Utvärdering av kortisol och TNF-α i saliv hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19

(1)

Utvärdering av kortisol

och TNF-a i saliv hos

individer

tidigare

diagnostiserade

med

Covid-19

HUVUDOMRÅDE: Biomedicinsk laboratorievetenskap FÖRFATTARE: Louise Poolsri

HANDLEDARE: Emma Carlsson JÖNKÖPING 2021 juni

(2)

Sammanfattning

I december 2019 rapporterades fall av oidentifierad lunginflammation, senare känd som Covid-19. Antalet fall ökar fortfarande snabbt i världen och därmed utgör Covid-19 ett extraordinärt hot mot folkhälsan. Studier har visat en ökad mängd proinflammatoriska cytokiner TNF-a, associerade med andningssvårigheter samt en ökad kortisolproduktion. Utsöndring av kortisol och TNF-a är associerade med fysiska- och psykiska hälsoeffekter, sjukdomsgrad samt dödsfall av Covid-19. Syftet med studien var att undersöka utsöndringen av biomarkörerna kortisol och TNF-a i saliv hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 samt hos individer utan diagnostiserad Covid-19 (kontrollgrupp). Det för att undersöka huruvida kvarvarande symtom kunde associeras till biomarkörerna. Studien inkluderade 40 individer, varav 20 individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 samt 20 individer utan diagnostiserad Covid-19. Saliv och ett frågeformulär om deras allmänna hälsotillstånd och symtom kopplade till Covid-19 infektion samlades in och analyserades. Salivprover tagna på morgon analyserades med ELISA och resultatet jämfördes mellan grupperna. Inga signifikanta skillnader visade mellan grupperna gällande biomarkörer. Resultaten visade dessutom inga korrelation mellan symtom och biomarkörer samt att inga förhöjda nivåer av analyserade biomarkörer kan associeras med kvarvarande symtom efter en Covid-19 infektion.

(3)

Summary

Evaluation of cortisol and TNF-a in the saliva of individuals previously diagnosed with Covid-19

A cluster of unidentified pneumonia cases, later known as Covid-19, were reported in December 2019. The number of Covid-19 cases is still rapidly increasing and poses an extraordinary threat to our public health. Studies have shown an increased level of the cytokine TNF-a, associated with severe respiratory symptoms as well as an increased cortisol production. Together associated with physical and mental health effects, disease severity and increased mortality of Covid-19.

This study aimed to evaluate the secretion of cortisol and TNF-a in the saliva of individuals previously diagnosed with Covid-19 and individuals not diagnosed with Covid-19 (control group). This to examine whether the residual symptoms can be associated with the analyzed biomarkers.

The study included 40 participants, 20 individuals diagnosed with Covid-19 and 20 individuals not diagnosed with Covid -19. Saliva and a questionnaire concerning their overall health and possible symptoms associated with Covid-19 infection were collected and analyzed. Saliva morning samples were analyzed with ELISA and results were compared between the groups. No significant differences were shown between the groups regarding the biomarkers. Also, the results showed no correlations between symptoms and biomarkers, nor elevated levels of analyzed biomarkers could be associated with residual symptoms after a Covid-19 infection.

(4)

Innehållsförteckning

Sammanfattning ...

Summary ...

Innehållsförteckning ...

Inledning ... 1

Bakgrund ... 1

Coronavirus ... 1 Coronavirus disease 2019 ... 1 Kortisol ... 2

Tumor Necrosis Factor – a (TNF-a) ... 2

Covid-19 diagnostik ... 2

Enzyme-linked immunosorent assay (ELISA) ... 3

Syfte ... 4

Material och metod ... 5

Studiedesign ... 5

Provtagning och hantering av salivprover ... 5

Cortisol Saliva ELISA ... 5

TNF-a ELISA ... 5

Statistisk analys ... 6

Etiska överväganden ... 6

Resultat ... 7

Analys av kortisol och TNF-a-nivåer ... 7

Bakgrundsvariabler ... 8

Diskussion ... 10

Metoddiskussion ... 10 Resultatdiskussion ... 11

Slutsatser ... 13

Referenser ... 14

Bilagor ... 17

Bilaga 1 – Frågeformulär för individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 ... 17

Bilaga 2 – Frågeformulär för individer utan diagnostiserad Covid-19 ... 21

Bilaga 3 – Informationsbrev för individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 ... 25

Bilaga 4 – Informationsbrev för individer utan diagnostiserad Covid-19 ... 26

(5)

