Ribosomerna är de partiklar i cellen som tillverkar proteiner. I en snabbt växande bakteriecell finns tiotusentals ribosomer och proteinerna som de tillverkar utför många livsviktiga processer, till exempel att katalysera ke-miska reaktioner (enzymer), reglera genuttryck, transportera joner genom cellmembranet eller att känna av signaler från cellens omgivning (recepto-rer). Proteiner är långa kedjor av aminosyror som fogats samman enligt den genetiska information som lagras i cellernas DNA. Enzymer, s.k. RNA-polymeraser, kopierar (transkriberar) en DNA-gen i form av en enkel-strängad RNA-molekyl, budbärar RNA (på engelska messenger RNA, mRNA) som ribosomerna binder till och använder som mall för att koppla samman aminosyrorna i rätt ordning. Detta görs med hjälp av adaptormole-kyler, transport-RNA (tRNA), som översätter (translaterar) en sekvens av tre nukleotider i mRNA (ett kodon) till en viss aminosyra.
Proteinsyntesen har fyra faser, initiering, elongering, terminering och re-cycling där olika translationfaktorer (hjälparproteiner) är inblandade. Ri-bosomen består av två subenheter och har tre tRNA-bindningsplatser, ami-noacyl- (A), peptidyl- (P) och exit-siten (E). Under initieringen binder den lilla subenheten (30S), med hjälp av proteiner som kallas initieringsfaktorer, till ett mRNA. En viss sekvens i mRNA, den s.k. Shine-Dalgarnosekvensen, basparar med ribosomens eget RNA, rRNA, för att placera mRNAt rätt. Ett initierings-tRNA som bär den första aminosyran (formylmetionin, fMet) binder till startkodonet i P-siten. Sedan ansluter den stora subenheten (50S), initieringsfaktorerna dissocierar och ribosomen går in i elongeringsfasen. Ett ternärkomplex, bestående av ett tRNA, elongerings-faktor Tu (EF-Tu) och GTP, binder sedan till A-siten, EF-Tu hydrolyserar GTP och lämnar därefter ribosomen. Om ett felaktigt tRNA har bundit till kodonet i A-siten kommer det med hög sannolikhet dissociera, men om det är korrekt bildas snabbt en peptidbindning mellan dess aminosyra och peptiden (aminosyrakedjan) på tRNAt i P-siten. Peptiden, nu förlängd med en aminosyra, förs då över till tRNAt i A-siten och ribosomen går in i sitt roterade tillstånd, där de två subenheterna är vridna ca. 6° i förhållande till varandra. De två tRNA-molekylerna måste nu förflyttas från A- respektive P-siten till P- respektive E-siten för att en ny aminosyra ska kunna fogas till den växande peptidked-jan. Detta sk. translokeringssteg katalyseras av elongeringsfaktor G (EF-G) som strax efter att ha bundit till ribosomen hydrolyserar en GTP-molekyl.
Energin som då frigörs omvandlas till konformationsförändringar i EF-G som leder till tillbakarotation av ribosomens subenheter, förflyttning av de två tRNA-molekylerna och förskjutning av mRNAts position på ribosomen med ett kodon. Cykler av peptidbindningsbildning och translokation uppre-pas till dess att ribosomen når ett stopkodon. I termineringsfasen binder en releasefaktor (Typ 1) till ribosomens A-site och hydrolyserar bindningen mellan peptiden och tRNAt i P-siten, så att det färdiga proteinet kan lämna ribosomen. Ytterligare en releasefaktor (Typ 2), binder därefter till riboso-men för att frigöra den första releasefaktorn. Posttermineringskomplexet som då återstår innehåller mRNA och ett deacylerat tRNA i P-siten, dvs. ett tRNA utan vare sig aminosyra eller peptid. Detta komplex splittras i re-cyclingfasen av EF-G och ribosome recycling factor (RRF) som separerar de två subenheterna från varandra för att frigöra dem för initiering av protein-syntes på ett nytt mRNA. Initieringsfaktor 3 (IF3) binder till 30S-subenheten och katalyserar tRNA- och mRNA-dissociation samt förhindrar subenheter-na från att återbinda till varandra i förtid.
