Örebro Universitet
Institutionen för Medicinska Vetenskaper Kandidatuppsats 15hp
Juni 2020
Kan man genom kvantifiering av extracellulära
vesiklar urskilja malign från benign lungsjukdom?
Version 2
Författare: Erika Jonsson Handledare: Alvida Qvick, Doktorand
Laboratoriemedicinska kliniken Universitetssjukhuset i Örebro (USÖ)
Sammanfattning
Bakgrund: Lungcancer är en av de cancerformer med sämst prognos, vilket delvis förklaras
av sen diagnos. Potentiellt kan cirkulerande extracellulära vesiklar, som diagnoskälla och screeningverktyg, möjliggöra tidigare diagnostik och därmed förbättra den annars dåliga prognosen.
Syfte: Syftet var att undersöka om det är möjligt att, genom kvantifiering av extracellulära
vesiklar, urskilja malign från benign lungsjukdom samt lungsjuka från friska. Vesiklarna isolerades med akustik för att bedöma dess användbarhet som framtida diagnostiskt verktyg.
Metoder: Plasmaprover togs från forskningspersoner med malign (n =5) respektive benign
(n=5) lungsjukdom samt frisk kontrollgrupp (n = 10). Grupperna med malign och benign lungsjukdom matchades utifrån kön, ålder (åldersspann ± 1 år) och rökstatus (fyra av fem par matchade). Vesiklarna isolerades genom akustik med AcouTrap och analyserades därefter med Nanoparticle Trackning Analysis (NTA).
Resultat: Repeterbarheten uttryckt i variationskoefficienten (CV) vid isolering med
AcouTrap hade medelvärdet 18,3% gällande koncentration och 3,7% gällande storlek medan NTA-analys hade medelvärdet 12,9% gällande koncentration och 3,2% gällande storlek. Mediankoncentrationen hos lungsjuka var 4,7x1013 partiklar/ml jämfört med 5,1x1012
partiklar/ml hos friska individer (p=0,005). Medianstorleken vid malign lungsjukdom var 74,4 nm jämfört med 68,0 nm vid benign lungsjukdom (p=0,08).
Slutsatser: Trots det fåtal patientprover som analyserats observerades en statistiskt
signifikant skillnad i antalet extracellulära vesiklar mellan lungsjuka och friska samt en icke-signifikant trend som visade större partiklar hos de med malign lungsjukdom än benign lungsjukdom. Akustik som isoleringsmetod av extracellulära vesiklar hade hög repeterbarhet och således kan metoden bli ett bra framtida kliniskt verktyg.
Nyckelord: Extracellulära vesiklar; Isolering; Akustik; Lungsjukdom; Icke-småcellig
Förkortningar
AC = Adenocarcinom
ctDNA = Cirkulerande tumör-DNA CV = Variationskoefficienten EVs = Extracellulära vesiklar lncRNA = lång-ickekodande RNA NTA = Nanoparticle tracking analysis miRNA = mikroRNA
PBS = Filtrerad fosfatbuffrad saltlösning SD = Standarddeviation
SqCC = Skivepitelcancer
Innehållsförteckning
1. Inledning ... 5
1.1 Bakgrund ... 5
1.2 Syfte ... 6
1.3 Hypotes ... 6
2. Material och metoder ... 7
2.1 Studiepopulation ... 7 2.2 Mätmetod ... 7 2.3 Statistiska analyser ... 9 2.4 Etiska överväganden ... 10 3. Resultat ... 10 4. Diskussion ... 13 5. Slutsats ... 17
Ett speciellt tack till ... 17
1. Inledning
1.1 Bakgrund
Lungcancer är en av de vanligaste cancerformerna och även en av de cancersjukdomarna med sämst prognos [1]. År 2016 var femårsöverlevnaden 16,8 procent för män respektive 24 procent för kvinnor, vilket kan jämföras med femårsöverlevnaden hos alla cancerpatienter i Sverige: 75 procent för män respektive 74 procent för kvinnor [2]. Den dåliga prognosen kan delvis förklaras av sen diagnos. Exempelvis upptäcks lungcancer ofta som ett bifynd vid lungröntgen av annan anledning [2, 3]. Den dåliga prognosen kan även förklaras av
svårigheter kring diagnostisering av lungcancer. Exempelvis kan utförandet av biopsi, som är en av diagnosticeringsmetoderna för lungcancer, vara problematiskt till följd av svåråtkomlig tumörvävnad och att patienterna ofta är i dåligt hälsotillstånd [4].
