Medipan ICA screen och RSR 2screen har likvärdig förmåga att detektera ICA, GADA och IA-2A i pratientprov, oberoende av patienternas ålder eller kön. Dessutom har båda metoderna samma sensitivitet och specificitet samt hög reproducerbarhet. Slutsatsen är
24
sådeles RSR 2screen kan användas istället för Medipan ICA screen, då metoden är billigare och analystiden lite kortare.
Tackord
Ett stort tack till Dr. Carina Törn för hennes handledning på Wallenberglaboratoriet och hjälp med statistikanalys. Stort tack till Kobra Rahmati för all hjälp på TEDDY- laboratoriet i Malmö. Speciellt tack till Dr. Fariba Vaziri-Sani för all hjälp jag har fått under min studiegång på HKR och för professionell handledning och snabb feedback.
Tack också till min familj som har stöttat mig på olika sätt. Slutligen skulle jag aldrig glömma tacka mina underbara lärare på HKR som har lyssnat och diskuterat med mig detta arbete.
25
Referenser
Anderssson, C., Kolmodin, M., Ivarsson, S-A., Carlsson, A., Forsander, G., Lindblad, B., Ludvigsson, J., Kockum, I., Marcus, C., Samuelessn, U., Örtqvist, E., Lernmark, Å., Elding-Larsson, H., Törn, C. Better Diabetes Diagnosis Study Group. (2014). Islet antibodies (ICA) identify autoimmunity in children with new onset diabetes mellitus negative for other islet cell antibodies. Pediatr Diabetes 15:336-344.
Baekkeskov, S., Aanstoot, H.J., Christgau, S., Reetz, A., Solimena, M., Cascalho, M., Folli, F., Richter-Olesen, H. & De Camilli, P. (1990). Identification of the 64K autoantigen in insulin-dependent diabetes as the GABA-synthesizing enzyme glutamic acid decarboxylase. Nature 347:151-156.
Berggren, P.O. & Hellerström, C. (2007). Reglering av insulin sekretion: Diabetes.
Stockholm: Liber AB.
Bottazzo, G.F., Florin-Christensen, A. & Doniach, D. (1974). Islet cell antibodies in diabetes mellitus with autoimmune polyendocrine deficiencies. Lancet 2:1279-1283.
Elfving, M., Lindberg, B., Lynch, K., Månsson, M., Sundkvist, G., Lernmark, Å. &
Ivarsson, S. A. (2008). Number of islet autoantibodies present in newly diagnosed type 1 diabetes children born to non‐diabetic mothers is affected by islet autoantibodies present at birth. Pediatric Diabetes 9:127-134.
Gianani, R., Rabin, D.U., Verge, C.F., Yu, L., Babu, S.R, Pietropaolo, M. & Eisenbarth, G.S. (1995). ICA512 autoantibody radioassay. Diabetes 44:1340-1344.
Hawa, M.I., Fava, D., Medici, F., Deng, Y-J., Notkins, A.L., De Mattia, G., & Leslie, R.D.G. (2000). Antibodies to IA-2 and GAD65 in type 1 and type 2 diabetes: isotype restriction and polyclonality. Diabetes Care 23:228-233.
26
Josephy, P.D., Eling, T. & Mason, R.P. (1982). The horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of 3, 5, 3', 5'-tetramethylbenzidine. Free radical and charge-transfer complex intermediates. Journal of Biological Chemistry 257:3669-3675.
Kin, T., Murdoch, T.B., Shapiro, A.M. & Lakey, J.R. (2006). Estimation of pancreas weight from donor variables. Cell Transplantation 15:181-185.
Kolmodin, M. (2009). Metodjämförelse mellan indirekt immunofluorescens och enzyme-linked immunosorbent assay för mättning av öcellsantikroppar. Examensarbete, Malmö Högskolan, Malmö.
Lan, M.S., Lu, J., Goto, Y. & Notkins, A.L. (1994). Molecular cloning and identification of a receptor-type protein tyrosine phosphatase, IA-2, from human insulinoma. DNA Cell Biol 13:505-514.
Landin-Olsson, M., Sundkvist, G. & Lernmark, Å. (1987). Prolonged incubation in the two-color immunofluorescence test increases the prevalence and titres of islet cell antibodies in Type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus. Diabetologia 30:327-332.
