Arbetsflöde för labbanalyser

För en person som är van vid traditionell provtagning inom miljöövervakningen, men ovan vid molekylära metoder, så innefattar eDNA-metodiken många nya steg.

Fig. 48 visar ett enkelt flödesschema från provtagning till färdig analys. Enligt figu-ren (baserad på artbestämning) är det stor skillnad på antal steg inom eDNA-meto-dik (6 steg) respektive traditionell provtagning (3 steg). Även om detta är en mycket generell uppskattning av de olika arbetsstegen så visar figuren en intressant jämfö-relse mellan molekylär (eDNA) och ekologisk (traditionell) metodik.

Frågeställning

Din ursprungliga frågeställning avgör vilka metoder du kan eller bör använda på labb. Detta bestämmer i sin tur vad det hela kommer att kosta. Generellt kan man säga att det rör sig om enartsanalyser eller flerartsanalyser (metabarcoding). Dessu-tom kan olika nivåer av kvantifiering och noggrannhet läggas till, vilket förlänger analystiden något. Figur 49 visar hur svaren i ett beslutsträd ger dig olika möjlig-heter för analys. Den enklaste enartsanalysen är konventionell PCR (endpoint PCR), medan sekvensering används vid flerartsanalyser eller för analys av okända arter.

Vill du genomföra en förbättrad kvantifiering så används olika PCR-metoder (qPCR eller ddPCR; se PCR). Framsteg inom PCR-tekniken har gjort att det nu är möjligt att använda PCR för upp 12 kända arter samtidigt. Vid sekvensering behöver du dock inte i förväg känna till vilka arter som finns i vattnet.

Figur 49. Exempel på ett beslutsträd för att genomföra eDNA-analyser (illustration: Patrik Bohman, SLU, efter en idé av Evans & Lamberti 2018).

Vanliga frågeställningar för att ta reda på vilken labbanalys som bör användas (Fig. 16-17 och 49) är t.ex.:

108

• Finns ett fåtal specifika arter på lokalen (ja/nej)? Med denna kvalitativa fråge-ställning räcker det med att arbeta fram till och med PCR-analys.

• Vad är detta för art (okänd)? Du vet t.ex. att det finns en invasiv eller sällsynt art i området, men inte vilken art det rör sig om. Det är fortfarande frågan om en enstaka art, men du måste då sekvensera innehållet i dina eDNA-prover och jäm-föra varje sekvens mot en databas som innehåller artspecifika sekvenser från många olika arter. Slutligen kommer målarten att identifieras, genom att rätt se-kvens från databasen matchas positivt mot provets DNA-innehåll. En förutsätt-ning för en positiv matchförutsätt-ning är förstås att målartens sekvens redan finns i data-basen.

• Vilka fiskarter finns i vattnet? Ibland finns det behov att försöka identifiera samt-liga fiskarter i ett vatten eller provtagningsområde. Då måste du genomföra alla steg i eDNA-metodikkedjan, fram till och med sekvensering (Fig. 52). Du an-vänder samma typ av markör och universella primers för att identifiera alla fiskarter (benfiskar) vid sekvenseringen. Sedan matchar du resultatet av sekven-seringen mot referenssekvenser i en databas.

• Vilka arter finns det totalt (av fisk, kräftor och musslor) i vattnet? Är du intres-serad av analyser på samhällsnivå, dvs. av samtliga arter av fisk, musslor och kräftor inom en sjö så krävs det också att du sekvenserar dina prover. Dessutom måste flera olika markörer ofta användas då det rör sig om olika organismgrup-per (tabell 3). Visserligen kan det räcka det med PCR för kräftor och stormusslor, eftersom grupperna innefattar så få arter, medan du måste genomföra sekvense-ring för identifiesekvense-ringen av fisksamhället.

• Hur mycket av en viss art finns på lokalen? Idag finns det stora behov att kvan-tifiera eDNA-provtagningen för en viss art, eller för flera arter. För kvantifiering används idag qPCR och ddPCR.

Provets karaktär

Flera samverkande faktorer bestämmer vilken typ av analys som senare kommer att användas. Figur 50 utgår först och främst från vilket typ av prov du har (x-axel).

Det kan röra sig om ett vävnadsprov från en individ, ett bulkprov (t.ex. från sedi-ment) med flera arter eller ett eDNA-prov från en sjö. Provets komplexitet baseras på dess innehåll och bestäms bl.a. av DNA-mängd/kvalitet och antal kända eller okända organismer. Det mest komplexa provet utgörs av ett eDNA-prov (t.ex. från vatten), då det består av många okända arter med delvis nedbrutet DNA. Provets komplexitet och vår egen frågeställning avgör vilken typ av markör som används för att identifiera våra arter (z-axel), samt vilken typ av analys som kan utföras.

