Examensarbete, 15 hp
Biomedicinsk analytikerprogrammet, 180 hp VT 2020
Guanylat-bindande protein vid
infektion med Francisella
tularensis
Institutionen för Klinisk mikrobiologi Biomedicinsk analytikerprogrammet
Examensarbete, 15 hp
Kursansvarig: Ylva Hedberg Fransson
ylva.hedberg.fransson@umu.se
Läraropponent:
Mari Norgren
Examinator:
Ylva Hedberg Fransson
Datum för godkännande:
2020 06 22
Examensarbetets engelska titel
Guanylate-binding Protein in Infection with Francesiella tularensis
Handledare
3
Abstrakt
Guanylat-bindande protein (GBP) tillhör familjen GTPase som medverkar i det medfödda immunförsvaret mot bakterier, virus och protozoer. Patogena mikrober utvecklar egenskaper för att kunna infektera människans celler och tar sig in i cytosolen genom att inducera fagocytos. I en värdcells försvar mot mikrobers intrång finns antimikrobiella mekanismer inne i cytosolen som kan upptäcka patogener och starta signalvägar för aktivering av immunförsvaret samt inflammasomer. Exakt hur detta sker och vilken roll GBP har i immunförsvarets signalvägar är fortfarande ej klarlagt. Syftet med studien var att undersöka hur aktivering av inflammasomer sker och hur GBP påverkar detta genom att infektera makrofager med
Francisella tularensis. Genom att isolera benmärg från möss med metoden Bone Marrow-derived
4
Introduktion
Det medfödda immunförsvaret och Guanylat-bindande protein
Infektioner är ett stort hälsoproblem världen över och med vetskap om hur immunförsvarets mekanismer fungerar och regleras kan sjukdomar botas på ett effektivare sätt. Det medfödda immunförsvaret har antimikrobiella mekanismer mot främmande mikrober inne i cellernas cytosol. För att immuncellerna ska kunna upptäcka patogener finns pattern recognition receptorer (PRRs) fästa på cellernas yta som känner igen främmande molekyler och mönster. Olika PRRs har varierande egenskaper för att upptäcka olika typer av patogener (1). Till PRRs familj hör de fyra stora subgrupperna Toll-like receptor (TLR),
nucleotide-binding oligomerization domain (NOD), leucin rich repeats (LRR), retionocid acid-inducible gene 1 (RIG1) och C-type lectin receptors (CLRs) (2).
Patogena mikrober upptäcks via unika mönster kallade Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs) som är specifika för patogener och förekommer inte naturligt på några celler inne i kroppen. På så sätt kan bakterier, virus, svampar, parasiter och protozoer binda till immunceller och transporteras in i genom fagocytos (3). Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs) är celler som är skadade och har frisläppt cytokiner som kan binda till närliggande cellers PRRs och varna celler eller aktivera dom att delta i det inflammatoriska svaret. Receptorerna PRRs kan även känna igen signalmolekyler som är frisläppta från närliggande celler vilka har skadats av nekros, vävnadsskador eller på grund av att homeostasen är rubbad. När en ligand bundit till PRRs på cellens ytmembran startar kaskader intracellulärt. Transkriptions-faktorer som NF- κB uppreglerar flertalet gener som deltar i immunförsvaret och produktionen av signalsubstanserna interferoner (IFN) ökar vilket leder till inflammatoriskt svar (4). Guanylat-bindande protein (GBP) är en grupp inom de hydrolyserande enzymen GTPase och deltar i medfödda immunförsvaret. Proteinet hydrolyserar nukleotiden guanosin trifosfat (GTP) till guanosin difosfat (GDP). Hos människan finns sju gener som uttrycker GBP1-7 varav GBP6-7 endast återfinns i tarmens och lungornas epitelceller (5). Proteinet GBP spelar en viktig roll i immunförsvaret mot bakterier, virus och protozoer samt verkar i cytosolen direkt vid mikrobernas intrång genom att förhindra
replikering och medverka som signalväg för aktivering av inflammasomer. Vissa GBP har också en hydrofob del som gör att de kan fusera med cellmembranet och bilda porer som lyserar cellen (6). Proteinet induceras av IFN typ 1 och 2 via signalmolekylen STING och kinaset TBK1. Denna signalväg leder till ökat uttryck av över 2000 IFN-stimulerade gener och däribland GBP. Tidigare studier har visat att GBP kan vara starkt kopplat till aktiveringen av inflammasomen AIM2 (7).
