Metabolomik är en gren inom den analytiska kemin där man har som mål att kunna analysera så många substanser som möjligt med så få experiment som möjligt. Substanserna som analyseras är små molekyler i biologiska system som ofta kallas metaboliter, därav benämningen metabolomik. I en meta-bolomikstudie är målet ofta att jämföra en eller flera grupper med varandra för att kunna identifiera skillnaderna, exempelvis kanske man vill veta hur en grupp sjuka patienter skiljer sig från friska individer. Man kan också under-söka processer i celler eller vävnader, i artikel I undersökte vi hur cancerceller med olika strålningskänslighet reagerade på just strålning för att få bättre för-ståelse kring varför vissa cancertyper utvecklar strålningsresistens. Alltså vet man inte på förhand exakt vad man letar efter utan experimenten designas för att söka så brett som möjligt för att kunna identifiera skillnaderna på metabo-litnivå. Detta brukar kallas att studien är hypotesgenererande, resultaten som genereras när studien är slutförd kan alltså vara en hypotes gällande skillna-derna på metabolitnivå mellan de sjuka patienterna och de friska indiviskillna-derna.
Detta står i kontrast till mer traditionell forskning då man allt som oftast startar med en hypotes och därefter designar experiment för att kunna testa om hy-potesen stämmer.
Metaboliter inom metabolomiken syftar på små molekyler i ett biologiskt system. Målet för analyserna är därför inte stora makromolekyler som protei-ner eller DNA som utgör våra geprotei-ner, utan mindre byggstenar och signalsub-stanser som aminosyror, sockerarter, vitaminer, organiska syror och så vidare.
Det biologiska systemet kan vara celler odlade i labbet, blodprover från män-niskor eller försökdjur, urinprover, vävnadsprover eller växtprover m.m. I de flesta biologiska system är antalet metaboliter otroligt stort, man uppskattar att hos oss människor finns ungefär 8500 kroppsegna metaboliter och upp till 40 000 exogena metaboliter från mat, läkemedel m.m.
I dagsläget går det inte att analysera alla dessa metaboliter med bara ett eller ett fåtal experiment, i verkligheten sker alltid ett urval beroende på hur man utformar sina experiment, och vilka metoder man använder. Det betyder också att när man designar sina experiment och väljer vilka metoder man ska använda sig av så ställs man inför ett väldigt viktigt avvägande, ska man för-söka att analysera så många metaboliter som möjligt eller ska man utveckla metoderna så att de är mer precisa för ett mindre antal metaboliter. Något som försvårar detta är att eftersom man utvecklar metoderna för att vara så gene-rella som möjligt och inte för ett mindre urval av metaboliter, så är det väldigt
svårt att utvärdera hur bra de analytiska metoderna fungerar. Att försöka ut-värdera och förbättra just de analytiska metoderna som används inom meta-bolomik var ett av huvudsyftena med arbetet för den för avhandlingen. Under arbetet med avhandlingen har de flesta stegen i en metabolomikstudie berörts, så som provinsamling, förvaring, provupparbetning, analys och utvärdering av data.
I artikel II utvärderades hur provtagningen och förvaringen efter provtag-ningen av svampdjur påverkar analysresultaten för en metabolomikstudie.
Svampdjuren samlades in i Kosterhavet utanför Tjärnö marina laboratorium, och frystes sedan in direkt på båten eller lite senare, alternativt så lades pro-verna i etanol eller metanol. Inom forskningsfältet av marina djur eller växter är det väldigt vanligt att förvara prover i etanol och vi ville därför undersöka hur förvaringen i etanol påverkar provkvalitén och analysresultaten samt jäm-föra med frysning som är vanligare i andra forskningsfält. Vi fann att ringen i etanol extraherar mycket av metaboliterna till etanolen och att förva-ringen urlakade själva svampdjursproverna, det betyder att etanolen bör sparas och inte kastas om man förvarar sina prover i etanol. I övrigt så fann vi att frysning direkt var bättre för variationen mellan prover. Resultaten kan ha stor inverkan på hur man ser på museisamlingar, där det finns många unika sam-lingar med stort värde ofta förvarade i etanol och där etanolen i sig kan inne-hålla mycket information om svampdjurens kemi.
