Institutionen för fysik och mätteknik
Examenarbete
Utvärdering av selenmetionins och nitroglycerins
påväxthindrande effekter på havstulpaner för eventuell
användning i båtbottenfärger
Evaluation of selenomethionine and nitro glycerine for possible use in
boat paint to prevent barnacle fouling
Mattias Gustafsson
Examensarbetet utfört vid Afasep AB
2005-06-01
LITH-IFM-EX—05/1428—SE
Linköpings universitet Institutionen för fysik och mätteknik 581 83 Linköping
Institutionen för fysik och mätteknik
Utvärdering av selenmetionins och nitroglycerins
påväxthindrande effekter på havstulpaner för eventuell
användning i båtbottenfärger
Evaluation of selenomethionine and nitro glycerine for possible use in
boat paint to prevent barnacle fouling
Mattias Gustafsson
Examensarbetet utfört vid Afasep AB
2005-06-01
Handledare
Birgit Nyberg-Swenson
Examinator
Avdelning, institution
Division, Department
Chemistry
Department of Physics and Measurement Technology Linköping University
URL för elektronisk version
ISBN
ISRN: LITH-IFM-EX--05/1428--SE
_________________________________________________________________
Serietitel och serienummer ISSN
Title of series, numbering ______________________________
Språk Language Svenska/Swedish Engelska/English ________________ Rapporttyp Report category Licentiatavhandling Examensarbete C-uppsats D-uppsats Övrig rapport _____________ Titel
Utvärdering av selenmetionins och nitroglycerins påväxthindrande effekter på havstulpaner för eventuell användning i båtbottenfärger Evaluation of selenomethionine and nitro glycerine for possible use in boat paint to prevent barnacle fouling
Författare
Mattias Gustafsson
Nyckelord
Keyword
Påväxt, havstulpan, cyprid, båtbottenfärg, selenmetionin, nitroglycerin
Sammanfattning
Abstract
Påväxt på båtar och andra föremål som sätts ner i vattnet är ett stort och kostsamt problem världen över. I Sverige orsakar havstulpanen, Balanus
improvisius, den största påväxten. Havstulpanen har många förstadier innan den blir en vuxen havstulpan. I det stadiet innan den sätter sig fast på
olika platser, kallas den cyprid. Det tar mellan tre dagar och upp till några veckor innan cypriden valt plats att settla på. Den väljer plats mycket noggrant då den skall tillbringa resterade delen av sitt liv på denna.
Mycket forskning läggs ner på att finna ett alternativ till dagens giftiga båtbottenfärger. Tennorganiska föreningar, som använts för att motverka settling på båtbottnar, blir totalförbjudet 1 januari, 2008. Nu mer tillsätts allt oftare kopparföreningar istället vilket inte är någon större förbättring för miljön. Det finns idag många miljövänliga färger, som t.ex. silikonbaserad färg, men de fungerar inte lika bra som färgerna med metaller. Det
forskas även på om ytan på båtbottenskall kunna förändras mekaniskt, för att motverka havstulpanens settling.
De substanser som är testade i denna rapport är selenmetionin och nitroglycerin. De testades i olika koncentrationsintervaller och i olika blandningar med varandra. Med en förhoppning om att selenmetioninen binder in i föreningar och då att hastigheten för reaktioner med tioler kan minska
drastiskt och leda till gifteffekter, och att nitroglycerinen skall pacificera cypriden genom att binda till hemoglobinet istället för syre, skall dessa två
substanser hålla cypriderna borta från båtbottnarna. Med föraningar om att substanserna har en synergistisk effekt då de blandas, skall lägre
koncentrationer kunna användas. Då för höga koncentrationer är kostsamt och har troligen större negativ påverkan på miljön.
Selenmetionin visade en antydan till att minska settling men nitroglycerinen hade en mer främjande effekt på cypridens settling. Det visade sig även att substanserna hade en synergistisk effekt och därmed kan koncentrationerna för substanserna sänkas.
Datum 2005-06-01
Abstract
Biological growth on boats and other objects that are placed in water is a big and expensive problem over the entire world. In Sweden, the barnacle, Balanus improvisius, grows the most easily. This barnacle has many larvae stages before it becomes mature. During the larvae stage when it searching for a surface to settle on it is called cyprid. It takes between three days and a couple of weeks before a cyprid chooses a spot to settle on. It chooses the spot to settle on very carefully because it will spend the rest of its life on that exact place.
A lot of research goes into to finding a good alternative to today’s toxic boat paints. Tin organic compounds, as used to counteract settling of cyprids on boats, will be totally
forbidden in January, 2008. As a replacement, copper compounds are being added more often to paints. These are not much better for the environment. Today there are many
environmentally friendly paints, as for example silicon-based paint, but they do not work as well as the paints with metals. Research is also looking at mechanically changing a boat’s surface so that barnacles cannot attach as easily.
The substances that are tested in this report are selenomethionine and nitro glycerine. They were tested in different concentration intervals and in different mixes with each other with the hope of that selenomethionine will bound into compounds and then the reaction velocity with thioles will be reduced and give toxic effects. The nitro glycerine will make the barnacle passive through the idea that the NO is binding into a heme group instead of oxygen. It was hoped that the substances show a synergistic effect when they are mixed, allowing lower concentrations to be used. With too high concentrations in the paint, the paint becomes too expensive and likely has a bigger negative influence on the environment.
Selenomethionine showed an indication to reduce the likelihood that barnacles would settle on a pained surface, but nitro glycerine, on the other hand, caused an increased rate of cyprid settling. It was also shown that the substances had a synergistic effect and thus the
Sammanfattning
Påväxt på båtar och andra föremål som sätts ner i vattnet är ett stort och kostsamt problem världen över. I Sverige orsakar havstulpanen, Balanus improvisius, den största påväxten. Havstulpanen har många förstadier innan den blir en vuxen havstulpan. I det stadiet innan den sätter sig fast på olika platser, kallas den cyprid. Det tar mellan tre dagar och upp till några veckor innan cypriden valt plats att settla på. Den väljer plats mycket noggrant då den skall tillbringa resterade delen av sitt liv på denna.
Mycket forskning läggs ner på att finna ett alternativ till dagens giftiga båtbottenfärger. Tennorganiska föreningar, som använts för att motverka settling på båtbottnar, blir
totalförbjudet 1 januari, 2008. Nu mer tillsätts allt oftare kopparföreningar istället vilket inte är någon större förbättring för miljön. Det finns idag många miljövänliga färger, som t.ex. silikonbaserad färg, men de fungerar inte lika bra som färgerna med metaller. Det forskas även på om ytan på båtbotten skall kunna förändras mekaniskt, för att motverka
havstulpanens settling.
De substanser som är testade i denna rapport är selenmetionin och nitroglycerin. De testades i olika koncentrationsintervaller och i olika blandningar med varandra. Med en förhoppning om att selenmetioninen binder in i föreningar och då att hastigheten för reaktioner med tioler kan minska drastiskt och leda till gifteffekter, och att nitroglycerinen skall pacificera cypriden genom att binda till hemoglobinet istället för syre, skall dessa två substanser hålla cypriderna borta från båtbottnarna. Med föraningar om att substanserna har en synergistisk effekt då de blandas, skall lägre koncentrationer kunna användas. Då för höga koncentrationer är kostsamt och har troligen större negativ påverkan på miljön.
Selenmetionin visade en antydan till att minska settling men nitroglycerinen hade en mer främjande effekt på cypridens settling. Det visade sig även att substanserna hade en synergistisk effekt och därmed kan koncentrationerna för substanserna sänkas.
Förord
Detta 10 poängs examensarbete gjordes under våren 2005 för Afasep AB i Göteborg.
Examensarbetet ingår i högskoleingenjörsutbildningen i kemiteknik vid Linköpings Tekniska Högskola.
Jag vill härmed tacka för den hjälp jag fått:
Birgit Nyberg-Swenson, Afasep AB, för all den hjälp och vägledning jag har fått.
Olle Orvar för att jag har fått utnyttja laboratorium på Chalmers Tekniska Högskola. Johan Hurtig som har hjälpt mig med den tekniska utrustningen men även att hitta i laboratoriet. Martin Ogemark på Tjärnös Marinbiologiska Center som har tillhandahållit med filtrerat havsvatten och framför allt cypridlarver.
Conny Johansson som var till stor hjälp med den statistiska delen i projektet. Olov Krantz, som tillhandahållit med dator då detta behövts. Sonja Gustafsson som korrekturläst arbetet. Till slut vill jag tacka min handledare vid Linköpings Universitet, Stefan Klintström, som gett mig råd och tips under arbetets gång.