Sjukdom och förekomst av Francisella tularensis
5
virulensfaktorer har identifierats. I genomet finns 350 specifika gener för Francisella och det kan vara förklaringen till uppkomsten av de faktorer som ger en så hög virulens som bakterien
har. Lipolysackarider (LPS) hos gramnegativa bakterier är bundet till yttermembranet och detta gäller även för F. tularensis. Gramnegativa bakterier med LPS känns igen av värdcellens PRRs, i
huvudsak TLR4, vilket leder till aktivering av cellens immunförsvar och frisättning av cytokiner. Vid infektion av F. tularensis sker inte denna aktivering via TLR4 men det är idag ej fullständigt utrett hur igenkänning sker. Det kan förväntas bero på att vissa strukturella egenskaper i lipid A delen av LPS skiljer sig hos bakterien jämfört med andra gramnegativa bakterier (9).
Sekretionssystemen T3SS och T6SS
I många bakteriers cytosol finns olika typer av effektorproteiner som utsöndras via sekretionssystem för att påverka bakteriernas överlevnad efter invasion av värdcellen och tillgodose dess näringsbehov. Vid en fagocytos av en bakterie anpassas istället den bildade vakuolen och gynnar bakterietillväxt genom att tillgodose behovet av näringsämnen. Sekretionssystem såsom typ III sekretion (T3SS) och typ VI (T6SS) är en av de viktigaste virulensfaktorerna och hos många gramnegativa bakterier så som Shigella,
Salmonella och Legionella. Sekretionssystemen bildar nålliknande strukturer uppbyggd av tre delar
bestående av bas, nål och translokon. Basen i sekretionssystemet hos bakterien är uppbyggd av flera olika proteiner som bildar en formation av ringar. Komplexet sträcker sig genom bakteriens inner- och
yttermembran och bildar en por i värdcellen varvid överföring av effektorproteiner kan ske. Effektorproteinerna transporteras från bakterien genom komplexet, ut genom den nålformade
injektosomen och in till värdcellens cytosol. Även celler som inte kan ta upp bakterier via fagocytos kan stimuleras till upptag genom sekretionssystem T3SS. Sekretionssystemets nålformade struktur eller proteinet i komplexets bas känns då igen av PRRs hos värdcellen. (10).
Sekretionssystemet T6SS har olika funktioner beroende på bakteriespecies samt vilken celltyp den ska infektera. Bakterier kan även ha flera olika sekretionssystem för olika ändamål. För exempelvis bakterien
Escherichia coli används T6SS för att slå ut andra bakterier i normalfloran och orsaka infektion (11). Den
gramnegativa bakterien F. tularensis använder sekretionssystem T6SS för att frigöras från fagosomen vid upptag till en värdcell och denna virulensfaktor är avgörande för dess överlevnad inne i cellen (12).
GBP i bakteriella infektioner orsakade av Salmonella, Legionella och Shigella
De gramnegativa bakterierna Salmonella, Legionella och Shigella använder sig av sekretionssystemet T3SS för att bland annat inducera fagocytos hos icke-fagocyterande celler. De utsöndrar sina effektor-proteiner för att upprätthålla vakuolens stabilitet och förhindrar nedbrytning när den kommer i kontakt med värdcellens molekyltransporterande motorproteiner. Effektorproteiner modifierar vakuolens
6
cellvägg som återfinns i kolhydratkedjor. Intracellulärt galectin har förmåga att känna igen några intracellulära bakterier samt vakuoler som gått sönder (14).