I mitt avhandlingsarbete har jag studerat de två faser av proteinsyntesen där EF-G spelar en viktig roll, elongering och recycling. Alla experiment har utförts i provrör (in vitro), men under förhållanden som är optimerade för att ribosomerna ska behålla den funktion och aktivitet som de har inuti cellen (in vivo). I artikel I utvecklade vi en metod för att mäta genomsnittstiden för ett translokeringssteg vid valfri position längs mRNA. Till skillnad från tidi-gare metoder, som bara kunnat följa delsteg i translokeringsprocessen, mätte vi med vår metod den totala tiden för alla EF-G-beroende steg, faktorbind-ning, GTP-hydrolys, mRNA- och tRNA-förflyttfaktorbind-ning, subenhetsrotation samt EF-G-dissociation. Vi kunde visa att det första translokeringssteget efter initieringen var långsammare än ett translokeringssteg 15 kodoner längre ned längs mRNAt. Vid låg koncentration av magnesiumjoner, såsom i cellen, var translokeringen snabb, med hastigheter förenliga med de elongeringshastig-heter som uppmätts in vivo. Hög koncentration av magnesiumjoner är för-ödande för ribosomernas funktion och leder till mycket långsam transloke-ring. Vi undersökte också en hypotes från en tidigare studie, där ribosomer-nas fördelning på mRNA inuti cellen analyserats, som föreslog att Shine-Dalgarno-lika sekvenser i mRNA påverkar hur fort ribosomerna transloke-rar. En starkare växelverkan mellan mRNA och ribosom skulle då ge en långsammare translokering, men någon sådan effekt kunde inte påvisas med vår metod.
I artikel III studerade vi hur EF-G och RRF samarbetar för att separera ri-bosomens subenheter från varandra under recyclingfasen. Vi kartlade den fullständiga mekanismen för detta och bestämde hastighetskonstanterna för alla delsteg i processen. Vi kunde visa att RRF måste binda till ribosomen innan EF-G för att splittring skulle ske. EF-G tävlar med RRF om att binda
till posttermineringskomplexet, vilket leder till långsam splittring samt onö-dig hydrolys av GTP vid höga EF-G koncentrationer. Den maximala splitt-ringshastigheten, som är 25 s-1, uppnås vid höga koncentrationer av både G och RRF och när RRF-koncentrationen samtidigt är mycket högre än EF-G-koncentrationen. Antalet GTP-molekyler som konsumeras per splittrings-händelse minskar med ökad RRF-koncentration och når tillslut ett värde nära en GTP per splittring, vilket avspeglar hög sannolikhet för splittring av post-termineringskomplexet när både RRF och EF-G har bundit. Vår biokemiska kartläggning av recyclingmekanismen, i kombination med en nyutvecklad metod för tidsupplöst kryo-elektronmikroskopi, har möjliggjort strukturbe-stämning av det RRF- och EF-G-bundna posttermineringskomplex.
Fusidinsyra är ett antibiotikum som inhiberar proteinsyntesen genom att binda till ribosombundet EF-G under både translokeringen och i recyclingfa-sen. I artikel II undersökte vi hur fusidinsyra påverkar translokeringen och fann att tre olika fusidinsyrakänsliga tillstånd förekommer i varje elongeringscykel. Det första och känsligaste, som nås tidigt i translokering-en, identifierades preliminärt som det stadium som uppnås efter GTP-hydrolys men före mRNA-förflyttning. Från detta stadium fortsätter riboso-merna snabbt till ett tillstånd från vilket fusidinsyran kan frigöras, men till vilket den även kan återbinda. Strukturen av ett sådant intermediärt translo-keringstillstånd har tidigare bestämts med kryo-elektronmikroskopi. Det tredje fusidinsyrabundna tillståndet, vars struktur bestämts med röntgen-kristallografi, nås antingen genom fusidinsyrabindning efter slutförd tRNA- och mRNA-förflyttning eller, efter att EF-G har lämnat ribosomen, genom återbindning av EF-G och fusidinsyra till posttranslokeringskomplexet. I det senare fallet fungerar EF-G och fusidinsyra som kompetitiva inhibitorer av ternärkomplexbindning och påföljande peptidbindningsbildning. Denna ef-fekt