SÄKERSTÄLLNING AV SÄLLSYNTA DNA-KONTROLLER MED HELGENOMAMPLIFIERING I KLINISKT SYFTE

Examensarbete i biomedicinsk laboratorievetenskap 15 hp Malmö högskola

Biomedicinska analytikerprogrammet Hälsa och samhälle

SÄKERSTÄLLNING AV

SÄLLSYNTA DNA-KONTROLLER

MED HELGENOMAMPLIFIERING I

KLINISKT SYFTE

SÄKERSTÄLLNING AV

SÄLLSYNTA DNA-KONTROLLER

MED HELGENOMAMPLIFIERING I

KLINISKT SYFTE

AMINA HALILOVIC

Halilovic, A. Säkerställning av sällsynta DNA-kontroller med helgenomamplifiering i kliniskt syfte. Examensarbete i biomedicinsk

laboratorievetenskap, 15 högskolepoäng. Malmö högskola: Fakulteten för hälsa och

samhälle, institutionen för biomedicinsk vetenskap, 2015.

Vid klinisk enbaspolymorfi (SNP) analys inkluderas DNA-kontroller med kända genotyper i varje analysomgång för att säkerställa riktigheten vad gäller

analysresultatet. DNA-kontrollerna har en central roll för resultatens trovärdighet vid genotypningen. Vissa kontrollprover som används är av sällsynt genotyp och kan vara mycket svåra att få tag på. Detta arbete har utförts för att undersöka om det går att erhålla DNA-material från sällsynta genotyper med hjälp av

helgenomamplifiering och på så sätt säkerställa en tillgång till dessa. I arbetet testades helgenomamplifiering med hjälp av två olika kit. De

helgenomamplifierade produkternas kvantitet och kvalitet analyserades och jämfördes med det ursprungliga DNA:t, med avsikt att redogöra för det mest fördelaktiga kitet för SNP-analys i kliniskt syfte. Båda helgenomamplifierings-kiten påvisade god förmåga att amplifiera genomiskt DNA med hög kvalité. Helgenomamplifierat DNA från det bästa kitet sekvenserades och här var skillnader mellan ursprungligt och helgenomamplifierat DNA marginella. Vid sekvensanalys av ett 464 baspar långt fragment av faktor II genen och 585 baspar långt fragment av ApoE genen på fem helgenomamplifierade DNA-prover påvisades endast en eventuell diskrepans.

Nyckelord: DNA-kontroll, enbaspolymorfi, genotypning, helgenomamplifiering,

SECURING RARE

DNA-CONTROLS WITH WHOLE

GENOME AMPLIFICATION IN

CLINICAL PURPOSE

AMINA HALILOVIC

Halilovic, A. Securing rare DNA-controls with whole genome amplification in clinical purpose. Degree project in Biomedical Laboratory Science, 15 credit

points. Malmö University: Faculty of Health and Society, Department of

Biomedical Science, 2015.

Clinical single nucleotide polymorphisms (SNP) analysis includes DNA controls with known genotypes in each run to ensure the accuracy of the analysis results. DNA controls have a central role for the credibility of the results in the

genotyping process. Some of the used control samples are rare and can be very difficult to obtain. This work was carried out to investigate whether it is possible to obtain DNA from samples with a rare genotype using whole genome

amplification and as a result ensure access to these samples. In this work the whole genome amplification method was tested by two different kits. The quantity and quality of the whole genome amplification products were analyzed and

compared with the original DNA, with the intention to describe the most

advantageous kit for clinical SNP analysis. Both tested kits demonstrated a good ability to amplify genomic DNA with high quality. Whole genome amplified DNA from the best kit was sequenced and the difference between the original DNA and whole genome amplified DNA was negligible. Sequence analysis of 464 base pairs of the factor II gene and 585 base pairs of the ApoE gene in five whole genome amplified DNA samples indicated only one possible discrepancy.

Keywords: DNA controls, single nucleotide polymorphism, genotyping, whole

FÖRORD

Jag skulle vilja först och främst tacka min handledare legitimerad biomedicinsk analytiker och PhD Ewa Lavant på DNA-laboratoriet vid avdelningen klinisk kemi i Malmö för professionell handledning och stöd till examensarbete. Jag vill dessutom rikta ett stort tack till Labmedicin Skåne på Universitetssjukhuset SUS i Malmö och enhetschefen Margareta Svensson för att jag fick tillstånd att använda lokaler och material till mitt projekt. Ett stort tack riktas på samma sätt till all personal som arbetar på DNA-laboratoriet i Malmö för deras stöd och

uppmuntran. Sist men inte minst riktas ett tack till alla som har läst och bidragit med åsikter längs skrivresans gång.

INNEHÅLLSFÖRTECKNING

FÖRORD 3

BAKGRUND 5

Helgenomamplifiering (WGA) 5 Multiple displacement amplification (MDA) 6

Syfte 7

METOD 7

DNA amplifiering med WGA 8 Koncentrationsbestämning med PicoGreen 8 Agarosgelelektrofores 9

SNP-analys 9

Sangersekvensering 10 Etisk bedömning 11

RESULTAT 11

Kvantitativ analys av WGA DNA-prov 11 Analys av WGA DNA-provernas fragmentstorlekar 12 Kvalitativ analys av WGA DNA-prov 13

DISKUSSION 14

Metoddiskussion 14 Resultatdiskussion 16

KONKLUSION 18

BAKGRUND

För att kunna utföra en DNA-analys krävs det en tillräcklig mängd av DNA. Ett problem som ofta uppstår när DNA-analyser utförs är att utgångsmaterialet är begränsat. Begränsad tillgång till DNA skapar hinder för bland annat forskning, forensisk medicin och klinisk diagnostik, eftersom molekylärbiologiska analyser blir allt vanligare. Många genomanalyser och detektionsanalyser kräver

genomiskt DNA (gDNA) i mikrogram (µg) [1]. Dessutom kan otillräckligt med DNA-templat leda till att flertal önskade analyser inte går att genomföras på ett prov, vilket innebär att det blir kostnadsineffektivt. För att kunna lösa detta problem används vanligtvis DNA amplifiering, varvid DNA:t kopieras och det skapas en tillräcklig stor mängd DNA för analys. Det största problemet är inte att skapa den kvantitativa mängden DNA, utan att få mängden DNA rent och av hög kvalité. Därför har helgenomamplifiering (WGA) utvecklats [1-2].

Idag finns det flera analyser tillgängliga med hög kapacitet för detektion av enbaspolymorfim (SNP) [3]. Med hjälp av SNP-analyser kan små variationer i genomet på en bas upptäckas. Dessa variationer kan vara gemensamt för vissa syndrom eller sjukdomar som på så sätt kan identifieras [3-4]. SNP-analyser utförs vid DNA-laboratoriet, klinisk kemi i Malmö och kontroll-DNA med känd genotyp inkluderas i varje analysomgång för att säkerställa riktigheten vad gäller analysresultatet. SNP-analyser i rutinarbete för medicinsk diagnostik på

patientprover utförs endast en gång, om kontrollen håller sig inom referensområdet. Därför spelar kontrollen en central roll för resultatens

trovärdighet. Vissa kontrollprover som används är av sällsynt genotyp som till exempel faktor II c.20210 A/A med en frekvens på 0,02 % i Europa och

Apolipoprotein E (ApoE) E2/E2 med en frekvens på 1 % i Sverige, och kan vara mycket svåra att få tag på [5-6]. Det är därför önskvärt att kunna amplifiera upp gDNA från dessa genotyper så att tillgången på kontrollmaterial säkerställs. Detta kan göras med hjälp av WGA.

