I allt levande finns arvsmassa i form av DNA. Denna DNA är nödvändig för alla sorters liv vi känner till. Att ha DNA innebär dock också en hel del prak-tiska problem. Cellens DNA måste lagras kompakt för att få plats i cellen, det måste vara tillgängligt för att kunna läsas av, det ska kunna kopieras åt cellens avkommor och slutligen ska det fördelas mellan dem.
För att cellens arvsmassa ska kunna föras vidare korrekt till avkommorna så måste det skyddas mot skador och eventuella skador som uppstår måste repareras. Att skador i arvsmassan uppstår är i någon mån oundvikligt då skad-ligt inflytande från strålning, reaktiva syreföreningar samt cellens egna pro-cesser är ständigt närvarande. I eukaryoter skapas till och med DNA-skador avsiktligt under meiotisk celldelning.
Skadorna som uppstår är av olika slag. De sträcker sig från kemiska för-ändringar i enstaka DNA-bokstäver (eller baser), till skador i flera baser, sam-manbindning av närliggande baser och i det allra värsta fallet DNA-dubbel-strängsbrott. Gemensamt för alla slags skador är att de förhindrar korrekt ko-piering av arvsmassan, vilket oftast hindrar cellens fortplantning överhuvud-taget. På grund av detta har i stort sett alla organismer flera lagningsmekanismer för olika slags DNA-skador.
Denna avhandling utforskar lagning av DNA-dubbelsträngsbrott i bakte-rien Escherichia coli. Dubbelsträngsbrott är när båda strängarna i DNA-dub-belhelixen går av nära varandra samtidigt. Denna form av skador är de farlig-aste för cellen, då de inte bara hindrar kopiering över själva brottet utan också låter kromosomens delar glida isär i rummet. För att laga ett dubbelsträngs-brott räcker det inte med en serie kemiska reaktioner genomföras vid skadan, utan först måste de två trasiga ändarna föras ihop igen. Om fel ändar sätts ihop så orsakas omkastningar i arvsmassan, vilka kan allvarligt påverka genuttryck och fördelningen av arvsmassa mellan avkommorna. I högre organismer kan sådana omkastningar leda till cancer.
Den lagningsmekanism för dubbelsträngsbrott som finns i E. coli, lagning genom homolog rekombination (HR-lagning), finns också i eukaryota celler inklusive våra egna. HR-lagning använder en annan, oskadd, kopia av den plats på kromosomen där brottet skett som en mall för att para ihop de trasiga ändarna korrekt. Det innebär att tre olika delar av cellens DNA måste hittas och föras samman innan lagningen kan genomföras. Med tanke på hur mycket DNA cellen innehåller är sökningen för att hitta de rätta delarna, och då sär-skilt den oskadda kopian, oerhört svår. Vissa forskare har tvivlat på att det ens
är möjligt att hitta kopian inom rimlig tid, förutom i vissa specialfall då den ligger bredvid brottet från början.
Genom att kombinera avancerad mikroskopi och mikrofluidik så kan vi här visa att dubbelsträngsbrott repareras snabbt och effektivt i E. coli, även då kopian befinner sig flera mikrometer bort. Vi kan se att lagningen sker på cirka 20 minuter, vilket är mindre än hälften av cellernas generationstid. Särskilt den befarat svåra sökningen efter lagningskopian är mycket snabbare än vän-tat. Den slutförs i genomsnitt på som längst åtta minuter, och kanske så snabbt som tre minuter. Det är inte lätt att förstå hur sökningen kan genomföras så fort. För att kunna paras ihop så måste delarna slumpmässigt stöta på varandra, då alla tre är stora och diffunderar mycket trögt genom cellen. Vi presenterar dock en ny fysikalisk modell där vi istället för att tänka oss att brottet letar efter kopian föreställer oss att kopian letar efter DNA kring brottstället, vilket har sträckts ut längs med cellen. En utsträckt form av proteinet RecA kan också observeras i cellerna efter att ett dubbelsträngsbrott skett. Under dessa förhållanden framstår det utifrån modellen faktiskt som möjligt att komponen-terna finner varandra inom den tidsram som experimenten visar.