visade sig dock vara svag, men kan möjligen bli viktig i vissa situationer när ternärkomplexkoncentrationerna är låga. Varje gång fusidinsyra binder till EF-G förblir den bunden i genomsnitt 5 till 10 sekunder. Eftersom denna tid är ungefär hundra gånger längre än genomsnittstiden för en oinhiberad elongeringscykel räcker det att en mycket liten andel av ribosomerna binder fusidinsyra för att uppnå en stark effekt. Vi fann att redan vid en antibiotika-koncentration av 0.6 µM ökade genomsnittstiden för en elongeringscykel till det dubbla trots att mindre än en procent av ribosomerna var bundna till fusidinsyra. Detta resultat stod i motsats till en tidigare studie som visat att det krävdes så mycket som 200 µM fusidinsyra för att dubblera tiden för en elongeringscykel. Samma studie innehöll även en uppskattning av fusidinsyrakänsligheten i recyclingfasen och visade att så lite som 0.1 µM fusidinsyra krävdes för att dubblera recyclingtiden. Baserat på dessa resultat drog författarna slutsatsen att den huvudsakliga effekten av fusidinsyra i cellen är kopplad till inhibering av recycling. Vi kunde dock visa hur under-målig experimentutformning i den tidigare studien lett till en underskattning
av fusidinsyrakänsligheten i elongeringsfasen, vilket återigen gjorde fusidinsyrans huvudsakliga effekt i cellen till en öppen fråga.
I artikel IV kartlade vi den fullständiga mekanismen för fusidinsyrans inhi-berande effekt i recyclingfasen. Vi visade att fusidinsyra kan binda till EF-G både i närvaro och frånvaro av RRF på posttermineringskomplexet. I båda fallen var bindningstiden ca. 5 s, dvs ungefär lika lång som i elongeringsfal-let. Fusidinsyrans inhiberande effekt ökade med ökande koncentrationskvot mellan EF-G och RRF, på grund av ökad sannolikhet för bindning av EF-G och fusidinsyra till posttermineringskomplexet. Hur mycket fusidinsyra som krävdes för att dubbla recyclingtiden varierade alltså med koncentrationerna av de två faktorerna, men var cirka 0.3 µM vid förhållanden som liknar de i cellen. Våra resultat visar således att fusidinsyra inhiberar ribosomer i elongeringsfas och i recyclingfas ungefär lika effektivt. Dock måste man beakta att det för att tillverka ett genomsnittligt protein krävs flera hundra elongeringscykler men bara ett recyclingsteg. Trots att tiden för recycling ökar snabbare med fusidinsyrakoncentrationen än tiden för en elongeringscykel så kommer recyclingtiden, vid fysiologiskt relevanta kon-centrationer av fusidinsyra, aldrig att utgöra mer än en liten andel av den totala tiden för att tillverka ett protein. Den huvudsakliga effekten av fusidinsyra bör alltså vara inhibering av ribosomer i elongeringsfasen. Denna inhibering är sannolikt ännu starkare i cellen än den effekt vi uppskattat in
vitro eftersom de långa pauser som fusidinsyran orsakar i ribosomernas
rö-relse längs mRNAt kan leda till köbildning när bakomvarande ribosomer hinner ikapp den ribosom som stannat upp. Baserat på resultaten i artikel II och IV har vi nu påbörjat en studie för datormodellering av fusidinsyrans effekt på proteinsyntesen i cellen. Vi planerar också att utföra experiment som visar hur fördelningen av ribosomer på mRNA inuti cellen påverkas av fusidinsyra för att kunna visa vilket som är dess dominerande effekt och för att påvisa eventuella köbildningseffekter.
Acknowledgements
Thank you Måns! There have been ups and downs, but in the end I am very proud and happy about the things we achieved together. Thank you for shar-ing you unique ways of dealshar-ing with rate constants in particular and with life in general!
Suparna, thank you for scientific input and for always supporting me.
Thanks to 3H Biomedical for accepting me as an industry PhD student. Thanks to Professors Joachim Frank and Zoya Ignatova for letting me work with your groups, although the fruits from that work are yet to be har-vested.