Helgenomamplifiering (WGA)

Intresset har ökat under de senaste 20 åren och många studier har utförts med målet att kunna säkerställa tillgången av gDNA [1,7-13]. Flera olika sorters WGA-metoder har utvecklats i form av kit från olika tillverkare varav alla medför fördelar och begränsningar. För många företag är det en utmaning att skapa det mest omfattande WGA-kitet på marknaden, eftersom det kräver tillförlitlig amplifiering av tre billioner baser utan nedbrytning, förändring eller förlust av locus eller alleler [7]. Till skillnad från polymerase chain reaction (PCR) som riktar sig mot amplifiering av specifika sekvenser, är syftet med WGA att amplifiera hela genomet med minimal amplifieringsförlust. WGA skapar

möjligheten att amplifiera 1-80 µg gDNA in vitro från endast 1-10 celler [3,7-8]. Det kvantitativa utbytet samt längden på den amplifierade DNA-produkten skiljer mellan de olika WGA-metoderna (Tabell 1) [8].

De första WGA-metoderna var ursprungligen baserade på PCR med Taq-polymeras. Två exempel på PCR-baserade WGA-metoder är degenerate

oligonucleotide-primed PCR (DOP-PCR) och primer extension preamplification PCR (PEP-PCR). PEP-PCR och DOP-PCR använder degenererade och

slumpmässiga oligonukleotidprimers för att amplifiera gDNA innan körning av PCR. Fördelen med dessa metoder är att de ska kunna amplifiera

mikrogramkvantiteter av DNA från enstaka celler [3,7-8]. En nackdel med PCR-baserade WGA-metoder är att det amplifierade DNA:t består av en hög nivå av diskrepanser, i genomsnitt med en felfrekvens på 3 x 10-5 (Tabell 1). Sannolikt beror den höga nivån av diskrepanser på att Taq-polymeraset saknar 3'-5'

korrekturläsningsaktivitet [8]. På grund av den låga aktiviteten och specificiteten hos Taq-polymeras är även amplifieringen hos dessa metoder väldigt

oregelbunden. Vissa regioner av genomet kan som följd av detta bli

överrepresenterade och andra är underrepresenterade. PCR-baserade WGA-metoder kan därför ge ofullständig täckning av locus och vara olämpliga för SNP-analys i kliniskt syfte [3]. En annan nackdel är att PCR-baserade WGA-metoders amplifierade DNA endast fungerar på genotypning från PCR-reaktioner av korta regioner [7-8]. På senare tid har isotermiska amplifieringsmetoder utvecklats, som till exempel multiple displacement amplification (MDA), och i hög grad ersatt de PCR-baserade WGA-metoderna [9].

Tabell 1. Jämförelse av tre olika helgenomamplifierade metoders karaktäristiska egenskaper [8].

Metod MDA PEP DOP

DNA utbyte/100 µl reaktion 80 µg 40 ng 1-6 µg Valbar skala av reaktionsvolym Ja Nej Nej DNA produktlängd (baspar) 2000-≥100 000 100-1000 100-1000 DNA polymeras felfrekvens <3 x 10-6 3 x 10-4 – 1 x 10-5 3 x 10-4

Multiple displacement amplification (MDA)

MDA är inte baserad på PCR och är den första verkliga WGA-metoden med bäst genomisk täckning och minimal förlust av alleler [3,8]. MDA kan amplifiera det mänskliga genomet direkt från biologiska prover inklusive ifrån spermie [14], helblod och enskilda celler [9,12]. Amplifiering kan ske utan krav på DNA-rening [12]. MDA-tekniken använder sig av DNA-polymeraset från Φ29-bakteriofagen som amplifierar DNA vid en konstant temperatur på 30°C. Bakteriofagen Φ29 innehåller ett genom på 19 285 baspar (bp) och härstammar från bakterien

Bacillus subtilis. Hos Φ29 bakteriofagen kodar gen 2 för DNA-polymeraset som

skapar multienzymatiska aktiviteter och som används vid genomreplikationen [1,7]. MDA-amplifieringen sker genom att annealing utförs av slumpmässiga hexamer primers som riktas mot hela genomet. Därefter syntetiseras nytt DNA utefter primerna av Φ29 DNA-polymeraset och tidigare förlängda produkter förskjuts. Förskjutna DNA-strängar fungerar sedan som mallar för nya primers, vilket leder till primerförlängning i den motsatta riktningen. Till följd av att MDA-reaktionen fortsätter, förskjuts nya DNA-strängar och nya mallar bildas, som i sin tur bildar en hyperförgrenad struktur. Denna mekanism kallas

”hyperförgrenings mekanism” och resulterar i ett stort antal kopior av det ursprungliga DNA:t (Figur 1) [7-8].

Figur 1. Illustration av principen för multiple displacement amplification (MDA). MDA grundar sig påΦ29 DNA-polymeraset strängförskjutningsaktivitet som hålls igång av en

”hyperförgrenings mekanism” varvid exponentiell amplifiering av önskat DNA-templat uppnås. Resultatet av denna reaktion blir ett högt utbyte av DNA [1,3,7–8].

MDA har många fördelar jämfört med PCR-baserade WGA-metoder, bland annat på grund av den extremt höga processiviteten hos polymeraset, polymerasets starka strängförskjutningsaktivitet och 3'-5' korrekturläsningsaktivitet [1,3,7]. Φ29-polymeraset har en 3'-5' korrekturläsningsaktivitet som i genomsnitt tillför 70000 nukleotider varje gång polymeraset binder till en primer [3]. DNA-polymerasets mycket höga processivitet leder till dess förmåga att skapa långa WGA-produkter med hjälp av MDA. Enligt tidigare studie ligger längden på WGA-DNA med hjälp av MDA mellan 2000 – 100000 bp jämfört med PCR-baserade WGA-metoder vars produkter ligger mellan 100 – 1000 bp, men är i genomsnitt kortare fragment (<400 bp), se tabell 1 [8]. I många tillämpningar är det en fördel med långa DNA-produkter, inklusive vid DNA-sekvensering i kliniskt ändamål. En annan fördel som MDA har framför PCR-baserade WGA-metoder är att processiviteten även är bättre inom guanin-cytosin (GC)-rika regioner. 3'-5 'korrekturläsningsaktiviteten möjliggör även för enzymet att kopiera över samma mall flera gånger, men parallellt också utvidga för nya primers, vilket leder till stark strängförskjutningsaktivitet [1,3,7]. Denna egenskap medför mindre amplifieringsförlust och högre pålitlighet än med metoder där Taq-polymeras används, vilket resulterar i en lägre nivå av diskrepanser med <3 x 10-6 felfrekvens (Tabell 1) [8]. I tidigare studier beskrivs även att 1 SNP

