Miljöföroreningar och deras möjliga effekter i naturen, människor och djur är ett påtagligt bekymmer i dagens samhälle. Miljöföroreningar kan spridas med vinden eller vattenströmmar och hamna långt ifrån utsläppsplatsen. Ett exempel på det är att man finner höga halter av miljöföroreningar på Nord-polen. Vissa miljöföroreningar har hormonstörande egenskaper, vilket inne-bär att de kan störa kroppens naturliga hormonsignalering. Organsystem som misstänks vara särskilt känsliga är fortplantningsorganen som i hög utsträck-ning är beroende av normal könshormonsignalering för att fortplantutsträck-ningen ska fungera.
Gråsälspopulationen i Östersjön sjönk kraftigt under första hälften av 1900-talet till följd av jakt och sedan ytterligare under 1960- och 1970-talen. I den första rapporten av sitt slag i Sverige och världen rapporterade Sören Jensen 1966 att polyklorerade bifenyler (PCB) förkom i miljön. Därefter fann man att miljöföroreningar som PCB och diklorodifenyltrikloroetan (DDT) var vitt spridda runt om i världen, och att Östersjön var mycket för-orenad. Obduktioner av döda Östersjögråsälar visade njurskador, sår i tar-marna, benskörhet, samt sammanväxningar, förträngningar och muskelknu-tor (myom) i livmodern. Myom är vanligt förekommande även bland kvin-nor och är i de flesta fallen inte till besvär. En förhållandevis stor andel kvinnor som har myom får ändå problem med oregelbundna menstruationer, tryckkänslor i underlivet, smärtor och svårigheter att bli gravida. Man vet inte säkert varför myom uppstår hos vare sig kvinnor eller Östersjögråsälar. Eftersom det dels finns tecken på att myomförekomsten hos Östersjögråsä-larna har sjunkit i takt med att PCB- och DDT-föroreningen av Östersjön minskat, och dels inte finns några rapporter om att andra gråsälspopulationer drabbats av myom i så stor utsträckning som Östersjögråsälarna, verkar det vara något specifikt i Östersjömiljön som orsakade myomen hos gråsälsho-norna. Föroreningar som PCB och DDT misstänks därför vara bovar i dra-mat.
I det första delarbetet i avhandlingen undersöktes effekterna av könshor-moner och några olika PCB:er på odlade muskelceller från gråsälslivmoder. De testade PCB:erna har påvisats i späcket på Östersjögråsälar, vilket tyder på att dessa PCB:er förekommer i Östersjömiljön. Det visade sig att gul-kroppshormon (progesteron) hämmade muskelcelldelning medan en av
PCB:erna, PCB 101 orsakade ökad celldelning jämfört med obehandlade celler, vilket skulle kunna vara ett möjligt steg till begynnande myomutveck-ling.
I det andra delarbetet upprepades i princip försöket i det första delarbetet, men med odlade livmodermuskelceller från kvinnor. Det visade sig att liv-modermuskelceller från gravida kvinnor svarade med minskad celldelning på behandling med några PCB:er; 3'-MeSO2-CB 101, 4'-MeSO2-CB 101 och 4-OH-CB 107, medan celldelningen hos livmodermuskelceller från icke-gravida kvinnor inte påverkades av PCB. Däremot minskades celldelningen hos livmodermuskelceller från både gravida och icke-gravida kvinnor efter att de utsatts för hormonerna östrogen, en kombination av östrogen och pro-gesteron, samt efter behandling med det konstgjorda östrogenet etinylöstra-diol och det konstgjorda gulkroppshormonet levonorgestrel. I kombination med cellodlingsförsöksresultaten från det första delarbetet antyder studien att PCB:er skulle kunna påverka celldelningen hos livmodermuskelceller i både människor och gråsälar åtminstone i odlade celler. Däremot är det inte troligt att minskad celldelning kan vara ett möjligt steg till begynnande myomut-veckling. Det verkar dock som om livmodermuskelceller från gravida kvin-nor reagerar ankvin-norlunda på PCB-behandling än livmodermuskelceller från icke-gravida kvinnor. Så vitt vi vet är dessa två studier de första som tyder på att PCB:er kan påverka livmodermuskelcelldelning både i gråsälar och i människor.