Genom att känna igen DNA-skadade celler med hjälp av ett neuralt nätverk kan vi också visa att lagningen av DNA-skador är så effektiv att skador inte kostar cellerna någon tid. Även om delningen av en DNA-skadad cell fördröjs något, så kommer dess döttrar att dela sig snabbare än vanligt så att de redan en cellgeneration senare kommit ifatt de oskadda cellerna. Detta visar hur för-finat och i vilket gott samspel med cellens normala processer HR-lagningen sker. Genom att mutera olika enzym som tros vara inblandade i lagningspro-cessen så har vi bekräftat att enzymen RecN, RuvABC och RecG är viktiga för lagning av dubbelsträngsbrott, men att ingen av dem är helt oundgänglig.
Som tidigare misstänkts så är det förstnämnda enzymet viktigt tidigt under lagningen, då sökningen efter en kopia pågår, medan de senare är verksamma i slutet, när den lagade kromosomen åter ska skiljas från kopian så att kromo-somerna kan fördelas mellan cellens avkommor.
Dessa resultat visar att lagning av dubbelsträngsbrott med användning av homologa kopior som befinner sig långt bort från brottet är tillräckligt effektiv för att vara en relevant och fungerande mekanism när E. coli växer i sin natur-liga miljö. Eftersom lagningsmekanismerna är liknande mellan de flesta bak-terier så gäller detta sannolikt även många andra sorters bakbak-terier, och kanske även eukaryoter som oss själva.
Acknowledgements
I am immensely thankful to everyone who has been on my side and supported me throughout these years, in science and in life. These years have not always been easy. Instead, there have been ample opportunity to “learn the hard way”
both inside and outside of work, but also many moments of joy. Many of you deserve special mention, and among you are
My main advisor Johan Elf, for letting me in, giving me the freedom to the experiments I wished for myself (with variable results) and for the deep knowledge and tremendously insightful theoretical support whenever results went somewhere we would not have predicted. Thank you for these years!
Magnus Johansson, I am sorry we failed to tame the ribosomes. But I am grateful for your enthusiasm in trying and for the support over the years. Tony Forster, thank you for persisting with the small RNAs. I actually newer thought they would end up published at all.
Prune, thank you for teaching me all the techniques. I mean all of them.
And also all the shortcuts. But also for ski trips in heavy winds, club nights and house parties. Kuba, thank you for being willing to come up to the dark cold north, always being critical of methods and results, and eventually turn-ing this into a successful research project!
Francisco Balzarotti and Yvan Eilers for putting immeasurable time into constructing, reconstructing and aligning the first MINFLUX microscope, as well as Stefan Hell for repetitively inviting me there for measuring. And also to Elias and Bo for doing all of this again in Uppsala!
Nam Ki Lee and coworkers for the interesting collaboration formed from a conference coincidence. I am happy my old master degree thesis once became the center of interest!
Franchesca Pennacchietti and Ilaria Testa for access to the experimental MoNaLISA microscope, and Franchesca for impeccable patience in operating it.
All dear ICM coworkers! Dan, for great company in the lab of course, but I will remember you more for fording wild rivers and journeys on frozen lakes!
Irmeli who I know I can always rely on to keep things in order. David for countless calibrations and alignments, as well as insightful comments on sci-ence and else. Jimmy, thank you for keeping everything in shape, always!
Emil, thank you for lending lunch money and buying beer. Spartak, who can always suggest a solution to any problems. Camsund, who is always ready to
be helpful how much in a hurry you may be. Anna, good luck to you all of the family! Petter, for getting me started at this place once upon a time. Mike, for being a big loud American friend. Martin, for tirelessly explaining the many theories about counting photons. Javier, for being such an upbeat guy. Pra-neeth, for solving difficult problems. Misha, I hope the ribosomes will start to listen at some point. Ivan, Konrad, please keep the courses going! Oscar and Malin, good luck with your projects and don’t forget to live as well!