Mattias Gustafsson Göteborg 1 juni 2005
Innehållsförteckning
1 INLEDNING... 1
1.1SYFTE... 1
1.2METOD OCH KÄLLOR... 1
1.3AVGRÄNSNINGAR... 1
2 HAVSTULPANEN, BALANUS IMPROVISIUS ... 3
3 SUBSTANSERNA... 6 3.1SELENMETIONIN... 6 3.1.1 Tänkt effekt... 7 3.2NITROGLYCERIN (GLYCERYLTRINITRAT)... 8 3.2.1 Tänkt effekt... 8 4 ANTIFOULING ... 9 4.1ALTERNATIVA ANTIFOULINGSYSTEM... 10 4.1.1 SafeBoatSkin ... 10 4.1.2 LeFant TF ... 10 4.2LAG... 10 5 FORSKNING ... 11 6 UTFÖRANDE ... 13 6.1LABORATIONER... 13 6.2STATISTISK ANALYS... 13 7 RESULTAT ... 15 7.1FÖRSÖK 1... 15 7.1.1 Selenmetionin ... 15 7.1.2 Nitroglycerin ... 16 7.2FÖRSÖK 2... 17 7.2.1 Selenmetionin ... 18 7.2.2 Nitroglycerin ... 19 7.3FÖRSÖK 3... 20 7.3.1 Selenmetionin + Nitroglycerin ... 20 8 DISKUSSION ... 22 8.1SELENMETIONIN... 22 8.2NITROGLYCERIN... 22 8.3SELENMETIONIN +NITROGLYCERIN... 22 8.4ALLMÄNT... 23 9 SLUTSATS... 24
10 FÖRSLAG TILL FORTSATTA FÖRSÖK... 25
Figurförteckning
Figur 1. Cypridlarver, (Berntsson, 1999-03-14)
Figur 2. Vuxna havstulpaner, (Marin Paint, 2003-09-09) Figur 3. Selenmetionin första försöket
Figur 4. Nitroglycerin första försöket Figur 5. Selenmetionin andra försöket Figur 6. Nitroglycerin andra försöket
Figur 7. Blandning av selenmetionin och nitroglycerin
Bilageförteckning
Bilaga A, Reaktion mellan selenproteinet och dopaminet Bilaga B, Beräkningar
Bilaga C, Data, antal som settlat i proverna och medelvärden Bilaga D, Data, p-värden och relativa risken
1
1 Inledning
Djur och växter sätter sig snabbt på båtbottnar och andra hårda föremål som placeras i sjöar och hav. Detta problem har i många år lösts genom att tillsätta olika miljöfarliga ämnen i t.ex. båtbottenfärger med tenn och koppar. År 2008 kommer tennföreningar att bli totalförbjudna i dessa färger. Detta medför att nya mer miljövänliga alternativ måste tas fram. Idag finns det relativt många miljövänliga alternativ till tenn- och kopparfärgerna men de fungerar långt ifrån lika bra. Detta har gjort att många forskare idag försöker finna nya alternativ.
1.1 Syfte
Syftet med examensarbetet var att på laboratoriet undersöka om selenmetionin och nitroglycerin har en påväxthindrande effekt för havstulpanen Balanus improvisius. Substanserna undersöks var för sig och i olika blandningar med varandra.
1.2 Metod och källor
Rapporten bygger på laboratorieförsök och litteraturstudier som utförts. Vid
laboratorieförsöken användes diverse provflaskor och ett mikroskop. Mikroskopet användes för att lätt kunna räkna antalet cypridlarver, havstulpanlarver, i de olika proverna. Vatten som använts är väl filtrerat saltvatten från Tjärnös marinbiologiska laboratorium och som även tillhandahållit cypridlarverna. Cypriderna delas in i batch nr. (kull nr.) för att kunna skilja på olika kullar. För att få uppfattning om hur många cyprider som settlat har statistisk analys gjorts på framtagna data.
På grund av att ämnet är under ständig utveckling har den mesta informationen hämtats från internet. Detta för att få en så uppdaterad information som möjligt. För att få trovärdig
information har det mesta materialet hämtats från kända internetadresser. Författaren har även försökt att ha ett kritiskt förhållningssätt till den internetbaserade informationen.
1.3 Avgränsningar
Det finns många faktorer som påverkar om havstulpanen Balanus improvisius skall settla på en yta. Bland annat inverkar strömmar i vattnet, ljus och cypridernas ålder. Ju äldre de är desto snabbare vill de settla. Denna rapport tar inte hänsyn till ljus då det var både mörkt och ljust i provrummet. Simulerade vattenströmmar har inte varit genomförbart då försöken gjorts
2
i petriskålar. Åldern på cypriderna har varit olika och även från olika kullar då man inte kan förvara dem längre än några dagar. Med cyprider från olika kullar innebär att de är genetiskt olika vilket kan påverka settligen. Försök med olika cypridkullar i samma koncentrationer har inte genomförts.
Antalet försök blev färre än tänkt då cyprider har dött under transport med posten, utebliven reproduktion och för få cyprider funnits med i leveransen.
3
2 Havstulpanen, Balanus improvisius
Havstulpanerna tillhör kräftdjuren, Crustaceca, vilket kan vara svårt att se på den vuxna individen men de har de typiska dragen för en kräftdjurslarv under larvstadiet. Skalet består av kalkplattor och utseendet på de vuxna individerna varierar starkt. Havstulpanerna är tvåkönade men har i allmänhet korsbefruktning. Efter att äggen har befruktats i mantelhålan sker den första larvutvecklingen till så kallade nauplielarver. Alla havstulpaner har sex naupliestadier innan den utvecklats till cypridlarv. Cypridlarven äter ingenting utan lever på upplagrad näring. Den lever i svenska vatten från slutet av maj till november. (Lagerholm, 2000-06-14)
Figur 1. Cypridlarver, (Berntsson, 1999-03-14)
Cypridlarven (se figur 1) är 0,3-0,5 mm lång och är frisimmande i tre dagar upp till ett par veckor. Larvens uppgift är att finna en lämplig yta att sätta sig fast på. Detta görs mycket aktivt, då den kommer att tillbringa resterande del av livet, cirka 3 år, på den valda platsen. När cypriden kommer i kontakt med en yta, utforskas denna, för att avgöra om platsen är bra. När de läser av ett område går de omkring med hjälp av sina antenner. Då den stöter på sprickor och gropar i samma storleksintervall som antennerna (35-50µm) försvårar det cypridernas vandring över ytan. Larverna kan förflytta sig över relativt stora områden. En yta kan testas i över en timma. (Lagerholm, 2000-06-14)
Cypridlarver är i allmänhet dåliga simmare och har därmed problem att aktivt förflytta sig till en plats. Förflyttningen delas in i två delar, vertikal och horisontell. Med hjälp av
vattenströmmarna tar de sig till olika platser då de själva kan reglera sin position vertikalt. Cypridlarverna innehåller mycket lipider som gör att de kan hålla sig vid vattenytan eftersom att lipiderna är hydrofoba. Lipiderna bryts successivt ner och larven får det allt lättare att simma neråt. (Lagerholm, 2000-06-14)
4
Det är många faktorer som spelar in på var larven sätter sig fast, bland annat färg, ljus, tryck och strömförhållande. Äldre larver har ett behov av att settla snabbare än yngre som är mer alerta, vilket beror på att den upplagrade näringen bara räcker under en viss tid. Om många larver tidigare varit på en plats och suttit fast temporärt avges ett så kallat fotsteg vilket
medför att platsen är mer attraktiv än en plats där ingen har försökt settla tidigare. Settling kan definieras som den process där larver utforskar en yta, skapar en reversibel (temporär) kontakt och slutligen sätter sig fast irreversibelt (permanent). Det har även visats att om det redan finns vuxna individer på en plats är den mer attraktiv. Det är kanske inte så konstigt ty det betyder ju att platsen är lämplig för dem. Ytan har också en betydelse då det visats att cypriderna hos Balanus improvisius i större utsträckning settlar på släta ytor. (Lagerholm, 2000-06-14)
För att välja rätt plats har cypridlarven olika nervfunktioner till sin hjälp. Deras nerver fungerar analogt med människans. Basfunktionen i nervsystemet hos olika djur är lika varandra (Holmgren & Winquist, 2004). Det är känt att vissa neurotransmittorer som finns hos människan också finns hos havstulpanlarverna. En sådan substans är dopamin. Hos människan reglerar dopamin många olika funktioner, framförallt i hjärnan. Hos
havstulpanlarven har dopamin effekt på frisättningen av lim och dessutom effekt på en rad andra processer. (Mårtensson, 2005)
Inuti larven finns två cementkörtlar där limmet lagras. När larven funnit en yta ställer den sig på antennerna och frisätter lim från körtlarna via cementkanaler i antennerna och limmar sig fast. Havstulpanens lim består av en unik uppsättning proteiner. Dessa proteiner är inuti larven flytande för att sedan kunna härdas till ett mycket starkt och hårt lim. Hur härdningen av limmet sker är ännu okänt. (Mårtensson, 2005)
