reaktioner är erytrocyterna samlade på kolonnens botten som en pellet, dvs. ingen agglutination. En 1+
reaktion karaktäriseras av agglutinerade erytrocyter i den lägre halvan av gelkolonnen. En 2+ reaktion indikeras av erytrocyter fördelade över hela gelkolonnen. När agglutinerade erytrocyter placeras i den övre halvan av kolonnen är reaktionen 3+. Vid 4+ reaktion placeras de agglutinerade erytrocyterna allra högst upp på gelkolonnen som ett fast band (10). Agglutinationsgraderingarna framgår visuellt i figur 3.
Daratumumab
Daratumumab är en human immunoglobulin G1 monoklonal antikropp som används till behandling för multipelt myelom, speciellt vid återfall. Multipelt myelom är en malign sjukdom inom B-cellslinjen. Sjukdomen karaktäriseras av en neoplastisk monoklonal expansion av plasmaceller i benmärgen. Trots befintliga behandlingar finns hittills inget botemedel mot sjukdomen (15, 16).
Daratumumab (anti-CD38) binder till CD38 (Cluster of differentiation 38) på ytan av plasmacellerna. CD38 är ett typ II transmembran-glykoprotein som har en roll vid bland annat cellsignalering och receptor-medierade adhesioner. Maligna plasmaceller har en hög
Figur 3: Agglutinationsgraderingarna 4+, 3+, 2+, 1+ och negativt (-) på ett gelkort.
Illustration: Jonna Gustafsson
expression av CD38. I normala fall uttrycks glykoproteinet lågt på bland annat lymfoida- och myeloida celler (15, 17). När daratumumabantikroppen binder till CD38 leder det till inducerad celldöd av dessa maligna plasmaceller genom bland annat antikroppsberoende cellulär fagocytos (ADCP), komplement-beroende cytotoxicitet (CDC),
antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) samt apoptos (15, 18).
CD38 uttrycks inte bara på lymfoida- och myeloida celler, utan även på erytrocyter. På grund av detta uppstår problem vid analyser inom transfusionsmedicin (19).
Daratumumabantikropparna i patientens plasma/serum binder till CD38 hos
testerytrocyterna vilket ger upphov till positiv reaktion vid screening av antikroppar och vid antikroppsutredning, principen framgår i figur 4. Daratumumab bidrar till en
panreaktivitet som kan bestå upp till 6 månader efter avslutad behandling. Panreaktivitet karaktäriseras av en positiv reaktion mellan plasma och samtliga testerytrocyter (16, 19, 20).
Panreaktiviteten påträffas i IAT vid antikroppsdetektion (screening),
antikroppsidentifieringspaneler samt AHG-korsmatchningar. Daratumumab kan därför maskera viktiga alloantikroppar och ökar risken att ge oförenliga erytrocyter (20).
Dithiothreitol
Dithiothreitol (DTT) verkar enligt flera studier kunna motverka panreaktiviteten som uppkommer av daratumumab (20). DTT är ett reduktionsmedel som denaturerar CD38 på
Figur 4: Till vänster beskrivs daratumumabantikroppar som binder till CD38 på ytan av erytrocyterna.
Till höger visas hur antihumant globulin (AHG) binder till Fc-delen av daratumumabantikropparna och ger upphov till agglutination och ett falskt positivt resultat.
Illustration: Jonna Gustafsson
erytrocyterna genom att bryta disulfidbindningar i den extracellulära domänen av glykoproteinet. Detta medför att daratumumabantikroppen ej kan binda in (21, 22).
DTT kan också förstöra Kell-antigenet och andra antigen inom blodgruppsystemet Kell (16, 20). Erytrocytenheter som är negativa för Kell-antigenet måste då ges till patienten, om patienten är känd att vara positiv för Kell antigenet (21). DTT inaktiverar IgM antikroppar genom att reducera disulfidbryggorna i antikroppens tertiära struktur. Andra antikroppsklasser påverkas inte av DTT och behåller därför sin förmåga att binda till antigen (23).
Metodvalidering/verifiering
En metod valideras av ett laboratorium för att kontrollera att resultatet av metoden uppfyller fastställda kvalitetskrav (24). När en ny metod utvecklas, när förändringar uppstår vid kvalitetskontroller eller när en tidigare validerad metod ändras ska det genomföras en metodvalidering eller omvalidering (25).
Verifiering av en metod utförs när exempelvis något annat laboratorium utfört en
validering. När en omvalidering inte är nödvändig utförs istället en verifiering av metoden.
Verifiering utgörs av en dokumentation att metoden kan hanteras korrekt hos laboratoriet för att uppfylla sin uppgift (24).
Skillnaden mellan metodvalidering respektive verifiering är att vid validering
dokumenteras att metoden uppfyller sin uppgift och vid verifiering dokumenteras att metoden kan hanteras korrekt på laboratoriet (24).
Syfte
Syftet med studien var att välja ut, och verifiera en metod för dithiothreitol (DTT)- behandling av testerytrocyter.
MATERIAL OCH METODER
Val av metod
Region Skånes respektive Region Östergötlands metodbeskrivning för DTT-behandling av testerytrocyter har studerats.
Region Skånes metodbeskrivning utgick efter Judd et al. (26) och startar DTT- behandlingen från 0,8% suspension av testerytrocyter.
I Region Östergötlands metodbeskrivning utgick DTT-behandlingen från tinade och packade testerytrocyter.
Valet av metod gjordes på basen av enklast möjliga handhavande. Eftersom Region Östergötlands metod utgick från packade testerytrocyter har den metoden färre
arbetsmoment än Region Skånes metodbeskrivning, vilket minimerar eventuella felkällor.
