Institutionen för hälsovetenskap och medicin Enheten för Klinisk medicin
Program: Biomedicin och metoder inom medicin diagnostik Kurs: BMLV, avancerad nivå, Examensarbete 15 hp
Datum: HT 2015
CK5/6 och CEA uttryck i skivepitelcancer i
lunga: en retrospektiv studie
Författare: Ihsan Kasim, B.Sc, M.Sc, Gävle sjukhuset
Handledare: Hirsh Koyi, MD, PhD, Gävle sjukhuset Examinator: Allan Sirsjö, Prof,
CK5/6 och CEA uttryck i skivepitelcancer i
lunga: en retrospektiv studie
Ihsan Kasim
Bakgrund. Diagnostisk av lungcancer med exakt klassificering av tumörtypen, har stor betydelse med specifik behandling.
Syfte. Att undersöka CK5/6 och CEA uttryck i lungtumörer som klassificerades som skivepitelcancer efter rutin färgning (Hematoxylin- eosin).
Metod. En retrospektiv studie med CK5/6 och CEA immunhistokemiska färgningsmarkörer av lungbiopsier som initialt diagnostiserades som skivepitelcancer. Resultat. I 61 lungbiopsier var 34,4% (n=21) CK5/6 positiva och CEA negativa. Dessa representerade ren skivepitelcancer. I 47,5% (n=29) förekom både markörerna, CK5/6 och CEA färgning. Dessa klassificerades som adeno-skivepitelcancer. I 14,8% (n=9) förekomst endast CEA färgning. Dessa klassificerades som adenocarcinom. I 3,3 % (n=2) saknades både CK5/6 och CEA färgning. Dessa ansågs som odifferentierad cancer. Konklusion. Många fall av skivepitelcancer i lungan uttrycker även körteldifferentiering. Dessa förhållanden påverkar val av behandling.
Nyckelord: lungcancer, skivepitelcancer, adenocarcinom, CK5/6, CEA, immunhistokemi.
CK5/6 and CEA expression in lung
squamous cell carcinoma: a retrospective
analysis
Ihsan Kasim
Background Accurate classification of lung carcinomas is of importance for choice of adequate chemotherapy
Aim To study CK5/6 and CEA expression in lung tumors classified as squamous cell carcinomas after routine staining (Hematoxylin-eosin)
Method A retrospective study with CK5/6 and CEA immuno-histochemical staining of lung biopsies with an initial diagnosis of squamous cell carcinoma
Results In 61 lung biopsies 34.4% (n=21) showed a pure CK5/6 staining and were classified as squamous cell carcinomas. Twenty nine (47.5%) were both CK5/6 and CEA stained and the CK5/6 immunoreaction predominated in all cases except in two in which the CEA immunoreaction predominated. These tumors were re-classified as adeno-squamous carcinomas. In nine cases (14.8%) were only CEA immunoreactive and were re-classified as adenocarcinomas. Only 3.3% (2/61) stained negative for both CK5/6 and CEA and were classified as undifferentiated carcinomas.
Conclusion The results show that lung squamous cell carcinomas routinely diagnosed in Hematoxylin-eosin stained sections to a high extent could be re-classified to adenocarcinoma after CK5/6 and CEA immunostaining. The re-classification may result in a refined choice of treatment
Key words: lung cancer, squamous cell carcinoma, adenocarcinoma, CK5/6, CEA, expression.
1
Förkortningar
ADC Adenocarcinom BB Bronkoskopi
CB Core biopsi
CEA Carcinoembrygent antigen CK 5/6 Cytokeratin 5/6
DAB Diaminobensidintetrahydroklorid HE Hematoxylin-eosin
H2O2 Väteperoxid
HTX Hematoxylin
HRP Horse radish peroxidas IHK Immunhistokemi KDa Kilodalton
NSCLC Icke småcellig lungcancer SCC Skivepitelcancer
TTF-1 Tyroidea tanskriptionsfactor-1 WHO World Health Organization
2
Introduktion
Lungcancer
Lungcancer är en aggressiv tumörsjukdom och den blir idag allt vanligare hos befolkningen. Nästan 4000 individer diagnostiseras med lungcancer i Sverige per år. Det är därmed den femte vanligaste cancerformen bland både män och kvinnor i landet. De flesta som drabbas är mellan 60 och 80 år (1).
Lungcancer är den främsta orsaken till cancerrelaterad död i hela världen (2). Det är samtidigt en cancerform med hög dödlighet, fem årsmortaliteten är närmare 90 % enligt Europeiska data (3). Den står i Sverige för drygt var femte dödsfall i cancersjukdom (4) och den totala incidensen är ca 40 fall per 100 000 invånare (5-6). I Gävleborg diagnosticeras varje år mellan 100 och 130 nya fall. Av dessa har upp till 50 % av patienterna fjärrmetastasering vid diagnostillfället och ytterligare ca 25 % lokalt avancerad sjukdom med lymfkörtelmetastasering.
