Proteiner deltar i nästan alla processer i en cell, exempelvis DNA-replikation, katalys av kemiska reaktioner eller signaltransduktion. Vid dessa processer interagerar proteiner med andra molekyler för att kunna utföra sina uppgifter. Många läkemedel verkar även genom interaktioner med proteiner och påverkar därmed deras funktion. Att förstå molekylära interaktioner med proteiner är därför viktigt för att förstår hur celler fungerar och för att ut-veckla nya läkemedel. I detta arbete undersökts interaktioner mellan protei-ner och mindre interaktionspartprotei-ners genom användning av ytplasmon reso-nans spektroskopi (SPR) baserade biosensorer och fluorescens baserade ak-tivitets mätningar.
C-reaktivt protein (CRP) är ett blodplasmaprotein som markerar bakterie och skadade cellen för immunförsvaret. Dessutom är CRP en viktig in-flammationsmarkör och mätningar av koncentrationen i blod används van-ligtvis i medicinisk diagnostik. För att analysera interaktioner mellan CRP och olika ligander har proteinet kopplats till en SPR biosensoryta. Interakt-ionsstudier med den endogena liganden phosphocholin belyste hur CRP känner igen cellmembran hos bakterier och skadade celler. Dessutom stude-rades interaktioner med flera artificiella ligander som kan användas för att utveckla nya förbättrade metoder för att mäter CRP koncentrationer i blod-prov. En interaktionsstudie med kalcium visade att biosensor analyser kan användas för att mäta jon-protein interaktioner. Denna typ av metod har knappt används förut och öppnar därmed upp för nya användningsområden för biosensor baserade analyser.
BACE1 är ett transmembran protein och ett viktigt mål för läkemedel mot Alzheimers sjukdom. Hitintills har det inte vart möjligt att hitta BACE hämmare som är lämpliga att använda som läkemedel. I denna studie för-sökts därför att förbättra metoder för att söka efter nya BACE1 hämmare.
Vanligtvis använder man en trunkerad och därmed löslig variant av BACE1, däremot är det inte klart att denna variant är lämplig för att identifiera och karaktärisera hämmare. En SPR biosensormetod utvecklades för både den trunkerade varianten och den membranbundna varianten i vilket enzymet var integrerat i ett lipid membran. Analysering av växelverkan med kända BACE1 hämmare visade att interaktionen inte blir påverkad av den trans-membran regionen och att den trunkerade varianten är ett bra modellsystem.
Dessutom visade det sig att hämmare med en hög affinitet for BACE1 i ne-utrala och sura pH även är bra hämmare i cellbaserade analyser.
Samma metod som används för att koppla membranbundet BACE1 till en biosensor yta används också för en GABAA receptor, en viktig jonkanal i det centrala nervsystemet och ett mål för många läkemedel. Karakterisering av dess interaktion med små molekyler såsom histamin eller GABA gav nya insikter i GABAA receptorernas funktion i hjärna. I framtiden kan denna metod användas för att hitta nya molekyler som interagerar med GABAA receptorn och därmed finna nya läkemedel.
Att söka efter nya bioaktiva ämnen från havsdjurs extrakt är en vanlig strategi i marin bioprospektering. En kombination av SPR baserade metoder och fluorescens baserade aktivitets mätningar undersöks för att förbättra denna process. Det var möjligt att identifiera extrakt från sill som innehåller ämnen som reducerar aktiviteten hos olika proteaser. För HIV-1 proteasen och SAP1, 2 och 3 som är läkemedel mål för olika sjukdomar, var det möj-ligt med SPR baserade kompetitions analyser visar att denna hämning är med stor sannolikhet orsakat genom interaktion med enzymets aktiva säte.
Denna avhandling visar att det är viktig att studera protein interaktioner för att förstå proteiners funktion och för att utveckla nya läkemedel.