I ett annat projekt (artikel III) studerades hur oorganiska joner som natrium- och kaliumjoner kan påverka analysen av metaboliter. Natrium- och kaliumjoner finns i alla biologiska prover och följer ofta med i provupparbet-ningen när man analyserar polära metaboliter, de kan sedan under provana-lysen störa analysresultatet och ge upphov till många extra detektorsignaler samt släcka detektorsignalen för viktiga och intressanta metaboliter. Detta kan ge felaktiga analysresultat och kan också leda till att dataanalysen och utvär-deringen av resultaten försvåras.
För att komma runt problemet med de oorganiska jonerna i biologiska pro-ver så utvecklades en provupparbetningsmetod för att kunna isolera och ta bort de oorganiska jonerna från blodplasmaprover utan att ta bort några av de pol-ära metaboliterna i proverna (artikel IV). Detta gjordes genom att använda ett negativt laddat absorptionsmaterial, där alla positivt laddade joner fastnade, natrium och kalium joner så väl som positivt laddade metaboliter, men de po-sitivt laddade metaboliterna kunde sedan frigöras från absorptionsmaterialet med hjälp av olika tvättsteg. På så sätt kunde de oorganiska jonerna separeras från de organiska metaboliterna och det ledde till ökad känslighet för många av de viktigaste metaboliterna som aminosyror.
Sammanfattningsvis innehåller den här avhandlingen fyra delarbeten som berör olika delar av arbetsgången inom metabolomik. Två av arbetena har ut-förts i samarbete med andra forskningsgrupper och har ett tydligt tvärveten-skapligt fokus (I och II). De andra projekten, fokuserar kring metodutveckling och grundforskning (III och IV). I artikel I så studerades hur metabolismen
hos cancerceller med olika strålningskänslighet reagerade på joniserande strålning, målet var att kunna bilda en hypotes om vad som skiljer strålnings-resistenta cancerceller från strålningskänsliga cancerceller. En teori kring hur strålningsresistenta cancerceller kan ställa om sin metabolism för att överleva joniserande strålning kunde presenteras. I arbetet med artikel I identifierades ett antal förbättringsmöjligheter i de analytiska metoderna som användes, framförallt problemen med de oorganiska jonerna som sedan studerades i ar-tikel III och sedan presenterades ett förslag för att lösa de beskrivna proble-men i artikel IV. Slutligen så undersöktes hur provinsamlingen av svampdjur kan påverka analysresultaten och vilka metaboliter man kan detektera bero-ende på hur man behandlar proverna (artikel II).
Acknowledgement
All research presented in this thesis was conducted at the department of me-dicinal chemistry at Uppsala University and there are several people I would like to thank, who have in one way or another made sure I completed this thesis.
Firstly, I would like to thank my supervisors, Professor emeritus Curt Petters-son for taking me in as a PhD student in the first place and for believing in me, Professor Mikael Hedeland for arriving mid-way through my studies and setting the course making sure I completed this thesis as well as Torbjörn Arvidsson for your support.
I would also like to thank all my co-authors in the papers included in this thesis and especially Marika Nestor and Paco Cardenas for your invaluable help and expertise.
Thank you Apotekarsocieteten for providing me with the possibility to present my work at international conferences.
Furthermore, I would like to direct my sincerest gratitude and thanks towards all co-workers at the Department of Medicinal Chemistry and especially eve-rybody in the research group of Analytical Pharmaceutical Chemistry.
Micke thank you for your never-ending enthusiasm and creativity, for your support and help throughout my PhD studies. Jakob thank you for always sup-porting me in teaching and research alike, and special thanks for the many times you have reorganized teaching at short notice, just so that I could go away with the national team. That is something I never took for granted but somehow you always made it work. Kristian thank you for always keeping your office door open for research discussions and non-research discussions alike. I think it is safe to say that I would have given in a long time ago if it wasn’t for you. Malin, possibly the most competent person I have ever met, thank you for always having a MacGyver-solution and a laugh at hand. Eme-lie, it has been a pleasure to share office with you these last years and to dis-cuss insects, science as well as everything else important or not in between.
Jenny, it has been so nice to have you and your high spirits buzzing around the lab this past year. Thank you David for all the help and many interesting discussions. Former, PhD students Annelie, Alfred and Albert thank you for
teaching me the ropes and know that you left a big void behind when leaving.