Då larven har funnit en trolig plats sätter den sig temporärt fast, en så kallad reversibel infästning, på ytan. Detta görs för att testa platsen ordentligt och varar längre ju attraktivare platsen är (Lagerholm, 2000-06-14). Om platsen är bra ställer den sig på antennerna och frisätter lim från körtlarna via cementkanaler i antennerna och limmar sig fast irreversibelt. Därefter sker omvandlingen från frisimmande larv till ett fastsittande vuxet djur. (Mårtensson, 2005)
5
Efter att cypriden har klistrat sig fast bildas skalplattor. Bottenplattan som till en början är kitinplattor, men sedan påbörjas förkalkningen och kalkplattor bildas. Cypridskalet kastas av efter att kalkplattorna nått en viss grad i utvecklingen. Balanus improvisius har en snabb tillväxt, bara tre veckor efter att larven har satt sig fast är den ca 5mm i diameter. Efter
ytterligare två veckor är den könsmogen, vilket medför att de under en sommar hinner bli upp till tre generationer. Som fullvuxen är Balanus improvisius ca 10mm i diameter och 6mm hög och tillhör den minsta arten av balanida havstulpaner (se figur 2). (Lagerholm, 2000-06-14)
Figur 2. Vuxna havstulpaner, (Marin Paint, 2003-09-09)
Balanus improvisius sätter sig på hård och slät botten vilket är en begränsande faktor i havet
och orsakar mycket av påväxten i Sverige. Därför blir det nästan omedelbart settling på nya hårda föremål som sätts ner i vattnet t.ex. båtbottnar. I många fall kan det orsaka stora problem och stora kostnader. Den klarar sig även bra i vatten med låga salthalter och finns därmed långt in i Östersjön som har bräckt vatten. (Lagerholm, 2000-06-14)
6
3 Substanserna
3.1 Selenmetionin
Selen (Se) är ett spårämne som har uppkallats efter den grekiska mångudinnan Selene och upptäcktes av den svenske kemisten Berzelius år 1817. Först på 1950-talet observerades, att selen hade betydelse för olika sjukdomar. År 1972 upptäcktes att selen är livsnödvändigt för människan och att det ingick i enzymet glutationperoxidas (Gpx) som förkommer i kroppens alla celler och vävnader. (Branht & Hambraeus)
Selenmetionin (SeMet) är organiskt bundet selen som människan får i sig genom födan t.ex. växter. Selen och svavel (S) finns i samma grupp i det periodiska systemet. De är kemiskt likartade och ämnena hanteras därmed på analogt sätt i naturen. Selen byggs in i metionin (aminosyra) istället för svavel (Hansson, 1997). Växternas innehåll av selen beror mycket på var de har odlats. I Sverige innehåller t.ex. mjöl låga halter av selen medan mjöl från vissa delar av USA innehåller högre halter. Även Karl-Johansvamp och renkött kan innehålla mycket höga halter av selen. Lever, skaldjur och fisk är relativt rika på selen. (Branht & Hambraeus)
En stor del selenmetionin byggs in i proteiner t.ex. hemoglobin (Branht & Hambraeus) på motsvarande sätt som en svavelinnehållande aminosyra. Selen (Se) har till uppgift i kroppen att skydda mot syrets skadliga verkningar (Nyberg-Swenson, 2005-04-15). Se bildar starka föreningar med olika tungmetaller t.ex. kvicksilver, kadmium och bly vilket kan leda till att Se-aktiviteten blir för låg. Metallerna är giftiga på grund av att de binder upp Se (Nyberg-Swenson, 2005-04-12). Två exempel på de sjukdomar som kan drabba människan vid selenbrist är Keshans sjukdom, hjärtmuskelsvaghet, och Kashin-Becks sjukdom som utgörs av inflammationer som drabbar och deformerar leder (Branht & Hambraeus). Indikationerna är många för att fler sjukdomar kan ha sin grund i en Se-brist (cancer, Alzheimers,
hjärtkärlsjukdomar med flera). (Nyberg-Swenson, 2005-04-15)
Särskilt den så kallade oorganiska selenformen är ett toxiskt ämne som vid förhöjt intag kan orsaka t.ex. leverskador, diarré och hudrodnad. Vid hög exponering, gramdoser, kan allvarliga magtarm- och neurologiska störningar bli följden. (Branht & Hambraeus)
7
Atomärt S och Se binder lätt till sulfider och selenider vilka bildar länkar innehållande två eller fler S eller Se atomer. De senaste åren har upptäckter gjorts att många enzymer och proteiner innehåller SeCys (Selencystein). (Nyberg-Swenson, 2005-04-15)
3.1.1 Tänkt effekt
En teori finns om att en selenlänk bundet till enzymer (protein-Se-Se-) är närvarande vid ultrasnabba elektrontransporter som skydd mot syrets skadliga verkningar. Är den riktig skulle det innebära att ett utmärkt system mot nedbrytande oxidationer i många fundamentala biologiska processer existerar. (Nyberg-Swnson, 2005-04-12)
Organiskt selen, SeCys och SeMet innehåller selenid (Se-2) som kan reagera med S0 och bilda Se-länkar. Se-länkar i enzymer (P-Se-Se-) agerar troligtvis som en elektronledare mellan redoxagenter och ett reducerbart syre (O2,O2-, eller H2O2 = väteperoxid), en elektron acceptor.
H2O är den sista produkten. Om Se-länkarna blir inaktiva kan NO (kvävemonoxid) bildas från
aminogrupper av t.ex. arginin och dopamin (Nyberg-Swnson, 2005-04-12).
Signaler från antennerna avgör om en plats är tillfredställande för cypriden. Signalsubstansen som den använder är dopamin. Dopaminet kan avge elektroner (e-) eller väteatomer (H) till Se-enzymet (protein-Se-Se-) som i sin tur avger en exiterad e- till O2 som då reduceras (se
bilaga A). Därvid frigörs den energi som krävs för olika processer, i detta fall troligtvis settlingen. Om dopaminet avger H eller e- till O2 direkt istället för genom Se-proteinet,
oxideras dopaminet vilket inte är någon önskad reaktion. Dopaminet kan oxideras till bland annat 3,4-dihydroxyfenylättiksyra (DOPAC) om inte Se-länken finns för elektrontransporten och tappar därmed sin funktion. Detta gör troligen att cypriden inte kan settla eller utsöndra limmet. NO är bundet till hemoglobin under passiva faser för att undvika oxidationsskador. (Nyberg-Swensson, 2005-04-12)
Tillförsel av Se i höga doser kan ge gifteffekter. Då går Se in i föreningar i stället för eller tillsammans med S med påföljden att hastigheten för reaktioner med tioler kan minska drastiskt och leda till gifteffekter. Detta gäller speciellt för selenit eller andra föreningar som reduceras till Se(0). I tidigare försök har selenit visat sig motverka settling effektivt
men dosen ligger ganska nära den dödliga. Selenmetionin är inte lika toxiskt som selenit och borde därför motverka settlingen sämre. (Nyberg-Swensson, 2005-05-20)
8
3.2 Nitroglycerin (Glyceryltrinitrat)
Nitroglycerin framställdes första gången 1847 av en italiensk kemist vid namn Sobero. Alfred Nobel försökte tämja denna lätt reagerande substans, genom att göra den till ett praktiskt användbart sprängämne. Han lyckades med det efter många misslyckade försök. Ett exempel är när hans yngre bror omkom i en explosion i Vinterviken utanför Stockholm. Han kallade sitt sprängmedel för dynamit. (Andersson et al., 2001)
Nitroglycerin är en svagt gul vätska som innehåller kol, väte och syre i nästan exakta proportioner för förbränning till CO2 och H2O (Andersson et al., 2001). Nitroglycerin är
mycket svårlöslig i vatten, hydrofob, och i organiska föreningar, men löses i nitrocellulosa och organiska nitroföreningar (Bengtsson, 2003). Den producerar NO vilket har många positiva effekter på människokroppen i samband med nedsatta funktioner såsom reglering av kärlvidd och blodtryck, reaktivitet i perifera och centrala nervsystemet samt i immunförsvaret. Därför används nitroglycerin ofta som läkemedel. (Karolinska Institutet, 2004-08-31)
Nitroglycerin har använts som medel mot kärlkramp för dess kärlvidgande egenskaper. Venerna i kroppen utvidgas så att de kan hålla kvar mer blod. Därigenom avlastas hjärtat och hjärtmuskelns syrebehov minskar. Dessutom utvidgas hjärtats kranskärl så att blodflödet till hjärtmuskeln ökar. Resultatet blir att syrebristen i hjärtmuskeln minskar eller försvinner (Andersson et al., 2001). Nitroglycerin används idag som medicin för t.ex.
blodtrycksreglering och hjärtsvikt. (Astra Zeneca, 2003)
De biverkningar som kan uppkomma vid medicinering av nitroglycerin är framför allt huvudvärk, hudrodnad och yrsel. Vid för hög exponering kan bland annat kräkningar,
blodtrycksfall och kallsvettningar förekomma. Nitroglycerin är med andra ord toxiskt om det förekommer i kroppen med för hög dos. (Astra Zeneca, 2003)
3.2.1 Tänkt effekt
Nitroglycerin producerar NO vilket kan binda till hemoglobin i havstulpanen istället för O2.