Acknowledgements
When I came to Sweden I planned to stay only for 6 months. Now I have been here for more than five years and I did not regret a single moment. I’m thankful for this memorable time and all the great people I meet. I’m sorry that it is not possible to mention all of you here but that would definitely go beyond the scope of this thesis.
I would like to thank my great supervisor, Helena Danielson, for accept-ing me as PhD student and givaccept-ing me the possibility to stay in Uppsala. I also want to thank my cosupervisor Mikael Widersten, it was nice to see that also as professor and head of the department you still had time to show up at the lunch room for “fika”. Thanks to Gun Stenberg, Bengt Mannervik, Françoise Raffalli-Mathieu and Gunnar Johansson for sharing your bio-chemical knowledge and experience.
I also want to thank Inge W. Nilsen for giving me the opportunity to work at Nofima in Tromsø and to enjoy the great nature of Northern Norway.
Thanks to all people at Nofima for the friendly working atmosphere espacially Diana Lindberg, Kersti Øverbø, Bjørnar Myrnes and Jan Arne Arnesen.
I thank all my collaborators and co-authors for the contributions to this thesis. During the last years, I also had several project students which often were a great help.
Thanks to all the present and former members of the Department of Chemistry-BMC: Angelica, the ÄKTA expert, without you the lab was dis-turbingly calm during the last year and I’m sorry that I had to refuse all your kind offers. Sofia, how much I enjoy working with you is probably best re-flected in how I defended my office space in your room (now it is all yours Angelica). You have a great organizing talent and thanks to you we had sev-eral really nice group events. Johan, without you the lab would not have been running as smoothly as it did. Matthis and Thomas, your great introduc-tion to the Biacore made my time as a PhD student much easier. Eldar, you are a quite but invaluable person for the lab. Helena N., your Biacore exper-tise were a great help. Malin, you are a great discussion partner. Göran, you had always helpful tips in case an experiment was not working. Christian, it
was great to work with you and to have someone to talk with in germane.
Cissi, you have been a great friend at work and outside of the BMC, I will always remember the first time I met you. Åsa, thanks for the skiing lessons and a lot of fun discussion and new insights. Nisse, it was nice to have someone around who understands that it is fun climbing ice walls at -15°C.
Emilia, you have a great sense of humour which was greatly missed after you left BMC. Diana, we started together the adventure to work in Tromsø and I hope it will be as much fun in the future as it was in the past. Magnus B., thanks for open up your home in Kiruna and showing the beauty of Northern Sweden. Sara S., it is a pity that you started at the lab when I was already on my way out. I wish we could have worked more together. Johan-na J., you always helped when fast help was needed and not only that you know the latest interesting rumours, you also produced some by yourself.
Rikard, Christian, Sara N., thanks for many nice “fikas”
Kicki, Mangnus L., Patrik, Cissi, Emilia, Magnus B., thanks for distracted me from work with countless numbers of beers during the last years and introducing me to the student nation culture in Uppsala.
References
1 'Iupac-Iub Joint Commission on Biochemical Nomenclature (Jcbn).
Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides.
Recommendations 1983', Biochem J, 219 (1984), 345-73.
2 David L. Nelson, Albert L. Lehninger, and Michael M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry (New York: W.H. Freeman, 2008).
3 David E. Golan, Principles of Pharmacology : The Pathophysiologic Basis of Drug Therapy (Philadelphia, Pa.; London: Lippincott Williams & Wilkins, 2011).
4 Peter De Paula Julio Atkins, Physical ChemistryW. H. Freeman & Co, 2009).
5 Robert A. Copeland, Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacolists (Hoboken, NJ: Wiley Interscience, 2005).
6 G. B. Kim, and Y. P. Kim, 'Analysis of Protease Activity Using Quantum Dots and Resonance Energy Transfer', Theranostics, 2 (2012), 127-38.