Upptäckten av cirkulerande biomarkörer har däremot öppnat upp för en ny minimalt invasiv diagnostikkälla som möjliggör tidigare diagnos och därmed bättre prognos av bland annat lungcancer. Tumörer frisätter flera olika ämnen ut i blodcirkulationen, så kallade
tumörmarkörer, som i sin tur kan analyseras och användas inom tumördiagnostiken [1]. En typ av cirkulerande biomarkör som fått särskilt stor uppmärksamhet är extracellulära vesiklar (EVs). EVs kan frisättas av alla kroppens celler och fungerar som intercellulära budbärare. De innehåller olika lipider, proteiner och nukleinsyror (exempelvis DNA och olika typer av RNA) som på olika sätt bidrar till den intercellulära kommunikationen [5]. Vesiklarna varierar i storlek från cirka 30 nm upp till >1000 nm [6] och kan delas in i tre olika subgrupper utifrån dess storlek och biogenes: exosomer, mikrovesiklar och apoptotiska kroppar [5]. Betydelsen av EVs, både normal- och patofysiologiskt, börjar nu successivt klargöras. Patofysiologiskt beskrivs EVs bland annat spela en roll i cancerutveckling och metastasering [7], immunförsvarets respons [5] samt i en rad sjukdomar så som Parkinsons, Alzheimers och HIV-1 [8].
Långsiktigt kan EVs mängd och innehåll potentiellt användas som biomarkörer för en rad olika sjukdomstillstånd, däribland lungcancer. Mängden på grund av att maligna celler verkar frisätta större kvantiteter av EVs än vad friska celler gör [9]. Innehållet på grund av att analys av EVs, frisatta av tumörceller, kan ge värdefull information om cancercellernas genetiska uppbyggnad. Studierna av Thakur et al. [10] samt av Lee.K et al. [11], har påvisat att
EVs påvisats i flera olika kroppsvätskor, exempelvis blod, vilket ökar deras potential för att kunna användas som ett screeningverktyg [9]. Potentiellt kan detta utnyttjas diagnostiskt för att upptäcka lungcancer i ett tidigare stadium och därmed öka möjligheterna för en kurativ behandling.
För att kunna analysera de extracellulära vesiklarna behöver de isoleras från provmaterialet. Trots att vesiklarna finns i en stor koncentration, vanligen över 1012 vesiklar/ml blod, kommer deras storlek och komplexa miljö att medföra tekniska utmaningar, särskilt vid en begränsad mängd provmaterial [11]. Ultracentrifugering är en av de vanligaste metoderna som används för att isolera extracellulära vesiklar [12]. Denna metod är dock inte optimal som ett verktyg inom framtida klinisk diagnostik då den ställer krav på större provvolymer, är tidskrävande och har mer omfattande procedurer som kan skada provmaterialet [13]. En isoleringsmetod som däremot uppfyller ovanstående kriterier på att vara mer tidseffektivt, skonsamt mot provmaterialet och kräver mindre provvolymer är akustik [11, 13].
Användandet av akustik som en isoleringsmetod av EVs går generellt ut på att generera stående ljudvågor, varvid partiklarna reagerar olika beroende på deras storlek; ju större partiklar desto snabbare rör sig till ljudvågornas noder till följd av att den akustiska
kraftpåverkan är proportionell till vesiklarnas storlek [11]. Därmed uppnås en separation av provmaterialets innehåll och isolering av de extracellulära vesiklarna som därefter kan analyseras vidare.
1.2 Syfte
Studiens syfte var att undersöka om det är möjligt att, genom kvantifiering av extracellulära vesiklar, urskilja malign från benign lungsjukdom samt lungsjuka från friska. Vesiklarna isolerades med akustik för att avgöra om denna isoleringsmetod är användbar som framtida diagnostiskt verktyg.
1.3 Hypotes
Hypotesen är att man kan urskilja malign från benign lungsjukdom samt lungsjuka från friska genom kvantifiering av extracellulära vesiklar samt att akustik kan användas som en effektiv metod för att isolera extracellulära vesiklar.
2. Material och metoder
2.1 Studiepopulation
Studiedesignen är deskriptiv, retrospektiv och kvantitativ där kohortmaterialet består av plasmaprover tagna från forskningspersoner med malign eller benign lungsjukdom. Plasmaproven samlades in i samband med utredning för misstänkt lungcancer på Örebros universitetssjukhus, USÖ (för mer information kring insamling av provmaterialet, se 2.4 Etiska överväganden). Studien är en del av en större studie (LiBio-studien).
Inklusionskriterierna för malign lungsjukdom var icke-småcellig lungcancer, antingen adenocarcinom eller skivepitelcancer. Exklusionskriterna innefattade otillräckligt prov för diagnos samt annan primär cancer. Inklusionskriterierna för benign lungsjukdom var utredning för misstänkt lungcancer på USÖ, men som istället diagnosticerats med benign lungsjukdom. De två studiegrupperna, malign lungsjukdom (n=5) respektive benign lungsjukdom (n=5), matchades utifrån kön, ålder (åldersspann ± 1 år) och rökstatus. Fullständig matchning på rökstatus var ej möjlig i ett av paren. Blodprover samlades även från friska blodgivare (n = 10) som kontrollgrupp och metodvalidering. Det fanns ej kliniska data på dessa prover.