Detta ger en passiviserande effekt på havstulpanen då dess hemoglobin transporterar mindre O2 än vanligt. Därmed utvecklas inte den för t.ex. settlingen nödvändiga energin i samma takt
9
4 Antifouling
För att undvika att växter och djur sätter sig på båtbottnar används antifoulingsystem. De mest använda antifoulingfärgerna innehåller koppar- och zinkföreningar samt organiskaföreningar (Håll skärgårgen ren rf, 2004). Den hittills mest använda antifoulingfärgen innehåller
tennorganiska ämnen som tributyltenn (TBT) (Flodström et al., 2000). När dessa ämnen löses upp ur färgen är de giftiga också för andra organismer än de som ämnena är avsedda för. Särskilt skadliga är de för organismerna i kustvatten och hamnområden. På våren, när båtarna är nymålade och sjösätts, är skadeverkningarna som störst, eftersom det är den bästa
fortplantningstiden för många vattenorganismer. (Håll skärgården ren rf, 2004)
Nedan visas de giftiga antifoulingämnenas verkan på naturen, (Håll skärgården ren rf, 2004) Kopparföreningar
• Dödar alger, vattenloppor och fiskar
• Ansamlas i bland annat musslor och strömming • Ökande halt på botten minskar organismernas artantal Zinkföreningar
• Är giftiga för vissa kräftdjur och fiskar
• Ansamlas framförallt i alger och organismer i sediment, t.ex. blötdjur Organiska föreningar
• Är giftiga framför allt för alger och vattenväxter
• Många föreningar är bioackumulerande och svårnedbrytbara
• Redan mycket små halter kan leda till att mängden alger och antalet algarter minskar Påväxthindrade system som t.ex. antifoulingsystem är nödvändigt, annars skulle
bränsleförbrukningen bli för hög. Påväxten gör att det blir mer friktion och därmed högre bränslekonsumtion (Flodström et al., 2000) vilket ökar kostnaderna för båtägaren och ökar koldioxidutsläppen. Forskare försöker att finna nya miljövänligare alternativ. Se kap. 5 Forskning
10
4.1 Alternativa antifoulingsystem
Sjöfartsverket har tagit fram en lista på alternativa färger till de giftiga bottenfärgerna. Listan visar vilka färger som är bra för båtar på t.ex. ostkusten och västkusten. Den tar även upp positiva och negativa aspekter med de olika alternativen. Ett par exempel är:
4.1.1 SafeBoatSkin
Denna färg består av ett polymervax som hindrar påväxt genom att ge en hal yta. Färgen kräver att båten seglar regelbundet. Denna passar sig bäst i insjöar, på ost- och västkusten. Fungerar för alla typer av skrov och de tester som utförts visar att färgen inte har någon negativ inverkan på ekosystemet. (Sjöfartsverket, 2005-03-18)
4.1.2 LeFant TF
Detta är en fysikalisktverksam färg. Systemet bygger på en biokatalytisk effekt som reducerar bildning av bakteriefilm på båtbotten och gör ytan mindre lockande för beväxning.
Havstulpaner och alger har svårt att få fäste då ytan löses upp långsamt vilket kan liknas med en ”kvicksilveryta” på mikronivå. Denna färg säljs över hela landet och fungerar på alla typer av skrov men passar sig bäst i insjöar och på ostkusten. Efter olika tester har det visat sig att skroven fick relativt lite påväxt på ostkusten. (Sjöfartsverket, 2005-03-18)
4.2 Lag
Den 1 juli 2003 blev användningen av antifoulingfärger innehållande tennorganiska föreningar förbjudet på alla svenska fartyg med undantag för örlogsfartyg och militära hjälpfartyg. Dessa föreningar fungerar som biocider, medel som håller skadliga organismer borta. Från den 1 januari 2008 är det totalförbud mot tennorganiska föreningar som fungerar som biocider på fartyg och kommer därmed att innefattar även de undantagna fartygen. Från 2008 kommer förbudet att gälla alla fartyg som lägger till i svenska hamnar. Dessa lagar kommer att gälla i hela EU. (Sjöfartsverket, 2005-03-10)
Eftersom tennorganiska föreningar kommer att bli förbjudna har de bytts ut i många färger mot kopparföreningar. Detta är inte en förbättring. (Flodström et al., 2000)
11
5 Forskning
Att finna en färg där naturen inte störs, är mycket svårt. Många forskare försöker finna
alternativ till dagens giftiga färger. Valar, havssköldpaddor och alger skyddar sig på olika sätt mot påväxt. Det forskas intensivt på att finna naturens egna lösningar på påväxtproblemet. Dock uppstår ofta problem med att djuren producerar och utsöndrar ämnena hela tiden vilket är svårt att simulera i bottenfärgen. (Mårtensson, 2005)
Nedan tas några fler forskningsområden upp: • Bakterier
Av en slump upptäcktes att havstulpaner inte sätter sig på vissa stenar som annars ofta är fulla av tulpaner. Det visade sig att en viss bakterie fanns på stenen. Denna bakterie försöker forskare blanda in i en plastfärg för att på så sätt minska settlingen. (Granmar, 2000-06-07)
• Silikon och ”självtvätt”
De flesta forskare har inriktat sig på bottenfärg baserad på silikon eller liknade ämnen. Denna färg kallas för ”easy release fouling”. Färgen gör att havstulpanen fäster på skrovet men när båten rör på sig i en viss hastighet halkar de av (Granmar, 2000-06-07). Denna färg är dock mycket känslig för mekanisk nötning då den lätt lossnar (Mårtensson, 2005).
• Topografi
Som tidigare nämnts i rapporten sätter sig havstulpanerna ogärna på platser med för stora sprickor och gropar. Detta har forskare tagit fasta på och försöker med hjälp av topografi få havstulpanen att undvika settling (Granmar, 2000-06-07). På Tjärnös marinbiologiska laboratorium har en yta tagits fram som är räfflad på ett speciellt sätt och där ville inte havstulpanslarver limma sig fast på ytan (Mårtensson, 2005). • Polysackarider
Vissa båtbottenfärger innehåller vattenlösliga polysackarider. I och med att färgen är vattenlöslig innebär det att färgen löses upp ju längre säsongen lider och tappar därmed effektivitet. Så länge det finns tillräcklig mängd av polysackariden kvar håller den havstulpanen borta. (Granmar, 2000-06-07)
12
• Nikotin och selen
Det har visats att en blandning av selenit och nikotin har en bra motverkande effekt mot havstulpaners settling. Dessa substanser är dock vattenlösliga vilket försvårar användandet. Forskare försöker binda in ämnena med hjälp av t.ex. polymerer för att förhindra att substanserna löses ut för snabbt i vattnet. Projektet är det första som någonsin presenterats med en garanterat långsiktig ofarlig miljöeffekt, trots en gifteffekt i en verksam coatingprodukt (vilket är nödvändigt). (Nyberg-Swenson, 2005-05-03)
• Nervsystemet
Eftersom basfunktionen i nervsystemet hos olika djur är lika varandra finns det en möjlighet att använda kända molekyler som har låg giftighet men som kan störa larvens bearbetning av nervsignalerna. (Holmgren & Winquist, 2004) Det finns många olika substanser som förhindrar funktionerna av dopamin. Det är troligen möjligt att använda någon av dessa vilket förhindrar larven från att limma. (Mårtensson, 2005) Ett av de största forskningsprojekten i Sverige inom påväxt av havstulpaner utförs av Marin Paint. Vilket är ett forskningsprogram vid Göteborgs Univeristet och Chalmers Tekniska Högskola. Forskningen ingår i ett så kallat MISTRA-program (Marin Paint, 2004-06-17). MISTRA, stiftelsen för miljöstrategisk forskning, arbetar för en hållbar utveckling och finansierar en stor del av miljöforskningen i Sverige, där i bland Marin Paint (MISTRA, 2005). Marin Paint forskar på substansen kateminer, som påverkar nervsystemet hos cypriden på ett sätt att den inte settlar. De forskar bland annat på substansens ekotoxiska egenskaper, hur substansen skall kunna blandas in i en färg och framställning av färgen i stor skala. (Marin Paint, 2004-06-02)
13
6 Utförande
6.1 Laborationer
Beredning av stamlösningarna gjordes för selenmetionin och nitroglycerin med koncentrationen, 1mM, (se bilaga B). I försöken användes ren selenmetionin och hjärtmedicinen Nitromex 0,5mg användes som nitroglycerinkälla. Substanserna löstes i (OBS) renat havsvatten. Detta vatten användes för att få en så lik miljö som cypridernas naturliga som möjligt. Stamlösningarna späddes ut till de önskade koncentrationerna. Mellan 15 och 30 stycken cypridlarver lades i varje petriskål och de räknades med hjälp av ett
mikroskop. Efter räkningen hälldes 15ml av de olika koncentrationslösningarna i var och en av petriskålarna. Vid varje försök gjordes två till fyra nollprover, för att ha en referens. Detta är speciellt viktigt då bland annat olika kullar med olika genetiskuppsättning av cypriderna settlar olika snabbt. Även de övriga proverna gjordes med två till fyra petriskålar per
koncentrationshalt. Därefter stod proverna i sex dagar i ett rum med temperaturen 19,5±1°C. Proverna rördes inte under denna period för att inte påverka settlingsprocessen.
