Målet med nästan all forskning är att bidra med kunskap som i slutänden ska hjälpa till att lösa de problem som hemsöker världen. Den här avhandlingen är också en ansträngning i den riktningen. Jag har valt att jobba med pro-teiner som spelar viktiga roller i varje organisms livscykel; från att fungera som enkla strukturella enheter till komplexa funktioner såsom reglering av syntes, nedbrytning, transport och underhåll av cellens maskineri. Proteiner överför också information från en del av cellen till den andra, eller till andra celler. Denna överföring av information kallas signallering. Betydelsen av signallering kan förstås om man betänker att de flesta cancerformer som drabbar oss orsakas av försämrad proteinsignallering. Så, då uppstår frågan, hur fungerar denna cellulära signallering? Jo, för att information ska kunna överföras från ena sidan av en cell till den andra så behövs flera proteiner som tillsammans bildar en signalleringskaskad. I en sådan signalkaskad väx-elverkar, interagerar, det informationsbärande proteinet med ett annat protein i kaskaden och överför informationen. I den här avhandlingen har jag arbetat med en liten modul som finns i signalleringsproteiner och som kallas PDZ-domän. De är inte bara inblandade i signallering utan de formar också knut-punkter mellan celler, till exempel täta knutknut-punkter (tight junctions) fastsät-tande knutpunkter (adherence junctions). Täta knutpunkter är de kopplingar mellan två grannceller som de kan kommunicera överföra näringsämnen genom. Fastsättande knutpunkter utgör kopplingen mellan cellen och de molekyler som finns runt cellen. PDZ-domäner är mycket välstuderade på grund av deras roll i signallering men också eftersom de är direkt eller in-direkt kopplade till flera sjukdomar, till exempel livmoderhalscancer, bröst-cancer, Parkinson's sjukdom, schizofreni, cystisk fibros, infuensa, rabies, denguefeber och andra. Man måste komma ihåga att cellsignallering kräver att proteinerna i sigalleringskaskaden interagerar exakt och specifikt med deandra proteinerna. På grund av detta har forskare funderat mycket på var-för PDZ-proteiner kan fysiskt växelverka med så många andra proteiner, som de har setts göra. En viktig fråga är alltså hur dessa PDZ-proteiner kan upprätthålla selektivitet och specificitet, det vill säga känna igen sina interak-tionspartners. En mekanism som PDZ-domänen kan använda för att känna igen och interagera med sitt partnerprotein är att överföra information från den speciella plats där partnern binder till en annan plats på PDZ-domänen och på detta sätt öka den yta som medverkar i interaktionen med
partnerpro-36
På detta sätt kan alltså PDZ-domänen skapa allosteriska nätverk som reagerar på olika sätt beroende på vilken bindningspartner den interagerar med. I denna avhandling har jag visat experimentellt att dessa allosteriska nätverk finns i PDZ-domäner och att de hjälper PDZ-domänen att känna igen sina olika bindningspartners. Många virusproteiner såsom E6 från humant papillomavirus interagerar med PDZ-domäner för att ta kontroll över cellen.
Men många andra proteiner interagerar förstås med PDZ-domäner för att upprätthålla normala fysiologiska funktioner, vilket gör det svårt att använda PDZ-domänen som ett läkemedelsmål. Men kanske kan dessa allosteriska nätverk användas i framtida drug design för att specifikt hindra de skadliga interaktionerna mellan PDZ-domäner och virusproteiner som leder till olika sjukdomar, och samtidigt bibehålla de normala fysiologiska interaktionerna mellan PDZ-domäner och deras cellulära proteinpartners.
Acknowledgements:
It gives me great pleasure to use this opportunity to thank all the people who helped me a lot to make this thesis possible. Especially, I want to thank my Supervisor Associate Professor Per Jemth for your guidance, support and excellent supervision. These few words are not enough but still I want to convey my gratitude to you for all your help and encouragement during my research and during the writing of my thesis. I am very grateful to you.