Den vanligaste orsaken till lungcancer är tobaksrökning. Även radon, asbest och avgaser är exempel på medverkande faktorer till cancer utvecklingen. Oftast upptäckts lungcancer sent eftersom symtomen kommer i ett skede när cancern redan har spridit sig. Vanligaste symtomen är hosta, hemoptys (blodhosta), dyspné (andnöd), bröstsmärta, heshet, trötthet, aptitlöshet, viktminskning och feber. Prognos och överlevnad av sjukdomen är mycket dålig. Tidig diagnos samt behandling är avgörande för prognosen. (1, 7).
Totalt är femårsöverlevnaden 15-31 %, med en exponentiell minskning för personer med lungcancer i sent skede, som förekommer hos ca 70 % av patienter med icke - småcellig lungcancer (NSCLC) (2, 8-9). Femårsöverlevnaden har rapporterats vara ca 12 % för män och 15 % för kvinnor i Sverige (5-6).
Det finns olika typer av lungcancer och de flesta uppträder i epitelvävnader som bronker och i lungparenkym. Efter histologiskt utseende indelas lungcancer i två huvudgrupper: Småcellig lungcancer (SCLC) som utgör ca 20 % och NSCLC som utgör ca 80 % av
3
fallen. De vanligaste typerna av NSCLC är skivepitelcancer (SCC) och adenocarcinom (ADC) (1, 10).
Skivepitelcancer
SCC är en malign epitelialcell tumör som utgör nästan 25 % av cancerfallen (10). Det är den vanligaste lungcancerformen hos män. Vanligen uppstår den centralt i primärbronk, sekundärbronk eller segmentbronk. Den kan också uppstå i perifera delarna av lungan (11). SCC utgår från metaplastiska skivepitelceller i bronker. Oftast växer den långsammare och metastaserar något senare än t.ex. ADC (12).
Makroskopiskt är SCC en oregelbunden, ofta fast och gråvit tumör som ofta har nodulär tillväxt med central nekros och kavitation.Histologiskt kännetecknas SCC av förekomst av keratinpärlor (ett stabilt olösligt protein) och intracellulära bryggor mellan angränsade tumörceller (figur1). Morfologiska typer av SCC inkluderar papillär, klarcellig, basaloid och småcellig icke keratiniserande cancer. Immunhistoskemiskt (IHK) innehåller vanligen SCC cytokeratin 5/6 antigen (CK 5/6) som finns i basala celler i normala bronkepitelet (12).
Figur 1. Skivepitelcancer med en keratinpärla och intracellulära bryggor, Hematoxylin eosin färgning. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Well_differentiated_squamous_cell_carcinoma.jpg#fil e Keratinpärl a Intracellulära bryggor
4 Adenocarcinom
ADC utgör nästan 40 % av lungcancerfallen (10), kvinnor drabbas oftare än män och tumören kan även förekomma hos icke rökare. Sjukdomen uppkommer ofta i anslutning till ärr i lungans perifera delar men kan också uppstå centralt (13). Den växer ofta långsamt, men metastaserar relativt tidigt. Symtomen uppträder sent på grund av det perifera läget (10,13).
Det finns olika typer av ADC. Vanligaste är en perifert växande tumör, som är gråvit, köttig, fast och med fibrosbeläggning på lungsäcken. Histologiskt ses körteldifferentiering och/eller mucinproduktion i tumörcellerna. Det finns olika morfologiska typer av ADC som acinär (körtelbildande), papillär, bronchioloalveolär, solid med mucin formning, blandad typ och olika varianter av dessa typer. IHK karakteriseras ADC genom uttryck av olika tumörmarkörer, en av dessa är carcinoembrygent antigen (CEA) (13).
Under senare år har andelen SCC i lunga minskat medan andelen ADC har ökat. Den ökningen kan antingen bero på en verklig ökning eller på ändrande diagnoskriterier eller på båda dessa faktorer tillsammans (14).
Histologisk diagnostik
Histologiskt provmaterial för patologisk anatomisk diagnos (PAD) av lungcancer består av bronkoskopi (BB) och core biopsier (CB), dvs. datortomografiledda mellannålsbiopsier. Huvudsakligen sker diagnostik av lungcancer med en vanlig
färgningsmetod, s.k. Hematoxylin-eosin (HE). Enligt World Health Organization ”WHO”-klassifikationen från 2015 ”vid tydlig morfologisk bild av SCC inte något tillägg av IHK färgning” rekommenderas. Det vill säga om det går att påvisa keratinisering och/eller intercellulärbryggor. Den morfologiska diagnosen blir ofta kategorisk, ibland endast sannolik, men nästan alltid vägledande. Ibland kan det vara svårt vid lågt differentierade SCC att skilja dem från andra typer av NSCLC (15-17).
För att förbättra lungcancer diagnostiken krävs användning av IHK färgning, som är ett komplement till HE. En säker diagnos har betydelse för att skilja lungcancer från metastatisk cancer och för möjligheten till riktad behandling (18)
5
Immunhistokemisk färgning
Med en IHK kan specifika proteinmarkörer (antigener) och deras lokalisation i vävnadssnitt detekteras med hjälp av specifikt märkta primär-antikroppar. Användningsområdet för IHK är stort, såväl forskning som i klinisk diagnostik tillåter metoden retrospektiva studier på arkiverat material. Metoden är viktig för att identifiera och klassificera tumörvävnad.