7 Robert Allen Copeland, Enzymes : A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis (New York: Wiley, 2000).
8 M. A. Cooper, 'Optical Biosensors in Drug Discovery', Nat Rev Drug Discov, 1 (2002), 515-28.
9 Biacore AB, Biaevaluation Software Handbook. version 3.0 edn, 1997).
10 S. Black, I. Kushner, and D. Samols, 'C-Reactive Protein', J Biol Chem, 279 (2004), 48487-90.
11 M. B. Pepys, and G. M. Hirschfield, 'C-Reactive Protein: A Critical Update', J Clin Invest, 111 (2003), 1805-12.
12 J. E. Volanakis, 'Human C-Reactive Protein: Expression, Structure, and Function', Mol Immunol, 38 (2001), 189-97.
13 B. C. Holwerda, 'Herpesvirus Proteases: Targets for Novel Antiviral Drugs', Antiviral Res, 35 (1997), 1-21.
14 M. Geitmann, and U. H. Danielson, 'Studies of Substrate-Induced Conformational Changes in Human Cytomegalovirus Protease Using Optical Biosensor Technology', Anal Biochem, 332 (2004), 203-14.
15 U. Rudolph, and F. Knoflach, 'Beyond Classical Benzodiazepines: Novel Therapeutic Potential of Gabaa Receptor Subtypes', Nat Rev Drug Discov, 10 (2011), 685-97.
16 E. A. Barnard, P. Skolnick, R. W. Olsen, H. Mohler, W. Sieghart, G. Biggio, C. Braestrup, A. N. Bateson, and S. Z. Langer, 'International Union of Pharmacology. Xv. Subtypes of Gamma-Aminobutyric Acida Receptors:
Classification on the Basis of Subunit Structure and Receptor Function', Pharmacol Rev, 50 (1998), 291-313.
17 R. W. Olsen, and W. Sieghart, 'International Union of Pharmacology. Lxx.
Subtypes of Gamma-Aminobutyric Acid(a) Receptors: Classification on the Basis of Subunit Composition, Pharmacology, and Function. Update', Pharmacol Rev, 60 (2008), 243-60.
18 P. S. Miller, and T. G. Smart, 'Binding, Activation and Modulation of Cys-Loop Receptors', Trends Pharmacol Sci, 31 (2010), 161-74.
19 J. Eder, U. Hommel, F. Cumin, B. Martoglio, and B. Gerhartz, 'Aspartic Proteases in Drug Discovery', Curr Pharm Des, 13 (2007), 271-85.
20 Perry A. Frey, and Adrian D. Hegeman, Enzymatic Reaction Mechanisms (Oxford; New York: Oxford University Press, 2007).
21 C. E. Hunt, and A. J. Turner, 'Cell Biology, Regulation and Inhibition of Beta-Secretase (Bace-1)', FEBS J, 276 (2009), 1845-59.
22 A. Brik, and C. H. Wong, 'Hiv-1 Protease: Mechanism and Drug Discovery', Org Biomol Chem, 1 (2003), 5-14.
23 A. K. Ghosh, 'Harnessing Nature's Insight: Design of Aspartyl Protease Inhibitors from Treatment of Drug-Resistant Hiv to Alzheimer's Disease', J Med Chem, 52 (2009), 2163-76.
24 G. Koelsch, J. Tang, J. A. Loy, M. Monod, K. Jackson, S. I. Foundling, and X.
Lin, 'Enzymic Characteristics of Secreted Aspartic Proteases of Candida Albicans', Biochim Biophys Acta, 1480 (2000), 117-31.
25 M. Bein, M. Schaller, and H. C. Korting, 'The Secreted Aspartic Proteinases as a New Target in the Therapy of Candidiasis', Curr Drug Targets, 3 (2002), 351-7.
26 M. Schaller, M. Bein, H. C. Korting, S. Baur, G. Hamm, M. Monod, S.
Beinhauer, and B. Hube, 'The Secreted Aspartyl Proteinases Sap1 and Sap2 Cause Tissue Damage in an in Vitro Model of Vaginal Candidiasis Based on Reconstituted Human Vaginal Epithelium', Infect Immun, 71 (2003), 3227-34.