Aktivering av inflammasomen AIM2
Inflammasomen AIM2 är ett positivt laddat proteinkomplex som binder till dubbelsträngat DNA i cytosolen. Proteinet känner igen främmande och skadat DNA vilket gör att den har en nyckelroll vid det inflammatoriska svaret vid intrång av patogena mikrober. AIM2 upptäcker via HIN200 domänen
bakterier, DNA-virus, protozoer och parasiter som vid frisättning från endosomen startar sin replikering i värdcellens cytosol och inflammasomkomplex börjar att bildas (15). Inflammasomer är ett immunkomplex i cytosolen som kan framkalla aktivering av kaspase-1. Komplexet består i huvudsak av tre delar där sensorprotein, adaptorprotein och ett effektorprotein ingår. Sensorproteinet upptäcker främmande DNA, adaptorproteinet vidarebefordrar signaler och effektorproteinet aktiverar pro-inflammatoriska cytokiner och gasdermin D (16). Aktiveringen av kaspase-1 leder till en ökad produktion och frisättning av de inflammatoriska cytokinerna IL-1β och IL-18 vilka är nödvändiga för immunförsvarets inflammatoriska process. Gasdermin D inducerar pyroptos som är en inflammatorisk medierad celldöd för att förhindra bakteriens replikation. Till skillnad från programmerad celldöd är pyroptos helt beroende av kaspase 1 och inte kaspase 3, kaspase 6 och kaspase 8 som aktiverar apoptos. Vid klyvning aktiveras gasdermin D och binder till cellens membran och bildar porer som orsakar lysering av cellen och en snabb frisättning av cytokiner sker som extracellulärt påverkar närliggande celler (17).
En betydande del av immunförsvaret mot intracellulära bakterier påverkas och styrs av GBP tillsammans med inflammasomkomplexen. Exakt hur GBP påverkar inflammasomen AIM2 är idag inte helt känt. Bakterier som aktiverar inflammasomen AIM2 är inte beroende av signalering via TLR utan aktiveras enbart genom igenkänning av främmande DNA. Den gramnegativa bakterien Francisella novicida är en nära släkting till F. tularensis och replikerar inne i värdcellens cytosol efter upptag och lysering. Bakterien används för att studera immunförsvaret i cytosolen hos celler. För aktivering av AIM2 vid en F. novicida infektion krävs lysering av bakterien och om det sker spontant eller uppkommer som följd av ett
immunologiskt svar är inte helt utrett. Studier på möss har visat att GBP2 och GBP5 verkar ha en betydande roll för att lysering av F. novicida ska kunna ske (18). Studier av infektion med F. novicida i makrofager har visat att aktiveringen av AIM2 är beroende av signaler från interferon (INF)-typ 1 innan aktivering kan ske vilket inte är fallet för andra bakterier. IFN kräver en signal via transmembranproteinet STING och uppreglering av transkriptionsfaktorn IRF3 (19).
GBP i infektioner med virus och proteosoer
Toxoplasma gondii är en parasit som kan infektera människor och smittar främst från katter eller ej
7
effekt mot virusets hölje av glykoprotein. Den antivirala aktiviteten kräver närvaro av golgiapparaten men inte GTPase aktivitet (21).
Infektion med F. novicida och betydelsen av GBP2 samt GBP5
Kromosom tre hos möss kodar för GBP och det har visat sig att möss med bristfälligt fungerande GBP inte tar kontroll över F. novicida infektioner i försök på makrofager in vivo. Specifikt GBP2 och GBP5 i
cytosolen hos makrofager kontrollerar aktiveringen av inflammasomen AIM2 genom att lysera bakterien. Exakt hur lysering av bakterien sker är inte klarlagda (22). Bakterien F. novicida undviker nedbrytning genom att ta sig ut ifrån fagosomen och starta sin replikering i cytosolen men triggar också aktivering av AIM2. Bone marrow-derived macrophages (BMDM) renas fram från benmärg från möss och infekteras sen med vildtyp F. novicida vilket orsakar pyroptos av cellen via inflammasomen AIM2 och kaspase-1. Vid försök med en muterad F. novicida som saknar viktiga infektiösa egenskaper aktiveras inte
inflammasomen AIM2. Genom att slå ut GBP2 och GBP5 minskas produktionen av IL-1β och inducering av pyroptos medan en utslagning av andra GBP inte påverkar detta (23). Även på muterade makrfager som saknar kaspase-1 och kaspase-11 induceras celldöd via apoptos istället för pyroptos vilket indikerar på att GBP har en roll i den apoptopiska kaskaden (24).