genotypingsfel per 1000 analyser har indikerats, då högkvalitativt DNA använts som mall för WGA [1,3,15]. För genotypning är noggrannheten mycket viktig eftersom det bekräftar en tillförlitlig representation av alleler. Tidigare studier visar att korrelationen i SNP-analyser mellan oamplifierat stam-DNA och WGA-DNA med MDA är högre än 98 % [15-18]. Flera studier antyder att i jämförelser med PCR-baserade WGA-metoder är MDA den mest tillförlitliga metoden för genotypning, inklusive för SNP-analys [1,3,7-8,12,15-23]. De två mest

användbara MDA-kiten enligt tidigare studier är GenomiPhi (GE Healthcare Life Sciences) och Repli-g (Qiagen) [1,3,10-11,15,21-22]. I detta arbete verifierades om det går att säkerställa DNA-kontrollprover ifrån sällsynta genotyper genom in

vitro amplifiering med hjälp av baserad WGA. Hypotetiskt bör

MDA-tekniken vara lämplig för att säkerställa sällsynta DNA-kontroller för SNP-analys. Om antagandet visar sig vara korrekt ställs frågeställningen: vilket kit, Replig-g från Qiagen eller GenomiPhi från GE Healthcare Life Sciences, erbjuder den mest optimala MDA-baserade WGA för att garantera tillförlitligt referensprov vid SNP-analys i kliniskt syfte?

Syfte

Syftet var att undersöka två MDA-baserade WGA-kit och försöka implementera det mest fördelaktiga kitet för att säkerställa sällsynta DNA-kontroller i SNP-analys i det kliniska arbetet på DNA-laboratoriet i Malmö.

METOD

Fem avidentifierade DNA-prov som tidigare använts med framgång till SNP-analys valdes ut till WGA-försöken. DNA hade tidigare extraherats från EDTA-blod med Agencourt Genfind v2 (Beckman Coulter, USA) med hjälp av en Biomek FXP pipetteringsrobot (Beckman Coulter, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Initialt testades två olika kit för MDA-baserad

helgenomamplifiering: Repli-g från Qiagen och GenomiPhi från GE Healthcare Lifescience. Kvantiteten på erhållet WGA-amplifierat material mättes med

PicoGreen och koncentration av amplifierat DNA utvärderades. För att få en visuell bild av WGA DNA-fragmentens längd genomfördes agarosgelelektrofores. Dessutom kontrollerades kvalitén på helgenomamplifierade DNA-prover med SNP- och sekvenseringsanalys.

DNA amplifiering med WGA

Helgenomamplifieringen utfördes med hjälp av kiten Repli-g ® minikit (Qiagen, Tyskland) och Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kits (GE Healthcare Life Sciences, Storbritannien) enligt tillverkarenas instruktioner med 10 ng DNA som startmaterial för WGA-reaktionen. Sedan upprepades

helgenomamplifieringen med 1 ng input för att testa kitens förmåga att amplifiera DNA från en liten mängd start-DNA och 100 ng DNA input med Replig-g kitet respektive stam-DNA input med GenomiPhi kitet för att kontrollera funktionen vid en stor mängd DNA input. Då endast 1 µl DNA tillsätts vid

WGA-amplifiering med GenomiPhi kunde inte mängder på 100 ng erhållas utan stam-DNA användes istället som maximal mängd. Prov 5 amplifierades med

GenomiPhi 1 ng input på samma sätt under två olika tillfällen för att testa om metoden är robust. Den andra amplifieringen av prov 5 fick namnet ”prov 5 extra”. Före amplifiering mättes även koncentrationen på samtliga provspädningar vid 1 ng DNA input med en nanodrop 2000c spektrofotometer (Thermo Scientific, USA).

Repli-g minikit

I Repli-g kitet utnyttjades kemisk denaturering av DNA med tillsats av

denaturerings-buffert som fick verka i 3 minuter i rumstemperatur. Vid tillsats av neutraliseringsbuffert stoppades denatureringen. Färdigblandad mastermix från Repli-g kitet innehållande reaktionsbuffert och Φ29 DNA-polymeras tillfördes till DNA-proverna som inkuberades vid 30°C över natt (ca 16 timmar).

Amplifieringsreaktionen stoppades därefter genom inaktivering av Φ29 DNA-polymeraset vid 65°C i 3 minuter.

GenomiPhi

Provbuffert blandades med DNA-proverna. I GenomiPhi kitet utnyttjades temperaturdenaturering genom att DNA-proverna värmdes upp till 95°C i 3 minuter. Proven kyldes sedan ned till 4°C. Färdigblandad mastermix från GenomiPhi kitet innehållande reaktionsbuffert och enzymmix med Φ29 DNA-polymeras tillfördes till DNA-proverna som amplifierades i 1,5 timme vid 30°C. Amplifieringsreaktionen stoppades genom inaktivering av Φ29 DNA-polymeraset vid 65°C i 10 minuter.

Koncentrationsbestämning med PicoGreen

Samtliga WGA DNA-prov koncentrationbestämdes med hjälp av PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular Probes, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Kortfattat blandades WGA DNA-prover med 1 x triss-EDTA (TE) buffert och PicoGreen som binder till dubbelsträngat DNA och framkallar fluorescens. Fluorescensen mättes med DTX 880 (Beckman Coulter Inc, USA) vid 520 nm. Med hjälp av linjär regressionsanalys från en standardkurva beräknades koncentrationen av amplifierat gDNA.

Agarosgelelektrofores

Ursprungliga oamplifierade DNA-prover och WGA DNA-prover från Repli-g 10 ng input, GenomiPhi 10 ng input, GenomiPhi 1 ng input samt storleksmarkörerna GeneRuler™ 100 bp Plus DNA ladder (Thermo Scientific, USA) och

O’RangeRuler 200 bp DNA ladder (Thermo Scientific, USA) separerades på 1 %-ig agarosgel (SeaKem® LE Agarose, USA). Gelen färgades med GelRedTM (Biotium, USA) och separation av DNA-fragmenten utfördes vid 90 V under 60 min. Efter avslutad elektrofores visualiserades DNA-fragmenten med hjälp av UV-ljus och gelen fotograferades med gelkamera (GenoSmart, VWR, USA).

SNP-analys

Samtliga WGA DNA-prov och oamplifierade stam-DNA-prov späddes till 1 ng/µl i DNase fritt vatten. Tre olika SNP-analyser utfördes på proverna med hjälp av TaqMan kemin: FII c.20210 G>A (rs1799963), ApoE C112R (rs429358) och ApoE R158C (rs7412) enligt tillverkarens instruktioner. För varje SNP-analys inkluderades fyra kontroller: en homozygot vildtyp, en heterozygot, en

homozygot muterad och en non-template kontroll.