Genom att använda metodbeskrivningen från Region Östergötland krävdes inte beredning av 0,8% suspension av testerytrocyterna eftersom centrifugering ändå krävdes senare för att erhålla packade testerytrocyter för DTT-behandling. Valet för denna studie föll därför på Region Östergötlands metod.
Provmaterial
I studien användes fryst plasma från venöst tagna blodprover i EDTA-rör. Blodproverna togs från patienter som led av multipelt myelom och behandlades med Darzalex®
(daratumumab). I studien analyserades totalt 21 prover från totalt 10 patienter. Proverna kom från både män och kvinnor med medelåldern 70 år. Ingen av patienterna hade några kända irreguljära blodgruppsantikroppar i plasman.
Förberedelser Provmaterial
Blodproverna, tagna venöst i EDTA-rör för att förhindra koagulering. Rören
centrifugerades vid 1500g i 10 minuter varpå plasman avlägsnades och placerades i märkta rör. Under väntan på analys förvarades plasman i frys med temperaturen -80℃. Inför analys tinades plasman och centrifugerades vid 1000g i 5 minuter.
Beredning av fosfatbuffrad koksaltlösning, PBS
Beredning av fosfatbuffrad koksaltlösning, PBS (0,15 mol/dm3 NaCl), utfördes enligt laboratoriets instruktioner. För beredning av PBS löstes 45 g NaCl (lot: K50705604 843, Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) med 5 L avjonat vatten. När homogen blandning erhållits tillsattes 50 mL fosfatbuffert koncentrat pHix (lot: 20319006, Immucor Inc.
Norcross, USA). Lösningen blandades om och kontroll av pH utfördes. Slutgiltiga pH blev 7,19 och godkänt pH-intervall är 6,9–7,2.
Beredning av Dithiothreitol (DTT)
Beredning av DTT-lösning utfördes enligt instruktioner från avdelningen för Klinisk immunologi och transfusionsmedicin, Region Östergötland. En 0,2 M DTT-lösning bereddes genom att 1,0 g dithiothreitol (lot: 00872161, Thermo Scientific, Vilnius, Litauen) blandades med 35 mL PBS (pH 7,19) tills homogen lösning erhållits. DTT- lösningen fördelades i 71 mikrorör, 450 μL i varje, och förvarades i -30℃ (27).
Tining, tvättning och beredning av 0,8% Testerytrocyter
Testerytrocyterna (avdelning för immunologi och transfusionsmedicin Lund, Region Skåne) förbereddes enligt egna laboratoriets anvisningar. Samtliga testerytrocyter som ingår i antikroppsutredning (Ak 1–11, S1-3 och B1-4) valdes ut. Utvalda frysta
testerytrocyter, tinades i värmeblock Thermo-Rack (Ljungberg & Kögel AB, Sollentuna, Sverige). Erytrocyterna överfördes direkt därpå, droppvis med transferpipett, till respektive centrifugrör under omskakning. Innan överföring av erytrocyter förmärktes samtliga centrifugrör med ID för respektive testerytrocyt och rören fylldes med 0,9 mL 12% NaCl, totalvolymen 2,4 mL. Centrifugrören inkuberades i rumstemperatur i 3 minuter. Med diluent pH 7 (Labex Reagens AB, Helsingborg, Sverige, lot: 1880) fylldes rören och innehållet blandades om noga varpå de centrifugerades vid 600g i 5 minuter.
Supernatanten avlägsnades och ny diluent pH 7 tillsattes. Denna tvätt repeterades till dess att den synliga hemolysen i supernatanten försvunnit. Efter klar supernatant uppnåtts, centrifugerades rören en gång vid 1000g i 5 minuter. De tvättade och packade
erytrocyterna användes för att bereda en 0,8% erytrocytsuspension med LISS-lösningen ID-cellstab (lot: 05740 0003, DiaMed GmbH, Cressier, Schweiz). De 0,8%
testerytrocyterna förvarades i 2–8℃.
Apparatur och tillbehör
Gelkortscentrifug (DiaMed GmbH), gelkortsinkubator (DiaMed GmbH), gelkort med IAT- teknik Coombs Anti-IgG (lot: 50540 1503, BioRad, DiaMed), automatpipett 5–50 μL (Thermo Scientific) och 40–200 μL (Labsystems).
Utförande
DTT-behandling av 0,8% Testerytrocyter
DTT-behandling av 0,8% testerytrocyter utfördes enligt instruktioner från avdelningen för Klinisk immunologi och transfusionsmedicin, Region Östergötland. Respektive
testerytrocyt, tinade och tvättade föregående dag, centrifugerades vid 1000g i 5 minuter.
Till totalt 18 märkta centrifugrör tillsattes 75 μL 0,2 M DTT-lösning samt 90 μL packade erytrocyter för respektive testerytrocyt. Rören inkuberades i 37℃ i 30 minuter varpå rören tvättades med diluent pH 7 (Labex Reagens AB) totalt fyra gånger. Mellan tvättningarna centrifugerades rören vid 600g i 5 minuter och därpå avlägsnades supernatanten innan ny diluent pH 7 tillsattes.
Plaströr (16x105 mm, rundbottnad) märkta med ID för varje enskild testerytrocyt fylldes med 2 mL ID-CellStab (DiaMed GmbH). Från centrifugrören överfördes 16 μL packade erytrocyter till respektive märkt plaströr för 0,8% suspension. Testerytrocyterna förvarades i 2–8 ℃ (27).