I want to thank all past and present members of the Molecular Biology
program that I have worked with over the years, I will just mention a few.
Thank you Misha for taking my results to another level, I wish I could un-derstand what you unun-derstand! Magnus for sharing your experimental knowledge, for comments on manuscripts and for always encouraging me.
David for help with Matlab programming and data evaluation. Ikue and Vasili for pioneering the fusidic acid work. Ikue for tears and laughter and
music, I really enjoyed having you as my friend and colleague! Kristin for common struggles in the early days, for arranging activities and fikas. Since you left, we miss you in the lab! Mikael for proofreading the thesis, for great parties, for “therapy” and discussions about anything between heaven and earth. Ray for supplying enormous amounts of components – I know, RRF was never your favorite! Harriet, Emmeli and Onur for present and future collaborations. Eugene and Erik for good work in the lab and for letting me practice my pedagogical skills on you. Thanks also to Akiko, for solving large and small problems!
I would also like to thank my family and friends, although in Swedish:
Tjejerna - Amina, Ullis, Katja, Christina och Malin, även om vi inte ses
Spelvänner och Dansvänner! För ”minisemestrar”, bortkoppling,
hjärn-städning och ny energi!
Meta, för mysiga middagar och för att du håller ett öga på mig!
Per, du har varit ett stort stöd genom många år! Jag är stolt över alla bedrifter
vi har klarat av tillsammans och glad över alla minnen från våra semesteräven-tyr!
Pappa, för att du finns där när det verkligen behövs och för allt du har lärt
mig genom åren.
Mamma, jag saknar dig, det är så mycket jag hade velat dela med dig. Jag
vet att du hade varit stolt över mig nu!
Magnus, du är den varmaste och mest omtänksamma person jag vet. Jag är
References
1. Bremer H, Dennis P. (1996) Modulation of Chemical Composition and Other Parameters of the Cell by Growth Rate. Escherichia coli
and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, ed al. NFCe
(ASM Press, Washington DC), 2 Ed, pp 1553-1569.
2. Alberts B (2004) Essential cell biology (Garland, New York) 2. Ed pp xxi, 740 s.
3. Schmeing TM & Ramakrishnan V (2009) What recent ribosome
structures have revealed about the mechanism of translation. Nature 461(7268):1234-1242.
4. Rheinberger HJ, Sternbach H, & Nierhaus KH (1981) Three tRNA binding sites on Escherichia coli ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 78(9):5310-5314.
5. Lill R, Robertson JM, & Wintermeyer W (1984) tRNA binding sites of ribosomes from Escherichia coli. Biochemistry (Mosc). 23(26):6710-6717.
6. Grajevskaja RA, Ivanov YV, & Saminsky EM (1982) 70-S
ribosomes of Escherichia coli have an additional site for deacylated tRNA binding. Eur. J. Biochem. 128(1):47-52.
7. Shine J & Dalgarno L (1975) Determinant of cistron specificity in bacterial ribosomes. Nature 254(5495):34-38.
8. Klein DJ, Moore PB, & Steitz TA (2004) The contribution of metal ions to the structural stability of the large ribosomal subunit. RNA 10(9):1366-1379.
9. Schuwirth BS, et al. (2005) Structures of the bacterial ribosome at 3.5 A resolution. Science 310(5749):827-834.
10. Selmer M, et al. (2006) Structure of the 70S ribosome complexed with mRNA and tRNA. Science 313(5795):1935-1942.
11. Zitomer RS & Flaks JG (1972) Magnesium dependence and
equilibrium of the Escherichia coli ribosomal subunit association. J.
Mol. Biol. 71(2):263-279.
12. Jelenc PC & Kurland CG (1979) Nucleoside triphosphate
regeneration decreases the frequency of translation errors. Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76(7):3174-3178.
13. Johansson M, Zhang J, & Ehrenberg M (2012) Genetic code
translation displays a linear trade-off between efficiency and accuracy of tRNA selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109(1):131-136.
14. Gromadski KB & Rodnina MV (2004) Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Mol. Cell 13(2):191-200.
15. Antoun A, Pavlov MY, Lovmar M, & Ehrenberg M (2006) How
initiation factors maximize the accuracy of tRNA selection in initiation of bacterial protein synthesis. Mol. Cell 23(2):183-193.