1

Inledning

I december 2019 rapporterades fall av oidentifierad lunginflammation med misstänkt indexfall i Wuhan, Kina. Utbrottet spred sig snabbt över hela världen och i mars 2020, identifierade Världshälsoorganisationen (WHO) utbrottet som en pandemi orsakad av Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), där sjukdomen kallas för Coronavirus disease 2019 (Covid-19) (1). Alla åldersgrupper riskerar att smittas av Covid-19 och framförallt äldre och individer med underliggande medicinska tillstånd kan bli allvarligt sjuka (2,3). Individer med Covid-19 är relativ svårdefinierade då en infektion kan orsaka mycket lindriga symtom eller mycket allvarliga symtom där det är okänd varför symtomen skiljer sig åt mellan individer (4,5).

Studier har visat en ökad mängd proinflammatoriska cytokiner hos individer med Covid-19, däribland, Tumor Necrosis Factor – alpha (TNF-a), associerade med lunginflammation och lungskador (4). Det hyperinflammatoriska tillståndet är i sin tur associerat med serotoninmetabolismen och hypotalamus-hypofys-binjurebarkaxeln (HPA-axeln), som inducerar produktion av kortisol, ett stresshormon (6). Utsöndring av kortisol och TNF-a är associerade med fysiska- och psykiska hälsoeffekter, livskvalité, sjukdomsgrad samt dödsfall av 19 (7–9). Sjukvården börjar nu även se långtidseffekter av Covid-19 infektioner, där individer tidigare diagnostiserade med Covid-Covid-19 upplever kvarvarande symtom även efter de tillfrisknat (4,5). Det är därav värdefullt att kortisol och TNF-a hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19. Det för att undersöka huruvida kvarvarande symtom kan associeras till fortsatt höga nivåer av inflammatoriska biomarkörer och stresshormon även efter ett tillfrisknande. Studien avser att analysera biomarkörer i saliv då det är en icke-invasiv provtagningsmetod, där individerna kan ta provet hemma. Därav minskar belastningen på provtagningen i vården men även smittspridningen.

Bakgrund

Coronavirus

Det finns ett stort antal virus som tillhör Coronaviridae familjen. De är en välstuderad virusgrupp som återfinns hos olika djurarter och som även kan orsaka milda till allvarliga luftvägsinfektioner hos människor. Coronavirusfamiljen är indelade i subgrupperna alfa-, beta-, gamma- och delta-coronavirus, där alfa- och beta-coronavirus vanligtvis infekterar människor och däggdjur. Subgrupperna gamma- och delta-coronavirus infekterar främst fåglar (10,11). Coronavirus är runda, höljeförsedda RNA virus som är omgivna av ett extracellulärt membran med utskott av glykoproteiner. Därmed, har de ett kronliknande utseende i elektronmikroskop och därav namnet coronavirus (10).

Coronavirus är kända för att infektera många olika värdar på grund av höga mutations- och rekombinationshastigheter och på så sätt kan de hybridisera mellan olika arter (12). Coronavirus infekterar värdcellerna med hjälp av sina glykoproteinutskott, som ansvarar för inbindning och inträde i värdcellen (13).

Coronavirus disease 2019

Sedan 1960-talet har sju humana coronavirus karakteriserats och de är associerade med både övre och nedre luftvägssjukdomar (14). Däribland två högpatogena coronavirus med zoonotiskt ursprung, Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) samt Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) som upptäcktes år 2002 samt 2012. I slutet av 2019 upptäcktes ett nytt coronavirus, SARS-CoV-2, tillhörande subgruppen beta-coronavirus, som är mycket överförbart på grund av hög prevalens, genetisk mångfald och ökad överföring mellan djur och människor (11,15). Sjukdomen Covid-19 har överträffat SARS-CoV och MERS-CoV gällande antalet infekterade och dess epidemiologiska utbredning. Antalet fall ökar fortfarande snabbt i världen och därmed utgör Covid-19 ett extraordinärt hot mot folkhälsan (10). Studier har visat att SARS-CoV-2 sprids från person till person via droppsmitta, exempelvis, när en infekterad person hostar, nyser, talar eller andas ut. Dropparna kan sedan ta sig in i kroppen via inandningen eller genom kontakt med slemhinnor i näsa och mun (11). Därav, påverkar SARS-CoV-2 främst luftvägarna och ofta de nedre luftvägarna, där Acute respiratory distress syndrome (ARDS) eller viruspneumoni kan uppstå (4). Överförbarheten av Covid-19 är mycket hög, att även asymtomatiska individer kan sprida sjukdomen. Det är därav svårt att spåra och isolera potentiella virusbärare (16).