Efter de sex dagarna räknades antalet settlade cyprider (se bilaga C). När första räkningen gjorts fick proverna från försök 1 och försök 2 stå i några dagar till för att avläsas ytterligare två gånger. Proverna i försök 3 stod ytterligare i två dagar innan en andra avläsning gjordes. Detta för att få en uppfattning om tiden har någon påverkan på settlingsresultatet och
havstulpanens tillväxt. När all data var framtagen, diskades petriskålarna ur med renat havsvatten.
6.2 Statistisk analys
Resultaten från laborationerna analyserades med statistikprogrammet Graphpad Prism version 4,00. Vid analysen användes Fischer's test med ”two-tailed” p-värden, där testerna gjordes mot kontrollgruppen (nollproverna). Med ett antagande om att proverna med samma
koncentration och batch nr. var lika, adderades cypriderna i proverna och därefter räknades ett medelvärde ut på antal settlade. Denna analys gjordes för att få en uppfattning om resultaten är signifikanta eller inte och för att överskådligt kunna se hur substanserna har påverkat settlingsprocessen hos cypriderna. Analysen är gjord i ett 95- procentigt konfidensintervall och då skall p<0,05, för att resultaten skall vara signifikanta. Det kan vara svårt att få
14
signifikans i försöken när det bara användes 2-4 stycken dubbelprover, därför räknades även den relativa risken ut.
Relativa risken visar hur många gånger större chans det är att cypriderna inte settlar i proverna med olika koncentrationer jämfört med kontrollen. Detta för att få en klarare bild över hur substansen påverkar settlingen. Om relativa risken är under ett innebär det att cypriderna settlar mer i proverna med substansen än i nollproverna. Även om vissa prover inte är signifikanta och har en relativ risk under ett finns det antydningar i resultaten som visar hur substanserna har påverkat settlingen.
Graferna visar ett medelvärde hur många procent som settlat i proverna och jämförs mot kontrollerna. Varje prov visar två eller tre staplar vilket är vid de olika avläsningstillfällena (se figur 3-7). Felstaplarna visar maxantal som settlat i proverna.
15
7 Resultat
De två första försöken avlästes på i tre omgångar för att se om tiden hade någon betydelse för settlingsprocessen. Första räkningen av cypriderna gjordes efter sex dagar, därefter gjordes ytterligare avläsningar på försök 1 efter tre dagar och försök 2 efter två dagar. Den tredje räkningen gjordes för båda försöken efter ytterligare tre dagar. I försök 3 avlästes proven i två omgångar, första efter sex dagar och andra efter ytterligare två dagar. Data över antalet cyprider som settlat finns i bilaga C.
7.1 Försök 1
I det första försöket användes för selenmetionin, som har molekylvikten 196,13 gram/mol, ett koncentrationsintervall på 1µM, 10µM, 50µM och 100µM. För nitroglycerin, som har
molekylvikten 227,11 gram/mol, användes koncentrationerna 100nM, 1µM, 10µM och 100µM. I detta försök användes cyprider från batch nr. 1.
7.1.1 Selenmetionin
Resultatet i selenmetioninproverna visade att i samtliga prover med koncentrationen 1µM var settlingen lägre än nollproverna (se figur 3). Detta är positivt då det inte är bra om det krävs för hög koncentration eftersom det är troligt att även andra organismer påverkas mer av en hög koncentration och dessutom är det mer kostsamt. De övriga koncentrationerna fungerade relativt bra som antifoulingagent. Det är bra med ett stort effektivt spridningsintervall då det vid en inblandning i bottenfärg är svårt att veta hur mycket som löses ut från färgen. Dock visade det sig att inget av proverna är signifikanta då p>0,05 i samtliga fallen. Däremot har bland annat koncentrationen 1µM en relativ risk på cirka 1,7 (se bilaga D). Det visade sig även att under detta försök varken ökade eller minskade settlingen något nämnvärt med tiden.
16
Kontr1 Kontr2 Kontr3 Se1 1uM Se2 1uM Se3 1uM Se1 10uM Se2 10uM Se3 10uM Se1 50uM Se2 50uM Se3 50uMSe1 100uMSe2 100uMSe3 100uM 0 10 20 30 40 50
Drog, Tid, Koncentration
% S e tt la d e
Figur 3. Selenmetionin första försöket
De noteringar som gjordes efter första räkningen (efter sex dagar) var att antalet settlade var färre än i nollproverna. Cypriderna hade inte utvecklats till havstulpaner och satt relativt löst. Därmed släppte några cyprider den valda platsen när proverna räknades.
Efter nio dagar noterades att färre eller lika många cyprider var settlade. Även att de fortfarande inte hade utvecklats till havstulpaner och satt löst. Aktiviteten i proverna var mindre än efter första räkningen.
Efter tolv dagar var cypriderna mycket inaktiva, de som inte settlat såg i det närmaste döda ut. Det kunde även noteras att i många av proven hade några släppt sin plats och inga fler hade settlat i proven. Vissa av de som settlat hade utvecklat sig till havstulpansliknande varelser, men det var bara ett fåtal.
7.1.2 Nitroglycerin
I samtliga nitroglycerinprover visade resultatet att många fler cyprider hade settlat än i nollproverna (se figur 4). Det visade sig även att settligen ökade lite med tiden vilket visar att nitroglycerin har en motsatt effekt än den tänkta. Inget av prover gav dock någon signifikans då samtliga p-värden var över 0,05. Den relativa risken var under ett (se bilaga D) vilket visar på att det är större chans att cypriderna settlar i proverna med nitroglycerin än i nollproverna vilket i även syns i diagrammet nedan. Dock visade det sig att vid sista avläsningen var samtliga prover signifikanta men fortfarande var relativa risken mycket låg.
17
Kontr1 Kontr2 Kontr3 Ni1 100nMNi2 100nMNi3 100nM Ni1 1uM Ni2 1uM Ni3 1uM Ni1 10uM Ni2 10uM Ni3 10uM Ni1 100uMNi2 100uMNi3 100uM 0 10 20 30 40 50 60 70
Drog, Tid, Koncentration
% Se ttl a d e
Figur 4. Nitroglycerin första försöket
Efter det första försöket, noterades vid avläsningen att för nitroglycerin var det många som settlat och att de flesta hade kommit relativt långt i utvecklingen. De hade utvecklats till små havstulpansliknande varelser och satt därmed fast hårt i proverna. Cypriderna såg även relativt aktiva ut i proverna.
Efter nio dagar var det ingen större skillnad.
Efter tolv dagar var det fortfarande ingen större skillnad på antalet settlade. Däremot hade få cyprider börjat äta som de börjat med i nollproverna. Med andra ord utvecklingen kan ha avstannat av nitroglycerinen. Detta kan bero på, att NO som är en viktig molekyl för många organismer under passiva faser påskyndar settlingen för en del cyprider av samma orsak som att äldre cyprider settlar snabbare än yngre. Men blir passiviseringen utbredd avstannar cypridens processer och hämmar dem tills cypriderna så smånigom dör.
7.2 Försök 2
För andra försöket användes koncentrationerna för selenmetionin, 5µM, 25µM, 75µM och 500µM. För nitroglycerin användes koncentrationerna 200nM, 500nM, 50µM och 500µM. Efter att dessa prover stått i sex dagar bör det noteras att i de två nollproverna hade cypriderna settlat relativt mycket i ena och nästan inget i den andra. De var även mycket aktiva (simmade runt) i nollproverna. I detta försök användes cyprider från batch nr. 1.
18
7.2.1 Selenmetionin
I de flesta proverna, förutom 500µM, var settlingen högre efter sex dagar än i nollproverna. Däremot sjunker samtliga prover drastiskt med tiden (se figur 5). För koncentrationerna 5, 25 och 75µM, kan en ökande trend utläsas för den relativa risken, vilket innebär att risken för settling minskar i proverna jämfört med nollproverna. Allmänt om provernas signifikans kan det nämnas att den varierar starkt från avläsningstillfällena. För koncentrationen med 500µM ökar relativa risken över tiden till oändligt stort då ingen cyprid var settlad vid sista
avläsningen. Proverna blir även mer och mer signifikanta med tiden (se bilaga D). Detta var lite för hög koncentration då cypriderna dog.