16. Antoun A, Pavlov MY, Lovmar M, & Ehrenberg M (2006) How
initiation factors tune the rate of initiation of protein synthesis in bacteria. EMBO J. 25(11):2539-2550.
17. Huang C, Mandava CS, & Sanyal S (2010) The ribosomal stalk plays a key role in IF2-mediated association of the ribosomal subunits. J. Mol. Biol. 399(1):145-153.
18. Schmeing TM, et al. (2009) The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science 326(5953):688-694. 19. Ogle JM, et al. (2001) Recognition of cognate transfer RNA by the
30S ribosomal subunit. Science 292(5518):897-902.
20. Zhang J, Ieong KW, Johansson M, & Ehrenberg M (2015) Accuracy of initial codon selection by aminoacyl-tRNAs on the mRNA-programmed bacterial ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 21. Valle M, et al. (2003) Locking and unlocking of ribosomal motions.
Cell 114(1):123-134.
22. Frank J & Agrawal RK (2000) A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature 406(6793):318-322.
23. Ermolenko DN, et al. (2007) Observation of intersubunit movement of the ribosome in solution using FRET. J. Mol. Biol. 370(3):530-540.
24. Spiegel PC, Ermolenko DN, & Noller HF (2007) Elongation factor G stabilizes the hybrid-state conformation of the 70S ribosome. RNA 13(9):1473-1482.
25. Rodnina MV, Savelsbergh A, Katunin VI, & Wintermeyer W (1997) Hydrolysis of GTP by elongation factor G drives tRNA movement on the ribosome. Nature 385(6611):37-41.
26. Scolnick E, Tompkins R, Caskey T, & Nirenberg M (1968) Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 61(2):768-774.
27. Freistroffer DV, Pavlov MY, MacDougall J, Buckingham RH, & Ehrenberg M (1997) Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J. 16(13):4126-4133.
28. Peske F, Kuhlenkoetter S, Rodnina MV, & Wintermeyer W (2014) Timing of GTP binding and hydrolysis by translation termination factor RF3. Nucleic Acids Res 42(3):1812-1820.
29. Zavialov AV, Mora L, Buckingham RH, & Ehrenberg M (2002) Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol. Cell 10(4):789-798.
30. Zavialov AV, Buckingham RH, & Ehrenberg M (2001) A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107(1):115-124. 31. Gao H, et al. (2007) RF3 induces ribosomal conformational changes responsible for dissociation of class I release factors. Cell 129(5):929-941.
32. Hirashima A & Kaji A (1973) Role of elongation factor G and a protein factor on the release of ribosomes from messenger ribonucleic acid. J. Biol. Chem. 248(21):7580-7587.
33. Karimi R, Pavlov MY, Buckingham RH, & Ehrenberg M (1999) Novel roles for classical factors at the interface between translation termination and initiation. Mol. Cell 3(5):601-609.
34. Peske F, Rodnina MV, & Wintermeyer W (2005) Sequence of steps in ribosome recycling as defined by kinetic analysis. Mol. Cell 18(4):403-412.
35. Zavialov AV, Hauryliuk VV, & Ehrenberg M (2005) Splitting of the posttermination ribosome into subunits by the concerted action of RRF and EF-G. Mol. Cell 18(6):675-686.
36. Hirokawa G, et al. (2005) The role of ribosome recycling factor in dissociation of 70S ribosomes into subunits. RNA 11(8):1317-1328. 37. Savelsbergh A, Rodnina MV, & Wintermeyer W (2009) Distinct
functions of elongation factor G in ribosome recycling and translocation. RNA 15(5):772-780.
38. Alatossava T, Jutte H, Kuhn A, & Kellenberger E (1985)
Manipulation of intracellular magnesium content in polymyxin B nonapeptide-sensitized Escherichia coli by ionophore A23187. J.
Bacteriol. 162(1):413-419.
39. Johansson M, Bouakaz E, Lovmar M, & Ehrenberg M (2008) The kinetics of ribosomal peptidyl transfer revisited. Mol. Cell 30(5):589-598.