2.2 Mätmetod
Plasmaproverna togs i RNA BCT-rör (Streck, La Vista, NE, USA) och centrifugerades 1600xg under 10 minuter i rumstemperatur (se figur 1. för flödesschema av studiens metod). Plasman isolerades och överfördes till nya rör följt av en ny centrifugering 16000xg under 10 minuter i rumstemperatur och isolering av plasman. Därefter frystes provet i -80°C. För att undvika att tina proverna och därmed riskera att skada provmaterialet skars cylinderformade kärnor ut ur de frysta proverna med hjälp av en biopsinål. Kärnan överfördes till nya provrör som återigen placerades i frys i -80°C fram tills analys.
Inför analys tinades proverna för att sedan centrifugeras 2400xg under 7 minuter i
rumstemperatur. Den mittersta delen av plasman överfördes till nya provrör med syftet att undvika att få med aggregat som kan täppa till AcouTrap-maskinen vid isolering av provet. Provet späddes 1:3 med in-house filtrerad fosfatbuffrad saltlösning (PBS). De matchade proverna isolerades och analyserades direkt efter varandra för att minimera eventuella systematiska fel.
Isolering av de extracellulära vesiklarna från plasmaproverna gjordes med hjälp av AcouTrap (AcouSort, Lund, Sverige) vars kopplade transduktor (frekvens 4,15 MHz, amplitud 8,5 V) genererade en stående ljudvåg. Tolv mikrometer polystyren-mikropartiklar (Kisker, Steinfurt, Tyskland), så kallade seed-partiklar, tillsattes och fastnade i fältet till följd av de akustiska krafterna. De utspädda proverna aspirerades ur brunnsplattan och fördes genom det akustiska fältet med seed-partiklarna resulterande i en isolering av provets partiklar. Partiklarna
tvättades med samt eluerades i in-house filtrerad PBS. Mellan varje prov rengjordes maskinen invändigt med FACS-Clean (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) och in-house etanol 70%. Två tekniska replikat gjordes på sex av kontrollproven för att utvärdera maskinens repeterbarhet. De isolerade partiklarnas storlek och koncentration analyserades med hjälp av Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) och dess mjukvara (ZetaView 8.05.1) enligt tillverkarens
instruktioner. NTA-metodens syfte är att genomlysa och analysera ljusspridningen från provets partiklar, vilket ger information om partiklarnas egenskaper, exempelvis partiklarnas storlek och koncentration. Instrumentet, Zeta View PMX-120 BASIC (Particle Metrix, Meerbusch, Tyskland), ställdes in med: högsta bildhastighet (60 fps), 11 kameror, 2 cykler med känslighet 93. Minst 9 av 11 kameror var tvungna att ge resultat för att mätningen skulle inkluderas i resultatet. Eluatet späddes med PBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) för att uppnå maskinens optimala mätområde (50-200 partiklar/bild). Tre tekniska replikat gjordes per prov för att utvärdera hur konsekvent mätningen var.
Figur 1. Översiktligt flödesschema av studiedesignen. Studieurvalet bestod av forskningspersoner med malign lungsjukdom (n=5), benign lungsjukdom (n=5) samt frisk kontrollgrupp (n=10). Plasmaproverna centrifugerades i två omgångar för att sedan frysas i -80°C. En cylinderformad kärna skars ut från de frysta proverna för att undvika upptining av provmaterialet. Kärnan förvarades i frys -80°C fram tills isolering och analys. Provernas extracellulära vesiklar isolerades via stående ljudvågor med AcouTrap. Partiklarnas storlek och koncentration analyserades via NTA.
2.3 Statistiska analyser
All data sammanställdes i Microsoft Excel (version 16.36) uppdelat i två kategorier: koncentration och storlek. Statistikprogrammet IBM SPSS statistics version 25.0 (IBM, Armonk, NY, USA) användes för att utföra Mann–Whitney U-test för jämförelse mellan lungsjuka och friska samt Wilcoxon-signed rank test för jämförelse mellan malign och benign lungsjukdom. Resultaten presenterades med hjälp av scatter plot där linjer dragits mellan de matchade proverna. Felstaplarna representerade standarddeviationen (SD). P-värde ≤ 0,05 definierades som signifikant. Outliers definierades som värden >1,5 interkvartiler över tredje kvartilen (> 1.5 IQR + Q3). Mätmetodernas repeterbarhet kvantifierades genom
CV = ( 𝑆𝑆𝑆𝑆𝑚𝑚 ) × 100
Variationskoefficienten (%) = (standarddeviationen/medelvärdet) x 100
2.4 Etiska överväganden
Forskningsprojektet är godkänt av den regionala etikprövningsnämnden i Uppsala 2015-10-21 (DNR-nr: 2015/400). GDPR-formulär är inskickat och registrerat hos Dataskyddsombudet. Det finns både muntligt och skriftligt medgivande från forskningspersonerna. Denna studie använder sig av plasmaprover tagna från forskningspersoner med malign eller benign lungsjukdom i samband med utredning för misstänkt lungcancer på USÖ från år 2016. Plasmaprover är även insamlade från friska blodgivare använda som kontrollgrupp och metodvalidering. Dessa prover är anonyma och går ej att spåra tillbaka till individen. I alla medicinska undersökningar och studier måste nyttan överväga risken man utsätter patienten för. Att ta blodprov medför en liten risk i samband med nålsticket, men i övrigt utsätts forskningspersonen inte för några risker eller lidande. Däremot kan studien medföra att en förbättrad diagnostik utvecklas vilket innebär en tidigare upptäckt, diagnostik och behandling av lungcancer. Därmed överstiger nyttan risken. Blodproverna förvaras i biobank vid
Universitetssjukhuset i Örebro med biobanksavtal. Nyckeln till det kodade materialet är inlåst och förvaras separat från proverna. Endast ett fåtal personer med accessrättigheter har tillgång till denna nyckel.