Faktor II

Genotypning av FII c.20210 G>A utfördes genom att en reaktionsblandning bestående av TaqMan MasterMix (Applied Biosytems, USA) innehållande buffert, dNTP, Ampli Taq Gold® DNA-polymeras Ultra Pure samt ROX™ blandades med FII Assay Mix 40X (Applied Biosytems, USA). FII Assay Mix innehöll Forward primer 5’- TGT GTT TCT AAA ACT ATG GTT CCC AAT-3’, Reverse primer 5’- GAG AGC TGC CCA TGA ATA GCA -3’, Reporter 1 5’- VIC-TCA GCG AGC CTC AA-MGB-3’och Reporter 2 5’- 6-FAM-CTC AGC AAG CCT C-MGB-3’. I en MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied Biosytems, USA) tillsattes 10 µl reaktionsblandning och 10 µl av respektive spätt DNA-prov.

ApoE

Genotypning av ApoE C112R och ApoE R158C utfördes på samma sätt som faktor II c.20210 G>A med undantaget att Assay Mixen (C___3084793_20 respektive C____904973_10, Applied Biosystems, USA) är fördesignad av företaget och primer och reportersekvenserna okända.

PCR amplifiering

Med PCR-teknik amplifierades delar av de specifika generna som analyserades från gDNA. PCR-reaktionen utfördes med PCR-apparaten ABI Gene Amp 9700 (Applied Biosystems, USA) med följande PCR program: Taq aktivering vid 95C i 10 minuter, efterföljt av 40 cykler med denaturering 95C i 15 sekunder och annealing och därtill även extension vid 60C i 1 minut. Under PCR-reaktionen hybridiserar fluorescensmärkta allelspecifika prober med sina specifika produkter och allelspecifik fluorescens utvecklas.

Genotypning

Fluorescensen i PCR-produkterna mättes i instrumentet AB 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA). Resultat presenterades i form av ett scatterdiagram, där varje punkt motsvarar ett prov med ett visst X- och Y- värde. Genom detta påvisades genotyp för de olika proverna med 95 % säkerhet. Prover med samma genotyp hade närliggande X/Y kvoter och bildade cluster.

Sangersekvensering

Sangersekvensering utfördes med sekvenseringskiten BigDye®Direct Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) på ursprungligt, oamplifierat DNA-prov och WGA DNA-DNA-prov med GenomiPhi kit med 1 ng DNA input. Dessutom utfördes sangersekvensering på prov 5 extra och ytterligare en gång på WGA prov 5. Ett 464 bp långt fragment av FII 3´UTR respektive 585 bp långt fragment av delar av ApoE exon 4 sekvenserades.

Primär PCR

Primär PCR-reaktion genomfördes enligt ordinarie protokoll från tillverkaren (BigDye®Direct Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) med undantag att inget sterilt vatten tillfördes till reaktionsmixen och 3,5 µl 1 ng/µl DNA

tillsattes till reaktionsmixen. Reaktionsmixen bestod av färdigblandad BigDye® Direct PCR Master Mix och M13-tailede PCR-primermix enligt Tabell 2 (DNA technology, Danmark). Primär PCR reaktion utfördes med PCR-apparaten ABI Gene Amp 9700 från Applied Biosystems med följande PCR program för

amplifiering av FII: 96C i 5 minuter, följt av 35 cykler med 94C i 30 sekunder, 62C i 45 sekunder, 68C i 45 sekunder och 72C i 2 minuter. ApoE

amplifierades på samma sätt med undantaget att denatureringstemperaturen ändrades till 96C istället för 94C på grund av det höga innehållet av guanin och cytosin i området. Under primär PCR amplifierades delar av den specifika genen ifrån genomiskt DNA med genspecifika M13-tailade primers.

Tabell 2. Primers som använts för sekvensering.

Primermix Primernamn Sekvens 5´-3´

FII FII_F tgtaaaacgacggccagtGCATCGTCTCATGGGGTGAA FII_R caggaaacagctatgaccTGGCCCTGCTCTGAAGATAG ApoE APOE_F tgtaaaacgacggccagtCTCTTGGGTCTCTCTGGCTCAT

APOE_R caggaaacagctatgaccCTGCCCATCTCCTCCATCCG M13-forward tail: tgtaaaacgacggccagt, M13-reverse tail: caggaaacagctatgacc

Sekvens PCR

Sekvenserings PCR utfördes med sekvenseringskitetBig Dye® Direct Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) enligt tillverkarens instruktioner med undantaget att hälften så mycket BigDye® Direct Sequencing Master Mix (1 µl per prov istället för 2 µl) blandades med 1 µl DNase fritt vatten per prov istället. Till denna mix tillsattes BigDye® Direct M13 Forward Primer respektive Reverse Primer. Sekvenseringsmixen tillsattes till primär PCR produkterna och sekvens PCR utfördes på PCR-apparaten ABI Gene Amp 9700 (Applied Biosystems, USA) med följande PCR program: 37C i 15 minuter, 80C i 2 minuter, 96C i 1 minut, följt av 25 cykler med 96C i 10 sekunder, 50C i 5 sekunder och 60C i 4 minuter.

Rening av sekvens PCR produkter

Sekvens PCR produkterna späddes 1:2 med DNase fritt vatten och renades med Big Dye® XTerminatorTM Purification Kit (Applied Biosystems, USA) enligt tillverkarens instruktioner för att bli av med eventuella saltjoner och oönskade orenheter. Spädda sekvens PCR produkter blandades med SAM solution och BigDye XTerminator solution i en MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied Biosystems, USA). PCR plattan vortexades kraftigt i 10 min på

en plattskak och sekvensprodukterna centrifugerades därefter ned innan vidare analys.

Kapillärelektrofores

Producerade sekvens PCR produkter analyserades med kapillärelektrofores i ABI 3500xL (Applied Biosystems, USA). Genom elektrokinetisk injektion tillfördes enkelsträngade DNA-fragment på kapillären. Injektionen på kolonnen utfördes vid 1,6 kV under 5 sekunder. Separationen skedde vid 19,5 kV under 1400 sekunder i en POP7- polymer.

Analys av DNA sekvens

Sekvensdata analyserades med programvaran SeqScape v2.5 (Applied Biosystems, USA). WGA provernas sekvens jämfördes med

DNA-sekvenser ifrån ursprungsproven och mot referensDNA-sekvenser från NCBI-databasen för ApoE (NG_007084.2) och faktor II (NG_008953.1).

Etisk bedömning

Ingen etisk prövning ansöktes eftersom analyserna utfördes på avidentifierat DNA. Inga personuppgifter hanterades och proverna kan därför heller inte på något sätt kopplas till specifika personer.

RESULTAT

Med anknytning till de metoder som användes presenteras erhållna resultat.