Lernmark, Å. & Sundkvist. G. (2007). Orsaker till typ 1-diabetes: Diabetes Stockholm:
Liber AB.
Lewis, J.S., Dolgova, N.V., Zhang, Y., Xia, C.Q., Wasserfall, C.H., Atkinson, M.A., Clare-Salzler, L.J. & Keselowsky, B.G. (2015). A combination dual-sized microparticle system modulates dendritic cells and prevents type 1 diabetes in prediabetic NOD mice. Clinical Immunology 160:90-102.
Lönnroth, P. & Smith, U. (2007). Insulineffekter: Diabetes Stockholm: Liber AB
27
Madsen, O.D., Landin-Olsson, M., Bille, G., Sundkvist, G., Lernmark, Å., Dahlqvist, G.
& Ludvigsson, J. (1986). A two-color immunofluorescence test with a monoclonal human proinsulin antibody improves the assay for islet cell antibodies. Diabetologia 29:115-118.
Månsson, L., Törn, C. & Landin-Olsson, M. (2001). Islet cell antibodies represent autoimmune response against several antigens. International Journal of Experimental Diabetes Research 2:85-90.
Nicholas, D., Odumosu, O. & Langridge, W.H. (2011). Autoantigen based vaccines for type 1 diabetes. Discovery Medicine 11:293-301.
Nilson, E., Ekholm, B., Smith, B.R., Törn, C. & Hillman, M. (2008). Calcium addition to EDTA plasma eliminates falsely positive results in the RSR GADAb ELISA. Clinica Chimica Acta 388:130-134.
Palmer, J.P., Asplin, C.M., Asplin, C.M., Clemons, P., Lyen, K., Tatpati, O., Raghu, P.K.
& Paquette, T.L. (1983). Insulin antibodies in insulin-dependent diabetics before insulin treatment. Science 222:1337-1339.
Paschke, A., Grzelka, A., Zawada, A. & Zozulińska-Ziółkiewicz, D. (2013). Clinical characteristics and autoantibody pattern in newly diagnosed adult-onset autoimmune diabetes. Pol Arch Med Wewn 123:401-408.
Persson, A., Becker, C., Hansson, I., Nilsson, A. & Törn, C. (2010). Comparison of measurements of autoantibodies to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2 in whole blood eluates from dried blood spots using the RSR-enzyme linked immunosorbent assay kits and in-house radioimmunoassays. Experimental Diabetes Research 2010:1-6.
doi:10.1155/2010/173652.
28
Prázný, M., Škrha, J., Límanová, Z., Vaníčková, Z., Hilgertová, J., Prázná, J., Jarešová, M. & Stříž, I. (2005). Screening for associated autoimmunity in type 1 diabetes mellitus with respect to diabetes control. Physiological Research 54:41-48.
Rahmati, K., Lernmark, A., Becker, C., Foltyn-Zadura, A., Larsson, K., Ivarsson, S.A. &
Törn, C. (2007). A comparison of serum and EDTA plasma in the measurement of glutamic acid decarboxylase autoantibodies (GADA) and autoantibodies to islet antigen-2 (IA-antigen-2A) using the RSR radioimmunoassay (RIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kits. Clinical Llaboratory 54:227-235.
Schlosser, M., Mueller, P.W., Törn, C., Bonifacio, E. & Bingley, P.J. (2010). Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies. Diabetologia 53:2611-2620.
Steck, A.K., Vehik, K., Bonifacio, E., Lernmark, A., Ziegler, A.G., Hagopian, W.A., She, J., Simell, O., Akolkar, B., Krischer, J., Schatz, D., Rewers, M.J., TEDDY Study Group.
(2015). Predictors of Progression From the Appearance of Islet Autoantibodies to Early Childhood Diabetes: The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY). Diabetes Care 38:808-813.
Suckale, J. & Solimena, M. (2010). The insulin secretory granule as a signaling hub. Trends in Endocrinology & Metabolism 21:599-609.
TEDDY Study Group. (2007). The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) study: study design. Pediatric Diabetes 8:286-298.
Titus, T., Badet, L. & Gray, D.W.R. (2000). Location of human b cells in the islet of the pancreas. www.journals.cambridge.org [2015-12-08].