Inom IHK finns olika metoder som t.ex. direkt och indirekt metod. Vid direkt metod är den primära antikroppen inmärkt med ett fluorescerande färgämne eller ett enzymkomplex. Med indirekt metod används ett flerstegs teknik. I en två-stegsmetod detekteras den primära antikroppen med en märkt sekundär antikropp, medan med tre-stegsmetod krävs ytterligare en märkt antikropp som binds till den sekundära inmärkta antikroppen (19).
Den metod som användes i den här studien är en tre-stegsmetod med ett kit, OptiView DAB, som är ett indirekt biotinfritt system för detektering av den primära antikroppen. Systemet bygger på att den primära antikroppen binder till sitt antigen i vävnaden, och sedan fäster till en enzymmärkt sekundär antikropp s.k. HQ cocktail. HQ är en patentskyddad hapten som är kovalent bunden till den sekundera antikroppen. Denna i sin tur känns igen av en tertiär antikropp, enzymmärkt med horseradish peroxidas (HRP) multimer. Detta komplex av antikropp-antigenbindning visualiseras sedan med väteperoxidassubtrat (H2O2) och 3,3′ - diaminobensidintetrahydroklorid (DAB)
kromogen som bildar en brun fällning. Vävnadsprovet kontrastfärgas med hematoxylin lösning (HTX), som färgar cellkärnor blå genom bindning av ett bindemedel-färgkomplex till nukleinsyror och histonproteiner i hetrokromatinet. Resultat tolkas med ett ljusmikroskop (20). Se figur 2.
6
Figur 2 Optiview DAB immunhistokemisk detektions kit visar 3-stegsmetods antikroppar med ett enzymkomplex.
http://productlibrary.ventanamed.com/ventana_portal/OpenOverlayServlet?launchIndex=1&obj ectId=760-7001010323EN
OptiView DAB som användes i diagnostiken är både känslig och flexibel. Den gör specifik respektive sensitiv testning, genom att icke specifik bildning inte sker. Den har förmågan att identifiera låga nivåer av tumörmarkörer (CK5/6, CEA antigen) (20).
Tumörmarkörer vid differentialdiagnostik
Diagnostik med HE färgning är mer eller mindre sannolik men med tillägg av IHK kan en morfologisk bedömning stödjas (18). Att kunna skilja mellan SCC och ADC har blivit ett viktigt steg för att välja behandlingsalternativ (21).
Det finns olika markörer i lungcancer diagnostiken. Det rapporterades att CK5, CK5/6, p40, p63 är positiva tumörmarkörer för SCC. Positiva markörer för ADC är CK7,18 och 19, Tyroidea tanskriptionsfactor-1 (TTF-1), Napsin A och CEA (12,13,15–16).
Färgning med p63 och TTF-1 har använts för att skilja mellan SCC och ADC, detsamma gäller med färgningen CK5/6 och CK7 (21).
Angående CK antigen bakgrund, den är en stor familj av intracellulära cytoskelettproteiner i epitelceller. Keratin bildar intermediära filament proteiner. De utgör en familj på cirka 20 polypeptider med molekylvikt på 40-68 kilodalton (kDa). CK kan delas in i två typer. Typ I med surt pH och typ II ett basiskt pH. CK markörerna används för differentialdiagnostik av epitel (22-23).
7
Alveolära celler innehåller lågmolekylära CK-polypeptider typiska för s.k. körtelepitel (CK7,18 och 19), medan basala celler i bronkepitelet innehåller CK5/6. Alla ADC uttrycker CK typiska för körtelepitel medan SCC har en mer komplex CK fenotyp (15-16).
TTF-1 är en markör för kärnprotein som förekommer i thyreoideas follikelceller samt i typ II pneumocyter i alveolerna och i Clara celler i bronkioler. Napsin A är en cytoplasmatisk markör som förekommer i alveolarepitelcell II samt i njurepitelcancer (16, 22). Båda är lungspecifika markörer och är positiva i mer än 85-90% av ADC och används rutinmässig i ADC diagnostik enligt en studie i södra Sverige (24) och andra olika studier. Detsamma gäller CK5, CK5/6, p40 och p63 som är positiva tumörmarkörer i mer än 90 % av SCC (25).
Enligt WHO-klassifikationen från 2015 rekommenderas vid otydlig morfologisk diagnostik av SCC och ADC, en minimal panel av markören (p40, p63, CK5 eller CK5/6) för SCC och en markör (TTF-1 eller Napsin A) för ADC. I Sverige finns det en tradition att patologläkaren tar större ansvar och på eget initiativ utreder tumörursprung och beställer tilläggsanalyser utifrån morfologisk bild (16).
I den här studien utnyttjades CK5/6 och CEA som tumörmarkörer vid lungcancer diagnostiken.