Karin our collaboration projects was the ones I appreciated the most, thank you for your curiosity, energy and kindness.
Finally, a huge thanks to all my family and friends for your immense love and support. Mamma, Pappa, Calle and Johanna for always being there for me, for making sure I never take my self too seriously and keeping me constantly in between laughs.
Erik thank you for always being you, for letting me talk your ears off some-times, for teaching me to take a tupplur every now and then and living life just a bit slower.
References
[1] J.K. Nicholson, J.C. Lindon, E. Holmes, “Metabonomics”: understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data, Xenobiotica. 29 (1999) 1181–1189.
https://doi.org/10.1080/004982599238047.
[2] O. Fiehn, Metabolomics - The link between genotypes and phenotypes, Plant Mol. Biol. 48 (2002) 155–171.
[3] M.M. Rinschen, J. Ivanisevic, M. Giera, G. Siuzdak, Identification of bioactive metabolites using activity metabolomics, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
20 (2019) 353–367. https://doi.org/10.1038/s41580-019-0108-4.
[4] C.Z. Rumala, J. Liu, J.W. Locasale, B.E. Corkey, J.T. Deeney, L.E. Rameh, Exposure of Pancreatic β-Cells to Excess Glucose Results in Bimodal Activation of mTORC1 and mTOR-Dependent Metabolic Acceleration, IScience. 23 (2020) 100858. https://doi.org/10.1016/j.isci.2020.100858.
[5] M. Flasch, C. Bueschl, L. Woelflingseder, H.E. Schwartz-Zimmermann, G.
Adam, R. Schuhmacher, D. Marko, B. Warth, Stable Isotope-Assisted Metabolomics for Deciphering Xenobiotic Metabolism in Mammalian Cell Culture, ACS Chem. Biol. 15 (2020) 970–981.
https://doi.org/10.1021/acschembio.9b01016.
[6] R. Liu, F. Ye, Q.-P. Zhong, S.-H. Wang, T. Chai, H.-F. Dong, Z. Ming, Comparative serum metabolomics between SCID mice and BALB/c mice with or without Schistosoma japonicum infection: Clues to the abnormal growth and development of schistosome in SCID mice, Acta Trop. 200 (2019) 105186. https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2019.105186.
[7] A.K. Kaushik, S.K. Vareed, S. Basu, V. Putluri, N. Putluri, K. Panzitt, C.A.
Brennan, A.M. Chinnaiyan, I.A. Vergara, N. Erho, N.L. Weigel, N.
Mitsiades, A. Shojaie, G. Palapattu, G. Michailidis, A. Sreekumar, Metabolomic Profiling Identifies Biochemical Pathways Associated with Castration-Resistant Prostate Cancer, J. Proteome Res. 13 (2013) 1088–1100.
https://doi.org/10.1021/pr401106h.
[8] C. Ibáñez, C. Simó, V. García-Cañas, Á. Gómez-Martínez, J.A. Ferragut, A.
Cifuentes, CE/LC-MS multiplatform for broad metabolomic analysis of dietary polyphenols effect on colon cancer cells proliferation,
Electrophoresis. 33 (2012) 2328–2336.
https://doi.org/10.1002/elps.201200143.
[9] D. Gao, F. Jin, H. Liu, Y. Wang, Y. Jiang, Metabonomic study on the antitumor effect of flavonoid derivative 3d in HepG2 cells and its action mechanism, Talanta. 118 (2014) 382–388.
https://doi.org/10.1016/j.talanta.2013.09.018.
[10] O. Aftab, M.K.R. Engskog, J. Haglöf, A. Elmsjö, T. Arvidsson, C.
Pettersson, U. Hammerling, M.G. Gustafsson, NMR Spectroscopy-Based Metabolic Profiling of Drug-Induced Changes In Vitro Can Discriminate between Pharmacological Classes, J. Chem. Inf. Model. 54 (2014) 3251–
3258. https://doi.org/10.1021/ci500502f.
[11] M.M. Rashid, H. Lee, B.H. Jung, Evaluation of the antitumor effects of PP242 in a colon cancer xenograft mouse model using comprehensive metabolomics and lipidomics, Sci. Rep. 10 (2020) 17523.
https://doi.org/10.1038/s41598-020-73721-w.