Sedan tidigt 1970-tal har gråsälar obducerats vid Naturhistoriska riksmu-seet i Stockholm. Med hjälp av journalanteckningar och databasuppgifter undersöktes i det tredje delarbetet hur stor andel av de 257 könsmogna grå-sälshonorna som obducerades 1973-2007 som hade livmodermyom. Det visade sig att endast gråsälshonor som var 22 år eller äldre hade myom, och förekomsten i denna åldersgrupp var 65 %. Av alla könsmogna (över 4 år gamla) gråsälshonor var det 15 % som hade myom. I en mindre grupp grå-sälshonor som var 22 år eller äldre undersöktes även förekomsten av gul-kroppar i äggstockarna. Gulgul-kroppar bildas i äggstockarna efter ägglossning, och kvarstår även in i graviditet och bildar framför allt gulkroppshormon men också östrogen. Hos gråsälar pågår graviditeten nästan ett helt år, 350 dagar, så gulkroppen kvarstår normalt sett under nästan hela året. Gul-kroppshormon och östrogen behövs för myomtillväxt hos kvinnor. Av elva gråsälar med livmodermyom var det sju stycken som inte hade en gulkropp som förväntat. Hos fem av dessa sju fann vi trots avsaknaden av gulkropp, och därmed troligtvis även gulkroppshormon, tillväxt i myomen, vilket tyder på att det skulle kunna finnas en kroppsfrämmande faktor som stimulerade till myomtillväxt. Bland åtta gråsälshonor som saknade livmodermyom sak-nades uppgift om gulkroppsförekomst hos två individer. Bland övriga sex var det bara två stycken som saknade gulkropp. Det faktum att fler sälar med myom än sälar utan myom saknade gulkropp tyder på att vissa gråsälar med myom inte har ägglossning. Inga skillnader i halten av vare sig PCB eller
DDT i späck kunde påvisas mellan de elva gråsälshonorna som hade myom och de åtta gråsälshonorna utan livmodermyom, men det skulle kunna bero på att det var för få individer i de båda grupperna, eller på att mätningar av föroreningshalter i späck möjligen inte är lämpliga att studera på grund av att de kanske inte på ett rättvisande sätt speglar den sammanlagda förorening som individen varit utsatt för under sin livstid. Med hjälp av Naturhistoriska riksmuseets årliga provtagningar av halterna av PCB- och DDT-föroreningar i bottensediment och sillgrissleägg i Östersjömiljön skapade vi därför en statistisk modell för att uppskatta den sammanlagda förorening som en Ös-tersjögråsälshona kan ha utsatts för under sin livstid. Eftersom halterna av föroreningarna i Östersjön minskat under årens lopp tog vi även hänsyn till detta i den statistiska modellen, och det visade sig att ju högre halt av PCB en gråsälshona varit utsatt för, desto högre var risken för att myom skulle bildas i hennes livmoder. Ju äldre honan var, desto större var också risken för myombildning, vilket kanske faller sig naturligt eftersom en högre ålder innebär att man utsatts för miljöföroreningarna under en längre tid. Samban-det mellan höga halter av DDT och risken för myombildning var inte lika starkt som för PCB, vilket tyder på att det framförallt kan vara PCB som bidragit till att gråsälshonorna fick livmodermyom i stor utsträckning.
Det finns en utbredd strävan i forskarsamhället om att minska antalet djurförsök. För att reducera antalet djurförsök satsar man på att utveckla och förfina alternativa metoder som till exempel cellodlingsmodeller för att kun-na testa till exempel hormonstörande kemikalier utan att behöva använda så många försöksdjur. PCB och DDT är tyvärr inte de enda miljöföroreningarna med hormonstörande egenskaper som spridits i miljön. Andra exempel är dioxin samt plastmjukgörare som ftalater och bisfenol A. I det fjärde delar-betet studerades o,p’-DDT (en variant av DDT), två olika PCB:er, en ftalat, bisfenol A samt dioxin, men även könshormoner, och deras effekter på cell-delning och celldöd hos de blodkärlsceller som klär insidan av blodkärlen från livmoderslemhinnan i människor. I kroppen är det bland annat dessa blodkärlsceller som är i kontakt med blodflödet i kärlen och därmed olika kemikalier och miljöföroreningar som kan finns i blodet. För att kunna stu-dera blodkärlscellerna har vi isolerat och odlat dem från livmoderslemhinne-prover tagna från kvinnor som fått sin livmoder bortopererad. Östrogen sti-mulerade celldelningen hos blodkärlscellerna, och det konstgjorda gul-kroppshormonet levonorgestrel samt alla testade miljöföroreningar hämmade celldelningen. Alla miljöföroreningar utom ftalaten och dioxin ökade dessut-om celldöden, möjligen gendessut-om att förstöra det yttre membran sdessut-om dessut-omsluter cellerna. Studien tyder på att celldelningen hos blodkärlsceller från livmo-derslemhinnan påverkas av både hormoner och hormonstörande miljöförore-ningar, vilket är ett första steg i utvärderingen för att bedöma om den här celltypen är lämplig att använda i en cellodlingsmodell för att testa hormon-störande ämnens effekter på fortplantningssystemet.