CK5/6 är intracytoplasmatisk intermediär filament protein som utrycks i skivepitelceller. CK5/6 är ett basiskt protein med en högmolekylvikt, på 58 respektive 56 kDa. Antigenen är en specifik markör för SCC i lungan och negativ markör för ADC i lungan (23). CEA var den första tumörmarkören som beskrivits med relativt hög känslighet för många avancerade ADC, känslighets mättning är störst i ADC (26). CEA är ett glykoprotein med varierande kolhydrat komponenter. Molekylvikten är 180 kDa. Det finns i normala mukosala celler och ökar i mängd i ADC särskild i koloncancer. Det förkommer också vid ADC i lungan. Det är en typisk markör för körtelepitel, positiv i ADC och rekommenderas att användas i differentialdiagnostik med SCC (22-23). Vid diagnostik av NSCLC kan markören användas tillsammans CK5/6 (20).
Enligt en studie har CEA 97 % sensitivitet och specificitet för ADC, vid användning som enda markör (27). Enligt en annan studie är CK5/6 en specifik markör och har 100 % specificitet och mer än 80 % sensitivitet för SCC. Detta bekräftas av två tidigare studier
8
(28). Dessutom har enligt socialstyrelsen CK5/6 99 % specificitet och 99 % sensitivitet för SCC (18).
Avslutningsvis uttrycks CK5/6 i cytoplasman i SCC medan CEA utrycks i både cellmembran och cytoplasma i ADC.
Syfte
Målet med den här studien är att undersöka graden av körteldifferentiering i lungtumörer som klassificerades som SCC efter rutin färgning med HE.
Material och metod
Etiska aspekter
Eftersom studien endast grundar sig på färgning av identifierat och arkiverat vävnadsmaterial kommer ingen ansökan till etisk kommitté att göras.
Lungbiopsier
I den här studien användes formalinfixerad och paraffinbäddad vävnad från 67 fall av lung SCC diagnostiserad med 50 CB och 17 BB teknik. Patienterna utgjordes av 37 män och 30 kvinnor, som var mellan 54 till 83 år. Alla fall av SCC i lunga var registrerade i Enheten för Klinisk Patologis datasystem (Sympathy), Gävle sjukhus, under åren 1996 till 2009. De identifieras via datorsystemets specifika topografiska och morfologiska koder (T28, M80703). Paraffinklotsarna snittades och färgades därefter för histologisk och immunhistokemisk färgning.
Histologi
Snittning och färgning
De paraffinbäddade lungbiopsierna snittades (3,5µm) i en mikrotom och placerades därefter på objektglas (Menzel- Gläser, Tyskland) med avjoniserat vatten som blandades med ca två droppar äggviteglycerin på. Glasen överfördes till en objektglashållare och
9
flyttades till en automatisk färgmaskin (Tissue-Tek® Prisma, Sakura, Japan) där de
torkades i ca 25 min med värmeugn och därefter färgades med HE program. I färgningsprocessen blir glasen avparaffinerade med xylen och rehydrerade med minskande koncentration av alkohol därefter färgade med HE samt dehydrerade med alkohol och xylen. Färgmaskinen är ihopkopplad med monteringsapparat (Tissue-Tek®
Film, Sakura, Japan). Där monterades glasen automatisk med filmglas och pertex som monteringsmedel.
Immunhistokemi
Snittning och färgning
De paraffinbäddade lungbiopsierna snittades (3,5µm) och placerades därefter på superfrost plus (laddade) objektglas med avjoniserat vatten på. På varje glas placerades ett positivt (även negativt) kontrollsnitt (appendix, pankreas, lever och tonsill) för CK5/6 och CEA antikroppar. För CK5/6 var tonsill som positivt, lever och pankreas var som negativa medan för CEA var appendix som positivt. Glasen sorterades i objektglashållare inför IHK färgning.
Från Ventana medical system användes instrument (Benchmark Ultra, USA) som är en automatiserad objektglasfärgningsmaskin. I färgningsmaskinen användes Ventana medical system OptiView DAB IHK detektions kit 760-700 som innehåller, inhibitor lösning (väteperoxidas) för att blockera endogent peroxidas, HQ universal sekundär antikropp (get anti-mus IgG, get anti-mus IgM och get anti-kanin), HRP multimer innehåller monoklonal anti-HQ märkt HRP-tertiär musantikropp, DAB, H2O2 och
kopparsulfat. Även HTX som är en modifierad Mayer hematoxylin och blåningsreagens som är en vattenlösning buffrad med 0,1 M litiumkarbonat från Ventana medical system användes.
De antikroppar som användes var monoklonala mus CK5/6 (D5/16B4, ref. 790-4554) från Ventana medical system och monoklonala mus CEA (CEA 31, ref.760-4594) antikroppar från Cell marque. Båda var färdigspädda på spruta till Benchmark Ultramaskinen.
10
Avparaffinering och färgningsprocedur utfördes självständigt med maskinen enligt protokoll för de primära antikropparna, CK5/6 och CEA. Se bifogade protokoll (Bilaga 1-2).
När färgning var klar doppades glasen i handvarmt kranvatten med diskmedel innan de sköljdes 5 min i rinnande handvarmt kranvatten. Därefter dehydrerades glasen med Tissue-Tek® Prisma färgmaskin med alkohol och xylen. Sedan monterades glasen
automatisk med pertex via Tissue-Tek® Films apparat.