Kvalitetskontroll
Kvalitetskontroll utfördes enligt laboratoriets instruktioner. Beredda 0,8% testerytrocyter samt DTT-behandlade 0,8% testerytrocyter kontrollerades mot kända antikroppar innan användning. Antikropparna som användes var anti- K, anti- E, anti-Fya, anti-Fyb och anti- C. Till kontrollen användes gelkort för IAT-teknik Coombs Anti-IgG (lot: 5040 1403, DiaMed, Cressier, Schweiz). Till respektive mikrobrunn tillsattes 50 μL testerytrocyt och sedan även 25 μL av kontrollreagens med känd antikropp. Gelkorten inkuberades i 37℃
under 15 minuter varpå de centrifugerades vid 85g i 10 minuter (ID-Centrifuge 12 SII, DiaMed GmbH, Cressier, Schweiz). Efter centrifugering avlästes eventuell
agglutinationsgrad i gelkolonnen enligt figur 3.
Antikroppsutredning
Antikroppsutredning utfördes enligt laboratoriets anvisningar. Till analysen användes gelkort för IAT-teknik Coombs Anti-IgG (DiaMed). Kvalitén på gelkorten kontrollerades innan användning. Mikrobrunnarna märktes med ID för 0,8% testerytrocyter samt DTT- behandlade 0,8% testerytrocyter. Till respektive brunn tillsattes 50 μL av respektive testerytrocyt och därefter tillsattes 25 μL patientplasma. Gelkorten inkuberades i 15 minuter i 37℃ och centrifugerades därpå vid 85g i 10 minuter. Efter gelkorten centrifugerat färdigt avlästes eventuella reaktioner mot ljus bakgrund, enligt figur 3.
Det utfördes totalt tre antikroppsutredningar för varje prov. Den första testade patientplasman mot obehandlade 0,8% testerytrocyter för att undersöka en
daratumumabinterferens. Den andra antikroppsutredningen testade patientplasman (utan kända blodgruppsantikroppar) mot DTT-behandlade testerytrocyter för att utvärdera om daratumumabinterferensen avlägsnades. Den tredje antikroppsutredningen utfördes med hjälp av DTT-behandlade testerytrocyter för att verifiera att irreguljära antikroppar i plasman från patienter med daratumumabbehandling gick att identifiera. För denna utredning tillsattes kända antikroppar i patientplasman. De kända antikropparna som tillsattes i respektive prov var alla av IgG-typ och utgjordes av anti-Fya, anti-Fyb, anti-K, anti-D, anti-E, anti-𝑐̅, anti-S och anti-𝑠̅. Antikropparna valdes utifrån deras tillgänglighet på avdelningen. Totalt tillsattes antikroppar till 20 av 21 prover, till prov 6 tillsattes inga antikroppar på grund av ospecifika reaktioner mot testerytrocyter. Prov 5, 13, 18 och 19 kom från samma patient, även prov 2, 10, 12, 14, 14, 16 0ch 20 kom från samma patient.
Statistik
Alla statistiska beräkningar bearbetades i Microsoft Excel 2019 (Microsoft Corp.
Redmond, WA, USA). Positiva prediktiva värdet (PPV) och negativa prediktiva värdet (NPV) beräknades. PPV och NPV beskriver andelen positiva respektive negativa värden som verkligen är sanna positiva respektive negativa. Det beräknades också positive percentage agreement (PPA) och negative percentage agreement (NPA). PPA beskriver antalet resultat som förväntas bli positiva och som faktiskt utfaller positivt. NPA beskriver antal negativa resultat som förväntas bli negativa och som faktiskt utfaller negativt.
Procentuellt hur bra överensstämmer det erhållna resultatet med förväntat resultat (28).
Etik
Studien utfördes på avdelningen för Transfusionsmedicin i Växjö. I studien ingick totalt 21 plasmaprover hämtade från 10 avidentifierade patienter som behandlas med Darzalex ®. Lag (2003:460) om etikprövning av forskning som avser människor är utformad för att respektera och skydda enskilda människor vid forskning. Lagen avser forskning vilket enligt 2§ inte omfattar studier inom högskoleutbildning av grundnivå. Enligt samma lag omfattar 4§ ”studier på biologiskt material som tagits från en levande människa och kan härledas till denna människa” (29). Samtliga plasmaprover avidentifierades och kodades med utvalda nummer för att det biologiska materialet inte skulle kunna härledas till
patienten. Under studien fanns dock möjligheten att spåra proverna till tillhörande patient.
Patientdatalagen (2008:355) avser behandling av personuppgifter inom hälso-sjukvården samt att dessa respekteras (30). Förutom att plasmaproverna omkodades behandlades dessa också med respekt utan att obehöriga fick tillgång till personuppgifterna.
Blev patientdata synlig under studien på avdelningen råder sekretess enligt offentlighets- och sekretesslagen (2009:400) 1§ (31).
RESULTAT
Kvalitetskontroll av testerytrocyter
Testerytrocyter (AK 1–11) beredda i en 0,8% suspension kontrollerades mot anti-C, anti-K och anti-Fya. I tabell I presenteras erhållna reaktioner för varje testerytrocyt mot känd antikropp samt förväntat resultat. Det erhållna resultatet överensstämde med förväntat resultat.
Tabell I: Reaktionsresultat för kvalitetskontroll av 0,8% testerytrocyter (AK 1–11) som kontrollerades mot anti-C, anti-K och anti-Fya. Erhållna resultat i jämförelse med förväntat resultat. Erhållna resultat graderas från – till ++++ och det förväntade resultatet framgår som positivt (Pos) respektive negativt (Neg).