3. Resultat
Plasmaprover tagna från forskningspersoner med malign lungsjukdom (n=5), benign
lungsjukdom (n=5) och frisk kontrollgrupp (n=10) isolerades och analyserades utifrån storlek samt koncentration. Grupperna malign och benign lungsjukdom matchades utifrån kön, ålder (ålderspann ± 1 år) och rökstatus, se tabell 1. Fullständig matchning på rökstatus var ej möjlig i ett av paren. Kontrollprov 2 hade koncentrationen 1,3x1014 partiklar/ml, vilket är cirka 4,5 interkvartiler över Q3 och räknades därmed som en outlier. Provet exkluderades från alla kommande analyser (n=9).
Tabell 1. Beskrivning av studiens urval. Två av studiegrupperna (malign och benign lungsjukdom) matchades utifrån kön, ålder (ålderspann ± 1 år) och rökstatus (fyra av fem par matchade). Utöver detta användes en kontrollgrupp för metodvalidering bestående av 9 friska blodgivare. M = Man, F = Kvinna, AC = Adenocarcinom, SqCC = Skivepitelcancer.
Par Lungsjukdom Ålder Kön Rökstatus Diagnos Stadium
1 Malign 69 M F.d. AC IIb Benign 69 M F.d. Inflammation i lungslemhinnor - 2 Malign 73 M Ja AC IV Benign 73 M Ja Pneumoni - 3 Malign 81 F F.d. SqCC IIIb Benign 81 F F.d. Inflammation i lungor - 4 Malign 71 F Ja SqCC IV Benign 71 F Ja Hemoptys - 5 Malign 75 M F.d. SqCC IIIb Benign 76 M Ja Inflammation -
Mätmetodernas repeterbarhet räknades ut genom variationskoefficienten (CV), se tabell 2. Isolering med AcouTrap (n=5) hade CV som varierade mellan 6,5-35% (medelvärde 19,6%) i koncentration och 1,2-6,0% (medelvärde 3,5%) i storlek. Ingen konsekvent skillnad mellan den första och andra isoleringen observerades. NTA-analys med ZetaView (n=19) hade CV som varierade mellan 0-44% (medelvärde 13,4%) i koncentration och 0,5-7,1% (medelvärde 3,2%) i storlek. Ingen konsekvent skillnad mellan mätningarna observerades.
Tabell 2. Mätmetodernas repeterbarhet beskrivet genom variationskoefficienten (CV) uppdelat i isolering med AcouTrap (n=5) respektive NTA-analys (n=19) med ZetaView utifrån partikelkoncentration och storlek.
Mätning Intervall (CV%) Medelvärde (CV%) Median (CV%)
AcouTrap, koncentration 6,5–35 19,6 18,0
AcouTrap, storlek 1,2–6,0 3,5 3,6
ZetaView, koncentration 0–44 13,4 11,2
Partikelkoncentrationen jämfördes mellan grupperna malign lungsjukdom, benign lungsjukdom och frisk kontrollgrupp (se figur 2). Medianen för malign lungsjukdom var 4,6x1014 (SD ± 3,6x1014), benign lungsjukdom 4,5x1014 (SD ± 3,4x1014) samt 5,1x1012 (SD± 1,5x1013) för den friska kontrollgruppen. En statistiskt signifikant skillnad mellan lungsjuka och friska observerades (p=0,005, Mann Whitney U-test), men ingen statistiskt signifikant skillnad mellan malign och benign lungsjukdom (p=0,686, Wilcoxon signed-rank test).
Figur 2. Koncentration av partiklar vid malign lungsjukdom (n=5), benign lungsjukdom (n=5) och frisk kontrollgrupp (n=9). Grupperna malign och benign lungsjukdom matchades utifrån ålder (åldersspann ± 1 år), kön och rökstatus (fyra av fem par matchade). Medianen för malign lungsjukdom var 4,6x1014 (SD
±3,6x1014), benign lungsjukdom 4,5x1014 (SD ±3,4x1014), frisk kontrollgrupp 5,1x1012 (SD± 1,5x1013).