Diagnostik bedömning
Både HE och IHK färgningarna avlästes i mikroskop av en patolog. IHK färgningen undersöktes semi-kvantitativt. Färgningsintensitet och reaktivitet graderades som positiv (1-3) och (0) som negativ. De proverna som markerades med 1+ hade <10% positiva celler, 2+ hade 10-50% positiva celler och 3+ hade >50% positiva celler. Se figur 3. Positiv och negativ vävnadkontroll kontrollerades.
11
Figur 3. Immunhistokemisk färgning med olika graderingar av lungcancer A. Adenocarcinom, CEA överuttryck (1+). B. Adenocarcinom, CEA överuttryck (2+). C.
12
Resultat
Resultatet av IHK färgning med CK5/6 och CEA i 61 lungtumörer initialt bedömda som SCC visas i tabell 1. En del prover hade tumörområden med olika stark infärgning och därför har flera graderingar. Av de 67 proverna var sex fall (tre män och tre kvinnor) borttagna på grund av otillräckligt material.
Tabell 1. Samtliga resultat analyser av olika graderingar (0, 1+, 2+ och 3+) med CK5/6 och CEA proteinöveruttryck på lungbiopsier med immunhistokemi.
Fall CK5/6 CEA Kön Ålder (år) BB/CB
1 3+ 0 m 83 CB 2 3+ 0 k 81 CB 3 3+ 0 k 72 CB 4 3+ 0 m 71 CB 5 3+ 3+ m 77 CB 6 3+ 3+ k 81 CB 7 1+ 1+ m 78 CB 8 3+ 3+ k 77 CB 9 3+ 2+ m 80 CB 11 3+ 0 m 79 BB 12 3+ 3+ k 78 CB 13 3+ 0 m 80 CB 14 0 1+ k 74 CB 15 3+ 0 k 71 CB 16 3+ 0 k 80 CB 17 3+ 2+ m 78 CB 18 0 3+ m 72 CB 19 3+ 2+ m 71 BB 20 0 2+ k 77 CB 21 3+ 2+ m 78 CB 22 2+ 3+ m 76 BB 23 3+ 0 k 70 CB 24 3+ 0 k 70 CB 25 3+ 0 m 73 CB 26 3+ 1+ k 71 CB 27 0 1+ m 72 CB 28 3+ 3+ m 69 CB 29 3+ 0 m 75 CB
13 30 3+ 0 m 67 BB 31 3+ 2+ m 63 CB 32 3+ 1+ m 72 CB 33 3+ 1+ m 66 CB 34 3+ 1+ m 72 CB 35 3+ 1+ k 66 CB 36 0 3+ m 69 CB 37 0 3+ k 66 CB 38 0 0 m 63 CB 39 3+ 3+ k 62 BB 40 3+ 0 m 66 CB 41 3+ 1+ k 65 BB 42 3+ 2+ m 67 CB 43 3+ 1+ m 67 CB 44 3+ 2+ m 60 CB 45 3+ 1+ k 64 CB 46 3+ 2+ m 61 BB 47 0 1+ k 56 CB 48 2+ 1+ k 56 CB 49 0 0 k 63 CB 50 2+ 0 m 56 CB 51 1+ 0 k 55 CB 52 3+ 0 k 72 BB 53 0 3+ k 54 BB 54 1+ 0 m 71 BB 55 3+ 0 m 69 BB 56 3+ 3+ k 60 BB 57 1+ 3+ m 70 BB 58 3+ 1+ m 60 BB 60 0 1+ m 62 BB 61 3+ 0 m 62 BB
BB (bronkoskopi), CB (core biopsi), m (man), k (kvinna), 1+ (<10% positiva celler), 2+ (10-50% positiva celler), 3+ (>50% positiva celler) och 0 (ingen färgning).
Sammanställning av resultat i tabell 1 visas i tabell 2 och 3. I 21 fall (34,4 %) var CK5/6 positiv och CEA negativ. Dessa representerade ren SCC. I 29 fall (47,5 %) var både CK5/6 och CEA positiva. I två fall var CEA färgningen starkare än CK5/6 färgningen och i åtta fall var båda färgningen lika stark. Dessa betraktades som blandad ADC och SCC (adeno-skivepitelcancer). Se figur 4, som visar CEA markörer färgar ADC celler
14
medan CK5/6 markörer färgar SCC celler i samma fall. I nio fall (14,8 %) var endast CEA positiva och i Fyra fall av dessa var CEA färgningen i mer än 50 % av tumörceller. Dessa åter klassificerades som ADC. I två fall (3,3 %) var både CK5/6 och CEA färgningen negativa, vilket tyder på att dessa representerar odifferentierad cancer.
Tabell 2. Procentuella fördelningar mellan CK5/6 och CEA med positiva och/eller negativa proteinmarkörer.
Tabell Antal % CK5/6 CEA Kommentar
21 34,4 % positiva negativa
29 47,5 % positiva positiva 2 st CEA > CK5/6 och 8 st CEA=CK5/6 9 14,8 % negativa positiva
2 3,3 % negativa negativa
Totalt 61
Tabell 3. Gradering med förhållande mellan CK5/6 och CEA proteinmarkörer
.