I det femte delarbetet användes återigen blodkärlsceller från livmoder-slemhinnan för att studera vilka förändringar i celldelning och genuttryck som orsakas av behandling med o,p’-DDT jämfört med obehandlade celler. Förutom att o,p’-DDT återigen minskade celldelningen i blodkärlscellerna visade det sig även att gener som är inblandade i celldelning påverkades av behandlingen, vilket stödjer resultaten från det fjärde delarbetet. Också gener som är inblandade i immunförsvaret, samt gener som är inblandade i omsätt-ning av fett och kolesterol påverkades. Fett och kolesterol bygger bland an-nat upp cellernas membran och är även grundstenar för hormonbildning. Den ökade celldöden efter o,p’-DDT-behandling som beskrevs i delarbete fyra skulle alltså kunna vara en effekt av en membranpåverkan, men det går inte att säkert fastslå utifrån den här studien. Däremot kan man tänka sig att stu-dien är av värde för ytterligare studier i syfte att ta reda på hur o,p’-DDT påverkar blodkärlscellerna, och vilka tecken på förändringar i biologiska processer och genuttryck som eventuellt skulle kunna användas i en cellod-lingsmodell för tester av hormonstörande ämnens effekter på fortplantnings-systemet.
Sammanfattningsvis tyder resultaten som presenterats i den här avhand-lingen på att hormonstörande miljöföroreningar som finns i vår omgivning kan påverka odlade celler från det kvinnliga fortplantningssystemet både hos människor och gråsälar. Det kan röra sig om effekter på celldelning, celldöd, och gener som har med immunförsvaret samt fett- och kolesterolomsättning att göra. I Östersjögråsälshonor verkade det dessutom som att de individer som varit utsatta för höga halter av PCB drabbades av livmodermyom i stör-re utsträckning än sälar som inte varit utsatta för så höga halter av PCB. Yt-terligare studier behövs dock för att mer specifikt klargöra på vilket sätt mil-jöföroreningar, både var för sig och i kombination med andra miljöförore-ningar, påverkar olika slags celler från fortplantningssystemet.
ACKNOWLEDGEMENTS
The presented studies were carried out at the Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University. Without the help and support from the people around me, I would not have been able to accomplish this work. I would like to thank the former and present heads of the Department,
Profes-sor Emeritus Torsten Tuvemo and ProfesProfes-sor Ove Axelsson, for allowing
me to use the facilities at the department. I would also like to express my sincere gratitude to:
My main supervisor and co-author, Associate Professor Matts Olovsson, Department of Women’s and Children’s Health, for introducing me to this field of research and having enough faith in me to accept me as his PhD student, for guiding me through ups and downs, and for always being posi-tive about my work.
My assisting supervisor and co-author, Britt-Marie Bäcklin, PhD, Swedish Museum of Natural History, Department of Contamination Research, for valuable assistance and advice, for providing grey seal tissue and for amus-ing anecdotes that brightened up many meetamus-ings.
My room mate, Laboratory technician Margareta Nordling, Department of Women’s and Children’s Health, for skilfully teaching me the sterile cell culture technique, helping me with practical laboratory matters, and for shar-ing lunches, breaks and countless laughter with me. This work is based on so much of what you taught me in the laboratory, but I still do not understand your way of calculating dilutions!
Laboratory technician Ulla “Bonita” Geifalk, Department of Women’s
and Children’s Health, for helping me with practical laboratory matters, and for sharing laughter, lunches and cups of water during breaks. I hope you will still remember to keep me informed about when you are going to get your hair cut in the future!
Administrator Vera Holmgren, Department of Women’s and Children’s
Health, for taking care of my research accounts and paying my invoices, but also for sharing my lunches and breaks. We have shared much laughter dur-ing the years, and even though there were days when we did not find
any-thing to talk about I always appreciated your company. Thank you also for the rhubarb and apples from your garden that you have kindly given me dur-ing the years.