TESTERYTROCYT
ERHÅLLNA FÖRVÄNTAT
Anti-C Anti-K Anti-Fya Anti-C Anti-K Anti-Fya
AK 1 ++++ - - Pos Neg Neg
AK 2 ++++ - - Pos Neg Neg
AK 3 ++++ - +++ Pos Neg Pos
AK 4 - - +++ Neg Neg Pos
AK 5 - ++ - Neg Pos Neg
AK 6 - - ++ Neg Neg Pos
AK 7 ++++ - ++ Pos Neg Pos
AK 8 - - - Neg Neg Neg
AK 9 - ++ ++ Neg Pos Pos
AK 10 - ++ - Neg Pos Neg
AK 11 - - ++ Neg Neg Pos
Testerytrocyterna (S1-3 och B1-4) beredda i en 0,8% suspension kontrollerades mot anti- E, anti-K och anti-Fya. Reaktionsresultatet framgår i tabell II tillsammans med förväntat resultat. Det erhållna resultatet överensstämde med förväntat resultat.
Tabell II: Reaktionsresultat för kvalitetskontroll av 0,8% testerytrocyter (S1-3 och B1-4) som kontrollerades mot anti-E, anti-K och anti-Fya. Erhållna resultat i jämförelse med förväntat resultat. Erhållna resultat graderas från – till ++++ och det förväntade resultatet framgår som positivt (Pos) respektive negativt (Neg).
TESTERYTROCYT
ERHÅLLNA FÖRVÄNTAT
Anti-E Anti-K Anti-Fya Anti-E Anti-K Anti-Fya
S1 - - ++ Neg Neg Pos
S2 ++ ++ ++ Pos Pos Pos
S3 - ++ - Neg Pos Neg
B1 - - ++ Neg Neg Pos
B2 +++ - - Pos Neg Neg
B3 - ++ ++ Neg Pos Pos
B4 - ++ ++ Neg Pos Pos
Samtliga 0,8% testerytrocyter (AK1-11, S1-3 och B1-4) som behandlades med DTT kontrollerades mot anti-K, anti-Fya samt anti-Fyb. Erhållna resultat från kontrollen presenteras i tabell III tillsammans med förväntat resultat av kontrollen. Det erhållna resultatet överensstämde med förväntat resultat.
Tabell III: Reaktionsresultat för kvalitetskontroll av DTT-behandlade 0,8% testerytrocyter som kontrollerades mot anti- K, anti-Fya och Fyb. Erhållna resultat i jämförelse med förväntat resultat. Erhållna resultat graderas från – till ++++ och det förväntade resultatet framgår som positivt (Pos) respektive negativt (Neg).
TESTERYTROCYT
ERHÅLLNA FÖRVÄNTAT
Anti-K Anti-Fya Anti-Fyb Anti-K Anti-Fya Anti-Fyb
AK 1 - - ++ Neg Neg Pos
AK 2 - - ++ Neg Neg Pos
AK 3 - ++ ++ Neg Pos Pos
AK 4 - ++ - Neg Pos Neg
AK 5 - - ++ Neg Neg Pos
AK 6 - ++ ++ Neg Pos Pos
AK 7 - ++ - Neg Pos Neg
AK 8 - - ++ Neg Neg Pos
AK 9 - ++ ++ Neg Pos Pos
AK 10 - - ++ Neg Neg Pos
AK 11 - ++ - Neg Pos Neg
S1 - ++ - Neg Pos Neg
S2 - ++ - Neg Pos Neg
S3 - - ++ Neg Neg Pos
B1 - ++ - Neg Pos Neg
B2 - - ++ Neg Neg Pos
B3 - ++ ++ Neg Pos Pos
B4 - ++ - Neg Pos Neg
Antikroppsutredning
I tabell IV framgår resultat från antikroppsutredning av plasma från patienter behandlade med daratumumab. Det genomfördes tre antikroppsutredningar för varje prov. Med obehandlade testerytrocyter för att fastställa en daratumumabinterferens och med DTT- behandlade testerytrocyter för att kontrollera att daratumumabinterferensen avlägsnats. Till tredje antikroppsutredningen tillsattes antikroppar (anti-Fya, anti-Fyb, anti- K, anti-𝑐̅, anti- E, anti-D, anti-S, anti- 𝑠̅) i respektive patientplasma som testades mot DTT-behandlade testerytrocyter för undersökning att antikroppen kunde identifieras. Vid användning av obehandlade testerytrocyter påvisades en daratumumabinterferens hos samtliga
plasmaprover. Prov 9 uppvisade dock inte daratumumabinterferens mot alla testerytrocyter.
Vid användning av DTT-behandlade testerytrocyter för antikroppsutredning observerades att daratumumabinterferensen avlägsnades hos samtliga prover förutom prov 6. Prov 5 uppvisade en svag reaktion mot testerytrocyt B1, men resterande testerytrocyter mot prov 5 uppgav negativa resultat.
Vid identifiering av olika antikroppar tillsatta i patientplasman kunde samtliga antikroppar identifieras förutom anti-K och anti-𝑠̅. I prov 8 tillsattes anti-S som kunde identifieras vid en högre koncentration av antikroppen i plasman.
Tabell IV: Resultat för antikroppsutredning av plasma från daratumumabbehandlade patienter. För varje prov utfördes tre antikroppsutredningar. Den första med obehandlade testerytrocyter för att detektera daratumumabinterferens, den andra med DTT-behandlade testerytrocyter för att kontrollera att daratumumabinterferensen avlägsnats. Den tredje
antikroppsutredningen med DTT-behandlade testerytrocyter utfördes för att kontrollera att antikropparna kunde
identifieras. Antikropparna tillsattes i patientplasman. Proverna 5, 13, 18 och 19 hämtades från samma patient likväl som prov 2, 10, 12, 14, 15, 16, 20 togs från en patient.