CK5/6
CEA
0
1+
2+
3+
Total
---
0
2
2
1
18
23
1+
4
1
1
9
15
2+
1
0
0
9
10
3+
4
1
1
713
---
Total
11
4
3
43
61
15
Figur 4. Jämförelse mellan CEA och CK5/6 markörfärgningar av de olika cellerna i samma fall. Ovan: översikt av mikroskopisk bild över CEA och CK5/6 färgningar. Under: detaljerad mikroskopisk bild över CEA och CK5/6 markörer av adenocarcinom respektive skivepitelcancer cellfärgning
.
16
Diskussion
Diagnos av maligna lungtumörer sker ofta i ett sent skede och behandlingen med botemedel är då oftast omöjlig. Eftersom diagnostiken bygger på mikroskopiska undersökningar av små biopsier som BB eller CB, är därför tumörmaterialet begränsat och även antalet IHK färgningar som kan utföras (29).
I den här undersökningen utfördes en retrospektiv studie för att utvärdera ett antal fall av SCC i lunga diagnostiserade med HE färgning. Det fanns en svårighet i diagnostik av lungtumörer när de saknar de typiska dragen av SCLC och tecken på ADC differentiering såsom körtel och papillära strukturer saknas. De flesta tumörer var solida och med bara tillfälliga och tydliga tecken på skivepitel differentiering.
Eftersom biopsimaterialet för IHK var begränsat, valdes CK5/6 som anses vara en relevant och specifik markör för skivepitel differentiering i lungcancer (30-33). CEA valdes som sensitiv markör för att demonstrera ADC differentiering (34), eftersom CEA uttrycks i mer än 95 % av ADC i lunga (35-36). TTF-1ansågs inte vara ett alternativ eftersom den ibland också färgar tumörceller med SCC differentiering (37-39).
Även om CEA är en mycket känslig markör för ADC i lungan har den nackdelen av en låg specificitet (34). De flesta gastrointestinala ADC till exempel är typiskt CEA positiva, men den nackdelen hade mindre betydelse i studien eftersom inga undersökta tumörer var med all sannolikhet inte av metastatisk natur. Napsin A är en annan mycket känslig och specifik markör för lung ADC (40-41), men har nackdelen av en minskad expression i lågt differentierade tumörer (42).
Över 50 % av SCC uttryckte ADC markören. En del tumörer färgades med både CK5/6 och CEA och reklassificerades som adeno-skivepitelcancer. En del tumörer var endast CEA positiva och klassificerades som ADC. Sammanlagt 62 % av tumörerna visade körteldifferentiering. Det är oklart om en del celler färgas med båda markörerna, se figur 4.
Den aktuella studien visar att det inte alltid är lätt att beskriva lungtumörer i enkla histologiska termer. De är ofta fenotypiskt heterogena och tumörcellerna kan visa en mängd olika färgningsegenskaper med hjälp av IHK. Av denna anledning förefaller det möjligt att inte bara kvalitativa utan även kvantitativa mätningar i framtiden kommer att bli ett krav att beskriva biologi en lungtumör.
17
Det här resultatet visar tydligt att histologisk klassificering av små lungbiopsier på HE färgade snitt är svårt och att ytterligare IHK färgningen kommer att förfina diagnostiken. En mer specifik klassificering av maligna lungtumörer har stor betydelse genom de senaste framstegen med specifika terapier.
Tillkännagivande
Med stor respekt vill jag tacka alla som hjälpte mig på alla sätt och vis att klara den här uppsatsen.
Först och främst vill jag tacka min handledare:
Hirsh Koyi, utan dig mitt ”master”-skepp var i turbulents hav vilse och besviken men med din hjälp, vänlighet, uppmuntran och tips fick det att segla fram.
Sedan vill jag rikta ett speciellt stort tack till:
Professor Erik Wilander, för ödmjukhet, dyrbara tider, konsultation, stöd och diagnostik. Patologer, Michiel Dooper och Péter Egerszegi, för genomgång av diagnostiken.
Slutligen vill jag tacka:
Patologi enheten i Gävle sjukhus, för projekt utförandet. Anna lindblad, för digitala bilder.
18
Referenser
1. Cancerfonden, lungcancer [Internet]. Stockholm Gotland: Regionalt cancer centrum. 2015 [citerad 2015 April 15]. Tillgänglig från:
https://www.cancerfonden.se/om-cancer/lungcancer
2. Dela Cruz CS, Tanoue LT, Matthay RA. Lung cancer: epidemiology, etiology, and prevention. Clin Chest Med. 2011; 32:605-44.
3. Verdecchia A, Francisci S, Brenner H, Gatta G, Micheli A, Mangone L, et al. Recent cancer survival in Europe: a period analysis 2000–2002 of the
EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 2007; 8: 784–796.
4. Wilking N, Högberg D, Jönsson B. Karolinska Institutet/i3 Innovus Benchmarking report of lung cancer care in selected European Countries [Internet]. Stockholm, Comparator Reports, 2008.p.6-8. [citerad 2015 Okt 28]. Tillgänglig från:
http://www.comparatorreports.se/Lung_cancer_benchmarking_080526.pdf 5. Socialstyrelsen [Internet]. Nationella riktlinjer for lungcancer vård.