[12] J. Bai, M.X. Wang, B. Chowbay, C.B. Ching, W.N. Chen, Metabolic profiling of HepG2 cells incubated with S(-) and R(+) enantiomers of anti-coagulating drug warfarin, Metabolomics. 7 (2011) 353–362.
https://doi.org/10.1007/s11306-010-0262-3.
[13] D.H. Kim, J.W. Allwood, R.E. Moore, E. Marsden-Edwards, W.B. Dunn, Y.
Xu, L. Hampson, I.N. Hampson, R. Goodacre, A metabolomics investigation into the effects of HIV protease inhibitors on HPV16 E6 expressing cervical carcinoma cells, Mol. Biosyst. 10 (2014) 398–411.
https://doi.org/10.1039/c3mb70423h.
[14] Z. Tang, Y. Li, Y. Jiang, J. Cheng, S. Xu, J. Zhang, Cellular metabolomics reveals glutamate and pyrimidine metabolism pathway alterations induced by BDE-47 in human neuroblastoma SK-N-SH cells, Ecotoxicol. Environ. Saf.
182 (2019) 109427. https://doi.org/10.1016/j.ecoenv.2019.109427.
[15] L. Hou, S. Guan, Y. Jin, W. Sun, Q. Wang, Y. Du, R. Zhang, Cell metabolomics to study the cytotoxicity of carbon black nanoparticles on A549 cells using UHPLC-Q/TOF-MS and multivariate data analysis, Sci.
Total Environ. 698 (2020) 134122.
https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2019.134122.
[16] N.S. Stephens, J. Siffledeen, X. Su, T.B. Murdoch, R.N. Fedorak, C.M.
Slupsky, Urinary NMR metabolomic profiles discriminate inflammatory bowel disease from healthy, J. Crohn’s Colitis. 7 (2013) e42–e48.
https://doi.org/10.1016/j.crohns.2012.04.019.
[17] M. Ros-Mazurczyk, K. Jelonek, M. Marczyk, F. Binczyk, M. Pietrowska, J.
Polanska, R. Dziadziuszko, J. Jassem, W. Rzyman, P. Widlak, Serum lipid profile discriminates patients with early lung cancer from healthy controls, Lung Cancer. 112 (2017) 69–74.
https://doi.org/10.1016/j.lungcan.2017.07.036.
[18] C.R. Marchand, F. Farshidfar, J. Rattner, O.F. Bathe, A framework for development of useful metabolomic biomarkers and their effective knowledge translation, Metabolites. 8 (2018).
https://doi.org/10.3390/metabo8040059.
[19] Á. López-López, Á. López-Gonzálvez, T.C. Barker-Tejeda, C. Barbas, A review of validated biomarkers obtained through metabolomics, Expert Rev.
Mol. Diagn. 18 (2018) 557–575.
https://doi.org/10.1080/14737159.2018.1481391.
[20] D.K. Trivedi, K.A. Hollywood, R. Goodacre, Metabolomics for the masses:
The future of metabolomics in a personalized world, New Horizons Transl.
Med. 3 (2017) 294–305. https://doi.org/10.1016/j.nhtm.2017.06.001.
[21] G.A. Theodoridis, H.G. Gika, E.J. Want, I.D. Wilson, Liquid
chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: A review, Anal. Chim. Acta. 711 (2012) 7–16.
https://doi.org/10.1016/j.aca.2011.09.042.
[22] L.W. Sumner, A. Amberg, D. Barrett, M.H. Beale, R. Beger, C.A. Daykin, T.W.M. Fan, O. Fiehn, R. Goodacre, J.L. Griffin, T. Hankemeier, N. Hardy, J. Harnly, R. Higashi, J. Kopka, A.N. Lane, J.C. Lindon, P. Marriott, A.W.
Nicholls, M.D. Reily, J.J. Thaden, M.R. Viant, Proposed minimum reporting standards for chemical analysis: Chemical Analysis Working Group
(CAWG) Metabolomics Standards Initiative (MSI), Metabolomics. 3 (2007) 211–221. https://doi.org/10.1007/s11306-007-0082-2.