Felstaplarna representerar standarddeviationen (SD). P-värde ≤ 0,05 definierades som signifikant och markerades med asterisk (*) i figuren. Resultaten jämfördes mellan lungsjuka och friska (p=0,005) samt mellan malign och benign lungsjukdom (p=0,686).
Den genomsnittliga partikelstorleken jämfördes mellan grupperna benign lungsjukdom, malign lungsjukdom och frisk kontrollgrupp (se figur 3). Medianen för malign lungsjukdom var 74,4 nm (SD ± 4,1), benign lungsjukdom 68,0 nm (SD ± 4,9) samt 74,6 nm (SD± 8,5) för den friska kontrollgruppen. En trend observerades avseende större partiklar hos patienter med
0 1E+13 2E+13 3E+13 4E+13 5E+13 6E+13 7E+13 8E+13 9E+13 1E+14
Malign Benign Frisk
Ko nce nt ra tio n [ pa rt ik la r/m l]
Koncentration
Kontrollprov 1 Kontrollprov 3 Kontrollprov 4 Kontrollprov 5 Kontrollprov 6 Kontrollprov 7 Kontrollprov 8 Kontrollprov 9 Kontrollprov 10 Par 1 Par 2 Par 3 Par 4 Par 5*
malign lungsjukdom jämfört med benign lungsjukdom. Trenden nådde dock ej statistisk signifikans (p=0,08, Wilcoxon signed-rank test). Det fanns ingen skillnad i partikelstorlek mellan lungsjuka och friska individer (p=0,54, Mann-Whitney U-test).
Figur 3. Den genomsnittliga partikelstorleken vid malign lungsjukdom (n=5), benign lungsjukdom (n=5) och frisk kontrollgrupp (n=9). Grupperna benign och malign lungsjukdom matchades utifrån ålder
(åldersspann ± 1 år), kön och rökstatus (fyra av fem par matchade). Medianstorlek för malign lungsjukdom var 74,4 nm (SD ± 4,1), benign lungsjukdom 68,0 nm (SD ± 4,9), frisk kontrollgrupp 74,6 nm (SD± 8,5). Felstaplarna representerar standarddeviationen (SD). P-värde ≤ 0,05 definierades som signifikant. Resultaten jämfördes mellan malign och benign lungsjukdom (p=0,08) samt mellan lungsjuka och friska (p=0,54).
4. Diskussion
Studiens syfte var att bedöma akustik som isoleringsmetod samt jämföra koncentration och storlek av EVs hos patienter med malign lungsjukdom, benign lungsjukdom samt friska forskningspersoner. För att få en samlad bild av hela provflödet utvärderades även mätinstrumentet NTA. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Malign Benign Frisk
Ge no m sn itt lig pa rt ik el st or le k [ nm ]
Storlek
Kontrollprov 1 Kontrollprov 3 Kontrollprov 4 Kontrollprov 5 Kontrollprov 6 Kontrollprov 7 Kontrollprov 8 Kontrollprov 9 Kontrollprov 10 Par 1 Par 2 Par 3 Par 4 Par 5Repeterbarheten för akustisk isolering bedömdes hög och NTA-analys bedömdes medelhög. Bedömningen har en subjektiv valör. En statistiskt signifikant skillnad observerades i jämförelsen mellan koncentrationen av EVs hos lungsjuka och friska samt en trend som visade större partikelstorlek hos patienter med malign lungsjukdom än benign lungsjukdom. Inga statistiskt signifikanta skillnader hittades i övriga jämförelser.
Akustik med AcouTrap användes som isoleringsmetod med syftet att bedöma dess repeterbarhet. Isoleringens repeterbarhet uttryckt i variationskoefficienten (CV) var hög gällande storlek (intervall 1,2-6,0%) och något lägre gällande koncentration (intervall 6,5-35%). Sammanfattningsvis tyder resultaten på att akustik med AcouTrap är en konstant isoleringsmetod med hög repeterbarhet. Då variationskoefficienten av
AcouTrap-isoleringarna var beroende av NTA-mätningarnas variation behöver framtida studier fler isoleringar per prov för ett säkrare resultat.
I en komparativ studie av Rezeli et al. [14] jämfördes akustik med centrifugering som
isoleringsmetod av extracellulära vesiklar. Där var slutsatsen att det inte fanns någon skillnad mellan de två isoleringsmetodernas förmåga att isolera partiklar. Dessutom, som tidigare beskrivet, har studier påvisat akustik till att vara en effektivare isoleringsmetod än
centrifugering eftersom den är mer tidseffektivt och skonsamt mot provmaterialet samt kräver mindre provvolymer, vilket är ett krav som ställs om det ska användas kliniskt [11, 13]. Med detta pekar resultaten i denna studie mot att akustik är en effektiv isoleringsmetod av EVs från plasma som kan användas i kliniskt syfte.