The ICM runners, including Disa, Christoffer and Christian. It’s important to keep in shape! See you on Lidingö in fall?
I also would like to extend a thank to the cleaning and support staff, whose names I don’t even know despite these years. I really appreciate your work!
Tack Juvenalerna för glädjen. Tack till alla Eskatologer för dumheter och smartheter, Chewie, H#, F*, DtB, FreddieP, Au, Ɐ@ & många fler! Särskilt tack till ^* för att du var där när det var som svårast.
Mamma och pappa, tack för allt stöd från åttiotalet fram till idag! Kära syskon, hoppas vi ses mera framöver! Trots att ni är för många för att få plats här så skulle jag skulle vilja nämna alla lärare och peppande klasskompisar.
Kära Sara, tack för att du har låtit mig vara jobbig och tack för att du har petat mig ännu en bit så många gånger! Allt hade varit mycket svårare utan dig, och jag hoppas jag kan göra det lättare för dig med när du en dag sitter i samma sits. Jag är så glad att jag har dig.
References
1. Barzel A, Kupiec M. Finding a match: how do homologous sequences get to-gether for recombination? Nat Rev Genet. 2008;9: 27–37.
2. Weiner A, Zauberman N, Minsky A. Recombinational DNA repair in a cellular context: a search for the homology search. Nat Rev Microbiol. 2009;7: 748–755.
3. Hakem R. DNA-damage repair; the good, the bad, and the ugly. EMBO J.
2008;27: 589–605.
4. Truglio JJ, Croteau DL, Van Houten B, Kisker C. Prokaryotic nucleotide excision repair: the UvrABC system. Chem Rev. 2006;106: 233–252.
5. Kuzminov A. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda. Microbiol Mol Biol Rev. 1999;63: 751–813, table of con-tents.
6. Ward JF. DNA Damage Produced by Ionizing Radiation in Mammalian Cells:
Identities, Mechanisms of Formation, and Reparability. In: Cohn WE, Moldave K, editors. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Academic Press; 1988. pp. 95–125.
7. Barnard S, Bouffler S, Rothkamm K. The shape of the radiation dose response for DNA double-strand break induction and repair. Genome Integr. 2013;4: 1.
8. Blaisdell JO, Wallace SS. Abortive base-excision repair of radiation-induced clustered DNA lesions in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98:
7426–7430.
9. Yang N, Galick H, Wallace SS. Attempted base excision repair of ionizing radi-ation damage in human lymphoblastoid cells produces lethal and mutagenic dou-ble strand breaks. DNA Repair . 2004;3: 1323–1334.
10. Kozmin SG, Sedletska Y, Reynaud-Angelin A, Gasparutto D, Sage E. The for-mation of double-strand breaks at multiply damaged sites is driven by the kinetics of excision/incision at base damage in eukaryotic cells. Nucleic Acids Res.
2009;37: 1767–1777.
11. Michel B, Boubakri H, Baharoglu Z, LeMasson M, Lestini R. Recombination proteins and rescue of arrested replication forks. DNA Repair . 2007;6: 967–980.
12. Mehta A, Haber JE. Sources of DNA double-strand breaks and models of recom-binational DNA repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014;6: a016428.
13. Rickman K, Smogorzewska A. Advances in understanding DNA processing and protection at stalled replication forks. J Cell Biol. 2019;218: 1096–1107.
14. Steiner WW, Kuempel PL. Sister Chromatid Exchange Frequencies inEsche-richia coli Analyzed by Recombination at thedif Resolvase Site. J Bacteriol.
1998;180: 6269–6275.
15. Cox MM, Goodman MF, Kreuzer KN, Sherratt DJ, Sandler SJ, Marians KJ. The importance of repairing stalled replication forks. Nature. 2000;404: 37–41.
16. Sinha AK, Possoz C, Durand A, Desfontaines J-M, Barre F-X, Leach DRF, et al.
Broken replication forks trigger heritable DNA breaks in the terminus of a circu-lar chromosome. PLoS Genet. 2018;14: e1007256.