Kontr1 Kontr2 Kontr3 Se1 5uM Se2 5uM Se3 5uM Se1 25uM Se2 25uM Se3 25uM Se1 75uM Se2 75uM Se3 75uMSe1 500uMSe2 500uMSe3 500uM 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Drog, Tid, Koncentration
% S e tt la d e
Figur 5. Selenmetionin efter andra försöket
Efter sex dagar noterades att cypriderna i selenmetionin sitter mycket löst, precis som i försök 1, och att de inte är speciellt aktiva utan mer apatiska. Även denna gång släppte vissa sin plats då räkningen utfördes. Noterade även att några satt vid botten av petriskålen vilket kan tyckas märkligt då de flesta settlat vid vattenkanten. Det är vid vattenkanten som de vanligtvis settlar.
Efter åtta dagar satt de fortfarande mycket löst och det var fler som hade släppt sin plats än i försök 1 trots att proverna hade stått i en dag mindre. Cypriderna var även mindre aktiva än vid fösta räkningen.
Efter elva dagar var det ytterligare några som släppt sin plats och de flesta satt löst. Dock hade några utvecklats vidare till havstulpansliknande varelser, men de var inte speciellt många. De
19
som inte limmat sig fast på något sätt såg mycket livlösa ut, speciellt i de höga koncentrationerna.
7.2.2 Nitroglycerin
Även vid detta försök visade det sig att cypridernas settling är högre än nollproverna (se figur 6) utom vid 500µM som var en för hög koncentration ty cypriderna dog. De andra proverna är inte signifikanta, förutom 200nM proven vid första avläsningen. Även den relativa risken som blev < 1 visar att de settlar mer i proverna med nitroglycerin än i nollproverna (se bilaga D).
Kontr1 Kontr2 Kontr3 Ni1 200nMNi2 200nMNi3 200nMNi1 500nMNi2 500nMNi3 500nM Ni1 50uM Ni2 50uM Ni3 50uM Ni1 500uMNi2 500uMNi3 500uM 0 10 20 30 40 50 60 70
Drog, Tid, Koncentration
% S e tt la d e
Figur 6. Nitroglycerin andra försöket
Efter sex dagar noterades vid avläsningen att cypriderna har utvecklats till
havstulpansliknande varelser. Noterbart var också att de ibland satt mycket nära varandra, så pass nära att en lupp krävdes för att säkerställa antalet. I proverna med låga koncentrationer var det en hög aktivitet bland cypriderna. I de prover med 500µM var det liten settling och mycket liten eller ingen aktivitet. Ingen av cypriderna rörde på sig efter vad som kunde bedömas.
Efter åtta dagar hade ingen större skillnad på settlingen skett i nitroglycerinproverna. Cypriderna var dock mindre aktiva.
Efter elva dagar hade inga större förändringar skett i nitroglycerinproverna. De som settlat var fortfarande settlade och fler hade inte settlat. I proverna med koncentration på 500µM var cypriderna mycket livlösa. Det visade sig att i några av proverna var det få som utvecklats vidare till en ätande havstulpansliknande varelser, men i andra prover var det lika många som
20
utvecklats till en ätande havstulpan som i nollproverna. Med andra ord utvecklingen kan ha avstannat i vissa av nitroglycerinproverna.
7.3 Försök 3
I detta försök användes två olika blandningar av selenmetionin och nitroglycerin, 30µg (10,2µM) och 30µg (8,8µM) respektive 50µg (17µM) och 50µg (14,7µM) för att undersöka om substanserna har synergistiska effekter. I försöket användes cyprider från batch nr. 2. Efter sex dagar var det få som settlat i samtliga prover, dock i nollproverna var det en stor aktivitet, de simmade runt mycket. Vid andra avläsningen hade aktivitet minskat något.
7.3.1 Selenmetionin + Nitroglycerin
När substanserna blandades förstärktes deras effekter på cypriderna, de visade en kraftig synergistisk effekt. Även om det var få som settlat i nollproverna visade båda blandningarna att de har en stor effekt på cypriden (se figur 7). Vid första avläsningen var ingen av
blandningarna signifikanta men har en hög relativ risk (se bilaga D), vilket innebär att chansen är mindre att cypriden settlar i blandningarna än i nollproverna. Vid andra avläsningen var båda signifikanta och med ännu högre relativ risk. Dock påverkades cypriderna så pass att de flesta dog.
Kontr1 Kontr2 1 Se 10.2uM + Ni 8.8uM 2 Se 10.2uM + Ni 8.8uM 1 Se 17uM + Ni 14.7uM 2 Se 17uM + Ni 14.7uM
0 5 10 15 20 25 30 35
Drog, Tid, Koncentration
%
S
ettla
d
e
Figur 7. Blandning av selenmetionin och nitroglycerin
Vid första avläsningen efter sex dagar noterades att det var mycket få cyprider som settlat i båda blandningarna. I proverna var det även en mycket liten aktivitet, de såg döda ut. De hade benpaktet (thoracopoderna) utfällt vilket indikerar att cypriden är döende.
21
Efter åtta dagar var det aktivitet i nollproverna, dock mindre än vid förra avläsningen och några fler hade settlat. I proverna med de blandade koncentrationerna noterades ingen större skillnad och det var fortfarande ingen aktivitet, såg döda ut.
22
8 Diskussion
8.1 Selenmetionin
Av de försök som gjorts i denna rapport är det svårt att ta ett definitivt ställningstagande om selenmetionin kan fungera som antifoulingagent. Detta på grund av att den statistiska analysen visade att proverna i första försöket inte var signifikanta och i andra hoppar de mellan att vara signifikanta och inte signifikanta med tiden. Dock är det mycket intressant att en så låg koncentration som 1µM visar en tydlig motverkande effekt. Detta förstärks då den relativa risken var ungefär 1,7. De andra koncentrationerna visar också en potential att motverka settling för havstulpanen vilket är bra vid en eventuell inblandning i bottenfärg, då koncentrationerna måste kunna variera relativt mycket. Speciellt intressant är att i försök 2 visade selenmetionin tydligt att settlingen minskade med tiden och då även i låga
koncentrationer. Att settligen minskar vid låga koncentrationer är även bra ty då blir det mindre kostsamt vid en eventuell inblandning i bottenfärg.
Det är även intressant att cypriderna inte settlade sig fast irreversibelt som i nollprover. Därför bör substansen testas vidare då den visat i dessa försök att den har en bra potential som
antifoulingagent, men då i låga koncentrationer runt 1µM. 500µM är en för hög koncentration som bara dödar cypriden vilket inte är syftet med bottenfärg.
8.2 Nitroglycerin
Nitroglycerin visar att den mer främjar settling än motverkar. Substansen är inte signifikant i nästintill något prov förutom vid 500µM då cypriderna dog. Därför bör inte en sådan hög koncentration användas. Relativa risken visar att cypriderna settlar mer i proverna med nitroglycerin än i nollproverna. Att detta skedde beror troligen på att NO är en molekyl som i viss mängd är bra för många organismer (även människan). Men dess passiviserande effekt påskyndar settlingen för en del cyprider vilket inte är bra ur påväxtsynpunkt. Att enbart använda nitroglycerin i en bottenfärg är ingenting att rekommendera såvida inte försök i havsmiljö visar att cypriderna dör innan de utvecklats till havstulpaner
.
8.3 Selenmetionin + Nitroglycerin
En blandning av selenmetionin och nitroglycerin motverkar settlingen markant. De visade en stark synergistisk, samverkande, effekt då de flesta cyprider dog och få settlade vid relativt
23
låga koncentrationer. Att resultatet inte blev signifikant vid första avläsningen berodde troligen på att få cyprider settlat i nollproverna, ty då fler cyprider settlat vid andra avläsningen var resultaten signifikanta. Den relativa risken var dock hög under båda
avläsningarna vilket är mycket positivt. Eftersom substanserna påvisade en synergistisk effekt är det intressant att undersöka blandningarna närmare men då med lägre koncentrationer.
8.4 Allmänt
Att få prover blev signifikanta kan bero på att för få dubbelprover gjordes (2-4) i varje experiment. För att få fler försök signifikanta bör fler dubbelprover göras på varje
koncentration. Med tanke på detta användes den relativa risken som inte är beroende av om proverna är signifikanta eller inte, vilket visar om cypriden settlar mer i proverna med substanserna än i nollproverna.
24
9 Slutsats
Det är många faktorer som kan ha påverkat resultaten, såsom ljus, genetiskuppsättning och ålder. Även om resultaten ofta inte var signifikanta visade proverna en antydan till hur
substanserna påverkade cypridernas settling. Att använda selenmetionin skulle kunna vara ett alternativ i bottenfärgen då den visar antydningar till att koncentrationen 1µM har en viss effekt på cypridens settling som tydligt syntes i den relativa risken. Fler försök bör dock göras innan någonting definitivt kan konstateras om substansen. Att använda nitroglycerin i
bottenfärg är enligt resultaten i denna rapport inte något bra alternativ. Även om resultaten inte var signifikanta kunde även här vissa effekter skönjas och den relativa risken visade att cypriderna settlade mer än i nollproverna.