Törn, C., Landin-Olsson, M., Ostman, J., Scherstén, B., Arnqvist, H., Blohmé, G., Björk, E., Bolinder, J., Eriksson, J., Littorin, B., Nyström, L., Sundkvist, G. & Lernmark, Å.
29
(2000). Glutamic acid decarboxylase antibodies (GADA) is the most important factor for prediction of insulin therapy within 3 years in young adult diabetic patients not classified as Type 1 diabetes on clinical grounds. Diabetes/Metabolism Research and Rreviews 16:442-447.
Törn, C., Mueller, P.W., Schlosser, M., Bonifacio, E. & Bingley, P.J. (2008). Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for autoantibodies to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2. Diabetologia 51:846-852.
Vaziri-Sani, F., Oak, S., Radtke, J., Lernmark, A., Lynch, K., Agardh, C.D., Cilio, C.M., Lethagen, A.L., Ortqvist, E., Landin-Olsson, M., Törn, C. & Hampe, C.S. (2010). ZnT8 autoantibody titers in type 1 diabetes patients decline rapidly after clinical onset. Autoimmunity 43:598-606.
Wenzlau, J.M., Juhl, K., Yu, L., Moua, O., Sarkar, S.A., Gottlieb, P., Rewers, M., Eisenbarth, G.S., Jensen, J., Davidson, H.W. & Hutton, J.C. (2007). The cation efflux transporter ZnT8 (Slc30A8) is a major autoantigen in human type 1 diabetes. Proceedings of the Natural Academy of Sciences of the United States of America 104:17040-17045.
Winter, W.E. & Pittman, D. (2014). The Evaluation of Diabetes Mellitus, Immunology.
www.advanceweb.com 23:18.
30
Populärvetenskaplig sammanfattning
Jämförelse mellan två metoder för bestämning av antikroppar i humant blod riktade mot celler i bukspottkörteln
Typ 1-diabetes (T1D) är en autoimmun sjukdom som orsakas av samspel mellan genetiska- och omgivande faktorer som t.ex. virusinfektioner såsom påssjuka och röda hund. Inflammation i bukspottkörteln kan ge upphov till bildning och frisättning av antikroppar som riktar sig specifikt mot det inflammerade området, i cellöar i bukspottkörteln. Cellöarna delas in i fyra celltyper: beta-celler som producerar insulin, alfa-celler som producerar glukagon, delta-celler som producerar hormonet somatostatin och PP-celler som producerar pankreaspolypeptid. De här cellerna deltar tillsammans i blodglukosregleringssystemt. ICA (islet cell antibodies) är antikroppar riktade mot de här ö-cellerna. Ö-cellerna attackeras av ICA och förstörs gradvis, speciellt betacellerna som producerar insulin. Insulinbrist förhindrar glukosupptaget och ger upphov till höga glukoshalter i blodet. Man har upptäckt ICA som är riktade mot ö-celler och andra autoantikroppar riktade mot betacellsantigener: insulin autoantikroppar (IAA), Glutaminsyradekarboxylas autoantikroppar (GADA), insulinoma antigen-2 autoantikroppar (IA-2A) och zink transportören 8 autoantikroppar (ZnT8A). Bestämning av ICA i blodprover är viktigt för klassificering av diabetes, förutsägelse av T1D och för utveckling av behandlingsmetoder.
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) är en bland olika metoder som mäter ICA i blodserum. I denna studie undersöktes två tillgängliga kommersiella ELISA-metoder:
Medipan ICA screen, som används i rutinanalys på TEDDY-laboratoriet i Malmö, och RSR 2screen som är en ny ELISA-metod. I den här studien jämfördes RSR 2screen-ELISA med Medipan ICA screen-2screen-ELISA för att undersöka om båda metoderna fungerade lika bra eller inte. För att undersöka metodernas noggrannhet användes både blodprover från patienter med T1D och friska individer. Varje metods förmåga att skilja mellan patienterna (som bör ge positiva svar) och friska (som bör ge negativa svar) undersöktes.
Resultaten visade att båda metoderna var lika bra. Däremot är analyskostnaden per prov för RSR 2screen något lägre än för Medipan ICA screen. Därför är det en möjlighet att ersätta Medipan ICA screen med RSR 2screen.
31
Bilagor
Bilaga 1: Bruksanvisning till Medizym® ICA screen.
Medizym® ICA screen
0.5 ml SA-POD concentrate (D) + 9.5 ml SA-POD-spädningslösning (G).