NTA med ZetaView användes som analysmetod för att få information om partiklarnas storlek och koncentration. Analysmetodens repeterbarhet uttryckt i variationskoefficienten (CV) var hög gällande storlek (intervall 0,5-7,1%), men lägre gällande koncentration (intervall 0-44%). Sammanfattningsvis tyder fynden på att analys med NTA är en konstant mätmetod med medelhög repeterbarhet.
I en komparativ studie jämfördes NTA-metoden mellan två olika instrument: NanoSight NS300 och ZetaView [15]. Studien påvisade att ZetaView presterade bättre gällande koncentrationsmätning medan NanoSight NS300 uppvisade bättre resultat angående partikelstorlek. Båda NTA-maskinerna rapporterades att vara bristfälliga vid analys av
partikelstorlek <50 nm [15, 16]. Då det finns EVs vars storlek är <50 nm, måste det tas i beaktning att en andel av de mindre vesiklarna eventuellt inte registreras korrekt med NTA som mätmetod [6]. Samma studie drog även slutsatsen att ZetaView hade hög
reproducerbarhet, vilket stödjer denna studiens resultat som påvisade medel repeterbarhet [15].
Vid jämförelser av resultaten med studierna av Muller et al. [9] samt Hong et al. [17] hade denna studie koncentrationer som var genomgående högre genom alla studiegrupper. Däremot observerade Hong et al. samma tendens med högre koncentrationer av EVs hos de med
malign sjukdom jämfört med friska individer. Studien av Muller et al. isolerade EVs från en cancerpatient genom ultracentrifugering tillsammans med ultrafiltration och storleksbaserad kromatografi följt av NTA-analys med NanoSight. Den studiens resultat gav en
medelpartikelstorlek på 102 nm (SD ±46) och koncentrationen 5,6x1010 partiklar/ml plasma. Studien av Hong et al. användandes av samma isoleringsmetod som Muller et al. samt analys med qNano observerade partikelkoncentration inom intervallet 6,9x1010- 1,11x1011 hos huvud-halscancerpatienter. De friska kontrollernas koncentration varierade där istället mellan 3,6x109 - 4,0x109 partiklar/ml. Storleksintervallet hos kontroller samt
huvud-halscancerpatienter var jämförbar med denna studie. I denna studie observerades en trend med större partiklar hos patienter med malign lungsjukdom jämfört med benign lungsjukdom, som dock ej nådde statistisk signifikans (p=0,08). Ytterligare studier krävs för att påvisa eventuell storleksskillnad mellan dessa grupper.
Studiens hypotes var att de med malign lungsjukdom skulle ha högre koncentrationer av EVs än de med benign lungsjukdom. Resultaten visade däremot ingen statistisk signifikant skillnad mellan dessa två grupper. I tre av fem matchade prover visade resultaten att de med benign lungsjukdom hade likartad koncentration av EVs som deras matchning med malign
lungsjukdom. En möjlig förklaring bakom detta är att båda grupperna har förhöjda nivåer av EVs fast med skiljande innehåll resulterande i skilda patologiska processer. Som tidigare beskrivet har EVs flera olika fysiologiska såväl som patologiska funktioner beroende på deras innehåll och interaktioner. Exempelvis kan vissa EVs främja en pro-inflammatorisk respons medan andra EVs istället hämmar immunförsvaret [18]. Hos gruppen med benign
lungsjukdom med inflammatorisk patogenes kan vesiklarna exempelvis framförallt innehålla pro-inflammatoriska proteiner och miRNA som främjar inflammation i lungvävnaden [19]. I studien av Kulshreshtha et al. [18] tyder fynd på möss att luftvägsepitelet hos astmatiker
frisätter en ökad mängd exosomer innehållande pro-inflammatoriska proteiner som främjar och bibehåller den inflammatoriska miljön. I en annan studie har det påvisats att
KOL-patienter har ökade nivåer av cirkulerande EVs innehållande pro-inflammatoriska protein och cytokiner [20]. Hos gruppen med lungcancer kan de extracellulära vesiklarna istället innehålla andra molekyler, oftast olika typer av mikroRNA (miRNA) och lång-ickekodande RNA (lncRNA), som leder till effekter som främjar lungcancercellernas utveckling och metastasering [21, 22].