[23] H.G. Gika, I.D. Wilson, G.A. Theodoridis, LC-MS-based holistic metabolic profiling. Problems, limitations, advantages, and future perspectives, J.
Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 966 (2014) 1–6.
https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2014.01.054.
[24] A. Elmsjö, J. Haglöf, M.K.R. Engskog, I. Erngren, M. Nestor, T. Arvidsson, C. Pettersson, Method selectivity evaluation using the co-feature ratio in LC/MS metabolomics: Comparison of HILIC stationary phase performance for the analysis of plasma, urine and cell extracts, J. Chromatogr. A. 1568 (2018). https://doi.org/10.1016/j.chroma.2018.05.007.
[25] A. Elmsjö, J. Haglöf, M.K.R. Engskog, M. Nestor, T. Arvidsson, C.
Pettersson, The co-feature ratio, a novel method for the measurement of chromatographic and signal selectivity in LC-MS-based metabolomics, Anal.
Chim. Acta. 956 (2017) 40–47. https://doi.org/10.1016/j.aca.2016.12.022.
[26] M.K.R. Engskog, J. Haglöf, T. Arvidsson, C. Pettersson, LC–MS based global metabolite profiling: the necessity of high data quality, Metabolomics.
12 (2016). https://doi.org/10.1007/s11306-016-1058-x.
[27] D. Vuckovic, Improving metabolome coverage and data quality: Advancing metabolomics and lipidomics for biomarker discovery, Chem. Commun. 54 (2018) 6728–6749. https://doi.org/10.1039/c8cc02592d.
[28] R. González-Domínguez, Á. González-Domínguez, A. Sayago, Á.
Fernández-Recamales, Recommendations and best practices for standardizing the pre-analytical processing of blood and urine samples in metabolomics, Metabolites. 10 (2020) 1–18. https://doi.org/10.3390/metabo10060229.
[29] L. Smith, J. Villaret-Cazadamont, S.P. Claus, C. Canlet, H. Guillou, N.J.
Cabaton, S. Ellero-Simatos, Important considerations for sample collection in metabolomics studies with a special focus on applications to liver functions, Metabolites. 10 (2020). https://doi.org/10.3390/metabo10030104.
[30] K. Dettmer, N. Nürnberger, H. Kaspar, M.A. Gruber, M.F. Almstetter, P.J.
Oefner, Metabolite extraction from adherently growing mammalian cells for metabolomics studies: Optimization of harvesting and extraction protocols, Anal. Bioanal. Chem. 399 (2011) 1127–1139.
https://doi.org/10.1007/s00216-010-4425-x.
[31] M.K.R. Engskog, M. Björklund, J. Haglöf, T. Arvidsson, M. Shoshan, C.
Pettersson, Metabolic profiling of epithelial ovarian cancer cell lines:
Evaluation of harvesting protocols for profiling using NMR spectroscopy, Bioanalysis. 7 (2015) 157–166. https://doi.org/10.4155/bio.14.235.
[32] H. Bi, K.W. Krausz, S.K. Manna, F. Li, C.H. Johnson, F.J. Gonzalez, Optimization of harvesting, extraction, and analytical protocols for UPLC-ESI-MS-based metabolomic analysis of adherent mammalian cancer cells, Anal. Bioanal. Chem. 405 (2013) 5279–5289.
https://doi.org/10.1007/s00216-013-6927-9.
[33] H. Bi, Z. Guo, X. Jia, H. Liu, L. Ma, L. Xue, The key points in the pre-analytical procedures of blood and urine samples in metabolomics studies, Metabolomics. 16 (2020) 1–15. https://doi.org/10.1007/s11306-020-01666-2.
[34] M.A. Lorenz, C.F. Burant, R.T. Kennedy, Reducing time and increasing sensitivity in sample preparation for adherent mammalian cell metabolomics, Anal. Chem. 83 (2011) 3406–3414. https://doi.org/10.1021/ac103313x.
[35] T. Barri, L.O. Dragsted, UPLC-ESI-QTOF/MS and multivariate data analysis for blood plasma and serum metabolomics: Effect of experimental artefacts and anticoagulant, Anal. Chim. Acta. 768 (2013) 118–128.
https://doi.org/10.1016/j.aca.2013.01.015.