My colleagues and friends at the research laboratory, Department of Women’s and Children’s Health, and especially Christian Moberg, MD,
Kristina Kask, MD, Peppi Nash, MD, PhD, Research Nurse Lena Moby, Malin Lundmark, M Sc, Associate Professor Anneli Stavréus-Evers and Research Assistant Roger Olsson (Department of Medical Sciences), for
friendship, support and much shared laughter. Special thanks go to Anneli, who kindly volunteered to read this thesis over a weekend in September and for helping me to improve it through her comments.
Laboratory technician Barbro Westerberg, Department of Women’s and
Children’s Health, for helping me to sort out all kinds of computer and printer problems. When I couldn’t fix the problem myself, you always could.
Administrators Karin Wennqvist and Inga Andersson, Department of
Women’s and Children’s Health, for help and support, especially when money was an issue. Inga, I wonder who will take my place as the first PhD student who will return the activity report every semester?
Patrik Öhagen, M Sc, Swedish Medical Products Agency, and Professor Inger Sundström-Poromaa, Department of Women’s and Children’s
Health, for helping me with the statistics. What would I have done without you?
Professor Eva Brittebo, Department of Pharmaceutical Biosciences, for
valuable advice and collaboration.
Research engineer Elsebrit Ljungström Köhl, Department of Cell and
Molecular Biology, Karolinska Institutet, for help with planning of the mi-croarray experiment and for running the wetlabs, as well as for helping me with the manuscript preparation and to find answers about everything from RNA isolation to microarray data analysis, even if the problem was not in your own line of expertise, and for welcoming me as a guest in your labora-tory. You are truly the image of a professional!
Annika Eriksson, PhD, Department of Cell and Molecular Biology,
Karo-linska Institutet, for excellent assistance with the planning of and running the real-time qRT-PCR experiment and help with the manuscript preparation.
Bioinformatician Hanna Göransson, Department of Medical Sciences, for
helping me to plan the microarray experiment and for assistance with the array data processing, array data analysis and manuscript preparation.
My co-authors Associate Professor Anders Bignert, Department of Con-taminant Research, Swedish Museum of Natural History, and Associate
Professor Lena Sahlin, Department of Woman and Child Health,
Karolin-ska Institutet, for your contributions, input and ideas on how to improve the manuscripts and for patiently answering all of my questions.
My colleagues and fellow PhD students at the Centre for Reproductive Biology in Uppsala, for valuable advice and discussions during courses, seminars, workshops and meetings.
Mrs. Maud Marsden and the late Mr. Nigel Rollison for reading my
manuscripts and helping me to improve them linguistically. Special thanks go to Maud, who read this thesis and for helping me to improve it through her comments.
Carl Gemzell’s Fund for Research and Development, Uppsala; Födelsefon-den; ReProTect; the European Chemical Industry Council; the Family Plan-ning Fund in Uppsala; the Swedish Animal Welfare Agency; the Swedish Environmental Protection Agency; and the Swedish Research Council for Environment, Agricultural Sciences and Spatial Planning (FORMAS); for financial support.
Daniel, my dear family and friends, last but not least, for always believing
in me and standing by me. I could not have done this without your love and support. I am looking forward to being able to spend more time with you all!
REFERENCES
1. Speroff L and Fritz M. Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility. 7th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2005.
2. Wetzstein R. [The myometrium: morphology]. Archiv fur Gynakologie 1965; 202: 1-13.
3. Mertens HJ, Heineman MJ, Theunissen PH, de Jong FH and Evers JL. Andro-gen, estrogen and progesterone receptor expression in the human uterus during the menstrual cycle. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Repro-ductive Biology 2001; 98(1): 58-65.
4. Englund K, Blanck A, Gustavsson I, Lundkvist U, Sjoblom P, Norgren A and Lindblom B. Sex steroid receptors in human myometrium and fibroids: changes during the menstrual cycle and gonadotropin-releasing hormone treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1998; 83(11): 4092-6.
5. Noe M, Kunz G, Herbertz M, Mall G and Leyendecker G. The cyclic pattern of the immunocytochemical expression of oestrogen and progesterone recep-tors in human myometrial and endometrial layers: characterization of the en-dometrial-subendometrial unit. Human Reproduction 1999; 14(1): 190-7. 6. Werth R and Grusdew W. Untersuchungen über die Entwicklung und
Mor-phologie der menschlichen Uterusmuskulatur. Arch. Gynäkol. 1898; 55: 325-409.
