Studien i sin helhet visade att mastermix med inkluderat Ampli Taq DNA polymerase gav en bättre bildkvalitet med tydligare band, minskad förekomsten av ospecifika band och därmed tillförlitligare resultat. Nackdelen med den mastermix (utan polymeraset tillsatt) som man idag använder på laboratoriet för transplantationsimmunologi är att resultatet är svårtolkade på grund av ospecifika inbindningar. Därmed vill jag rekommendera att mastermix med Taq-polymeras inkluderat används vid HLA-typningen.
21 Tackord
Ett stort tack till min handledare Bodil Hernroth från Högskolan Kristianstad och min labbhandledare Barbro Sanfridsson från Klinik Transplantations immunologi i Lund för all hjälp, råd och stöd under studiens tid. Jag vill även tack Eva-Marie Karlsson enhet chef i Klinisk Transplantations immunologi i Lund och tack till alla personal för stöd.
Referenser
Andersen, J. C., & Mills, N. J. (2012). DNA Extraction from Museum Specimens of Parasitic Hymenoptera. PLoS One, 7(10): e45549.
Abmgood. (2012). Polymerase Chain Reaction. www.abmgood.com [2016-02-02].
Bengtsson, K., Nilsson, S., & Robinson, N. D. (2014). Conducting Polymer Electrodes for Gel Electrophoresis. PLoS One, 9(2): e89416.
Brown, T. E. (1995). Gene Cloning. 3 ed. Great Britain: Oxford.
Bućin, D. (1994). Blood Transfusion and HLA Renal Transplantation. 1 ed. Sweden:
Granhns Boktryckeri Lund.
Cao, H., Wu, J., Wang,Y., Jiang, H., Zhang, T., Liu, X., Xu, Y., Liang, D., Gao, P., Sun, Y., Gifford, B., Ascenzo, M., Liu, X., Tellier, L.C.A.M., Yang, f., Tong, X., Chen, D., Zheng, J., Li, W., Richmond, T., Xu, X., Jun, W., & Li, Y. (2013). An IIntegrated Tool to Stud MHC Region: Accurate SNV Detection and HLA Genes Typing in Human MHC Region Using Targeted High-Throughput Sequencing. PloS One, 8(7): e69388.
Chakrabarti, R., & Schutt, C. E. (2001). The enhancement of PCR amplification by low molecular weight amides. Nucleic Acids Res, 29(11): 2377-2381.
Chen, H, Rangasamy, M., Tan, S. Y., Wang, H., & Siegfried, B. (2010). Evaluation of Five Methods for Total DNA Extraction from Western Corn Rootworm Beetles. PloS One, 5(8): e11963.
22
Edamura, M., Murakami, G., Meng, H., Itakura, M., Shigemoto, R., Fukuda, A., &
Nakahara, D. (2014). Functional Deficiency of MHC Class Ӏ Enhances LTP and Abolishes LTD in the Nucleus Accumbens of Mice. PLoS One, 9(9): e107099.
Eisenstein, B.I. (1990). The Polymerase Chain Reaction A new Method of Using Molecular Genetics for Diagnosis. New England Journal of Medicine, 322.3: 178-183 Johnsson, C., & Tufveson, G. (2002). Transplantation. 1 ed. Lund: Narayana Press, Denmark.
Kissner, T. L., Ruthel, G., Alam, S., Ulrich, R. G., Fernandez, S., & Saikh, K. U. (2011).
Activation of MyD88 Signaling upon Staphylococcal Enterotoxin Binding to MHC Class ll Molecules. PLoS One, 6(1): e15985.
Mayor, N.P., Rohinson, J., Whinnie, A. J.M.MC., Ranade, S., Eng, K., Midwinter, w., Bultitude, W.P., Chin, C., S., Bowman, B., Marks, P., Braund, H., Madrigal, J. A., Latham, K., & Marsh, S. G. E. (2015). HLA Typing for the Next Generation. PloS One, 10(5): e0127153.