[36] G. Paglia, S. Hrafnsdóttir, M. Magnúsdóttir, R.M.T. Fleming, S. Thorlacius, B. Palsson, I. Thiele, Monitoring metabolites consumption and secretion in cultured cells using ultra-performance liquid chromatography quadrupole-time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-ToF-MS), Anal. Bioanal. Chem.
402 (2012) 1183–1198. https://doi.org/10.1007/s00216-011-5556-4.
[37] J. Pezzatti, J. Boccard, S. Codesido, Y. Gagnebin, A. Joshi, D. Picard, V.
González-Ruiz, S. Rudaz, Implementation of liquid chromatography–high resolution mass spectrometry methods for untargeted metabolomic analyses of biological samples: A tutorial, Anal. Chim. Acta. 1105 (2020) 28–44.
https://doi.org/10.1016/j.aca.2019.12.062.
[38] K.A. Mortier, G.F. Zhang, C.H. Van Peteghem, W.E. Lambert, Adduct formation in quantitative bioanalysis: Effect of ionization conditions on paclitaxel, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15 (2004) 585–592.
https://doi.org/10.1016/j.jasms.2003.12.013.
[39] A. Ruiz-Aracama, A. Peijnenburg, J. Kleinjans, D. Jennen, J. van Delft, C.
Hellfrisch, A. Lommen, An untargeted multi-technique metabolomics approach to studying intracellular metabolites of HepG2 cells exposed to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, BMC Genomics. 12 (2011) 251.
https://doi.org/10.1186/1471-2164-12-251.
[40] B. Cao, M. Li, W. Zha, Q. Zhao, R. Gu, L. Liu, J. Shi, J. Zhou, F. Zhou, X.
Wu, Z. Wu, G. Wang, J. Aa, Metabolomic approach to evaluating adriamycin pharmacodynamics and resistance in breast cancer cells, Metabolomics. 9 (2013) 960–973. https://doi.org/10.1007/s11306-013-0517-x.
[41] D. Setoyama, Y. Fujimura, D. Miura, Metabolomics reveals that carnitine palmitoyltransferase-1 is a novel target for oxidative inactivation in human cells, Genes to Cells. 18 (2013) 1107–1119.
https://doi.org/10.1111/gtc.12098.
[42] M.V. Niklison-Chirou, I. Erngren, M. Engskog, J. Haglöf, D. Picard, M.
Remke, P.H.R. McPolin, M. Selby, D. Williamson, S.C. Clifford, D. Michod, M. Hadjiandreou, T. Arvidsson, C. Pettersson, G. Melino, S. Marino, TAp73 is a marker of glutamine addiction in medulloblastoma, Genes Dev. 31 (2017). https://doi.org/10.1101/gad.302349.117.
[43] V. Tolstikov, A. Nikolayev, S. Dong, G. Zhao, M.S. Kuo, Metabolomics analysis of metabolic effects of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) inhibition on human cancer cells, PLoS One. 9 (2014) 1–24.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0114019.
[44] Z. León, J.C. García-Cañaveras, M.T. Donato, A. Lahoz, Mammalian cell metabolomics: Experimental design and sample preparation, Electrophoresis.
34 (2013) 2762–2775. https://doi.org/10.1002/elps.201200605.
[45] K. Dettmer, P.A. Aronov, B.D. Hammock, Mass spectrometry-based metabolomics, Mass Spectrom. Rev. 26 (2007) 51–78.
https://doi.org/10.1002/mas.20108.
[46] C.Z. Ulmer, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Metabolic and Lipidomic Sample Preparation Workflow for Suspension-Cultured
Mammalian Cells using Jurkat T lymphocyte Cells, J. Proteomics Bioinform.
08 (2015) 126–132. https://doi.org/10.4172/jpb.1000360.
[47] R.W.M. van Soest, N. Boury-Esnault, J. Vacelet, M. Dohrmann, D.
Erpenbeck, N.J. de Voogd, N. Santodomingo, B. Vanhoorne, M. Kelly, J.N.A. Hooper, Global diversity of sponges (Porifera), PLoS One. 7 (2012).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0035105.