Men att använda en blandning av båda substanserna ser ut att vara ett möjligt alternativ. De påvisar en synergistisk effekt med varandra och att den relativa risken var så pass hög visade att blandningarna har effekt. Däremot är det svårt att få någon indikation från p-värdet då få cyprider settlat i nollproverna. Då få blandningar och höga koncentrationer använts i försöken i denna rapport bör kombinationen undersökas närmare.
25
10 Förslag till fortsatta försök
Använd fler prover på varje koncentration då det är större sannolikhet att resultaten blir signifikanta.
Blanda olika kullar av cypriderna, eftersom olika genetisk uppsättning kan ha olika inverkan på settlingen.
Selenmetionin bör undersökas närmare för att finna en mer optimal koncentration. Eftersom en blandning av substanserna visade en synergistisk effekt bör lägre koncentrationer, olika halter och fler prover undersökas.
26
Referenser
Litteratur:
Andersson, Stig, Sonesson, Artur och Vanneberg, Nils-Gösta (2001). Kemin i samhället Liber AB. 2. uppl.
Internet:
Astra Zeneca (2003-09-22). Produktresumé - Nitroglycerin [www]. Hämtat från
<http://www.mpa.se/spc_pil/pdf/humspc/Nitroglycerin%20AstraZeneca%201%20mgml.pdf> 2005-03-22
Bengtsson, Lina (2003). Förorenade områden – Bekämpningsmedelstillverkare och
sprängmedelstillverkare [www]. Hämtat från
<http://www.ab.lst.se/upload/dokument/publikationer/M/Rapportserien/R2003_06_Fororenad e_omr_sprangmedel_bekampning_webb_5mars.pdf> 2005-04-06
Berntsson, Kent (1999-03-14). Utveckling av miljövänliga metoder för att förhindra påväxt
av marina organismer: djurlarvers förmåga att sätta sig fast vid olika ytor [www] Hämtat
från <http://www.marecol.gu.se/projsvensk/kentberntssonpsv.html> 2005-05-04
Branth, Stefan & Hambraeus,Leif. Mjölkfrämjandets guide om vitaminer och mineraler
[www]. Hämtat från
<http://www.mjolkframjandet.se/www/mf.nsf/vLPdf/739E1FF2CFDDAFF2C1256E5800596 293/$File/MF%2052%20Vitamin%20&%20Mineral.pdf> 2005-03-22
Erenmalm, Thomas (2005-02-28). Är trätjäran hotad? [www]. Hämtat från <http://www.raa.se/nyheter/mars2.asp> 2005-04-02
Flodström, Eje; Jirén, Karl & Sjöbris Anders (2000). Förstudie - Ekologiskt hållbart
sjötransportsystem. [www]. Hämtat från <http://www.kfb.se/pdfer/M-00-20.pdf> 2005-04-02
Granmar, Marie (2000-06-07). Stoppa havstulpanerna med bedövningsmedel [www]. Hämtat från <http://www.nyteknik.se/pub/ipsart.asp?art_id=9836> 2005-03-22
27
Hansson, Mats (1997). SELEN, Natruimselenit, Na2SeO3. [www]. Hämtat från <http://www.kvicksilver.org/abs/selen.html> 2005-03-22
Holmgren, Susanne & Winquist, Agneta (2004). Zoofysiologi [www]. Hämtat från http://vivaldi.zool.gu.se/Forskning/pdf/zfvb03.pdf Acc. 2005-04-14
Håll skärgården ren rf (2004). Mot renare seglatser-guide för båtfarare [www]. Hämtat från <http://www.roskaroope.net/chapter_images/558_Veneily-ymp._ruotsi.pdf> 2005-04-04 Karolinskainstitutet (2004-08-31). Hälsoriskbedömning-kväveoxider [www]. Hämtat från <http://www.imm.ki.se/riskweb/bedomningar/NOx.html> 2005-04-13
Lagerholm, Charlotte (2000-06-14). Cypridlarvers, Balanus improvisius (Darwin), beteende
och settlingsintensitet i strömmande vatten [www]. Hämtat från
<http://www.tmbl.gu.se/pdf/TMBL_pdf/Library_and_databases_pdf/examensarbeten_pdf/La gerholm20p.pdf> 2005-03-22
Marin Paint (2004-06-17). Programme Mission [www]. Hämtat från <http://marinepaint.org.gu.se/index.php?type=mission> 2005-04-20
Marin Paint (2003-09-09). The Barnacle [www]. Hämtat från <http://marinepaint.org.gu.se/index.php?type=barnacle> 2005-05-04
Marin Paint (2004-06-02). Projects [www]. Hämtat från
<http://marinepaint.org.gu.se/index.php?type=projects> 2005-04-20 MISTRA. Vad är mistra? [www]. Hämtat från
<http://www.mistra-research.se/mistra/ommistra/vadarmistra.4.1a01f911006c9df6dc800023612.html> 2005-04-20
Mårtensson, Lena (2005). Marinpåväxt – ett svårlöst problem eller konsten att limma i
havsvatten [www] Hämtat från
28
Sjöfartsverket (2005-03-10). Påväxthindrande system – antifouling. [www]. Hämtat från < http://www.sjofartsverket.se/templates/SFVXPage____935.aspx > 2005-03-22
Sjöfartsverket (2005-03-18). Alternativa antifoulingsystem som finns på svenska markanden [www] Hämtat från
<http://www.sjofartsverket.se/upload/4000/antifouling.pdf> 2005-03-22
E-post:
Berntsson, Kent & Lindgren, Fredrik. Utvärdering av effekterna av nikotin och selenit på
havstulpaners settling i laboratorie-assayer. [E-post] Hämtat från
<birgit.swensson@telia.com> 2005-02-15
Nyberg-Swenson, Birgit. The selenium link – missing link or our understanding of
biochemical trigger reactions? [E-post] Hämtat från
<birgit.swensson@telia.com> 2005-02-15
Nyberg-Swenson, Birgit (2001). Is molecular oxygen, O2, the reactive radical behind
oxidations of (aut)oxidable agents to which the bases of DNA belong [E-post] Hämtat från
<birgit.swensson@telia.com> 2005-02-15 Nyberg-Swenson, Birgit [E-post] Hämtat från <birgit.swensson@telia.com> 2005-04-15 Nyberg-Swenson, Birgit [E-post] Hämtat från <birgit.swensson@telia.com> 2005-05-03 Nyberg-Swenson, Birgit [E-post] Hämtat från <birgit.swensson@telia.com> 2005-05-20
Intervju:
Bilaga A. Reaktion mellan selenproteinet och dopaminet
O2
H2O2 OH2
Se Se
O2
Signalsubstans tex dopamin eller arginin som avger H eller
H eller
e-*e- (exiterad elektron) e-*e- avges till syret som reduceras till eller
(*)
(*) Denna reaktion är inte önskvärd då det är en oxidationsprocess
Protein e- (**)
(**) Reaktionen är inte önskvärd under aktiva faser då den ger en oxidationsprodukt av signalsubstansen som förhindrar en fortsatt elektrontransport.