40. Indrisiunaite G, Pavlov MY, Heurgue-Hamard V, & Ehrenberg M (2015) On the pH Dependence of Class-1 RF-Dependent Termination of mRNA Translation. J. Mol. Biol.
41. Studer SM, Feinberg JS, & Joseph S (2003) Rapid kinetic analysis of EF-G-dependent mRNA translocation in the ribosome. J. Mol.
Biol. 327(2):369-381.
42. Antoun A, Pavlov MY, Tenson T, & Ehrenberg MM (2004)
Ribosome formation from subunits studied by stopped-flow and Rayleigh light scattering. Biol Proced Online 6:35-54.
43. Bohren CF & Huffman DR (1983) Absorption and scattering of
light by small particles (Wiley, New York) pp xiv, 530 p.
44. Yonath A (2002) The search and its outcome: high-resolution structures of ribosomal particles from mesophilic, thermophilic, and halophilic bacteria at various functional states. Annu. Rev. Biophys.
Biomol. Struct. 31:257-273.
45. Zavialov AV & Ehrenberg M (2003) Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of translation factors. Cell 114(1):113-122.
46. Moazed D & Noller HF (1989) Interaction of tRNA with 23S rRNA in the ribosomal A, P, and E sites. Cell 57(4):585-597.
47. Cornish PV, Ermolenko DN, Noller HF, & Ha T (2008)
Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Mol. Cell 30(5):578-588.
48. Blanchard SC, Kim HD, Gonzalez RL, Jr., Puglisi JD, & Chu S (2004) tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101(35):12893-12898.
49. Kim HD, Puglisi JD, & Chu S (2007) Fluctuations of transfer RNAs between classical and hybrid states. Biophys. J. 93(10):3575-3582. 50. Fei J, Kosuri P, MacDougall DD, & Gonzalez RL, Jr. (2008)
Coupling of ribosomal L1 stalk and tRNA dynamics during translation elongation. Mol. Cell 30(3):348-359.
51. Agirrezabala X, et al. (2008) Visualization of the hybrid state of tRNA binding promoted by spontaneous ratcheting of the ribosome.
Mol. Cell 32(2):190-197.
52. Julian P, et al. (2008) Structure of ratcheted ribosomes with tRNAs in hybrid states. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105(44):16924-16927.
53. Munro JB, Altman RB, Tung CS, Sanbonmatsu KY, & Blanchard SC (2010) A fast dynamic mode of the EF-G-bound ribosome.
EMBO J. 29(4):770-781.
54. Munro JB, et al. (2010) Spontaneous formation of the unlocked state of the ribosome is a multistep process. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107(2):709-714.
55. Munro JB, Altman RB, O'Connor N, & Blanchard SC (2007)
Identification of two distinct hybrid state intermediates on the ribosome. Mol. Cell 25(4):505-517.
56. Chen J, Petrov A, Tsai A, O'Leary SE, & Puglisi JD (2013) Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nat Struct Mol Biol.
57. Savelsbergh A, et al. (2003) An elongation factor G-induced ribosome rearrangement precedes tRNA-mRNA translocation. Mol.
Cell 11(6):1517-1523.
58. Chen Y, Feng S, Kumar V, Ero R, & Gao YG (2013) Structure of EF-G-ribosome complex in a pretranslocation state. Nat Struct Mol
Biol 20(9):1077-1084.
59. Tourigny DS, Fernandez IS, Kelley AC, & Ramakrishnan V (2013) Elongation factor G bound to the ribosome in an intermediate state of translocation. Science 340(6140):1235490.
60. Zhou J, Lancaster L, Donohue JP, & Noller HF (2013) Crystal structures of EF-G-ribosome complexes trapped in intermediate states of translocation. Science 340(6140):1236086.
61. Ratje AH, et al. (2010) Head swivel on the ribosome facilitates translocation by means of intra-subunit tRNA hybrid sites. Nature 468(7324):713-716.
62. Zhou J, Lancaster L, Donohue JP, & Noller HF (2014) How the ribosome hands the A-site tRNA to the P site during EF-G-catalyzed translocation. Science 345(6201):1188-1191.
63. Ramrath DJ, et al. (2013) Visualization of two transfer RNAs trapped in transit during elongation factor G-mediated translocation.