Kvantitativ analys av WGA DNA-prov

Vid amplifiering enligt tillverkarens rekommendationer med 10 ng DNA input lyckades båda kiten producera en adekvat amplifieringsmängd. Jämfört med GenomiPhi erhölls genomsnittligt en lägre koncentration gDNA med Replig-g men den totala mängden amplifierat DNA var högre då en större volym WGA-material erhölls (Tabell 3). Med GenomiPhi gick det att amplifiera DNA från alla tre utvalda DNA-mängderna medan Repli-g kitet fungerade bäst med tillverkarens rekommendation på 10 ng DNA input. Vid 100 ng DNA input fungerade

amplifieringen med stor variation och vid 1 ng fungerade amplifieringen dåligt eftersom WGA-amplifieringen uteblev för flera prov. Vad gäller

amplifieringsökning gav GenomiPhi kitet med 1 ng input upphov till bäst resultat då 1 ng input i genomsnitt genererade 4800 ng DNA output. För att kontrollera att proverna spätts rätt mättes koncentrationerna på samtliga provspädningar vid 1 ng DNA input före amplifiering. Resultatet ifrån mätningen bekräftade att

provspädningarna var korrekta. Dessutom gav replikationsförsöket med GenomiPhi 1 ng DNA input på ”prov 5 extra” en koncentration på 350 ng/µl.

Tabell 3. Amplifierad mängd DNA (ng/µl) i fem prover från två olika kit som utgår ifrån tre olika DNA-inputmängder.

Analys av WGA DNA-provernas fragmentstorlekar

Samtliga fragment på agarosgelen hade en storlek över 3000 bp (Figur 2).

Figur 2. Erhållna resultat vid agarosgelelektrofores av helgenomamplifierade DNA-prov och oamplifierade stam-DNA-prov. I ordning från vänster till höger: brunn 1,23 = Storleksmarkör GeneRuler, 2 = Storleksmarkör O’RangeRuler, brunn 3,5,7,9,11 = stam-DNA för prov 1-5, brunn 4,6,8,10,12 = Repli-g 10 ng för prov 1-5, brunn 13,15,17,19,21 = GenomiPhi 10 ng för prov 1-5, brunn 14,16,18,20,22 = GenomiPhi 1ng för prov 1-5, brunn 24 = GenomiPhi 1 ng för ”prov 5 extra”. bp motsvarar ordet ”baspar”.

DNA (ng/µl) Prov Ursprungs-DNA GenomiPhi Repli-g 1 ng 10 ng Stam- DNA 1 ng 10 ng 100 ng 1 41,0 215 156 217 37 147 191 2 31,4 240 221 259 0 158 176 3 27,9 240 272 266 0 158 184 4 21,1 248 237 420 0 105 174 5 26,4 257 228 402 3 127 61 Utbyte (ng/µl) Medelvärde 240 223 313 8 139 157 Standardavvikelse 16 43 93 16 23 54 Medelvärde av amplifieringsökning (x) 4800 400 200 400 700 80

Kvalitativ analys av WGA DNA-prov

Resultaten vid SNP-analys av ApoE C112R, ApoE R158C och faktor II c.20210 G>A gav samstämmigt resultat för alla prov och WGA-amplifieringar med

undantag för prov 2, 3 och 4 (visas som kryss i Figur 3) där 1 ng DNA använts till WGA-reaktionen med Repli-g där inget resultat erhölls alls (Tabell 4). Alla genotyper kunde framkallas automatiskt med mjukvaran med 95 % säkerhet med undantag för ApoE C112R analysen där genotyperna fick framkallas manuellt. Med undantag för två prov (prov 2 och 5 där 1 ng DNA använts, visas med grå nyans i Figur 3) kunde GenomiPhi proverna framkallas automatiskt då de

analyserades separat för samma SNP, emellertid kunde inte samma sak upprepas för Repli-g proverna. Scatterdiagram för ApoE C112R finns presenterat i Figur 3.

Tabell 4. Enbaspolymorfi resultat vid analys med TaqMan allelic discrimination på ABI 7900HT.

Prov FII 20210 GA ApoE C112R ApoE R158C

1 both ApoE 112 C APOE 158 R

2 A/A* ApoE 112 C* both*

3 G/G* both* APOE 158 R*

4 G/G* both* both*

5 G/G both APOE 158 R

*resultat saknas för Replig-g WGA med 1 ng DNA.

Figur 3. Resultat vid analys av ApoE C112R där Replig-g prover är markerade i mörk grön och mörk blå nyans, GenomiPhi prover är markerade med ljus blå och ljus grön nyans och de

ursprungliga, oamplifierade proverna är utmärkta med provnummer. I SNP-analysen inkluderades fyra kontroller: en homozygot vildtyp (C/C), en heterozygot (C/R), en homozygot muterad (R/R) och en non-template kontroll (svart kvadrat).

Vid sekvensering av ett 464 bp långt fragment av 3´UTR av FII och ett 585 bp långt fragment av delar av exon 4 av ApoE identifierades inga ytterligare polymorfier förutom de redan analyserade SNP:arna. Sekvensdata från FII gav överensstämmande resultat mellan WGA-proven GenomiPhi 1 ng DNA input och ursprungsproven. Sekvensdata från ApoE uppvisade däremot ett diskrepant resultat mellan ursprungs-DNA prov 5 och WGA-amplifierat prov 5 vid position c.388, vilket motsvarar den analyserade ApoE C112R SNP:en. Figur 4 visar att DNA-sekvensen ifrån ursprungsprovet uppvisar ett heterozygot (T/C) resultat i position c.388, medan det WGA-amplifierade provet gav ett homozygot (C/C) resultat i samma position. Detta resultat är även diskrepant mot TaqMan SNP-analysen där ett heterozygot resultat erhölls för samma WGA-prov. Däremot noterades i scatterplotten (Figur 3) att resultatet drar något mot ett homozygot (C/C) resultat. Vid upprepad sekvensering av WGA-prov 5 blev resultatet återigen homozygot (C/C) i samma position medan ”prov 5 extra” uppvisade ett

heterozygot (T/C) resultat i denna position.

Figur 4. Diskrepant resultat mellan ordinarie prov 5 och helgenomamplifierat prov 5 i position c.388 vid sekvensering av ett 584 baspar långt fragment av ApoE genen.

DISKUSSION

I detta arbete verifierades om det går att säkerställa DNA-kontrollprover ifrån sällsynta genotyper genom in vitro amplifiering med hjälp av MDA-baserad WGA. Det övergripande syftet var undersöka två MDA-baserade WGA-kit och försöka implementera det mest fördelaktiga kitet för att säkerställa sällsynta DNA-kontroller i SNP-analys i det kliniska arbetet på DNA-laboratoriet i Malmö.

Metoddiskussion

I en tidigare studie jämfördes amplifieringsutbytet mellan PCR-baserade (iPEP och DOP) och MDA-baserade WGA-metoder (GenomiPhi och Repli-g) som visade att MDA-metoder producerar avsevärt mer DNA [22]. En annan studie har visat att cirka 80 µg amplifierat DNA kan erhållas från en 100 µl reaktionsvolym med hjälp av MDA [8]. MDA amplifierade DNA-prover har även visat sig kunna bildas i nanoliter reaktionsvolym [24-25]. Eftersom MDA dessutom inte kräver temperaturcykling utan utförs vid en konstant temperatur på 30°C kan metoden enkelt utföras i ett värmebad eller på en värmeplatta. Sammanfattningsvis kan

MDA enkelt användas som en preparativ metod och skalas upp eller ned till önskad volym efter önskad mängd amplifierat DNA [7-8].