Studier av GBP
Det första GBP proteinet upptäcktes för över 30 år sedan som det mest framträdande proteinet som inducerades av interferoner. Proteinets funktioner verkar vara många och studier har visat att GBP kan vara mer komplext än vad som tidigare förutspåtts. Under de senaste åren har utvecklingen av forskning och metoder för att förstå människans immunförsvar gått fort framåt, men mycket kvarstår att ta reda på (15).
Sambandet mellan cellers olika försvarsmekanismer vid infektion har en viktig betydelse för att öka förståelsen för patogenmekanismerna och för framställande av potentiella vacciner. Idag saknas fullständig kunskap inom området och outforskade mekanismer återstår att utreda. Proteinet GBP har visats att ha en betydande roll för aktivering av inflammasomer och att bakteriers DNA kan upptäckas. Vid intracellulära bakteriers intrång i värdcellen lokaliserar proteinerna till platsen och hur det integrerar med värdcellens immunförsvar skiljer sig beroende på bakterieart. Vad som gör att GBP kan upptäcka
8
Material och metoder
Bakteriella stammarI denna studien kommer bakterierna Francisella tularensis LVS subsp. holarctica (American Type Culture Collection), F. novicida (American Type Culture Collection) och F. tularensis stam SCHU S4
(Totalförsvarets forskningsinstitut, Umeå,Sverige) att användas. Allt arbete med bakteriestammen SCHU S4 utförs enligt skyddsklass 3, certifierat av svenska Arbetsmiljöverket.
Möss
Två framavlade möss av stammen C57/BL6 (Charles River, Tyskland) används. Mössen immuniseras med ca 105 CFU av F. tularensis LVS subkutant vilket ger en mild eller ej märkbar infektion. Alla möss är honor och hålls på djurhus i burar av genomskinlig plast. Mössen föds upp i fångenskap och ska ha fri tillgång till foder och vatten under studiens gång.
Metodprincip för framtagande av makrofager från benmärg
Makrofager aktiveras, som en del av det medfödda immunförsvaret, att reglera fysiologiska funktioner i kroppen för att upprätthålla homeostas. Makrofagernas effektiva förmåga att fagocytera patogena mikroorganismer gör att andra celler skyddas genom signalering från cytokiner och genom aktivering av immuncellerna T-lymfocyter. I benmärgen bildas monocyter från myeloida stamceller och migrerar ut i blod och vävnader där de diffunderar till makrofager. Deras höga anpassningsförmåga gör att de återfinns i nästan alla kroppens olika vävnader och kan via TLR upptäcka främmande och skadliga
mikro-organismer (25). Ett däggdjur som också har makrofager i större delen av kroppen är möss och de används med fördel för studier på makrofagernas specifika funktioner vid infektioner. Metoden Bone Marrow-derived Machrophage (BMDM) gör det möjligt att undersöka makrofagers utvecklade försvarsmekanismer
in vitro på ett sätt som ej hade varit möjligt med mikroskopi (26). För metoden rekommenderas primära
makrofager som har mer allmänna fysikaliska mekanismer än specialiserade. Makrofager diffunderas fram från benmärg som tas från transgena möss. Cellerna propageras i petriskålar med medium
innehållande en makrofagkolonistimulerande faktor och ger ett stort antal makrofager att analysera på sju dagar. Genom att förändra och påverka cellernas genuttryck med transkriptionsfaktorer kan produktionen av antalet celler ökas och generera en större mängd material (27). Garamycin används för att hålla
odlingen av celler steril.