PROV:
OBSERVERAD DARATUMUMAB- INTERFERENS HOS
OBEHANDLADE TESTERYTROCYTER
(JA/NEJ)
DARATUMUMAB- INTERFERENS AVLÄGSNAD HOS DTT-
BEHANDLADE TESTERYTROCYTER
(JA/NEJ)
ANTIKROPP IDENTIFIERAD
(JA/NEJ)
1 JA JA JA: anti-Fya
2 JA JA NEJ: anti-K
3 JA JA JA: anti-Fyb
4 JA JA JA: anti-𝑐̅
5 JA JA* JA: anti-S
6 JA NEJ** -
7 JA JA JA: anti-E
8 JA JA JA: anti-S***
9 JA**** JA JA: anti-Fyb
10 JA JA JA: anti-D
11 JA JA NEJ: anti-K
12 JA JA JA: anti-E
13 JA JA* JA: anti-D
14 JA JA NEJ: anti-𝑠̅
15 JA JA JA: anti-Fya
16 JA JA JA: anti-Fyb
17 JA JA JA: anti-E
18 JA JA* JA: anti-Fya
19 JA JA* JA: anti-Fyb
20 JA JA JA: anti-S
21 JA JA NEJ: anti-𝑠̅
* SVAG REAKTION HOS TESTERYTROCYT B1. PROVERNA KOM FRÅN SAMMA PATIENT
** SVAGA OSPECIFIKA REAKTIONER MOT TESTERYTROCYTER
*** KRÄVDES HÖGRE ANTIKROPPSKONCENTRATION I PLASMAN
**** INTERFERENS SÅGS INTE MOT ALLA TESTERYTROCYTER
Statistik
Vid identifiering av antikropp (tredje antikroppsutredningen) utföll 18 prover av 20 som förväntat och totalt 16 antikroppar kunde identifieras. Anti-K i prov 2 och 11 samt anti-𝑠̅ i prov 14 och 21 kunde inte identifieras. PPV och NPV beräknades till 100% respektive 50%. PPA och NPA beräknades till 88,9% respektive 100%.
DISKUSSION
Syftet med studien var att välja ut, och verifiera en metod för DTT-behandling av
testerytrocyter. Detta för att med mer säkerhet kunna transfundera förenliga erytrocyter till patienter som behandlas med daratumumab. Metodbeskrivning för DTT-behandling av testerytrocyter hämtades från Region Östergötlands avdelning för klinisk immunologi och transfusionsmedicin.
Kvalitetskontrollen för samtliga testerytrocyter utföll enligt förväntat resultat och därför kan dessa betraktas som tillförlitliga under studien.
Hos samtliga prover vid antikroppsutredning observerades en daratumumabinterferens mellan patientplasman från daratumumabbehandlade patienter och obehandlade 0,8%
testerytrocyter. Vid antikroppsutredning av prov 9 med obehandlade 0,8% testerytrocyter sågs inte daratumumabinterferens mot alla testerytrocyter. Prov 9 kommer från en patient som startade sin behandling av Darzalex ® 1:a april och provet togs 22:a april. Enligt FASS uppskattas medelvärdet av halveringstiden för daratumumab vid första dosen vara 9 dygn (32). Efter 5 halveringstider har 96,9% av substansen eliminerats (33). Enligt muntlig kommunikation med Lunds avdelning för klinisk immunologi och transfusionsmedicin framgick att patienten inte fått någon ytterligare infusion av läkemedlet mellan 1:a och 22 april. Eftersom halveringstiden ökar vid repeterande och ökande doser och patienten endast erhållit en första infusion har läkemedlet fortfarande en låg halveringstid. Vid första
infusionen av Darzalex ® (daratumumab) kan många av de monoklonala
daratumumabantikropparna ha bundit till CD38 på de maligna plasmacellerna och därför elimineras i en hög hastighet. Detta kan ha bidragit till en låg plasmakoncentration av daratumumab och därför lägre, men ändå en påvisbar daratumumabinterferens vid utredning. Det krävs många veckor och upprepade doser av läkemedlet för att uppnå
steady-state av anti-CD38 koncentrationen i plasman, dvs. när tillförsel samt eliminering av läkemedlet är i balans och koncentrationen i plasman uppnått jämvikt (33, 34).
Vid antikroppsutredning med DTT-behandlade testerytrocyter observerades att
daratumumabinterferensen avlägsnades i samtliga prover förutom prov 6. Prov 6 är hämtad från en patient som tidigare uppvisat svaga ospecifika reaktioner mot testerytrocyter. På grund av dessa ospecifika reaktionerna användes inte prov 6 till en tredje
antikroppsutredning för att identifiera antikroppar.
En avlägsnad daratumumabinterferens tyder, tillsammans med en godkänd kontroll, på en lyckad DTT-behandling av testerytrocyterna. DTT har denaturerat CD38 på erytrocyternas yta och förhindrat inbindning av daratumumab (21). Hos prov 5, 13, 18 och 19
observerades svaga reaktioner mot testerytrocyt B1, trots om negativt resultat förväntades se tabell IV. Dessa prover kom från samma patient och varför svag reaktion uppstår specifikt mot testerytrocyt B1 är okänt. Troligtvis beror reaktionerna på någon komponent i patientens plasma eftersom dessa reaktioner inte observerades hos resterande patienter.
Det krävs ytterligare observationer för att erhålla någon förklaring.
Vid identifiering av antikroppar tillsattes kända antikroppar till patientplasman och därefter testades dessa mot DTT-behandlade testerytrocyter. Anti-K kunde inte identifieras vilket är förväntat då Kell-antigenet bryts ner av DTT (16). På grund av detta är det viktigt att ge erytrocyter som saknar antigenet för Kell, då motsvarande antikropp ej går att detektera (21).