Hållbar 4 månader i kyl.
C-autoantigen-biotin
En flaska frystorkat IC-autoantigen-Biotin (H) löses upp med 5.5 ml IC-autoantigen-Biotin-spädningslösning (J).
Hållbar ett dygn – blanda direkt innan användning.
Utförande
6. Täck med plastfilm, skaka, inkubera över natt i kyl.
7. Rumstemperera plattan på skak minst 30 minuter.
8. Dekantera, tvätta 3 ggr med 300 µl tvättlösning.
9. 100 µl IC-autoantigen-biotin alla brunnar 10. Täck med plastfilm, inkubera 1 h på skak i RT.
11. Dekantera, tvätta 3 ggr med 300 µl wash solution.
12. 100 µl streptavidin-peroxidase (SA-POD) alla brunnar 13. Täck med plastfilm, inkubera 20 min på skak i RT.
14. Dekantera, tvätta 3 ggr med 300 µl wash solution.
15. 100 µl substrat (E) alla brunnar 16. Skaka, inkubera 20 min i mörker i RT.
17. 100 µl stopplösning alla brunnar
18. Skaka, avläs absorbans vid 450 nm med referens på 630 nm
32
Bilaga 2: Bruksanvisning till ELISA RSRTM 2Screen ICATM ELISA RSRTM 2Screen ICATM Förberedelser
Tvättlösning (spädes 1:10)
100 ml concentrated wash solution + 900 ml dH2O Hållbar till kits slutdatum, förvaras i kyl
Streptavidin peroxidase SA-POD (spädes 1:20)
0.6 ml Streptavidin-peroxidase (SA-POD) + 11.4 ml dilluent för diluting SA-POD Hållbar 18 veckor i kyl
GAD65/IA-2-Biotin (kolla på flaskan, mängden kan variera)
En flaska GAD/IA-2 Biotin löses upp med 5.5 ml Buffer (blå), mer än en flaska poolas ihop
6. 25 µl Reaction Enhancer alla brunnar förutom blank (A1 och B1) 7. Täck med plastfilm, skaka 5 sek, inkubera övernatten i kyl 16-20 h 8. Dekantera, tvätt 3 ggr med 300 µl tvättlösning
9. 100 µl GAD65/IA-2-Biotin alla brunnar förutom blank (A1 och B1) 10. Täck med plastfilm, inkubera 1 h på skak
11. Dekantera, tvätt 3 ggr med 300 µl tvättlösning
12. 100 µl streptavidin peroxidase SA-POD alla brunnar förutom blank 13. Inkubera 20 min på skak
14. Dekantera, tvätt 3 ggr med 300 µl tvättlösning 15. 100 µl peroxidase substrate (TMB) alla brunnar 16. Inkubera 20 min i mörkret i RT
17. 100 µl Stop Solution alla brunnar
18. skaka max 5 sek, avläsa inom max 10 min vid 450 nm
33
Bilaga 3: Histogram till Islet cell autoantibodies (ICA) fördelning mellan prover.
Figur 1. Histogrammet ovan visar att Islet cell autoantibodies (ICA) inte är normalfördelade mellan prover (n=299).
34
Bilaga 4:Jämförelse mellan män och kvinnor avseende bindningsindex (BI).
Tabell 1. Mann-Whitney U-test nedan jämfördes på män och kvinnor (n=299) avseende bindningsindex (BI) och gav inga signifikanta skillnader.
Bilaga 5:Sambandet mellan ålder och bindningsindex (BI) med Medipan ICA screen och RSR 2screen.
Figur 2. Figuren ovan visar sambandet mellan ålder (X-axel) och bindningsindex (Y-axel) analyserade med Medipan ICA screen.
y = 0,197x + 15,183 R² = 0,0159
0 5 10 15 20 25 30 35
0 10 20 30 40 50
BI (Medipan)
35
Tabell 2. Spearman test nedan visar korrelationen mellan ålder och BI analyserades på patienter (n=100) med Medipan ICA screen.
Figur 3. Figuren ovan visar sambandet mellan ålder (X-axel) och bindningsindex (Y-axel) analyserade med RSR 2screen.
Tabell 3. Spearman test nedan visar korrelationen mellan ålder och BI analyserade på patienter (n=100) med RSR 2screen.