17. Pennington JM, Rosenberg SM. Spontaneous DNA breakage in single living Escherichia coli cells. Nat Genet. 2007;39: 797–802.
18. Shee C, Cox BD, Gu F, Luengas EM, Joshi MC, Chiu L-Y, et al. Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells. Elife.
2013;2: e01222.
19. Vilenchik MM, Knudson AG. Endogenous DNA double-strand breaks: produc-tion, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A.
2003;100: 12871–12876.
20. Waters CA, Strande NT, Wyatt DW, Pryor JM, Ramsden DA. Nonhomologous end joining: a good solution for bad ends. DNA Repair . 2014;17: 39–51.
21. Shibata A. Regulation of repair pathway choice at two-ended DNA double-strand breaks. Mutat Res. 2017;803-805: 51–55.
22. Chang HHY, Pannunzio NR, Adachi N, Lieber MR. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18: 495–506.
23. Sallmyr A, Tomkinson AE. Repair of DNA double-strand breaks by mammalian alternative end-joining pathways. J Biol Chem. 2018;293: 10536–10546.
24. Aravind L, Koonin EV. Prokaryotic homologs of the eukaryotic DNA-end-bind-ing protein Ku, novel domains in the Ku protein and prediction of a prokaryotic double-strand break repair system. Genome Res. 2001;11: 1365–1374.
25. Doherty AJ, Jackson SP, Weller GR. Identification of bacterial homologues of the Ku DNA repair proteins. FEBS Lett. 2001;500: 186–188.
26. McGovern S, Baconnais S, Roblin P, Nicolas P, Drevet P, Simonson H, et al. C-terminal region of bacterial Ku controls DNA bridging, DNA threading and re-cruitment of DNA ligase D for double strand breaks repair. Nucleic Acids Res.
2016;44: 4785–4806.
27. Bertrand C, Thibessard A, Bruand C, Lecointe F, Leblond P. Bacterial NHEJ: a never ending story. Mol Microbiol. 2019;111: 1139–1151.
28. Pitcher RS, Green AJ, Brzostek A, Korycka-Machala M, Dziadek J, Doherty AJ.
NHEJ protects mycobacteria in stationary phase against the harmful effects of desiccation. DNA Repair . 2007;6: 1271–1276.
29. Moeller R, Stackebrandt E, Reitz G, Berger T, Rettberg P, Doherty AJ, et al. Role of DNA repair by nonhomologous-end joining in Bacillus subtilis spore re-sistance to extreme dryness, mono- and polychromatic UV, and ionizing radia-tion. J Bacteriol. 2007;189: 3306–3311.
30. Malyarchuk S, Wright D, Castore R, Klepper E, Weiss B, Doherty AJ, et al. Ex-pression of Mycobacterium tuberculosis Ku and Ligase D in Escherichia coli re-sults in RecA and RecB-independent DNA end-joining at regions of microho-mology. DNA Repair . 2007;6: 1413–1424.
31. Chayot R, Montagne B, Mazel D, Ricchetti M. An end-joining repair mechanism in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107: 2141–2146.
32. Dillingham MS, Kowalczykowski SC. RecBCD Enzyme and the Repair of Dou-ble-Stranded DNA Breaks. Microbiol Mol Biol Rev. 2008;72: 642–671.
33. Lamarche BJ, Orazio NI, Weitzman MD. The MRN complex in double-strand break repair and telomere maintenance. FEBS Lett. 2010;584: 3682–3695.
34. Cox MM. Recombinational DNA Repair in Bacteria and the RecA Protein. In:
Moldave K, editor. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology.
Academic Press; 1999. pp. 311–366.
35. Wyatt HDM, West SC. Holliday junction resolvases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2014;6: a023192.
36. Taylor A, Smith GR. Unwinding and rewinding of DNA by the RecBC enzyme.
Cell. 1980;22: 447–457.