2011.[citerad 2015 Okt 28]. Tillgänglig från:
http://www.socialstyrelsen.se/publikationer2011/2011-3-2
6. Socialstyrelsen [Internet]. Cancerincidens i Sverige 2012. Nya diagnosticerade cancerfall år 2012. Sveriges Officiella Statistik, statistik – hälso- och sjukvård. 2014. [citerad 2015 Okt 28]. Tillgänglig från:
http://www.socialstyrelsen.se/publikationer2013/2013-12-17
7. Om lungcancer [Internet]. Healthcare Media.2013 [citerad 2015 April 15]. Tillgänglig från: http://lungcancer.se/om-lungcancer/
8. Schabath MB, Thompson ZJ, Gray JE. Temporal trends in demographics and overall survival of non–small-cell lung cancer patients at Moffitt Cancer Centre from 1986 to 2008. Cancer Control. 2014; 21:51-6.
9. Jung CY. Biopsy and mutation detection strategies in non-small cell lung cancer. Tuberc Respir Dis (Seoul). 2013; 75:181-87.
10. Läkemedelsboken, lungcancer [Internet]. Göteborg: Sahlgrenska universitetssjukhus. 2014 [citerad 2015 April 15]. Tillgänglig från: http://www.lakemedelsboken.se/j4_onk_lungcancer_2013fm10.html
19
11. Funai K, Yokose T, Ishii G. Ariki K, Yoshida J, Nishimura M, et al.
Clinicopathologic characteristics of peripheral squamous cell carcinoma of the lung. Am J Surg Pathol. 2003; 27:978–984.
12. Hammar SP, Brambilla E, Pugatch B, Geisinger K, Fernandez EA, Vogt P, et al. Squamous cell carcinoma. In: Travis WD, Brambilla E, Muller-hermelink HK, Harris CC red. Pathology and genetics of tumours of the lung, pleura, thymus, and heart. Lyon: IARC Press. 2004. p. 26-30.
13. Colby TV, Noguchi M, Henschke C, Vazquez MF, Geisinger K, Yokose T, et al. Adenocarcinoma. I: Travis WD, Brambilla E, Muller-hermelink HK, Harris CC, red. Pathology and genetics of tumours of lung, pleura, thymus and heart. Lyon: IARC; 2004.p. 35-44.
14. Vårdprogram för lungcancer och mesoteliom [Internet]. Uppsala Örebro: Regionalt cancercentrum. 2012 [citerad 2015 April 10]. Tillgängligt från: http://www.slmf.se/v%C3%A5rdprogram
15. 15. Regionalt vårdprogram för lungcancer [Internet]. Norra sjukvårdsregionen: Norrbotten, Västerbotten, Västernorrland och Jämtland. 2015. [citerad Dec 6]. Tillgängligt från:
https://www.cancercentrum.se/globalassets/cancerdiagnoser/lunga-och-lungsack/norr/regionalt_vardprogram_lungcancer_150123.pdf
16. Lungtumörer- Svensk Förening för Patologi – Svensk Förening för Klinisk Cytologi. Framtagen av Thorax-KVAST-grupp.Dok.nr. Thorax-1. 2015.
17. Grilley-Olson JE, Hayes DN, Moore DT, Leslie KO, Wilkerson MD, Qaqish BF, et al. Validation of interobserver agreement in lung cancer assessment: hematoxylin-eosin diagnostic reproducibility for non-small cell lung cancer: the 2004 World Health Organization classification and therapeutically relevant subsets. Arch Pathol Lab Med.2013;137:32–40.
18. Socialstyrelse [Internet]. Misstänkt lungcancer där cytologiskt eller histologiskt vävnadsprov utförs. 2015. [citerad Dec 6]. Tillgängligt från:
https://www.socialstyrelsen.se/nationellariktlinjerforlungcancervard/sokiriktlinje rna/misstanktlungcancerdarcytologi
20
19. Taylor CR, Shi SR. Techniques of immunohistochemistry: Principles, pitfalls, and standardization. I: Dabbs DJ. Diagnostic immunohistochemistry. United States of America: Elsevier science. 2013. p. 1-12
20. Optiview DAB IHC detection kit [Internet]. Tucson: Ventana medical system; - [uppdaterad 2011 jun 23;citerad 2015 Jun 03]. Tillgänglig från:
http://www.ventana.com/product/1574?type=2037
21. Ho C, Tong KM, Ramsden K, Lonescu DN, Laskin J. Histologic classification of non-small-cell lung cancer over time: reducing the rates of not-otherwise-specified. Curr Oncol 2015;22(3):e164-70.
22. Advanced staining catalogue novocastra TM IHC antibodies, probes & leica bond reagents. International Ed. Bromma. 2014; p.50, 71, 104,133-134, 178 och 201.
23. Leong A S-Y, Cooper K F, Leong FJ W-M. Manual of diagnostic antibodies for immunohistology. 2nd ed. London: Greenwich medical media ltd; 2003.p. 185-86, 51-52.
24. Brunnström H, Johansson L, Jirström K, Jönsson M, Jönsson P, Planck M. Immunohistochemistry in differential diagnostics of primary lung cancer – an investigation within the Southern Swedish Lung Cancer Study. Am J Clin Pathol.2013; 140:37-46.