Mckinney, D.M., Fu, Z., Le, L., A, J., Greenbaum, J. A., Peters, B., & Sette, A. (2015) Development and validation of a sample spring strategy for HLA typing utilizing next generation sequencing. Human immunology 917-922.
Olerup, O., & Zetterquist, H. (1992). HLA- DR typing by PCR amplification with sequence- specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation.
Tissue Antigens 93: 225-235.
Ovsyannikova, I. G., Vierkant, R. A., Pankratz, V. S., Jacobson, R. M., & Poland, G. A.
(2010). Extended LTA, TNF, LST1 and HLA Gene Hapltypes and Thier Association with Rubella Vaccine Induced Immunity. PLoS One, 5(7): e11806.
Paunić, V., Gragert, L., Madbouly, A., Freeman, J., & Maiers, M. (2012). Measuring Ambiguity in HLA Typing Methods. PloS One, 7(8): e43585
Qiagen. (1984). EZ1 Advanced XL DNA. www.qiagen.com [2015-11-28]
Strachan, T., & Read, A. (2011). Human Molecular Genetics. 4 ed. New York: USA.
23
Warren, E. H., Zhang, X. C., Li, S., Fan, W., Storer, B. E., Chien, J. W., Boeckh, M. J., Zhao, L. P., Martin, P. J., & Hansen, J. A. (2012). Effect of MHC and non-MHC donor/
recipient genetic disparity on the outcome of allogenic HCT. Blood, 120 (14), 2796-2806.
Williams, C. A., & Chase, M. W. (1968). Methods in Immunology and Immunochemistry. 1 ed. New York: USA.
Zhong, J., Xu, J. F., Yang, P., Liang, Y., & Wang, C. Y. (2011). Innate Immunity in the Recognition of β- Cell Antigens in Type 1 Diabetes. Medicine Endocrinology and Metabolism, 10.5772/22264.
Zrimec, J., Kopinc, R., Rijavec, T., Zrimec, T., & Lapanje, A. (2013). Band Smearing of PCR amplified bacterial 16S rRNA genes: Dependence on initial PCR target diversity.
Journal of microbiological methods 95(2): 186-194.
24 Populärvetenskaplig sammanfattning
Idag är det möjligt att transplantera organ, vävnad, blod och benmärg från en person till annan. Inför en transplantation genomförs immunologisk undersökning, såsom HLA-typning. HLA-typning bestämmer antigen inom HLA-systemet (Johnsson & Tufveson, 2002). Major Histocompatibility Complex (MHC) regionen kodar för HLA som är de mest omformbara generna i det mänskliga genomet och ger cellerna en individuell markör. MHC består av många gener som kodar för proteinprodukter som är betydelsefulla för att aktivera det förvärvade immunförsvaret som angriper virus, bakterie, parasiter och cancerceller (Cao et al. 2013).
Det är viktigt att man har en tillfredsställande likhet mellan. HLA markörerna då man transplanterar annars kan transplantatet upplevas som främmande för immunsystemet som attackerar och stöter bort organet.
HLA-typning görs genom att mångfaldiga (amplifiera) det DNA man är intresserad av.
Det kan man göra med en molekylärbiologisk metod som kallas Polymerase Chain Reaction (PCR). Därmed kan man få så mycket DNA att det kan detekteras på agarosgel.
Man tar en bild på gelen och bestämmer vilka HLA-varianter som finns i patientens genom. För att DNA skall kunna amplifieras behövs de byggstenar (nukleotider) som DNA är uppbyggt av och för att starta PCR-processen används ett enzym som heter polymeras. Detta blandas i en buffert (mastermix).
Syftet med studien var att vid HLA-typning jämföra ospecifika inbindningar då PCR-analysen gjordes med mastermix där Ampli Taq DNA polymeras tillsattes före PCR-analysen med mastermix där Ampli Taq DNA polymeras redan fanns inkluderat då det köptes. 16 patientprov testades med båda mastermix-lösningarna, och analysen genomfördes på olika HLA-typer (HLA-A, HLA-B och HLA-DRP1).