Isolering av benmärgsceller
Lårben från möss C57/BL6 avlägsnas och benmärgsceller spolas ut med Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Cellerna tvättads i en suspension med DMEM (10% DMEM, 10% fetalt kalvserum, 0,2 mM L-glutamin, L-929 medium) som förbereds och pipetteras försiktigt till cellerna. Av cellerna tas 10 mL och räknas till 5x106 antal celler i DMEM och överförs till en 10 cm petriskål. Cellerna inkuberas under två dygn i 5% CO2 vid 37°C. Efter två dygn tillsätts ytterligare 10 ml DMEM innehållande L-929 medium till cellerna och inkuberas därefter fem dygn till. Efter totalt sju dagar av inkubering avlägsnas mediet och 10 ml iskall tvättlösning (1xPBS, 10 mM EDTA) tillsätts. Allt inkuberas på is i 10 min. Makrofagerna
9
96-brunns platta och inkuberas över natten (ÖN) i 5% CO2 vid 37°C. För att räkna de levande cellerna användes Viable Count assay och cellerna färgas blå med trypan färglösning.
Infektion av celler
Bakterierna inkuberas ÖN på GC agarplattor och resuspenderas i tvättlösning (1xPBS). Ett lager av bakterier tillsätts till cellkulturen BMDM med en kvot på 100:1 och inkuberas i 2 tim. Mediet avlägsnas från makrofagerna och tvättas två gånger med steril tvättlösning (1xPBS) vid 22°C. Därefter tillsätts splenocyter med en kvot på 1:5 per antalet BMDM. Av DMEM med celler tas 200 l innehållande 20 µg/ml Garamycin och tillsattes till varje brunn på 96-håls plattan. Plattan inkuberas i 45 min och tvättas med DMEM två gånger under tiden. Till varje brunn tillsattes 200 l DMEM med celler och hälften av brunnarna stimulerades med 100 U/ml IFN-γ. Cellerna lyseras och nivåerna av GBP i lysaten detekteras med western blot.
Cytokin analys
Supernatant från cellkulturerna samlas in och analyseras för närvaro av cytokiner. Från varje brunn används 50 l supernatant för bedömning av intracellulär bakteriell replikering med kittet 9-plex kit (BioRad Laboratories Inc, Hercules, CA). Kittet innehåller cytokinerna IL-2, IL-6, IL-12p40, IL-17, IFN-γ, MIP-1, GM-CSF, RANTES and TNF-α. Cellerna förvaras nedfrysa vid -80o C.
Etiska överväganden
För studier som inkluderar djurförsök finns krav för etisk prövning innan försöken tillåts. Nyttan av försöken vägs mot djurens lidande och försök på djur tillåts bara där andra metoder inte är tillgängliga. Vid infektering av möss med bakterier används en dos som ger en mild eller ej märkbar infektion. Inom en vecka är mössen symptomfria och har normalt avdödat alla bakterier inom 10 dygn. Efter mössen
10
Diskussion
Betydelsen av GBP i det mänskliga immunförsvaret
Under de senaste åren har förståelsen för människans sju upptäckta GBP och dess funktion ökat avsevärt. Infektioner med patogena mikrober är stort problem för den mänskliga hälsan och med vetskap hur immunförsvaret styrs och påverkas av olika mikrobiella infektioner kan bättre botemedel tas fram och rädda liv. Det finns fortfarande mycket att ta reda på om GBPs roll i immunförsvaret och metoder för studier på immunförsvaret behöver utvecklas och optimeras.