Inom grupperna i den aktuella studien observerades även en individuell variation gällande koncentrationen av EVs. Variationen kan bero på faktorer som har en känd eller misstänkt påverkan på mängden cirkulerande EVs, exempelvis ålder, kön, BMI, mediciner [23]. Det verkar även finnas en intraindividuell skillnad som förklaras av att olika processer i kroppen så som exempelvis stress, infektioner, träning [24] och menstruationscykeln tillfälligt kan påverka mängden cirkulerande EVs hos en individ [25]. Måltiders påverkan på mängden cirkulerande EVs är ännu inte helt klargjort, men då måltider påverkar blodkompositionen och lipoproteiner, som också transporterar cirkulerande miRNA, tros det eventuellt kunna spela en roll [23, 26]. I sådana fall hade tidpunkten för plasmaprovtagning haft betydelse gällande resultat. I denna studie var alla plasmaprover inom kontrollgruppen tagna under förmiddagen och tidpunkten för provtagning av de matchade proverna skiljde sig inte
nämnbart (data presenteras ej), men vid framtida studier kan det vara bra att ha detta i åtanke för att utesluta eventuella felkällor.
Vid upptining av plasmaproverna observerades fibrinliknande aggregat som i de flesta fall försvann efter centrifugering, men vissa aggregat kvarstod. Även andra studier har observerat aggregat vid frysta plasmaprover [27, 28]. Troligen innehåller fryst plasma ökade mängder fria proteiner i provet till följd av utläckt material från skadade vesiklar [27]. Däremot påstås vesikelantalet förbli stabilt upp till åtminstone ett år efter förvaring i fryst tillstånd [28]. Begränsningar i studien som bör tas i beaktning är litet urval (n=20, varav ett prov uteslöts). avsaknad av kliniska data på kontrollproverna, långvarig förvaring i frys av plasmaprover. Då projektet är en del av en större studie (LiBio) har en del prover varit frysta under flera års tid, medan kontrollproverna enbart varit frysta under en månad, vilket kan ha påverkat proverna olika och därmed även resultatet. Då vesiklarna inte märktes med flourescens inför analys går det inte heller att urskilja EVs från andra partiklar i denna studie. Det finns flera olika typer av
partiklar vars storlek överlappar med storleken av extracellulära vesiklar och kan därmed misstas för dem i resultaten. Exempel på sådana partiklar är lipoproteiner, virus, bakterier, mikrosomer, proteinaggregat samt olika makromolekyler frisatta från celler som genomgått nekros [29]. Då studier, bland annat studien av Evander et al. [30], påvisat AcouTraps effektivitet gällande isolering av vesiklar kan slutsatsen ändå dras att majoriteten av de isolerade partiklarna i denna studien är EVs.
Studiens styrkor är däremot att grupperna malign respektive benign lungsjukdom var parade, användandet av plasmaprover istället för cellkulturer samt tekniska replikat av mätmetoderna. För att minimera eventuellt systematiskt fel mättes de parades proverna efter varandra.
5. Slutsats
Trots det fåtal patientprover som analyserats fann man en statistisk signifikant skillnad i antalet extracellulära vesiklar mellan lungsjuka och friska samt en icke-signifikant trend som visade större partiklar hos de med malign lungsjukdom än benign lungsjukdom. Inga
skillnader observerades mellan malign och benign lungsjukdom gällande koncentration eller mellan lungsjuk och frisk gällande storlek. Akustik som isoleringsmetod av extracellulära vesiklar hade hög repeterbarhet och således kan metoden bli ett bra framtida kliniskt verktyg. Ytterligare studier krävs för att påvisa den biologiska bakgrunden och den kliniska betydelsen av dessa resultat.
Ett speciellt tack till
Jag skulle vilja rikta ett stort tack till Alvida Qvick för all handledning och stöd under projektets gång. Du har alltid varit tillgänglig för input och frågor - stora som små. Din handledning och kunskap har varit ovärderlig för mig - tack!
Referenser
1. Kumar V, Abbas AK, Aster JC. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. Ninth edition. Philadelphia, PA: Elsevier/Saunders; 2015.
2. Socialstyrelsen och Cancerfonden. Cancer i siffror 2018 [Internet]. Stockholm: Socialstyrelsen och Cancerfonden; 2018 [citerad 2020-01-09] Hämtad från
3. Iqbal MN, Stott E, Huml AM, Krishnan V, Scallan CJ, Darvesh J, m.fl. What’s in a Name? Factors Associated with Documentation and Evaluation of Incidental Pulmonary Nodules. Annals ATS 2016; 13:1704–11.
4. Vanni I, Alama A, Grossi F, Dal Bello MG, Coco S. Exosomes: a new horizon in lung cancer. Drug Discov Today 2017; 22:927–36.
5. Yáñez-Mó M, Siljander PR-M, Andreu Z, Zavec AB, Borràs FE, Buzas EI, m.fl. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles 2015; 4:27066.
6. Doyle L, Wang M. Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis. Cells 2019; 8:727. 7. Dos Anjos Pultz B, Andrés Cordero da Luz F, Socorro Faria S, Peixoto Ferreira de
Souza L, Cristina Brígido Tavares P, Alonso Goulart V, m.fl. The multifaceted role of extracellular vesicles in metastasis: Priming the soil for seeding. Int J Cancer 2017; 140:2397–407.