Resultatet visade att mastermix med inkluderat polymeras bör tillämpas, för att det gav säkrare resultat än mastermix med tillsatt polymeras. Mastermix med inkluderat Taq-polymeras gav tydligare specifikt band, bättre bildkvalitet samt gav svagare och mindre frekventa ospecifika inbindningar.
25 Referenser
Cao, H., Wu, J., Wang,Y., Jiang, H., Zhang, T., Liu, X., Xu, Y., Liang, D., Gao, P., Sun, Y., Gifford, B., Ascenzo, M., Liu, X., Tellier, L.C.A.M., Yang, f., Tong, X., Chen, D., Zheng, J., Li, W., Richmond, T., Xu, X., Jun, W., & Li, Y. (2013). An IIntegrated Tool to Stud MHC Region: Accurate SNV Detection and HLA Genes Typing in Human MHC Region Using Targeted High-Throughput Sequencing. PloS One, 8(7): e69388.
Johnsson, C., & Tufveson, G. (2002). Transplantation. 1 ed. Lund: Denmark.
26 Bilaga 1
Tabell 5: Bandintensitet för ospecifik inbindning som bildats vid användning av mastermix med tillsatt och mastermix med inkluderat Ampli Taq DNA polymerase.
Tabell 6: Bandintensiteten för specifika inbindningar vid användning av mastermix med tillsatt Taq polymeras och mastermix med denna inkluderad.
Nr LID
27
2015-3196 AB 2015-3196 AB-IN
Bild 1: Resultat från gelelektrofores, där banden (DNA) som vandrat längs gelen. I brun A-27 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning av mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderat polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn B-1; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
2015-3197 AB 2015-3197 AB-IN
Bild 2: I brunn A-27 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn B-4; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
16 3382 B 63 14 20
28
2015-3198 AB 2015-3198 AB-IN
Bild 3: I brunn A-27 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn B-24; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
2015-3172 AB 2015-3172 AB-IN
Bild 4: I brunn A-27 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn B-49; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
29
2015-3175 AB 2015-3175 AB-IN
Bild 5: I brunn B-52 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn B-52 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn B-23; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras
2015-3320 AB 2015-3320 AB-IN
Bild 6: I brunn A-27 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn A-2; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
30
2015-3352 AB 2015-3352 AB-IN
Bild 7: I brunn A-22 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-22 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn A-11; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
2015-3261 AB 2015-3261 AB-IN
Bild 8: I brunn A-27, 29 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare och i brunn A-29 saknas banden. Specifika band förekom i brunn A-2; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
31
2015-3368 AB 2015-3368 AB-IN
Bild 9: I brunn A-25 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras saknas banden. Specifika band förekom i brunn A-27: svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
2015-3271 AB 2015-3271 AB-IN
Bild 10: I brunn A-27 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn B-63; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
32
2015-3271 AB 2015-3271 AB-IN
Bild 11: I brunn A-27 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras var banden svagare. Specifika band förekom i brunn A-2; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
2015-3390 AB 2015-3390 AB-IN
Bild 12: Specifika band förekom i brunn A-27; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
33
2015-3393 AB 2015-3393 AB-IN
Bild 13: I brunn A-27,visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-27 i mastermix med inkluderad polymeras saknas banden. Specifika band förekom i brunn A-4; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
2015-3303 AB 2015-3303 AB-IN
Bild 14: I brunn A-23 visas ospecifik inbindning tydligt vid användning avi mastermix med tillsatt Taq, medan i brunn A-23 i mastermix med inkluderad polymeras saknas banden. Specifika band förekom i brunn B-12; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
34
2015-3330 AB 2015-3330 AB-IN
Bild 15: Specifika band förekom i brunn B-63; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
2015-3382 AB 2015-3382 AB-IN
Bild 16: Specifika band förekom i brunn A-63; svagare i mastermix med tillsatt än i mastermix med inkluderat polymeras.
35