Anti-S kunde identifieras med DTT-behandlade testerytrocyter, däremot observerades att äldre testerytrocyter (>2 veckor) ej kunde detektera låga plasmakoncentrationer (1:50) av antikroppen. Det krävdes 4 gånger högre plasmakoncentration (4:50) av anti-S för att kunna detekteras av testerytrocyter äldre än 2 veckor. Färska testerytrocyter som behandlats med DTT kunde reagera med lägre plasmakoncentrationer av anti-S. Nya testerytrocyter DTT-behandlades för att undersöka detta fenomen. Vid tecken på hemolys, oavsett ålder, ska testerytrocyterna sluta användas och nya behöver beredas och behandlas.
Det fanns milda tecken på hemolys hos testerytrocyterna som var äldre än 14 dagar, vid identifiering av anti-S och då kunde antikroppen inte identifieras. Med de nya, färska testerytrocyterna kunde låg plasmakoncentration av anti-S identifieras. DTT-behandlade
testerytrocyter verkar vara känsliga för hemolys och identifiering av antikroppar kräver därför färska testerytrocyter utan några tecken på hemolys.
DTT-behandlade testerytrocyterna uppvisade tecken på hemolys efter 2 veckor. Enligt metodbeskrivningen ska de vara hållbara upp till 1 månad. Efter nya testerytrocyter bereddes påvisades ingen hemolys medan studien pågick, däremot var dessa hållbara tills efter studien avslutades. Det är möjligt att hemolys hos dessa uppkom efter studien avslutades, men det krävs upprepade kontroller av testerytrocyterna för att undersöka hållbarheten. Enligt skriftlig kommunikation med metodansvarig från Region Östergötland avdelning för klinisk immunologi och transfusionsmedicin kunde hemolys uppkomma av diverse anledningar. Det krävs färska tinade testerytrocyter som vilar ett dygn innan DTT- behandling för att förhindra uppkomst av hemolys samt användning av en lägre andel DTT vid behandling. DTT-behandlade testerytrocyter bör alltid kontrolleras mot kända
antikroppar innan användning för att kontrollera att resultaten är tillförlitliga.
Under studien kunde anti-𝑠̅ inte identifieras, vilket enligt efterforskningar inte har
påträffats i tidigare studier angående DTT-behandling. För att utesluta att det var något fel på anti-𝑠̅ reagenset testades antikroppen mot obehandlade testerytrocyter och en positiv reaktion erhölls. Flera koncentrationer av anti-𝑠̅ i plasman testades mot DTT-behandlade testerytrocyter för att undersöka om en högre plasmakoncentration av antikroppen kunde identifieras. Plasmakoncentrationer från 1:5 till 1:50 prövades men ingen positiv reaktion observerades. Anti-𝑠̅ ingår i blodgruppssystemet MNS och antikroppen förekommer oftast som IgG. IgG är känt att bäst reagera vid 37℃, men det finns bevis på antikroppar med avvikande egenskaper (7, 35). Andra studier hävdar att anti-𝑠̅ kan reagera optimalt i en temperatur under 37℃ trots att den är av IgG-typ. Det finns fynd på att anti-𝑠̅ av IgG-typ reagerar bättre vid 4 ℃ och även vid rumstemperatur, men orsaken är oklar (35).
Antikroppsutredning av antikroppen med olika plasmakoncentrationer utfördes med inkubering i 4 ℃ respektive rumstemperatur. Samtliga resultat utföll negativt. Under studien kunde anti-𝑠̅ inte identifieras med DTT-behandlade testerytrocyter under studien.
Hos vuxna kan anti-𝑠̅ ge upphov till försenad hemolytisk transfusionsreaktion. Hos foster och nyfödda kan anti-𝑠̅ orsaka allvarlig hemolytisk sjukdom (HDFN) vilket kan leda till dödsfall. Antikroppen anses främst kliniskt relevant vid gravidimmunisering. Endast ca.
10% av kaukasier uttrycker inte 𝑠̅-antigenet på erytrocyterna och kan därför utveckla en
immunisering mot antigenet (2). Skulle en gravid kvinna vara immuniserad med anti-𝑠̅ är risken för att samma kvinna lider av multipelt myelom och behandlas med daratumumab låg. Multipelt myelom drabbar främst äldre personer i åldrarna 65–70 år (36). Risken att en kvinna mellan 65 och 70 år, lider av multipelt myelom, behandlas med daratumumab, är gravid och är immuniserad av anti-𝑠̅ är minimal. Betydelsen att identifiera anti-𝑠̅ hos daratumumabehandlade patienter är därför inte lika stor som att detektera antikroppen hos gravida kvinnor. Som tidigare nämnt har endast 10% av kaukasier fenotypen 𝑠̅- hos sina erytrocyter vilket medför svårigheter att kunna ge dessa erytrocyter till samtliga
daratumumabbehandlade patienter. Kvinnliga daratumumabbehandlade patienter i fertil ålder kan få erytrocyter som saknar 𝑠̅-antigenet, men om en kvinna är gravid, lider av multipelt myelom samt behandlas med daratumumab utsätts troligtvis fostret redan för stora påfrestningar. Sannolikt är inte en gravidimmunisering av anti-𝑠̅ det främsta problemet för denna patientgrupp.
Till totalt 20 prover tillsattes antikroppar och utav dessa utföll 18 prover som förväntat.
PPV beräknades till 100% vilket betyder att 100% av alla resultat som utföll positivt är sanna positiva. NPV beräknades till 50%, dvs. 50% av alla resultat som utföll negativt är sanna negativa. Det fanns endast två negativa prover som var sanna negativa (anti-K) och endast två positiva prover som utföll falskt negativt (anti-𝑠̅). Eftersom endast två värden som var sant negativa togs med i studien kommer statistiken att bli påverkad och minsta avvikande resultat ger stora förändringar statistiskt varav NPV är 50% (28).