Bilaga B. Beräkningar
Selenmetionin
M=196,13 g/mol
Evkationer som använts är:
m/(M*n) m=massa (g), M=molekylvikt (g/mol), n=substansmängd (mol) c1*V1= c2*V2 c=koncentration (mol/liter), V=volym (liter)
c=n/V
Beräkningar för stamlösningen 1mM: Beräkning av koncentrationen 1µM:
V=100ml Späddes i 250ml kolv c=1mM c1*V1=c2*V2 c=n/V c1=1,0*10-3 n=1,0*10-3*100*10-3=1,0*10-4 V 1=? m=(M*n)=196,13*1,0*10-4=0,019613 c 2=1,0*10-6 V2=250*10-3 m=19,6mg V1= c2* V2/c1=1,0*10-6*250*10-3/1,0*10-3 V1=0,25ml Uppmätt värde 19,4mg
Sedan gjordes liknande beräkningar för resten av koncentrationerna
Försök 1. I 250ml kolv: 1µM gav V=0,25ml från 1mM 10µM V=2,5ml 1mM 50µM V=12,5ml 1mM 100µM V=25ml 1mM Försök 2 5µM gav V=7,5ml från 10µM 25µM V=11,25ml 50µM 75µM V=7,5ml 100µM 500µM V=7,5ml 1mM
Nitroglycerin
M=227,11 g/mol
Evkationer som använts är: m/(M*n) c1*V1=c2*V2 c=n/V Räkning av stamlösning V=50ml c=1mM
Beräkningar för stamlösningen 1mM: Beräkning av koncentrationen 1µM:
V=50ml Späddes i 250ml kolv c=1mM c1*V1=c2*V2 c=n/V c1=1,0*10-3 n=1,0*10-3*50*10-3=5,0*10-5 V 1=? m=(M*n)=227,11*5,0*10-5=0,01136 c 2=1,0*10-6 V2=250*10-3 m=11,4mg V1= c2* V2/c1=1,0*10-6*250*10-3/1,0*10-3 V1=0,25ml
Då Nitromex 0,5mg användes togs 23 tabletter vilket ger 11,5mg nitroglucerin
Försök 1. I 250ml kolv: 100nM gav V=0,025ml från 1mM 1µM V=0,25ml 1mM 10µM V=2,0ml 1mM 100µM V=20ml 1mM Försök 2 200nM gav V=3,0ml från 1,0µM 500nM V=7,5ml 1,0µM 50µM V=7,5ml 100µM 500µM V=7,5ml 1mM
Selenmetionin + Nitroglycerin
Selenmetionin m=30µg (10,2µM) V=15ml c=50*10-6M n=m/M=30*10-6/196,13 n=1,5296*10-7mol n=c*V V=1,5296*10-7/50*10-6=3,06 V=3,1ml För m=50µg (17µM) V=5,1ml Nitroglycerin m=30µg (8,8µM) V=15ml c=100*10-6M n=m/M=30*10-6/196,13 n=1,3209*10-7mol n=c*V V=1,3209*10-7/50*10-6=1,32 V=1,3ml För m=50µg (14,7µM) V=2,2mlBilaga C, Dat
a, ant
al som settlat i proverna o
ch med
elvärden
Försök 1 3 0/3-05 Substan s/Dro g Konc Antal i provet Antal settlade tis 5/4-05 Antal s ettlade fre 8/4-05 Antal s ettlade mån 11/4-0 5 Kommenta r mån 11/4 -05 Nollp rov 1 18 6 5 4 Nollp rov 2 28 8 12 9 bara n ågo n rev resten i rre v Selenmetionin 1 µM 21 3 5 9hälften irrev + hälften rev
1 µM 15 3 2 2 1 µM 25 5 5 2 1 irrev + 1 rev 10 µM 15 5 3 3 rev 10 µM 20 11 8 8 felst rev någ ra få irrev 10 µM 14 3 3 3 rev 50 µM 20 6 7 5 2 irrev +3 rev 50 µM 28 7 6 6 2 irrev + 4 rev 100 µM 15 5 5 5 1 irrev + 4 rev 100 µM 17 3 3 3 rev Nitrogly cerin 100nM 21 10 9 9 100nM 25 11 14 12 100nM 32 13 13 13 1 åt reste n ej utveckl ade 1 µM 24 11 11 11 många äte r/a ktiva 1 µM 20 9 10 11 inte många ät er 1 µM 21 9 9 9 ej utveckl ade
till att äta
10 µM 22 10 11 12 ingen äte r 10 µM 19 9 10 10 100 µM 25 9 10 12 100 µM 24 14 14 15
Försök 2 3 1/3-05 Substan s/Dro g Konc Antal i provet Antal settlade tis 6/4-05 Antal s ettlade fre 8/4-05 Antal s ettlade mån 11/4-0 5 Nollp rov 1 23 10 12 12 Alla äter Nollp rov 2 20 1 4 3 2 st äter Selenmetionin 5 µM 24 9 6 5 Ingen äter d ock i rrev. 5 µM 19 9 5 2 1 rev + 1 irrev 5 µM 19 12 11 6 1 irrev +re ste n rev 25 µM 16 13 7 6 sitter rev 25 µM 22 14 11 8 rev 75 µM 15 4 en vid botten 3 2 rev 75 µM 18 10 5 4 rev 500 µM 23 4 2 0 500 µM 15 3 2 0 Nitrogly cerin 200nM 27 13 12 13 äter in än 200nM 27 12 12 14 irrev. Nå gra ä ter 200nM 28 13 13 13 500nM 28 11 12 12 500nM 27 12 12 12 irrev 500nM 18 5 många rör sig i skåle n 5 5 irrev 50 µM 16 6 6 8 irrev 50 µM 30 15 15 15 irev 500 µM 22 0 0 0 ser d öda ut 500 µM 15 3 1 1
Försök 3 2 6/4-05 Konc Antal i provet Antal s ettlade mån 2/5-05 Antal s ettlade ons 4/5-05 Kommenta r mån 4/5-05 Substan s/Dro g 17 7 8 Aktiva, långt utveckl ade Nollp rov 1 15 0 0 minsk ad ak tivitet från mån Nollp rov 2 19 0 5 Samma feno men i alla Nollp rov 3 15 0 0 nollprover, ät er do ck ej Nollprov 4 SeMet + n itrogl y. 10,2µM+8,8µ M 15 0 0 I samtliga pro ver se r de ut 15 2 1
att vara döda
16 0 0 16 0 0 SeMet + n itrogl y. 17µM+14,7µ M 15 2 0 Samma hä r a lla ser ut 15 0 0
att vara döda
16 0 0 16 0 0 Irrev=s itter fas t nära/ är tulpan rev=sitter inte hårt utan är f ortfara nde cyprid Äter=fälle r ut arme n (elle
r vad man skall
kalla d en) o ch "ren sar" vat tnet på mat
Bilaga D, Dat
a, p-värden och relativa risken
Försök 1 2005 -04 -05 2005 -04 -08 2005 -04 -11 Drog Ja Nej RR p-v ärde Drog Ja Nej RR p-v ärde Drog Ja Nej RR p-v ärde Kontroll 14 32 Kontroll 17 29 Kontroll 13 33 Se 1uM 11 50 1,688 0,1679 Se 1uM 12 49 1,879 0,0519 Se 1uM 13 48 1,326 0,4961 Se 10uM 19 30 0,7849 0,5182 Se 10uM 14 35 1,293 0,5117 Se 10uM 14 35 0,9891 1 Se 50uM 13 35 1,124 0,8207 Se 50uM 13 35 1,365 0,3777 Se 50uM 11 37 1,233 0,6388 Se 100uM 8 24 1,217 0,7986 Se 100uM 8 24 1,478 0,3281 Se 100uM 8 24 1,13 0,8004 Ni 100 nM 34 44 0,6982 0,1826 Ni 100 nM 36 29 0,6673 0,0821 Ni 100 nM 34 31 0,5403 0,0188 Ni 1uM 29 36 0,6822 0,1671 Ni 1uM 30 35 0,8007 0,4357 Ni 1uM 31 34 0,5926 0,0495 Ni 10uM 19 22 0,6568 0,1839 Ni 10uM 21 20 0,7215 0,2005 Ni 10uM 22 19 0,5267 0,018 Ni 100 uM 23 26 0,6484 0,1404 Ni 100 uM 24 25 0,7545 0,301 Ni 100 uM 27 22 0,5129 0,0123 Försök 2 2005 -04 -06 2005 -04 -08 2005 -04 -11 Drog Ja Nej RR p-v ärde Drog Ja Nej RR p-v ärde Drog Ja Nej RR p-v ärde Kontroll 11 32 Kontroll 16 27 Kontroll 15 28 Se 5uM 30 32 0,5287 0,0251 Se 5uM 22 40 1,049 1 Se 5uM 13 49 1,664 0,123 Se 25uM 27 11 0,36 P<0.000 1 S e 25uM 18 20 0,7855 0,3767 Se 25uM 14 24 0,9468 1 Se 75uM 14 19 0,603 0,1445 Se 75uM 8 13 0,9767 1 Se 75uM 6 15 1,221 0,7783 Se 500uM 7 31 1,389 0,5934 Se 500uM 4 34 3,535 0,0089 Se 500uM 0 38 Oändl/ej def. P<0.000 1 Ni 200 nM 38 44 0,552 0,0334 Ni 200 nM 37 45 0,8246 0,449 Ni 200 nM 40 42 0,7151 0,1842 Ni 500 uM 28 45 0,6669 0,222 Ni 500 uM 29 44 0,9366 0,8452 Ni 500 uM 29 44 0,8781 0,6933 Ni 50uM 21 25 0,5604 0,0763 Ni 50uM 21 25 0,8151 0,5194 Ni 50uM 23 23 0,6977 0,1988 Ni 500 uM 3 34 3,155 0,0741 Ni 500 uM 1 36 13,77 0,0002 Ni 500 uM 1 36 12,91 0,0004 Försök 3 2005 -05 -02 2005 -05 -04 Drog Ja Nej RR p-v ärde Drog Ja Nej RR p-v ärde Ja = De s om har settlat Kontroll 7 59 Kontroll 13 58 Nej = De s om inte s ettlat Se(10,2µM )+Ni(8,8µ M) 2 60 3,288 0,166 Se(10,2µM )+Ni(8,8µ M) 1 61 11,35 0,0015 RR = Rel at iv risk Se(17µM )+Ni (14,7µM ) 2 60 3,288 0,166 Se(17µ M )+Ni (14,7µM ) 2 60 5,676 0,0061