MDA-reaktionens utbyte är mindre beroende av mängden DNA-input. Reaktionen är istället självbegränsande och utbytet beror på reaktionsförhållandena,

reagensmängd och reaktionsvolym [7]. Under sådana förhållanden kommer de varierande DNA-koncentrationer i de ursprungliga proven att nå ett konstant läge under MDA-reaktionen. Detta är ytterligare en fördel för MDA om det tillämpas i storskalig genotypning exempelvis i genomstudier. En genomstudie där 2320 SNP:ar utfördes på MDA-amplifierat DNA och ursprungligt gDNA visade ingen signifikant skillnad mellan ursprungligt gDNA och MDA-amplifierat DNA och överensstämmande genotyper erhölls [8].

Kapaciteten hos MDA är emellertid beroende av kvalitén på input-DNA. Degraderade prover har färre bindningsställen för primers per DNA-molekyl, vilket försämrar sannolikheten för initiering av replikation. Följden av detta blir att degraderat DNA-templat genomgår färre hyperförgreningsreaktioner. Med avseende på detta utnyttjas polymerasets höga processivitet inte optimalt hos MDA-reaktionen. I konsekvens av det sänks även det kvantitativa utbytet av DNA mängden. Detta begränsar inte MDA-teknikens möjlighet för tillämpning inom kliniska ändamål på grund av att DNA-proverna oftast är av god kvalité och inte degraderade [7].

Även om GenomiPhi och Repli-g bygger på MDA och använder sig av samma Φ29-polymeras finns det skillnader mellan kiten [3]. Förutom eventuella

skillnader i buffersammansättning är den huvudsakliga kända skillnaden att kiten utnyttjar olika sorters DNA denaturering före amplifiering. Repli-g använder kemisk denaturering medan GenomiPhi använder temperaturdenaturering. En tidigare studie visar att kvaliteten på sangersekvensdata från MDA-baserade WGA-prover förbättrades efter kemisk denaturering och förlusten av alleler ökade efter temperaturdenaturering i ett GC-rikt genom [22]. För att skapa WGA DNA enligt tillverkarens instruktioner var GenomiPhi kitet mer gynnsamt eftersom 1 µl av DNA-templat behövdes för att få önskad mängd och koncentration medan Repli-g krävde 5 µl DNA-templat. Genom att använda en så liten DNA-volym som möjligt går det att framställa WGA-prov flera gånger om. Även en

observation gällande hur problematisk provupparbetningen var under användning av kiten utfördes. Resultatet blev att Repli-g hade varit att föredra eftersom det var enklare att arbeta med än GenomiPhi på grund av färre olika

temperatur-inkuberingar och därmed blir det en mindre omfattande provupparbetning. Emellertid var processen mer tidskrävande för Repli-g (cirka 16 timmar varav cirka 40 minuters praktiskt handarbete) än GenomiPhi (cirka 2 timmar varav cirka 20 minuter handarbete). GenomiPhi (1600 kr per kit) var även mer ekonomiskt fördelaktigt än Repli-g (2000 kr per kit).

För att kontrollera WGA-provernas kvantitet och kvalitet utfördes laborativa moment såsom koncentrationsmätning med PicoGreen, SNP-analys,

sangersekvensering och agarosgelelektrofores. DNA kvantifiering kan utföras med flera olika metoder, där den mest vanligt förekomande är spektrofotometrisk mätning vid 260 nm. I detta arbete användes PicoGreen för kvantifiering av WGA DNA-prover. PicoGreen är en känsligare metod för koncentrationsbestämning av DNA än absorbans och ger ett tillförlitligare resultat då endast dubbelsträngat DNA mäts medan icke-inbundna primers som använts i WGA-reaktionen inte

registreras. Emellertid är PicoGreen en dyrare metod som kräver mer provupparbetning [26].

Flera tidigare studier har undersökt WGA-produkter med SNP-analys [18-19]. Med hjälp av SNP-analys kan endast enstaka basparsförändringar upptäckas och eftersom SNP-analys endast granskar en bråkdel av ett givet genom, finns det risk att missa eventuella amplifieringsförluster [22]. På grund av detta användes även sangersekvensering för att kunna undersöka en större del av det

helgenomampliferade DNA:t. Vid både SNP-analys och sangersekvensering jämfördes WGA DNA-prover med stam-DNA ifrån ursprungsproven för kvalitetsäkring. Idealt bör WGA-proven och stam-DNA ifrån ursprungsproven vara identiska för optimal kvalité på MDA-kiten. Agarosgelelektrofores utfördes för att få en visuell överblick om WGA-proven består av långa eller korta DNA-fragment. Långa fragment är en indikation på bättre kvalité på

helgenomamplifieringen och dessutom kan långa fragment tillämpas i flertal önskade analyser exempelvis sekvensering [16]. Även om MDA-baserade WGA-metoder tillämpats framgångsrikt i många studier [1,3,7-8,12,15-23], finns det en potentiell felkälla i metoden. Felaktig DNA amplifiering kan ske med primer-riktad DNA-syntes, vilket kan påverka analysresultaten för genotypning och ge upphov till diskrepanser [3].

Resultatdiskussion

Enligt kitens tillverkare förväntas amplifierade DNA mängder på 10 μg i en 50 μl reaktion (ca 200 ng/µl) för Repli-g från Qiagen och 4–7 μg i en 20 µl reaktion (ca 200-350 ng/µl) för GenomiPhi från GE Healthcare, när amplifieringsreaktionen sker enligt tillverkarens rekommendation med 10 ng DNA input. Resultaten i dessa försök visar att det i genomsnitt bildades 139 ng/µl amplifierat DNA med Repli-g kitet, vilket är sämre än förväntat medan det med GenomiPhi kitet erhölls förväntade amplifieringsmängder och en medelkoncentration på 223 ng/µl. Det är viktigt att poängtera att båda kitens tillverkare rekommenderar 10 ng DNA input men enligt detta arbetets resultat fungerade GenomiPhi minst lika bra vid 1 ng DNA input och stam-DNA input medan Repli-g fungerade dåligt vid 1 ng DNA input och med stor variation med 100 ng DNA input. Även om resultaten visar att GenomiPhi med stam-DNA input ger högst kvantitativ mängd DNA i ng/µl, bidrar 1 ng DNA input till ett högre utbyte med en ökning på 4800 gånger jämfört med en genomsnittlig ökning på 200 gånger då stam-DNA användes. För att säkerställa att GenomiPhi kitets kvantitativa förmåga är bäst vid 1 ng DNA input, trots tillverkarens rekommendation, upprepades WGA med GenomiPhi på prov 5 vid ett annat tillfälle, som visade att GenomiPhi kitets kraftfulla amplifiering även var robust. Det är mer fördelaktigt i undersökningens syfte om det går att använda små mängder DNA input eftersom DNA-prover med sällsynta genotyper räcker under en längre tidsperiod. I tidigare studie beskrivs att mängden på DNA input inte ska spela en avgörande roll för amplifiering med MDA-reaktion men detta arbete ville även testa kitens effektiva amplifieringsförmåga för mindre och större DNA mängder [7]. De sammanlagda undersökningsresultaten av kvantitativ analys i detta arbete visar att GenomiPhi kitet har en bättre amplifieringsförmåga än Repli-g kitet. GenomiPhi kitet hade dessutom högst kvantitativt utbyte på amplifierade DNA-produkter och lyckades framgångsrikt amplifiera genomiskt DNA vid alla tre testade DNA input-mängderna.