PPA beräknades till 88,9% vilket betyder att 88,9% av samtliga positiva resultat utfaller positivt. NPA beräknades till 100%; dvs. samtliga negativa resultat utfaller enligt förväntat resultat.
Fördelar med metoden är att provet inte behöver skickas till avdelningen för klinisk immunologi och transfusionsmedicin Lund för analys. Identifiering av antikropp kan istället ske på egna avdelningen för transfusionsmedicin, Centrallasarettet i Växjö.
Metoden för DTT-behandling av testerytrocyter öppnar upp för en säkrare transfusion av erytrocyter till daratumumabbehandlade patienter.
Det negativa med metoden är att DTT denaturerar Kell-antigenet och anti-K kan inte identifieras. Utan DTT-behandlade testerytrocyter uppstår en daratumumabinterferensen och med DTT-behandlade testerytrocyter går antikroppen inte identifiera, och på grund av
detta råder ingen skillnad gällande att identifiera anti-K. Patienter måste erhålla erytrocyter som saknar antigenet för Kell, vilket är en stor nackdel, men nödvändig åtgärd. Anti-𝑠̅ går enligt studien inte heller detektera, men eftersom den främst är betydelsefull vid graviditet så är det inte nödvändigt att ge erytrocyter utan 𝑠̅-antigenet vid transfusion till
daratumumabbehandlade patienter. DTT-behandlade testerytrocyter är känsliga för hemolys och kan även lätt hemolysera om tinade testerytrocyter inte får vila ca. 1 dygn.
Innan användning av testerytrocyter krävs att dessa inte visar tecken på hemolys samt att de kontrolleras mot kända antikroppar.
Val av metod grundades främst på enklast möjliga handhavande. Metodbeskrivningen från Region Östergötland innehåller färre arbetsmoment och mindre risk för felkällor. Eftersom endast en metodbeskrivning genomfördes går det inte att exakt beskriva den vunna tiden, men utifrån noga studerande av metodbeskrivningarna beräknas en arbetsdag ha sparats in.
Detta eftersom testerytrocyterna behövde vila i ca. ett dygn för att motverka hemolys och de kunde vila tidigare om en 0,8% suspension inte behövde beredas. Förutom tidsaspekten, innebär en metodbeskrivning med färre arbetsmoment att möjligheten för felkällor
minskar. Efter DTT-behandling av testerytrocyter behövde cellerna tvättas och då kan lite hemolys uppstå. Med den valda metodbeskrivningen fanns mindre risk för felkällor trots att erytrocyter kan försvinna vid tvättning, detta på grund av en högre mängd
testerytrocyter användes. Samma princip gällde vid avlägsnade av supernatanten då det finns risk att packade erytrocyter försvinner. Det kan då bli svårare att erhålla en tillräcklig mängd erytrocyter för en 0,8% suspension om inte tillräckligt med erytrocyter används från start. En större mängd testerytrocyter, som i den valda metodbeskrivningen, kan därför minska flera felkällor.
För stark erytrocytsuspension, manuell pipettering och många olika testerytrocyter utgör möjliga felkällor som skulle kunna påverka resultatet.
SLUTSATS
Daratumumabinterferens ses vid antikroppsutredning med plasma från
daratumumabbehandlade patienter och antikroppar maskeras. Resultaten visade att DTT- behandlade testerytrocyter avlägsnade daratumumabinterferensen. Samtliga antikroppar som togs med i studien kunde identifieras förutom anti-K och anti-𝑠̅. Erytrocyter utan Kell- antigenet måste ges till patienterna och eftersom anti-𝑠̅ främst är kliniskt signifikant vid graviditet kan den förbises.
Slutsatsen är att metodbeskrivningen för DTT-behandling av testerytrocyter kan tillämpas med vetskapen att anti-K och anti-𝑠̅ ej kan detekteras. Med metoden kan mer förenliga erytrocyter ges till daratumumabbehandlade patienter och säkrare blodtransfusioner genomförs.
TACKORD
Tack till all personal på avdelningen för transfusionsmedicin, Centrallasarettet Växjö för möjligheten att genomföra examensarbetet samt all stöttning och hjälp.
Jag vill framföra tack till..
… min externa handledare Kim Ekblom, överläkare, Klinisk kemi och Transfusionsmedicin Centrallasarettet i Växjö.
… min interna handledare Magnus Ståhle, laboratorieingenjör, Linnéuniversitetet Kalmar.
… Britt Osbeck, biomedicinsk analytiker, Transfusionsmedicin Centrallasarettet i Växjö, för all praktisk hjälp och stöttning under studiens gång.
Till sist vill jag tacka mina föräldrar och kurskamrater för allt stöd under studietiden.
Referenser
1. Dean L. Chapter 2 Blood group antigens are surface markers on the red blood cell membrane. Blood Groups and Red Cell Antigens. Bethesda (MD): The National Center for Biotechnology Information (US). 2005.
2. Daniels G. Essential guide to blood groups. 3rd ed. Bromilow I, editor Chichester, West Sussex, U.K.: Chichester, West Sussex, U.K. : John Wiley & Sons Inc.; 2014.
3. Scharberg E, Rink G, Portegys J, Rothenberger S, Gillhuber N, Richter E, et al. The Impact of Using Genotyped Reagent Red Blood Cells in Antibody Identification. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 2018;45:218-24.
4. Transfusion ISoB. Red Cell Immunogenetics and Blood Group Terminolgy [Internet].
Amsterdam: ISBT Central Office; 2020 [cited 2020-04-13]. Available from:
http://isbtweb.org/working-parties/red-cell-immunogenetics-and-blood-group- terminology/.
5. Dean L. Chapter 3, Blood transfusions and the immune system. Blood Groups and Red Cell Antigens. Bethesda (MD): The National Center for Biotechnology Information (US).
2005.