37. Hickson ID, Robson CN, Atkinson KE, Hutton L, Emmerson PT. Reconstitution of RecBC DNase activity from purified Escherichia coli RecB and RecC proteins.
J Biol Chem. 1985;260: 1224–1229.
38. Capaldo-Kimball F, Barbour SD. Involvement of recombination genes in growth and viability of Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 1971;106: 204–212.
39. Gorbalenya AE, Koonin EV. Helicases: amino acid sequence comparisons and structure-function relationships. Curr Opin Struct Biol. 1993;3: 419–429.
40. Aravind L, Makarova KS, Koonin EV. SURVEY AND SUMMARY: holliday junction resolvases and related nucleases: identification of new families, phyletic distribution and evolutionary trajectories. Nucleic Acids Res. 2000;28: 3417–
3432.
41. Singleton MR, Dillingham MS, Gaudier M, Kowalczykowski SC, Wigley DB.
Crystal structure of RecBCD enzyme reveals a machine for processing DNA breaks. Nature. 2004;432: 187–193.
42. Phillips RJ, Hickleton DC, Boehmer PE, Emmerson PT. The RecB protein of Escherichia coli translocates along single-stranded DNA in the 3′ to 5′ direction:
a proposed ratchet mechanism. Mol Gen Genet. 1997;254: 319–329.
43. Chen HW, Ruan B, Yu M, Wang J d., Julin DA. The RecD subunit of the Rec-BCD enzyme from Escherichia coli is a single-stranded DNA-dependent ATPase.
J Biol Chem. 1997;272: 10072–10079.
44. Masterson C, Boehmer PE, McDonald F, Chaudhuri S, Hickson ID, Emmerson PT. Reconstitution of the activities of the RecBCD holoenzyme of Escherichia coli from the purified subunits. J Biol Chem. 1992;267: 13564–13572.
45. Gabbidon MR, Rampersaud VE, Julin DA. Salt-stable complexes of the Esche-richia coli RecBCD enzyme bound to double-stranded DNA. Arch Biochem Bi-ophys. 1998;350: 266–272.
46. Lam ST, Stahl MM, McMilin KD, Stahl FW. Rec-mediated recombinational hot spot activity in bacteriophage lambda. II. A mutation which causes hot spot ac-tivity. Genetics. 1974;77: 425–433.
47. Henderson D, Weil J. Recombination-deficient deletions in bacteriophage lambda and their interaction with chi mutations. Genetics. 1975;79: 143–174.
48. Cockram CA, Filatenkova M, Danos V, El Karoui M, Leach DRF. Quantitative genomic analysis of RecA protein binding during DNA double-strand break re-pair reveals RecBCD action in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015;112:
E4735–42.
49. Schultz DW, Swindle J, Smith GR. Clustering of mutations inactivating a Chi recombinational hotspot. J Mol Biol. 1981;146: 275–286.
50. Cheng KC, Smith GR. Recombinational hotspot activity of Chi-like sequences. J Mol Biol. 1984;180: 371–377.
51. Taylor AF, Amundsen SK, Smith GR. Unexpected DNA context-dependence identifies a new determinant of Chi recombination hotspots. Nucleic Acids Res.
2016;44: 8216–8228.
52. Bianco PR, Kowalczykowski SC. The recombination hotspot Chi is recognized by the translocating RecBCD enzyme as the single strand of DNA containing the sequence 5’-GCTGGTGG-3'. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94: 6706–6711.
53. Handa N, Ohashi S, Kusano K, Kobayashi I. Chi-star, a chi-related 11-mer se-quence partially active in an E. coli recC1004 strain. Genes Cells. 1997;2: 525–
536.
54. Cheng K, Wilkinson M, Chaban Y, Wigley DB. A conformational switch in re-sponse to Chi converts RecBCD from phage destruction to DNA repair. Nat Struct Mol Biol. 2020;27: 71–77.
55. Taylor AF, Smith GR. RecBCD enzyme is a DNA helicase with fast and slow motors of opposite polarity. Nature. 2003;423: 889–893.