8. Iraci N, Leonardi T, Gessler F, Vega B, Pluchino S. Focus on Extracellular Vesicles: Physiological Role and Signalling Properties of Extracellular Membrane Vesicles. IJMS 2016; 17:171.
9. Muller L, Hong C-S, Stolz DB, Watkins SC, Whiteside TL. Isolation of Biologically-Active Exosomes from Human Plasma. J Immunol Methods 2014; 411:55–65. 10. Thakur BK, Zhang H, Becker A, Matei I, Huang Y, Costa-Silva B, m.fl.
Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Res 2014; 24:766–9.
11. Lee K, Shao H, Weissleder R, Lee H. Acoustic Purification of Extracellular Microvesicles. ACS Nano 2015; 9:2321–7.
12. Théry C, Witwer KW, Aikawa E, Alcaraz MJ, Anderson JD, Andriantsitohaina R, m.fl. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a
position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles 2018; 7:1535750.
13. Ku A, Ravi N, Yang M, Evander M, Laurell T, Lilja H, m.fl. A urinary extracellular vesicle microRNA biomarker discovery pipeline; from automated extracellular vesicle enrichment by acoustic trapping to microRNA sequencing. PLOS ONE 2019;
14:e0217507.
14. Rezeli M, Gidlöf O, Evander M, Bryl-Górecka P, Sathanoori R, Gilje P, m.fl. Comparative Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles Isolated by Acoustic Trapping or Differential Centrifugation. Anal Chem 2016; 88:8577–86.
15. Bachurski D, Schuldner M, Nguyen P-H, Malz A, Reiners KS, Grenzi PC, m.fl. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis – An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles 2019; 8:1596016.
16. Dragovic RA, Gardiner C, Brooks AS, Tannetta DS, Ferguson DJP, Hole P, m.fl. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine 2011; 7:780–8.
17. Hong C-S, Funk S, Muller L, Boyiadzis M, Whiteside TL. Isolation of biologically active and morphologically intact exosomes from plasma of patients with cancer. Journal of Extracellular Vesicles 2016; 5:29289.
18. Kulshreshtha A, Ahmad T, Agrawal A, Ghosh B. Proinflammatory role of epithelial cell–derived exosomes in allergic airway inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology 2013; 131:1194-1203.e14.
19. Lee H, Zhang D, Zhu Z, Dela Cruz CS, Jin Y. Epithelial cell-derived microvesicles activate macrophages and promote inflammation via microvesicle-containing
microRNAs. Sci Rep 2016; 6:35250.
20. Feller D, Kun J, Ruzsics I, Rapp J, Sarosi V, Kvell K, m.fl. Cigarette Smoke-Induced Pulmonary Inflammation Becomes Systemic by Circulating Extracellular Vesicles Containing Wnt5a and Inflammatory Cytokines. Front Immunol 2018; 9:1724.
21. Wu D, Deng S, Liu T, Han R, Zhang T, Xu Y. TGF‐β‐mediated exosomal lnc‐MMP2‐ 2 regulates migration and invasion of lung cancer cells to the vasculature by promoting MMP2 expression. Cancer Med 2018; 7:5118–29.
22. Kim J, Kim TY, Lee MS, Mun JY, Ihm C, Kim SA. Exosome cargo reflects TGF-β1-mediated epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) status in A549 human lung adenocarcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun 2016; 478:643–8.
23. Witwer KW, Buzás EI, Bemis LT, Bora A, Lässer C, Lötvall J, m.fl. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles 2013; 2:20360.
24. Frühbeis C, Helmig S, Tug S, Simon P, Krämer-Albers E-M. Physical exercise induces rapid release of small extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles 2015; 4:28239.
25. McVey M, Tabuchi A, Kuebler WM. Microparticles and acute lung injury. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology 2012; 303:L364–81. 26. Boon RA, Vickers KC. Intercellular Transport of MicroRNAs. Arterioscler Thromb
Vasc Biol 2013; 33:186–92.
27. Helwa I, Cai J, Drewry MD, Zimmerman A, Dinkins MB, Khaled ML, m.fl. A
Comparative Study of Serum Exosome Isolation Using Differential Ultracentrifugation and Three Commercial Reagents. PLoS ONE 2017; 12:e0170628.
28. Jayachandran M, Miller VM, Heit JA, Owen WG. Methodology for Isolation, Identification and Characterization of Microvesicles in Peripheral Blood. J Immunol
Methods 2012; 375:207–14.
29. György B, Szabó TG, Pásztói M, Pál Z, Misják P, Aradi B, m.fl. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci 2011; 68:2667–88.
30. Evander M, Gidlöf O, Olde B, Erlinge D, Laurell T. Non-contact acoustic capture of microparticles from small plasma volumes. Lab Chip 2015; 15:2588–96.