6. Fernandes HP, Cesar CL, Barjas-Castro MdL. Electrical properties of the red blood cell membrane and immunohematological investigation. Revista brasileira de hematologia e hemoterapia. 2011;33(4):297-301.
7. Ness PM, Shirey RS. MOLLISON'S BLOOD TRANSFUSION IN CLINICAL MEDICINE, 11TH ED. Transfusion. 2007;47(3):551.
8. Jill Storry EW, Catarina Andersson, Lene Gustafsson. Handbok för Blodcentraler; kapitel 8, Erytrocytantikroppsidentifiering [Internet]. Jill Storry, Agneta Wikman; 2018 [cited 2020-02-16]. 3.0:[Available from: http://www.kitm.se/sv/kap-8-3-0/.
9. Pamphilon DH, Scott ML. Robin Coombs: his life and contribution to haematology and transfusion medicine. Oxford, UK2007. p. 401-8.
10. Theis S, Hashmi M. Coombs Test. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2019.
11. Säfwenberg J. Handbok för blodcentraler; kapitel 9, Förenlighetsprövning [Internet]. Jan Säfwenberg; 2016 [cited 2020-02-16]. 2.2:[Available from:
http://www.kitm.se/sv/handbokskapitel/.
12. Parker V, Tormey CA. The Direct Antiglobulin Test: Indications, Interpretation, and Pitfalls. Arch Pathol Lab Med. 2017 Feb;141(2):305-10.
13. Lapierre MD Y, Rigal D, Adam J, Josef D, Meyer F, Greber S, et al. The gel test: a new way to detect red cell antigen-antibody reactions. Transfusion 1990;30(2):109-13.
14. Sawierucha J, Posset M, Hähnel V, Johnson CL, Hutchinson JA, Ahrens N. Comparison of two column agglutination tests for red blood cell antibody testing. PLoS One. 2018;13(12).
15. Krejcik J, Casneuf T, Nijhof IS, Verbist B, Bald J, Plesner T, et al. Daratumumab depletes CD38+ immune regulatory cells, promotes T-cell expansion, and skews T-cell repertoire in multiple myeloma. Blood. 2016;128(3):384-94.
16. Dizon MF. The Challenges of Daratumumab in Transfusion Medicine. Laboratory medicine. 2017;48(1):6-9.
17. de Weers M, Tai Y-T, van Der Veer MS, Bakker JM, Vink T, Jacobs DCH, et al.
Daratumumab, a novel therapeutic human CD38 monoclonal antibody, induces killing of multiple myeloma and other hematological tumors. Journal of immunology (Baltimore, Md : 1950). 2011;186(3):1840-8.
18. Kumar SK, Anderson KC. Immune Therapies in Multiple Myeloma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research.
2016;22(22):5453-60.
19. Sullivan HC, Gerner-Smidt C, Nooka AK, Arthur CM, Thompson L, Mener A, et al.
Daratumumab (anti-CD38) induces loss of CD38 on red blood cells. Blood.
2017;129(22):3033-7.
20. Bub CB, Reis IND, Aravechia MG, Santos LD, Bastos EP, Kutner JM, et al. Transfusion management for patients taking an anti-CD38 monoclonal antibody. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. 2018;40(1):25-9.
21. Chapuy CI, Aguad MD, Nicholson RT, Aubuchon JP, Cohn CS, Delaney M, et al.
International Validation of a Dithiothreitol (DTT)-Based Method to Resolve the
Daratumumab Interference with Blood Compatibility Testing. Blood. 2015;126(23):3567-.
22. Chapuy CI, Nicholson RT, Aguad MD, Chapuy B, Laubach JP, Richardson PG, et al.
Resolving the daratumumab interference with blood compatibility testing. Transfusion.
2015;55(6pt2):1545-54.
23. Khodadadi L, Adib M, Pourazar A. Immunoglobulin Class (IgG, IgM) Determination by Dithiothreitol in Sensitized Kidney Transplant Candidates. Transplantation Proceedings.
2006;38(9):2813-5.
24. Simonsen F. Analysteknik : instrument och metoder. Lindegren R, editor Lund:
Studentlitteratur; 2005.
25. Lundgren B, Stensiö K-E, Nilsson A. Validering av kemiska analysmetoder. SWEDAC DOC, 2000 Contract No.: ISSN 1400-6138.
26. Judd WR, Johnson ST, Story J. Judd's Methods in Immunohematology. Bethesda (Md):
AABB Press; 2008.
27. Östergötland R. DTT-behandling. 4 ed: Klin immunologi och transfusionsmed; 2019.
28. CLSI. User Protocol for Evalutation of Qualitative Test Performance; Approved Guideline- Second Edition. Wayne,PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008.
29. Lag (2003:460) om etikprövning av forskning som avser människor.
Utbildningsdepartementet. 2003.
30. Patientdatalagen (2008:355). Socialdepartementet. 2008.
31. Offentlighets- och sekretesslag (2009:400). Justitiedepartementet L6. 2009.
32. Darzalex [Internet]. FASS-verksamheten. 2020.
33. Simonsen T. Illustrerad farmakologi. 1, Principer och tillämpningar. 4. [uppdaterade] utg., varav den tredje på svenska. ed. Aarbakke J, Hasselström J, editors. Stockholm : Natur &
kultur; 2016.
34. National Library of M. Daratumumab. Australian prescriber. 2017;40(6):240-1.
35. Issitt PD, Anstee DJ. Applied blood group serology. Durham, N.C.: Montgomery Scientific Publications; 1998.
36. Hoffbrand AV. Hoffbrand's essential haematology. Seventh edition. ed. Moss PAH, editor Chichester, West Sussex; Hoboken, NJ : John Wiley & Sons; 2016.