Maria Selmer, my co-supervisor, special thanks for your support.
Dorothe Spillmann, my examiner for your encouragement and support.
Stefano Gianni, for your engagement in all the projects.
Associate Professor Åke Engström, for all the mass-specs.
Patrik Lundstrom, for introducing me to the NMR.
All past and present members of Jemth Lab, especially Lisa Elfstrom, for all the help and support. Chi Celestine, for being patient to my questions, and the help and support in side and outside the lab.
Huiqin wang, Maike, Andreas, Aziz, Jakob, Greta, Aravind for being wonderful lab mates and Tanja, Naida, Jonas, Sören.
All my co-authors and collaborators
All past and present members of the B9:4 corridor, Erik, Pia, Birgitta, Sophia, Sandra, Wei, Karin, Henrique.
The technical staff at IMBIM, Barbro for your help especially in last few weeks. Olav, Rehne, Marianne, Kerstin, Erika.
Past and present members of IMBIM.
My friends in Sweden, without you people it would have been very diffi-cult.
Ann-Sophie, for your kind words and advice.
Special thanks to my father, my mother, my sisters, my brothers, Shams, Adeel, Mohsin and Bilal, especially Tanveer for helping me a lot here in Uppsala, my nephews and nieces and my uncles and aunts.
Last but certainly not the least, my wife Sabeen for your support and company all these years and for being on my side through thick and thin.
38
Reference
1. Ivarsson Y, Travaglini-Allocatelli C, Morea V, Brunori M, Gianni S. The fold-ing pathway of an engineered circularly permuted PDZ domain. Protein Eng Des Sel. 2008, 21(3):155-60.
2. Von Ossowski I, Oksanen E, von Ossowski L, Cai C, Sundberg M, Goldman A, Keinänen K. Crystal structure of the second PDZ domain of SAP97 in com-plex with a GluR-A C-terminal peptide. FEBS J. 2006, 273(22):5219-29.
3. Liu Y, Henry GD, Hegde RS, Baleja JD. Solution structure of the hDlg/SAP97 PDZ2 domain and its mechanism of interaction with HPV-18 papillomavirus E6 protein. Biochemistry. 2007, 46(38):10864-74.
4. Chi CN, Bach A, Engström A, Wang H, Strømgaard K, Gianni S, Jemth P. A sequential binding mechanism in a PDZ domain. Biochemistry. 2009, 48(30):7089-97.
5. Calosci N, Chi CN, Richter B, Camilloni C, Engström A, Eklund L, Travaglini-Allocatelli C, Gianni S, Vendruscolo M, Jemth P. Comparison of successive transition states for folding reveals alternative early folding pathways of two homologous proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105(49):19241-6.
6. Lockless SW, Ranganathan R. Evolutionarily conserved pathways of energetic connectivity in protein families. Science. 1999, 286(5438): 295-9.
7. Dhulesia A, Gsponer J, Vendruscolo M. Mapping of two networks of residues that exhibit structural and dynamical changes upon binding in a PDZ domain protein. J Am Chem Soc. 2008,130(28): 8931-9.
8. Dima RI, Thirumalai D. Determination of network of residues that regulate allostery in protein families using sequence analysis. Protein Sci. 2006, 15(2):
258-68.
9. Jemth P, Gianni S. PDZ domains: folding and binding. Biochemistry. 2007, 46(30): 8701-8.
10. Stiffler MA, Chen JR, Grantcharova VP, Lei Y, Fuchs D, Allen JE, Zaslavskaia LA, MacBeath G. PDZ domain binding selectivity is optimized across the mouse proteome. Science. 2007, 317(5836): 364-9.
11. Petit CM, Zhang J, Sapienza PJ, Fuentes EJ, Lee AL. Hidden dynamic allostery in a PDZ domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009, 106(43):18249-54.