[48] C. Thoms, P.J. Schupp, Chemical defense strategies in sponges: a review, in:
R. Márcio, L.-H. Gisele, H. Eduardo, M. Guilherme (Eds.), PORIFERA Res.
BIODIVERSITY, Innov. Sustain., Museu Nacional, 2007: pp. 627–637.
[49] A.R. Carroll, B.R. Copp, R.A. Davis, R.A. Keyzers, M.R. Prinsep, Marine natural products, Nat. Prod. Rep. 36 (2019) 122–173.
https://doi.org/10.1039/c8np00092a.
[50] M.C. Leal, J. Puga, J. Serôdio, N.C.M. Gomes, R. Calado, Trends in the Discovery of New Marine Natural Products from Invertebrates over the Last Two Decades – Where and What Are We Bioprospecting?, PLoS One. 7 (2012) e30580. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0030580.
[51] F. Hoffmann, R. Radax, D. Woebken, M. Holtappels, G. Lavik, H.T. Rapp, M.-L. Schläppy, C. Schleper, M.M.M. Kuypers, Complex nitrogen cycling in the sponge Geodia barretti, Environ. Microbiol. 11 (2009) 2228–2243.
https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2009.01944.x.
[52] S.P. Leys, A.S. Kahn, J.K.H. Fang, T. Kutti, R.J. Bannister, Phagocytosis of microbial symbionts balances the carbon and nitrogen budget for the deep-water boreal sponge Geodia barretti, Limnol. Oceanogr. 63 (2018) 187–202.
https://doi.org/10.1002/lno.10623.
[53] S.R. Maier, T. Kutti, R.J. Bannister, J.K.-H. Fang, P. van Breugel, P. van Rijswijk, D. van Oevelen, Recycling pathways in cold-water coral reefs: Use of dissolved organic matter and bacteria by key suspension feeding taxa, Sci.
Rep. 10 (2020) 9942. https://doi.org/10.1038/s41598-020-66463-2.
[54] I. Mohanty, S. Podell, J.S. Biggs, N. Garg, E.E. Allen, V. Agarwal, Multi-Omic Profiling of Melophlus Sponges Reveals Diverse Metabolomic and Microbiome Architectures that Are Non-overlapping with Ecological Neighbors, Mar. Drugs. 18 (2020) 124. https://doi.org/10.3390/md18020124.
[55] L.M. Bayona, G. Van Leeuwen, O. Erol, T. Swierts, E. Van Der Ent, N.J. De Voogd, Y.H. Choi, Influence of Geographical Location on the Metabolic Production of Giant Barrel Sponges ( Xestospongia spp.) Revealed by Metabolomics Tools, ACS Omega. 5 (2020) 12398–12408.
https://doi.org/10.1021/acsomega.0c01151.
[56] L.M. Bayona, M. Videnova, Y.H. Choi, Increasing metabolic diversity in marine sponges extracts by controlling extraction parameters, Mar. Drugs. 16 (2018). https://doi.org/10.3390/md16100393.
[57] E. Einarsdottir, M. Magnusdottir, G. Astarita, M. Köck, H. Ögmundsdottir, M. Thorsteinsdottir, H. Rapp, S. Omarsdottir, G. Paglia, Metabolic Profiling as a Screening Tool for Cytotoxic Compounds: Identification of 3-Alkyl Pyridine Alkaloids from Sponges Collected at a Shallow Water
Hydrothermal Vent Site North of Iceland, Mar. Drugs. 15 (2017) 52.
https://doi.org/10.3390/md15020052.
[58] E.K. Olsen, K.L. Søderholm, J. Isaksson, J.H. Andersen, E. Hansen,
Metabolomic Profiling Reveals the N-Acyl-Taurine Geodiataurine in Extracts from the Marine Sponge Geodia macandrewii (Bowerbank), J. Nat. Prod. 79 (2016) 1285–1291. https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.5b00966.
[59] M. Reverter, M.A. Tribalat, T. Pérez, O.P. Thomas, Metabolome variability for two Mediterranean sponge species of the genus Haliclona: specificity, time, and space, Metabolomics. 14 (2018). https://doi.org/10.1007/s11306-018-1401-5.
[60] N. Drouin, S. Rudaz, J. Schappler, Sample preparation for polar metabolites
[60] N. Drouin, S. Rudaz, J. Schappler, Sample preparation for polar metabolites