25. Zhang K, Deng H, Cagle PT. Utility of Immunohistochemistry in the Diagnosis of Pleuropulmonary and Mediastinal Cancers: A Review and Update. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2014; 138:12: 1611-1628.
26. Lung cancer [Internet]. Prague: European group on tumour markers; - [citerad 2015 Dec 12]. Tillgänglig från: http://www.egtm.eu/professionals/lung_cancer
27. Richard WB, Gary MC, Atul KT, Craig Allred D. Multiple-marker immunohistochemical phenotypes distinguishing malignant pleural mesothelioma from pulmonary adenocarcinoma. Human Pathology. 1993; 24:4:347–354.
21
28. Zhao W, Wang H, Peng Y, Tian B, Peng L, Zhang DC. ΔNp63, CK5/6, TTF-1 and napsin A, a reliable panel to subtype non-small cell lung cancer in biopsy specimens Int J Clin Exp Pathol. 2014; 7:7: 4247–4253.
29. Coghlin CL, Smith LJ, Bakar S, Stewart K N, Devereux GS, Nicolson MC. et al. Quantitative analysis of tumor in bronchial biopsy specimens. Journal of
Thoracic Oncology. 2010; 5: 448-452.
30. Kaufmann O1, Fietze E, Mengs J, Dietel M.Value of p63 and cytokeratin 5/6 as immunohistochemical markers for the differential diagnosis of poorly
differentiated and undifferentiated carcinomas Am J Clin Pathol. 2001 Dec; 116(6):823-30.
31. Chu PG, Weiss LM. Expression of cytokeratin 5/6 in epithelial neoplasms: an immunohistochemical study of 509 cases. Mod Pathol. 2002 Jan; 15(1):6-10.
32. Terry J, Leung S, Laskin J, Leslie KO, Gown AM, Ionescu DN. Optimal immunohistochemical markers for distinguishing lung adenocarcinomas from squamous cell carcinomas in small tumor samples. Am J Surg Pathol. 2010 Dec; 34(12):1805-11.
33. Yunfan M, Mengying F, Liang D, Xiaozheng K, Yiqiang L, Yu S. et al.
Expression of p63 and CK5/6 in early-stage lung squamous cell carcinoma is not only an early diagnostic indicator but also correlates with a good prognosis. Thoracic Cancer. 2015; 6: 288-295.
34. Sheahan K, O'Brien MJ, Burke B, Dervan PA, O'Keane JC, Gottlieb LS, et al. Differential reactivities of carcinoembryonic antigen (CEA) and CEA-related monoclonal and polyclonal antibodies in common epithelial malignancies. Am J Clin Pathol. 1990 Aug; 94(2):157-64.
35. Vårdprogram för lungcancer-Region Skåne [Internet]. Lund: Onkologiskt centrum. 2011 [citerad 2015 Okt 6]. Tillgängligt från:
https://www.google.se/search?sourceid=navclient&hl=sv&ie=UTF-8&rlz=1T4AVNF_svSE626SE626&q=V%c3%a5rdprogram+f%c3%b6r+lungca ncer+-+Region+Sk%c3%a5ne
36. Peiguo C, Lawernce W. editor. Modern Immunohistochmistry [Internet]. United Kingdom: Cembridig University Press; 2014 [citerad 2015 Okt 5]. Tillgänglig från:
https://books.google.se/books?id=-tbSAgAAQBAJ&pg=PA89&dq=CEA+best+lung+adenocarcinoma&hl=sv&sa=
X&ved=0CDYQ6AEwA2oVChMI65e-22
mZ2syAIVi75yCh0RWAlt#v=onepage&q=CEA%20best%20lung%20adenocar cinoma&f=false
37. Downey P, Cummins R, Moran M, Gulmann C. If it's not CK5/6 positive, TTF-1 negative it's not a squamous cell carcinoma of lung. APMIS. 2008 Jun; 116(6):526-9.
38. Johansson L Histopathologic classification of lung cancer: Relevance of cytokeratin and TTF-1 immunophenotyping. Ann Diagn Pathol. 2004 Oct; 8(5):259-67.
39. Nakamura N, Miyagi E, Murata S, Kawaoi A, Katoh R. Expression of thyroid transcription factor-1 in normal and neoplastic lung tissues. Mod Pathol. 2002 Oct; 15(10):1058-67.
40. Hirano T, Auer G, Maeda M, Hagiwara Y, Okada S, Ohira T, et al. Human tissue distribution of TA02, which is homologous with a new type of aspartic proteinase, napsin A. Jpn J Cancer Res. 2000 Oct;91(10):1015-21.
41. Kim MJ, Shin HC, Shin KC, Ro JY. Best immunohistochemical panel in distinguishing adenocarcinoma from squamous cell carcinoma of lung: tissue microarray assay in resected lung cancer specimens. Ann Diagn Pathol. 2013 Feb; 17(1):85-90.
42. Stoll LM, Johnson MW, Gabrielson E, Askin F, Clark DP, Li QK. The utility of napsin-A in the identification of primary and metastatic lung adenocarcinoma among cytologically poorly differentiated carcinomas. Cancer Cytopathol. 2010 Dec 25;118(6):441-9.
23
24