56. Dillingham MS, Spies M, Kowalczykowski SC. RecBCD enzyme is a bipolar DNA helicase. Nature. 2003;423: 893–897.
57. Spies M, Amitani I, Baskin RJ, Kowalczykowski SC. RecBCD enzyme switches lead motor subunits in response to chi recognition. Cell. 2007;131: 694–705.
58. Roman LJ, Eggleston AK, Kowalczykowski SC. Processivity of the DNA hel-icase activity of Escherichia coli recBCD enzyme. J Biol Chem. 1992;267: 4207–
4214.
59. Wiktor J, van der Does M, Büller L, Sherratt DJ, Dekker C. Direct observation of end resection by RecBCD during double-stranded DNA break repair in vivo.
Nucleic Acids Res. 2017. doi:10.1093/nar/gkx1290
60. Amundsen SK, Taylor AF, Reddy M, Smith GR. Intersubunit signaling in Rec-BCD enzyme, a complex protein machine regulated by Chi hot spots. Genes Dev.
2007;21: 3296–3307.
61. Yang L, Handa N, Liu B, Dillingham MS, Wigley DB, Kowalczykowski SC.
Alteration of χ recognition by RecBCD reveals a regulated molecular latch and suggests a channel-bypass mechanism for biological control. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109: 8907–8912.
62. Anderson DG, Kowalczykowski SC. The translocating RecBCD enzyme stimu-lates recombination by directing RecA protein onto ssDNA in a chi-regulated manner. Cell. 1997;90: 77–86.
63. Spies M, Kowalczykowski SC. The RecA binding locus of RecBCD is a general domain for recruitment of DNA strand exchange proteins. Mol Cell. 2006;21:
573–580.
64. Dixon DA, Kowalczykowski SC. The recombination hotspot chi is a regulatory sequence that acts by attenuating the nuclease activity of the E. coli RecBCD enzyme. Cell. 1993;73: 87–96.
65. Taylor AF, Smith GR. Strand specificity of nicking of DNA at Chi sites by Rec-BCD enzyme. Modulation by ATP and magnesium levels. J Biol Chem.
1995;270: 24459–24467.
66. Smith GR. How RecBCD enzyme and Chi promote DNA break repair and re-combination: a molecular biologist’s view. Microbiol Mol Biol Rev. 2012;76:
217–228.
67. Arakawa K, Uno R, Nakayama Y, Tomita M. Validating the significance of ge-nomic properties of Chi sites from the distribution of all octamers in Escherichia coli. Gene. 2007;392: 239–246.
68. Levy A, Goren MG, Yosef I, Auster O, Manor M, Amitai G, et al. CRISPR ad-aptation biases explain preference for acquisition of foreign DNA. Nature.
2015;520: 505–510.
69. Wigley DB. Bacterial DNA repair: recent insights into the mechanism of Rec-BCD, AddAB and AdnAB. Nat Rev Microbiol. 2013;11: 9–13.
70. Lin Z, Kong H, Nei M, Ma H. Origins and evolution of the recA/RAD51 gene family: evidence for ancient gene duplication and endosymbiotic gene transfer.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103: 10328–10333.
71. Clark AJ, Margulies AD. ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF RE-COMBINATION-DEFICIENT MUTANTS OF ESCHERICHIA COLI K12.
Proc Natl Acad Sci U S A. 1965;53: 451–459.
72. Skarstad K, Boye E. Degradation of individual chromosomes in recA mutants of Escherichia coli. J Bacteriol. 1993;175: 5505–5509.
73. Story RM, Weber IT, Steitz TA. The structure of the E. coli recA protein mono-mer and polymono-mer. Nature. 1992;355: 318–325.
74. Rehrauer WM, Kowalczykowski SC. The DNA binding site(s) of the Escherichia coli RecA protein. J Biol Chem. 1996;271: 11996–12002.
74. Rehrauer WM, Kowalczykowski SC. The DNA binding site(s) of the Escherichia coli RecA protein. J Biol Chem. 1996;271: 11996–12002.