Enligt tidigare studie ska MDA-baserad WGA kunna replikera 2000 – 100 000 bp långa DNA-fragment [8]. Resultaten från agarosgelelektrofores visar att samtliga

fragment på agarosgelen hade en storlek över 3000 bp (Figur 2), vilket stämmer överens med förväntade resultat. Detta medför möjligheten att använda de helgenomamplifierade DNA-fragmenten för SNP-analys på DNA-laboratoriet i Malmö som kräver >100 bp. Längden på DNA-fragmenten från WGA-proverna ger även en möjlighet att utföra sangersekvensering som kräver fragment >400 bp, ifall det skulle varit en lämplig analys på DNA-laboratoriet förutom att analysera endast SNP:ar.

För att kontrollera kvalitén på de helgenomampliferade DNA-proverna utfördes SNP-analys och sangersekvensering. Alla tre SNP-analyserna gav samstämmigt resultat för alla prov och WGA-amplifieringar med undantag för prov 2, 3 och 4 där 1 ng DNA använts till WGA-reaktionen med Repli-g där inget resultat erhölls alls. GenomiPhi kitets prover kunde framkallas automatiskt med 95 % säkerhet och undantag för två prov (prov 2 och 5 där 1 ng DNA använts vid analys av ApoE C112R), vilket inte kunde upprepas för Repli-g proverna. Dessa resultat styrker och tillför ytterligare fördelar med GenomiPhi kitet vars indikationer tyder på att kvalitén på det amplifierade DNA:t är bättre än med Repli-g kitet.

Eftersom GenomiPhi kitet visade sig vara det mest fördelaktiga kitet enligt resultaten vid kvantitativa analysen och SNP:arna i detta arbete, utfördes endast sangersekvensanalys på kitets WGA-prover vid 1 ng DNA input. Urvalet av WGA-prover med 1 ng DNA input motiverades med att små mängder DNA input är mest fördelaktigt i arbetes syfte att säkerställa sällsynta genotyper ifrån DNA-prover. Sekvensdata från ett 464 bp långt fragment av FII 3´UTR visade att det inte fanns några sekvensskillnader mellan det WGA-amplifierade DNA:t jämfört med det ursprungliga DNA:t, vilket tyder på att MDA-baserad WGA amplifiering har fungerat med GenomiPhi kitet. Sekvensdata från ett 585 bp långt fragment av delar av ApoE exon 4 stämde också överens med DNA-sekvenser ifrån

ursprungsproven, med undantag för en eventuell diskrepans vid position c.388 för prov 5 (Figur 4). Sangersekvensdata för WGA-amplifierat prov 5 uppvisar ett homozygot (C/C) resultat i denna positionen istället för ett heterozygot (T/C) genotypresultat . Denna position motsvarar ApoE C112R SNP:en där WGA-amplifierat prov 5 erhöll ett heterozygot resultat (T/C). Däremot noterades det scatterplotten i Figur 3 att resultatet drar något mot ett homozygot (C/C) resultat, vilket pekar på en något ojämn amplifiering av de två allelerna i detta prov. Till följd av resultaten från sekvensanalysen utfördes därför ännu ett

sekvenseringsförsök på ApoE-genen för prov 5 men även på ”prov 5 extra”. Det nya resultatet visade återigen homozygot genotyp (C/C) i position c.388 för prov 5 medan ”prov 5 extra” erhöll en heterozygot (T/C) genotyp i samma position. Alltså verkar denna diskrepans vara en kombination av en ojämn amplifiering av alleler som beror på slumpen och sangersekvenseringens låga analyskänslighet [7,27]. ApoE-genen ligger på kromosom 19, inom en mycket GC-rik region [28]. Det är viktigt att poängtera att båda kiten utmanades av ApoE:s höga GC-innehåll redan vid SNP-analysen. Tidigare studie upplyser om att MDA-metoder fungerar bättre i GC-rika områden än PCR-baserade WGA-metoder, men det är fortfarande en utmaning för amplifieringsmetoder att vara lika effektiva i GC-rika regioner [7]. För MDA fungerar strängförskjutningsaktiviteten svårare i regioner med ökad halt GC, vilket kan skapa svårigheter i amplifieringen [22].

Det viktigaste resultatet för att kunna dra slutsats om framtida tillämpningar av MDA-kit i kliniskt syfte bygger på att amplifierade DNA-produkter ska kunna presentera en adekvat representation av alleler som leder till tillförlitlig

genotypningsresultat. Tidigare studie visar att genom MDA-amplifiering kan bortfall av alleler hos WGA-produkter ske vilket kan leda till att en heterozygot genotyp tolkas som homozygot [7]. Eftersom allt WGA-material innan

användning som kontrollmaterial vid SNP-analys kommer att kontrolleras

gällande genotyp för aktuell sällsynt SNP förhindras att felaktiga WGA-produkter används.

Resultaten från alla tre SNP-analyserna påvisades emellertid vara tillräckligt goda för att uppfylla arbetets syfte att kunna implementera sällsynta DNA-kontroller för SNP-analys. Vid sekvensanalys av ett 464 bp långt fragment för faktor II genen och 585 bp långt fragment för ApoE genen på fem WGA DNA-prover påvisades endast en diskrepans som dessutom delvis beror på

sangersekvenseringens låga analyskänslighet [27]. Dessa sammanställda data pekar på en adekvat representation av alleler och möjligheten att implementera GenomiPhi kitet för användning i det kliniska arbetet på DNA-laboratoriet i Malmö. Däremot skulle olika platser i genomet kunna ge upphov till olika typer av resultat, detta arbete har undersökt delar av ApoE och faktor II generna, men inte tagit hänsyn till hela genomet. Det är en utelämnad fråga som den här undersökningen inte har fokuserat på.

KONKLUSION

DNA-prover med sällsynta genotyper behövs för upprepad användning som kontrollprover vid SNP-analys. MDA-baserad WGA möjliggör replikation av ett mänskligt genom med en enkel in vitro metod som tidigare näst intill var omöjlig. Detta arbete visar att det mest fördelaktiga kitet av de två som testades var

GenomiPhi från GE Healthcare Lifescience, som erbjuder hög kvalité och god kvantitet på sina WGA-produkter och kan användas i syftet att säkerställa sällsynta DNA-kontroller för klinisk SNP-analys. Mest effektiv amplifiering erhölls med 1 ng DNA input men den låga DNA mängden i MDA-reaktionen kan eventuellt också innebära en högre risk för allel-bortfall.