12. Doyle DA, Lee A, Lewis J, Kim E, Sheng M, MacKinnon R. Crystal structures of a complexed and peptide-free membrane protein-binding domain: molecular basis of peptide recognition by PDZ. Cell. 1996, 85(7): 1067-76.
13. Peterson FC, Penkert RR, Volkman BF, Prehoda KE. Cdc42 regulates the Par-6 PDZ domain through an allosteric CRIB-PDZ transition. Mol Cell. 2004, 13(5):665-76.
14. Grembecka J, Cierpicki T, Devedjiev Y, Derewenda U, Kang BS, Bushweller JH, Derewenda ZS. The binding of the PDZ tandem of syntenin to target pro-teins. Biochemistry. 2006, 45(11):3674-83.
15. Kim E, Sheng M. PDZ domain proteins of synapses. Nat Rev Neurosci. 2004, 5(10):771-81.
16. Wu J, Yang Y, Zhang J, Ji P, Du W, Jiang P, Xie D, Huang H, Wu M, Zhang G, Wu J, Shi Y. Domain-swapped dimerization of the second PDZ domain of ZO2 may provide a structural basis for the polymerization of claudins. J Biol Chem. 2007, 282(49):35988-99.
17. Long J, Wei Z, Feng W, Yu C, Zhao YX, Zhang M. Supramodular nature of GRIP1 revealed by the structure of its PDZ12 tandem in complex with the car-boxyl tail of Fras1. J Mol Biol. 2008, 375(5):1457-68.
18. Malatesta F. The study of bimolecular reactions under non-pseudo-first order conditions. Biophys Chem. 2005, 116(3):251-6.
19. Wong HC, Bourdelas A, Krauss A, Lee HJ, Shao Y, Wu D, Mlodzik M, Shi DL, Zheng J. Direct binding of the PDZ domain of Dishevelled to a conserved internal sequence in the C-terminal region of Frizzled. Mol Cell. 2003, 12(5):1251-60.
20. Tyler RC, Peterson FC, Volkman BF. Distal interactions within the par3-VE-cadherin complex. Biochemistry. 2010, 49(5):951-7.
21. Charbonnier S, Nominé Y, Ramírez J, Luck K, Chapelle A, Stote RH, Travé G, Kieffer B, Atkinson RA. The structural and dynamic response of MAGI-1 PDZ1 with noncanonical domain boundaries to the binding of human papillo-mavirus E6. J Mol Biol. 2011, 406(5):745-63.
22. Tonikian R, Zhang Y, Sazinsky SL, Currell B, Yeh JH, Reva B, Held HA, Appleton BA, Evangelista M, Wu Y, Xin X, Chan AC, Seshagiri S, Lasky LA, Sander C, Boone C, Bader GD, Sidhu SS. A specificity map for the PDZ do-main family. PLoS Biol. 2008, 6(9):e239.
23. Zhang Y, Dasgupta J, Ma RZ, Banks L, Thomas M, Chen XS. Structures of a human papillomavirus (HPV) E6 polypeptide bound to MAGUK proteins:
mechanisms of targeting tumor suppressors by a high-risk HPV oncoprotein. J Virol. 2007, (7):3618-26.
24. Pan L, Chen J, Yu J, Yu H, Zhang M. The structure of the PDZ3-SH3-GuK tandem of ZO-1 suggests a supramodular organization of the MAGUK family scaffold protein core. J Biol Chem. 2011. [Epub ahead of print]
25. Zhang J, Petit CM, King DS, Lee AL. Phosphorylation of a PDZ domain exten-sion modulates binding affinity and interdomain interactions in the PSD-95 MAGUK. J Biol Chem. 2011. [Epub ahead of print]
26. Wang CK, Pan L, Chen J, Zhang M. Extensions of PDZ domains as important structural and functional elements. Protein Cell. 2010, 1(8):737-51.