27 J. R. Naglik, S. J. Challacombe, and B. Hube, 'Candida Albicans Secreted Aspartyl Proteinases in Virulence and Pathogenesis', Microbiol Mol Biol Rev, 67 (2003), 400-28, table of contents.
28 N. Khuseyinova, A. Imhof, G. Trischler, D. Rothenbacher, W. L. Hutchinson, M. B. Pepys, and W. Koenig, 'Determination of C-Reactive Protein:
Comparison of Three High-Sensitivity Immunoassays', Clin Chem, 49 (2003), 1691-5.
29 M. A. Ramadan, A. K. Shrive, D. Holden, D. A. Myles, J. E. Volanakis, L. J.
DeLucas, and T. J. Greenhough, 'The Three-Dimensional Structure of Calcium-Depleted Human C-Reactive Protein from Perfectly Twinned Crystals', Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 58 (2002), 992-1001.
30 A. K. Shrive, G. M. Cheetham, D. Holden, D. A. Myles, W. G. Turnell, J. E.
Volanakis, M. B. Pepys, A. C. Bloomer, and T. J. Greenhough, 'Three Dimensional Structure of Human C-Reactive Protein', Nat Struct Biol, 3 (1996), 346-54.
31 J. E. Gestwicki, H. V. Hsieh, and J. B. Pitner, 'Using Receptor Conformational Change to Detect Low Molecular Weight Analytes by Surface Plasmon Resonance', Anal Chem, 73 (2001), 5732-7.
32 T. Flatmark, A. J. Stokka, and S. V. Berge, 'Use of Surface Plasmon Resonance for Real-Time Measurements of the Global Conformational Transition in Human Phenylalanine Hydroxylase in Response to Substrate Binding and Catalytic Activation', Anal Biochem, 294 (2001), 95-101.
33 T. Mannen, S. Yamaguchi, J. Honda, S. Sugimoto, A. Kitayama, and T.
Nagamune, 'Observation of Charge State and Conformational Change in Immobilized Protein Using Surface Plasmon Resonance Sensor', Anal Biochem, 293 (2001), 185-93.
34 T. Zako, K. Harada, T. Mannen, S. Yamaguchi, A. Kitayama, H. Ueda, and T.
Nagamune, 'Monitoring of the Refolding Process for Immobilized Firefly Luciferase with a Biosensor Based on Surface Plasmon Resonance', J Biochem, 129 (2001), 1-4.
35 H. Sota, Y. Hasegawa, and M. Iwakura, 'Detection of Conformational Changes in an Immobilized Protein Using Surface Plasmon Resonance', Anal Chem, 70 (1998), 2019-24.
36 C. M. Kinoshita, S. C. Ying, T. E. Hugli, J. N. Siegel, L. A. Potempa, H. Jiang, R. A. Houghten, and H. Gewurz, 'Elucidation of a Protease-Sensitive Site Involved in the Binding of Calcium to C-Reactive Protein', Biochemistry, 28 (1989), 9840-8.
37 O. I. Egbuna, and E. M. Brown, 'Hypercalcaemic and Hypocalcaemic Conditions Due to Calcium-Sensing Receptor Mutations', Best Pract Res Clin Rheumatol, 22 (2008), 129-48.
38 A. K. Ghosh, M. Brindisi, and J. Tang, 'Developing Beta-Secretase Inhibitors for Treatment of Alzheimer's Disease', J Neurochem, 120 Suppl 1 (2012), 71-83.
39 M. A. Yildirim, K. I. Goh, M. E. Cusick, A. L. Barabasi, and M. Vidal, 'Drug-Target Network', Nat Biotechnol, 25 (2007), 1119-26.
40 W. D. Mallender, D. Yager, L. Onstead, M. R. Nichols, C. Eckman, K.
Sambamurti, L. M. Kopcho, J. Marcinkeviciene, R. A. Copeland, and T. L.