Valet av markör är viktigt eftersom det avgör hur noggrant du kan bestämma taxo-nomin hos organismen/-erna (y-axel), dvs. om det sker på släkt-, familj- eller artnivå (se Artidentifiering med markörer och primers).

Figur 50. Beroende på vad du vill veta, vilken typ av prover du tar och frågans komplexitet så finns möjligheter att använda DNA-teknikens olika barcoding-analyser. Figuren är 3-dimensionell där ax-larna visar: provets komplexitet (x-axel), typ av markör (z-axel) och taxonomisk identifieringsnivå (y-axel). Källa: Taberlet et al. 2012.

Kontaminationskontroll

Det kan inte nog poängteras att det alltid finns en risk att kontaminera prover. Därför är det viktigt att laboratoriet som anlitas använder separata rum för olika analyser och kontaminationsfri utrustning, samt att olika kontroller och tekniska replikat an-vänds (se Hantering av förorening och felkällor på labb; Fig. 51).

110

Figur 51. Kontakta ett pålitligt laboratorium som kan utföra eDNA-analyser med bra rutiner och god kontaminationskontroll (foto: Mark Harris, SLU).

Flödesschema för labbanalyser

Fig. 52 visar vilka steg som behöver tas för att genomföra en eDNA-analys från vattenprov, oberoende av din frågeställning.

Figur 52. Flödesschema över de olika momenten vid analys av eDNA på ett laboratorium (illustration:

Patrik Bohman, SLU).

Om flödesschemat i figur 52 följs så kan de olika stegen på labb förklaras enligt följande:

• Provberedning. För att labbet ska kunna analysera dina prover, måste dessa nog-grant märkas upp. Om proverna innehåller sediment eller kommer från förfiltre-ring, måste de dessutom homogeniseras och sedan märkas (se DNA-extraktion).

• Extraktion och kontroll av DNA. Efter beredningen av prover måste DNA isole-ras och renas. Filtraten innehåller ju allt möjligt som du inte vill ha med i en analys, t.ex. olika organiska molekyler som kan påverka PCR. Efter genomförd extraktion kontrolleras hur mycket DNA som finns kvar och om det är av god kvalitet. Laboratoriet beslutar därefter om det är möjligt att fortsätta med ana-lyserna (se DNA-extraktion; Kontrollera och kvantifiera DNA).

• Markörval och primerdesign. Beroende på organismgrupp, typ av prov (vatten, sediment etc.) och analysmetod (PCR eller sekvensering) så väljs en markör ut.

Dessa markörer används sedan för att tillverka de primers som hjälper till att kopiera upp DNA vid PCR-analysen (se Artidentifiering med markörer och pri-mers).

• PCR och kontroll av DNA. Det är ofta mycket lite målarts-DNA i vattenprover.

Det innebär att labbet måste använda PCR för att mångfaldiga DNA-fragmenten så att det kan analyseras vidare. Efter avslutad PCR renas DNA från restproduk-ter. Kontroller görs även för att säkerställa att tillräckligt med DNA har produ-cerats för att kunna gå vidare till sekvensering (se Förberedelser inför PCR;

PCR).

• Förberedelser inför sekvensering. Innan labbet låter en sekvenseringsmaskin läsa sekvenser, måste proverna förberedas. Så kallade ”bibliotek” skapas genom att först späda, sedan märka upp och slutligen blanda samman (poola) samtliga prover (se Förberedelser inför sekvensering).

• Sekvensering. Vid sekvensering läses ordningsföljden av de olika nukleotiderna i de undersökta fragmenten. Flera prover behandlas samtidigt, men tack vare att proverna tidigare har märkts så ser maskinen skillnad på dem. Flera miljoner läsningar görs, beroende på hur djupt maskinen tillåts läsa. Detta tar tid, betydligt längre tid än vid en PCR-analys, och genererar hundratals gigabytes (GB) av information (se Sekvensering).

• Bioinformatik, artbestämning och statistisk bearbetning. När sekvenseringen är klar så behöver all sekvenseringsdata tolkas av datorprogram. Detta görs med hjälp av bioinformatik. De olika sekvenserna matchas därefter mot en databas som innehåller sekvensinformation från samtliga arter som kan finnas i dina vat-tenprover (se Bioinformatik: att tolka data). Du behöver därefter gå igenom och

112

verifiera dina sekvenserade arter och göra statistiska analyser för att se hur rim-liga resultaten är (se Slutlig utvärdering av resultat).

• Lagring. Slutligen samlas DNA-extrakt och sekvenseringsdata på stabila lag-ringsplatser. För miljöövervakning så är det viktigt att DNA-extrakt sparas och görs tillgängliga så att kompletterande analyser kan göras vid senare tillfällen (se Lagring av prover och data).