REFERENSER

1. Lasken R S, (2009) Genomic DNA amplification by the multiple displacement amplification (MDA) method. Biochemical Society

Transactions, 37, 450–453.

2. Hawkins T L, Detter J C, Richardson P M, (2002) Whole genome amplification – applications and advances. Current Opinion in

Biotechnology, 13, 65-67.

3. Han T, Chang C W, Kwekel J C, Chen Y, Ge Y, Martinez-Murillo F, Roscoe D, Težak Ž, Philip R, Bijwaard K, Fuscoe J C, (2012)

Characterization of whole genome amplified (WGA) DNA for use in genotyping assay development. BMC Genomics, 13, 1-15.

4. Primrose S B, Twyman R M, (2003) Genomics: Applications in Human

Biology. United Kingdom, Padstow: TJ International Ltd.

5. dbSNP databas, (2015) FII c.20210 A/A >http://www.ncbi.nlm.nih.gov/< (2015-03-12)

6. Labmedicin Skåne, (2009) Apolipoprotein E (ApoE) genotypning

>https://www.skane.se/sv/Webbplatser/Labmedicin_Skane/Verksamhetso

mraden/Klinisk-kemi/Klinisk-kemi-startsida/FragestallningDiagnostik/DNA/DNA/ApoE< (2015-03-12) 7. Lovmar L, Syvänen A C, (2006) Multiple Displacement Amplification To

Create a Long-Lasting Source of DNA for Genetic Studies. Human

Mutation, 27(7), 603-614.

8. Lasken R S, Egholm M, (2003) Whole genome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens. Trends in

Biotechnology, 21(12), 531–535.

9. De Bourcy F A C, De Vlaminck I, Kanbar J N, Wang J, Gawad C, Quake S R, (2014) A Quantitative Comparison of Single-Cell Whole Genome Amplification Methods. PLoS One, 9(8), 1-9.

10. Maciejewska A, Jakubowska J, Pawaowski R, (2014) Different Whole-Genome Amplification Methods as a Preamplification Tool in

Y-Chromosome Loci Analysis. Am J Forensic Med Pathol, 35(2), 140-144. 11. Maciejewska A, Jakubowska J, Pawaowski R, (2013) Whole genome

amplification of degraded and nondegraded DNA for forensic purposes.

Int J Legal Med, 127, 309–319.

12. Dean F B, Hosono S, Fang L, Wu X, Faruqi A F, Bray-Ward P, Sun Z, Zong Q, Du Y, Du J, Driscoll M, Song W, Kingsmore S F, Egholm M, Lasken R S, (2002) Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. PNAS, 99(8), 5261–5266.

13. Lu Y, Gioia-Patricola L, Gomez J V, Plummer M, Franceschi S, Kato I, Canzian F, (2005) Use of whole genome amplification to rescue DNA from plasma samples. BioTechniques, 39(4), 511-515.

14. Jiang Z1, Zhang X, Deka R, Jin L, (2005) Genome amplification of single sperm using multiple displacement amplification. Nucleic Acids Research, 33(10), 1-9.

15. Barker D L, Hansen M S, Faruqi A F, Giannola D, Irsula O R, Lasken R S, Latterich M, Makarov V, Oliphant A, Pinter J H, Shen R, Sleptsova I, Ziehler W, Lai E, (2004) Two methods of whole-genome amplification enable accurate genotyping across a 2320-SNP linkage panel. Genome

Research, 14(5), 901–907.

16. Aaltonen KE1, Ebbesson A, Wigerup C, Hedenfalk I, (2011) Laser capture

microdissection (LCM) and whole genome amplification (WGA) of DNA from normal breast tissue --- optimization for genome wide array analyses.

BMC Research Notes, 4(69), 1-7.

17. Paez J G, Lin M, Beroukhim R, Lee J C, Zhao X, Richter D J, Gabriel S, Herman P, Sasaki H, Altshuler D, Li C, Meyerson M, Sellers W R, (2004) Genome coverage and sequence fidelity of phi29 polymerase-based multiple strand displacement whole genome amplification. Nucleic Acids

Research, 32(9), 1-11.

18. Xing J, Watkins WS, Zhang Y, Witherspoon D J, Jorde L B, (2008) High fidelity of whole-genome amplified DNA on high-density single

nucleotide polymorphism arrays. Genomics, 92(6), 452–456.

19. Ling J, Zhuang G, Tazon-Vega B, Zhang C, Cao B, Rosenwaks Z, Xu K, (2009) Evaluation of genome coverage and fidelity of multiple

displacement amplification from single cells by SNP array. Molecular

Human Reproduction, 15(11), 739–747.

20. Anjum G M, Du W, Klein R, Amara U, Huber-Lang M, Schneider E M, Wiegand P, (2010) Pyrosequencing-based strategy for a successful SNP detection in two hypervariable regions: HV-I/HV-II of the human mitochondrial displacement loop. Electrophoresis, 31(2), 309–314. 21. Croft D T, Jordan R M, Patney H L, Shriver C D, Vernalis M N, Orchard

T J, Ellsworth D L, (2008) Performance of whole-genome amplified DNA isolated from serum and plasma on high-density single nucleotide

polymorphism arrays. Journal of Molecular Diagnostics, 10(3), 249–257. 22. Pinard R, De Winter A, Sarkis G J, Gerstein M B, Tartaro K R, Plant R N,

Egholm M, Rothberg J M, Leamon J H, (2006) Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. BMC Genomics, 7, 1-21.

23. Ballantyne K N, van Oorschot R A H, Mitchell R J, (2007) Comparison of two whole genome amplification methods for STR genotyping of LCN and degraded DNA samples. Forensic Science International, 166, 35–41.

24. Marcy Y, Ishoey T, Lasken R S, Stockwell T B, Walenz B P, Halpern A L, Beeson K Y, Goldberg S M, Quake S R, (2007) Nanoliter reactors improve multiple displacement amplification of genomes from single cells. PLoS Genetics, 3(9), 1702–1708.

25. Tamminen M V, Virta M P J, (2015) Single gene-based distinction of individual microbial genomes from a mixed population of microbial cells.

Frontiers in Microbiology, 6, 1-10.

26. Sedlackova T, Repiska G, Celec P, Szemes T, Minarik G, (2013) Fragmentation of DNA affects the accuracy of the DNA quantitation by the commonly used methods. Biological Procedures Online, 15(1), 1-8. 27. Altimari A1, de Biase D, De Maglio G, Gruppioni E, Capizzi E,

Degiovanni A, D'Errico A, Pession A, Pizzolitto S, Fiorentino M, Tallini G, (2013) 454 next generation-sequencing outperforms allele-specific PCR, Sanger sequencing, and pyrosequencing for routine KRAS mutation analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded samples. OncoTargets and

Therapy, 6, 1057-1064.

28. Mousavian Z, Sadeghi H M, Sabzghabaee A M, Moazen F, (2014)

Polymerase chain reaction amplification of a GC rich region by adding 1,2 propanediol. Advanced Biomedical Research, 3, 1-4.