Rosenberry, 'Characterization of Recombinant, Soluble Beta-Secretase from an Insect Cell Expression System', Mol Pharmacol, 59 (2001), 619-26.
41 H. Park, and S. Lee, 'Determination of the Active Site Protonation State of Beta-Secretase from Molecular Dynamics Simulation and Docking Experiment: Implications for Structure-Based Inhibitor Design', J Am Chem Soc, 125 (2003), 16416-22.
42 R. Rajamani, and C. H. Reynolds, 'Modeling the Protonation States of the Catalytic Aspartates in Beta-Secretase', J Med Chem, 47 (2004), 5159-66.
43 N. Yu, S. A. Hayik, B. Wang, N. Liao, C. H. Reynolds, and K. M. Merz, Jr., 'Assigning the Protonation States of the Key Aspartates in Beta-Secretase Using Qm/Mm X-Ray Structure Refinement', J Chem Theory Comput, 2 (2006), 1057-69.
44 I. D. Hills, and J. P. Vacca, 'Progress toward a Practical Bace-1 Inhibitor', Curr Opin Drug Discov Devel, 10 (2007), 383-91.
45 P. Stenlund, G. J. Babcock, J. Sodroski, and D. G. Myszka, 'Capture and Reconstitution of G Protein-Coupled Receptors on a Biosensor Surface', Anal Biochem, 316 (2003), 243-50.
46 M. A. Cooper, A. Hansson, S. Lofas, and D. H. Williams, 'A Vesicle Capture Sensor Chip for Kinetic Analysis of Interactions with Membrane-Bound Receptors', Anal Biochem, 277 (2000), 196-205.
47 O. P. Karlsson, and S. Lofas, 'Flow-Mediated on-Surface Reconstitution of G-Protein Coupled Receptors for Applications in Surface Plasmon Resonance Biosensors', Anal Biochem, 300 (2002), 132-8.
48 I. Navratilova, M. Dioszegi, and D. G. Myszka, 'Analyzing Ligand and Small Molecule Binding Activity of Solubilized Gpcrs Using Biosensor Technology', Anal Biochem, 355 (2006), 132-9.
49 A. Slany, J. Zezula, V. Tretter, and W. Sieghart, 'Rat Beta 3 Subunits Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells Form High Affinity [35s]T-Butylbicyclophosphorothionate Binding Sites Modulated by Several Allosteric Ligands of Gamma-Aminobutyric Acid Type a Receptors', Mol Pharmacol, 48 (1995), 385-91.
50 J. R. Wooltorton, S. J. Moss, and T. G. Smart, 'Pharmacological and Physiological Characterization of Murine Homomeric Beta3 Gaba(a) Receptors', Eur J Neurosci, 9 (1997), 2225-35.
51 A. Saras, G. Gisselmann, A. K. Vogt-Eisele, K. S. Erlkamp, O. Kletke, H.
Pusch, and H. Hatt, 'Histamine Action on Vertebrate Gabaa Receptors: Direct Channel Gating and Potentiation of Gaba Responses', J Biol Chem, 283 (2008), 10470-5.
52 M. T. Bianchi, A. G. Clark, and J. L. Fisher, 'The Wake-Promoting Transmitter Histamine Preferentially Enhances Alpha-4 Subunit-Containing Gabaa Receptors', Neuropharmacology, 61 (2011), 747-52.
53 J. W. Blunt, B. R. Copp, R. A. Keyzers, M. H. Munro, and M. R. Prinsep, 'Marine Natural Products', Nat Prod Rep, 29 (2012), 144-222.
54 K. P. Mishra, L. Ganju, M. Sairam, P. K. Banerjee, and R. C. Sawhney, 'A Review of High Throughput Technology for the Screening of Natural Products', Biomed Pharmacother, 62 (2008), 94-8.
55 A. L. Harvey, and I. A. Cree, 'High-Throughput Screening of Natural Products for Cancer Therapy', Planta Med, 76 (2010), 1080-6.