Guanylat-bindande protein vid infektion med F. tularensis
Proteinet GBP styrs av IFN signalering och deltar i försvaret mot mikrober genom att påverka
signalvägarna för det inflammatoriska svaret och kan även uttryckas i olika tumörsjukdomar. I nuläget finns det ingen studie som fullständigt visar hur GBP förhindrar bakteriers replikering i cytosolen eller hur det deltar i aktiveringen av kaspaser. Däremot kan det fastställas att dess lytiska förmåga i kombination med dess membranpåverkan deltar vid bakteriers intrång och DNA frisättning (28). Uttrycket av GBP i olika tumörer kan även användas som en möjlig framtida tumörmarkör och ge en prognos för hur långt gången sjukdomen är (29). Proteinfamiljen IpaH är unika ligaser hos bakterier och speciellt i Shigella och
Salmonella där de deltar i ubiquitinering. Det har visats att proteinet IpaH9.8 hos Shigella bryter ned en
beståndsdel hos GBP vilket gör den mer motståndskraftig och bakterien kan påbörja sin replikering i cytosolen (30). Att bakterier utvecklar resistensmekanismer mot GBP ger ytterligare ett bevis för att proteinet har en stor roll i immunförsvaret då bakterier utvecklar sitt försvar mot just dem.
Efter en bakteries intrång i värdcellen lokaliseras GBP till den patogeninnehållande vakuolen men om det är vakuolen som proteinet känner igen eller delar av bakteriens membran är inte fastställt. Vid en
infektion med F. tularensis subsp. novicida kan två intracellulära igenkänningsprocesser vara av extra intresse för GPBs medverkan i det inflammatoriska svaret. Den första är aktiveringen av IFN typ 1 produktionen och den andra aktiveringen för sammansättningen av inflammasomer. Vid infektion av F.
novicida i celler som saknade genen för GBP syntes ingen tydlig skillnad jämfört där GBP var närvarande
vilket indikerar på att GBP borde ha viktigast funktioner efter att bakterien kommit ut i cytosolen. Frisättningen från fagosomen ut till cytosolen sker då oberoende av IFN och igenkänningen i cytosolen är en förutsättning för interferonsvaret (18, 30).
F. tularensis har som andra gramnegativa bakterier LPS fäst på bakteriens yttermembran. Genom
11
Sjukdom och förekomst av Francisella tularensis
Sjukdomen tularensis, även kallad harpest, utgör ett stort hot mot mänskligheten på grund av F.
tularensis höga infektiösa förmåga och klassas därför som kategori A under tänkbara biologiska terrorhot.
Utvecklingen av att framställa ett vaccin mot F. tularensis har hittills inte gett några framgångsrika resultat då kunskapen om hur den intracellulära bakterien påverkar immunförsvaret inte är helt klarlagt. För samma celltyper förekommer även viss skillnad i immunsvaret beroende på cellens omliggande miljö vilket påverkar hur immunsvaret beter sig vid infektioner av samma bakterie. Genom att studera möss som aldrig tidigare kommit i kontakt med bakteriella infektioner kan studier visa hur immunförsvaret reagerar vid en första kontakt. Skillnader i immunsvaret hos tidigare infekterade möss och aldrig infekterade kan på så vis studeras (32).
Metoder och material för studier på GBP
För att studera på immunförsvaret och dess mekaniska funktioner krävs känsliga metoder. Alla studier som sker på immunologisk nivå använder små volymer och rör små molekyler som ofta är omöjliga att detektera för det mänskliga ögat. För att studera immunförsvaret med enbart mikroskopi krävs avancerade mikroskop som elektronmikroskop och det är svårt att urskilja specifika proteiner. GBP genen hos mus har 40–98% aminosyrahomologi med den humana genen vilket gör att
funktionsstudier på det mänskliga immunförsvaret kan utföras på möss (33). Immuniseringen sker med en liten dos bakterier som orsakar en mild infektion. Benmärgen från möss kan användas för att
framställa makrofager som ger möjlighet för ett stort antal olika analyser. Med metoden BMDM kan ett stort antal celler snabbt tas fram för att analyseras genom att stimulera benmärg att diffundera till makrofager. Det tar sju dagar att ta fram makrofagerna vilket jämfört med andra metoder är mycket snabbare. Fördelar med benmärgsstamceller är också att cellerna isoleras innan de hinner påverkas av mössens allmänna hälsotillstånd. Att ta benmärg direkt från möss ger även färska celler som aldrig utsatts för nedfrysning och gör det till en metod som idag är mest använd för undersökning av immunförsvarets funktioner hos makrofager (34). För att minska antalet möss som behöver avlivas för att studera
benmärgsceller med BMDM kan frysta celler vara en lösning. Idag finns inte tillräckligt med information om hur cellernas intracellulära mekanismer påverkas av nedfrysning. En fördel med att kunna frysa ned cellerna är att en mus räcker för att erhålla celler till flera försök över en längre tid och antalet försöksdjur minskar.