27. Bhattacharya S, Dai Z, Li J, Baxter S, Callaway DJ, Cowburn D and Bu Z. A conformational switch in the scaffolding protein NHERF1 controls autoinhibi-tion and complex formaautoinhibi-tion. J Biol Chem. 2010, 285: 9981–9994.
28. Lee SS, Weiss RS, Javier RT. Binding of human virus oncoproteins to hDlg/SAP97, a mammalian homolog of the Drosophila discs large tumor sup-pressor protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997, 94: 6670-6675.
29. Golebiewski L, Liu H, Javier RT, Rice AP. The Avian Influenza Virus NS1 ESEV PDZ Binding Motif Associates with Dlg1 and Scribble To Disrupt Cellu-lar Tight Junctions. J Virol. 2011, 85:10639-48.
30. Aoyagi T, Takahashi M, Higuchi M, Oie M, Tanaka Y, Kiyono T, Aoyagi Y, Fujii M. The PDZ domain binding motif (PBM) of human T-cell leukemia virus type 1 Tax can be substituted by heterologous PBMs from viral oncoproteins during T-cell transformation. Virus Genes. 2010, 40: 193-199.
31. Blot V, Delamarre L, Perugi F, Pham D, Bénichou S, Benarous R, Hanada T, Chishti AH, Dokhélar MC, Pique C. Human Dlg protein binds to the envelope glycoproteins of human T-cell leukemia virus type 1 and regulates envelope
40
32. Rebeaud, F., S. Hailfinger, and M. Thome. Dlgh1 and Carma1 MAGUK pro-teins contribute to signal specificity downstream of TCR activation. Trends Immunol 2007, 28:196-200.
33. Werme, K., M. Wigerius, and M. Johansson. Tick-borne encephalitis virus NS5 associates with membrane protein scribble and impairs interferon-stimulated JAK-STAT signalling. Cell Microbiol 2008, 10:696-712.
34. Eckford PD, Bear CE. Targeting the regulation of CFTR channels. Biochem J.
2011, 435(2):e1-4.
35. Chi CN, Bach A, Engström Å, Strømgaard K, Lundström P, Ferguson N, Jemth P. Biophysical characterization of the complex between human papillomavirus E6 protein and synapse-associated protein 97. J Biol Chem. 2011, 286(5):3597-606.
36. DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System. DeLano Scientific, San Carlos, CA, USA. 2002.
37. Shepherd TR, Hard RL, Murray AM, Pei D, Fuentes EJ. Distinct ligand speci-ficity of the Tiam1 and Tiam2 PDZ domains. Biochemistry. 2011, 50(8):1296-308.
38. Chi CN, Elfström L, Shi Y, Snäll T, Engström A, Jemth P. Reassessing a sparse energetic network within a single protein domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105(12): 4679-84.
39. Schreiber G, Fersht AR. Energetics of protein-protein interactions: analysis of the barnase-barstar interface by single mutations and double mutant cycles. J Mol Biol. 1995, 248(2): 478-86.
40. Saro D, Li T, Rupasinghe C, Paredes A, Caspers N, Spaller MR. A thermody-namic ligand binding study of the third PDZ domain (PDZ3) from the mammal-ian neuronal protein PSD-95. Biochemistry. 2007, 46(21):6340-52.
41. Kalyoncu S, Keskin O, Gursoy A.Interaction prediction and classification of PDZ domains. BMC Bioinformatics. 2010, 11:357.
42. Bach A, Chi CN, Olsen TB, Pedersen SW, Røder MU, Pang GF, Clausen RP, Jemth P, Strømgaard K. Modified peptides as potent inhibitors of the post-synaptic density-95/N-methyl-D-aspartate receptor interaction. J Med Chem. 2008, 51(20):6450-9.
43. Gianni S, Engström A, Larsson M, Calosci N, Malatesta F, Eklund L, Ngang CC, Travaglini-Allocatelli C, Jemth P. The kinetics of PDZ domaligand in-teractions and implications for the binding mechanism. J Biol Chem. 2005, 280(41):34805-12.