7. Graham JD and Clarke CL. Physiological action of progesterone in target tissues. Endocrine Reviews 1997; 18(4): 502-19.
8. de Vries K, Lyons EA, Ballard G, Levi CS and Lindsay DJ. Contractions of the inner third of the myometrium. American Journal of Obstetrics and Gyne-cology 1990; 162(3): 679-82.
9. Kunz G, Beil D, Deininger H, Wildt L and Leyendecker G. The dynamics of rapid sperm transport through the female genital tract: evidence from vaginal sonography of uterine peristalsis and hysterosalpingoscintigraphy. Human Re-production 1996; 11(3): 627-32.
10. Leiva MC, Hasty LA and Lyttle CR. Inflammatory changes of the endo-metrium in patients with minimal-to-moderate endometriosis. Fertility and Sterility 1994; 62(5): 967-72.
11. Loke YW and King A. Immunology of human implantation: an evolutionary perspective. Human Reproduction 1996; 11(2): 283-6.
12. Gipson IK, Ho SB, Spurr-Michaud SJ, Tisdale AS, Zhan Q, Torlakovic E, Pudney J, Anderson DJ, Toribara NW and Hill JA, 3rd. Mucin genes ex-pressed by human female reproductive tract epithelia. Biology of Reproduc-tion 1997; 56(4): 999-1011.
13. Noyes RW, Hertig AT and Rock J. Dating the endometrial biopsy. Fertility and Sterility 1950; 1: 3-25.
14. Bergeron C, Ferenczy A and Shyamala G. Distribution of estrogen receptors in various cell types of normal, hyperplastic, and neoplastic human endo-metrial tissues. Laboratory Investigation 1988; 58(3): 338-45.
15. Tabibzadeh S. Proliferative activity of lymphoid cells in human endometrium throughout the menstrual cycle. Journal of Clinical Endocrinology and Me-tabolism 1990; 70(2): 437-43.
16. Gurpide E, Gusberg SB and Tseng L. Estradiol binding and metabolism in human endometrial hyperplasia and adenocarcinoma. Journal of Steroid Bio-chemistry 1976; 7(11-12): 891-6.
17. Falany JL and Falany CN. Regulation of estrogen sulfotransferase in human endometrial adenocarcinoma cells by progesterone. Endocrinology 1996; 137(4): 1395-401.
18. Lockwood CJ and Schatz F. A biological model for the regulation of peri-implantational hemostasis and menstruation. Journal of the Society for Gyne-cologic Investigation 1996; 3(4): 159-65.
19. Krikun G and Lockwood CJ. Steroid hormones, endometrial gene regulation and the Sp1 family of proteins. Journal of the Society for Gynecologic Inves-tigation 2002; 9(6): 329-34.
20. Folkman J. Tumor angiogenesis. Advances in Cancer Research 1985; 43: 175-203.
21. Reisinger K, Baal N, McKinnon T, Munstedt K and Zygmunt M. The gonad-otropins: tissue-specific angiogenic factors? Molecular and Cellular Endocri-nology 2007; 269(1-2): 65-80.
22. Gargett CE and Rogers PA. Human endometrial angiogenesis. Reproduction 2001; 121(2): 181-6.
23. Iruela-Arispe ML, Rodriguez-Manzaneque JC and Abu-Jawdeh G. Endo-metrial endothelial cells express estrogen and progesterone receptors and ex-hibit a tissue specific response to angiogenic growth factors. Microcirculation 1999; 6(2): 127-40.
24. Critchley HO, Brenner RM, Henderson TA, Williams K, Nayak NR, Slayden OD, Millar MR and Saunders PT. Estrogen receptor beta, but not estrogen re-ceptor alpha, is present in the vascular endothelium of the human and nonhu-man primate endometrium. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2001; 86(3): 1370-8.
25. Krikun G, Schatz F, Taylor R, Critchley HO, Rogers PA, Huang J and Lock-wood CJ. Endometrial endothelial cell steroid receptor expression and steroid effects on gene expression. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2005; 90(3): 1812-8.
26. Chambliss KL, Yuhanna IS, Anderson RG, Mendelsohn ME and Shaul PW. ERbeta has nongenomic action in caveolae. Molecular Endocrinology 2002; 16(5): 938-46.
27. Pedram A, Razandi M and Levin ER. Nature of functional estrogen receptors