Antikroppar används sedan för att detektera specifika proteiner och volymen GBP. För studier som mäter volymen av cytokiner av typ IL-18 och IL-1 kan ELISA användas som har sensitivitet och specificitet. Utförandet av metoden är tidskrävande men ger snabba resultat med spektrofotometri. Nackdelar med metoden är behovet av en större provvolym och att endast ett protein i taget kan detekteras. Kvalitén på antikropparna kan också påverka utfallet av metoden (35). Ett alternativ till ELISA är flödescytometri som snabbt indelar cellerna efter vilka antikroppar som bundit till cellernas yta genom att de bestrålas med laserljus. Flera proteiner och antikroppar kan användas på samma gång. Den metoden används också för att räkna hur många celler som tillväxt efter de avlägsnats från mössens benmärg och kräver en liten mängd provvolym. Western Blot är också en alternativ metod som används för att detektera och
12
13
Referenser
1. Krocova Z, Macela A, Kubelkova K. Innate immune recognition: implications for the interaction of
Francisella tularensis with the host immune system. Front Cell Infect Microbiol. 2017;7:446.
2. Amarante-Mendes GP, Adjemian S, Branco LM, Zanetti LC, Weinlich R, Karina R. Bortoluci KR. Pattern recognition receptors and the host cell death molecular machinery. Front Immunol.
2018;9:e2379.
3. Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity. 2011;34(5)637-650.
4. Velloso FJ,Trombetta-Lima M, Anschau V, Sogayar MC, Correa RG. NOD-like receptors: major players (and targets) in the interface between innate immunity and cancer. Biosci Rep.
2019;39(4)e20181709.
5. Kravets E, Degrandi E, Ma Q et al. Guanylate binding proteins directly attack Toxoplasma gondii via supramolecular complexes. eLife. 2016;5:e11479.
6. Britzent-Laurent N, Bauer M, Berton V et al. Intracellular trafficking of guanylate-binding proteins is regulated by heterodimerization in a Hierarchical Manner. PLoS One. 2010;5(12):e14246.
7. Costa Franco MM, Marim F, Guimarães ES et al. Brucella abortus triggers a cGAS-Independent STING pathway to induce host protection that involves guanylate-binding proteins and
inflammasome activation. J Immunol. 2018;200(2):607-622.
8. Roberts LM, Powell DA, Frelinger JA. Adaptive Immunity to Francisella tularensis and Considerations for Vaccine Development. Front Cell Infect Microbiol. 2018;8(115):e3389 9. Jones BD, Faron M, Rasmussen JA, Fletcher JR. Uncovering the components of the Francisella
tularensis virulence stealth strategy. Front Cell Infect Microbiol. 2014;doi:10.3389
10. Guo EZ, Desrosiers DC, Zalesak J et al. A polymorphic helix of a Salmonella needle protein relays signals defining distinct steps in type III secretion. PLoS Biol. 2019;17(7)e3000351
11. Aschtgen MS, Gavioli M, Dessen A, Lloubès R, Cascales E. The SciZ protein anchors the enteroaggregative Escherichia coli type VI secretion system to the cell wall. Mol Microbiol. 2010;75(4)886–899.
12. Clemens DL, Lee BY, Horwits MA. The Francisella type VI secretion system. Front Cell Infect Microbiol. 2018;8:121 doi 10.3389.
13. Alix E, Mukherjee S, Roy CR. Subversion of membrane transport pathways by vacuolar pathogens. J Cell Biol. 2011;195(6):943-952.
14. Feeley EM, Pilla-Moffett DM, Zwack EE et al. Galectin-3 directs antimicrobial guanylate binding proteins to vacuoles furnished with bacterial secretion systems. Proc Natl Acad Sci USA.
2017;114(9):1698–1706.
15. Hayward JA, Mathur A, Ngo C, Man SM. Cytosolic recognition of microbes and pathogens: inflammasomes in action. Microbiol Mol Biol Rev. 2018;82(4)e00015-18.
14
17. Kesavardhana S, Kanneganti TD.Mechanisms governing inflammasome activation, assembly and pyroptosis induction. Int Immunol. 2017;29(5)201-210.
18. Meunier E, Wallet P, Dreier RF et al. Guanylate-binding proteins promote activation of
the AIM2 inflammasome during infection with Francisella novicida. Nat immunol. 2015;16(5):476– 484.
19. Fernandes-Alnemri T, Yu JW, Juliana C et al. The AIM2 inflammasome is critical for innate immunity against Francisella tularensis. Nat immunol. 2010;11(5)385-393.
20. Santos JC, Broz P. Sensing of invading pathogens by GBPs: At the crossroads between cell-autonomous and innate immunity. J Leukoc Biol. 2018;104(4)729–735.
21. Krapp C, Hotter D, Gawanbacht A et al. Guanylate Binding Protein (GBP) 5 is an interferon-inducible inhibitor of HIV-1 infectivity. Cell Host Microbe. 2016;19(4):504-514.
22. Cerqueira DM, Gomes MTR, Silva ALN et al. Guanylate-binding protein 5 licenses caspase-11 for Gasdermin-D mediated host resistance to Brucella abortus infection. PLoS pathog. 2018;14(12) e1007519.
23. Meunier E, Wallet P, Dreier RF et al. Guanylate-binding proteins promote AIM2 inflammasome activation during Francisella novicida infection by inducing cytosolic bacteriolysis and DNA release. Nat immunol. 2015;16(5):476-484.
24. Wallet P, Benaoudia S, Mosnier A et al. IFN-gamma extends the immune functions of guanylate binding proteins to inflammasome-independent antibacterial activities during Francisella novicida infection. PLoS pathog. 2017:13(10):729–735.
25. Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008;8(12):958–969.
26. Ying W, Cheruku PS, Bazer FW, Safe SH, Zhou B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. 2013;(76)e50323.
27. Trouplin V, Boucherit N, Gorvel L, Conti F, Mottola G, Ghigo E. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. 2013;(81)e50966.
28. Kravets E, Degrandi D, Weidtkamp-Peters S et al. The GTPase activity of murine guanylate-binding protein 2 (mGBP2) controls the intracellular localization and recruitment to the parasitophorous vacuole of Toxoplasma Gondii. J Biol Chem. 2012;287(33):27452-27466.
29. Vestal DJ, Jeyaratnam JA. The guanylate-binding proteins: Emerging insights into the biochemical properties and functions of this family of large interferon-induced guanosine triphosphatase. J InterferonCytokine Res. 2011;31(1):89-97.
30. Ji C, Du S, Li P et al. Structural mechanism for guanylate-binding proteins (GBPs) targeting by the
Shigella E3 ligase IpaH9.8. PLoS Pathog. 2019;15(6):e1007876.
31. Haldar AK, Foltz C, Finethy R et al. Ubiquitin systems mark pathogen-containing vacuoles as targets for host defense by guanylate binding proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112(41) 5628–5637. 32. Hajjar AM, Harvey MD, Shaffer SA et al. Lack of in vitro and in vivo recognition of Francisella
tularensis subspecies lipopolysaccharide by toll-like receptors. Infect Immun.
15
33. Tretina K, Park ES, Maminska A. Interferon-induced guanylate-binding proteins: Guardians of host defense in health and disease. J Exp Med. 2019:216(3):482-500.
34. Marim FM, Silveira TN, Lima DS, Zamboni DS. A method for generation of bone marrow-derived macrophages from cryopreserved mouse bone marrow cells. PLoS. 2010;5(12)e15263.