(6)

2

Inkubationstiden för Covid-19, är ungefär 2–14 dagar (16). De vanligaste symtomen som kan förekomma vid infektion är förkylningssymtom men även huvudvärk, trötthet, muskelvärk och nedsatt lukt- och smaksinne. Individer med kvarvarande symtom efter en infektion har även en ökad risk att utveckla fysisk- och psykologisk stress samt försämrad livskvalité (4,5). Symtomen skiljer sig åt mellan individer på grund av interaktionen mellan viruset och immunsystemet, där immunsvaret förstärks med hjälp av cytokiner (17). Studier har visat en ökning av det totala antalet neutrofila celler men även av proinflammatoriska cytokiner och kemokiner. De överdrivna inflammatoriska reaktionerna produceras som svar på kaskadsignalering i immunsystemet och fenomenet kallas för cytokinstorm (4,18,19). Vid cytokinstorm produceras cytokiner snabbt och i stora mängder som svar på infektiösa agens (20). Exempel på en proinflammatorisk cytokin som produceras vid Covid-19 cytokinstorm är TNF-a (4). Det hyperinflammatoriska tillståndet hos individer med Covid-19 har i sin tur inverkan på kortisolutsöndringen (6).

Kortisol

Kortisol är ett glukokortikoidhormon, även känd som ett stresshormon, som syntetiseras och utsöndras i binjurebarken. Under normala förhållande är kortisolkoncentrationen i saliv som högst de första 30– 60 minuterna efter uppvaknandet, så kallad cortisol awakening response. Sedan minskar nivåerna på eftermiddagen och kvällen. Faktorerna som påverkar kortisolkoncentrationen är bland annat kön, ålder, medicinering, fysiska- och psykiska sjukdomar samt livsstil, så som fysisk aktivitet, övervikt och utbrändhet (21). Kortisol regleras av HPA-axeln som svar på överlevnadsmekanismen, även kallad fight och flightrespons. Fight och flightrespons reagerar snabbt vid stress och vid livshotande tillstånd och resulterar i hormonella förändringar och fysiologiska reaktioner, för att motstå eller fly ifrån ett hot (22). Den är associerade med stress men även med virusinfektioner bland annat i luftvägarna (6). Associationen mellan stress och virusinfektioner beror på kortisolens negativa feedback på immunförsvaret. Den ökande kortisolutsöndringen kan sedan binda till immuncellsreceptorer för syntes och frisättning av cytokiner. Därav, kan de ökande cytokinnivåerna leda till hyperaktivitet i HPA-axeln (8). Långvarig aktivering av HPA-axeln kan sedan leda till en minskad effektivitet av immunförsvaret. Vidare kan den negativa återkopplingen och nedregleringen av glukokortikoidreceptorerna leda till glukokortikoidresistens, vilken i sin tur främjar cytokinstorm vid virusinflammationer. Psykosocial stress kan även leda till negativ inverkan på antikroppsutveckling mot virus och resulterar i ökad produktion av proinflammatoriska cytokiner (6,23).

Tumor Necrosis Factor – a (TNF-a)

En Covid-19 infektion är associerad med ökade nivåer av TNF-a, som tillhör det innata immunförsvaret, där den produceras av monocyter och makrofager (4,24). Cytokinet TNF-a har flera funktioner och den genereras av flera celltyper genom cellsignalering (25). Den fungerar i nätverk och kaskader, som svar på sjukdomar, stress, infektioner och kroniska smärtor (25,26). Den har även en viktig roll i fysiologiska funktioner som sömnreglering, immunologisk övervakning – diagnos och behandling av cancer, immunbristsjukdomar och autoimmuna tillstånd, neuroplasticitet – nervsystemets förmåga att ändra sin reaktivitet efter upprepad aktivering, och neurogenes – bildandet av nervceller (24,25). Studier har visat att a har en viktig roll i viruspatogenes vid en virusinfektion, eftersom virus kan reglera TNF-a cellsignTNF-aleringen (27). Vid en Covid-19 infektion, kTNF-an TNF-TNF-a orsTNF-akTNF-a bronkiell hyperreTNF-aktivitet, en muskelsammandragning i luftvägarna, samt skada på respiratoriskt epitel. Skadan på respiratoriskt epitel resulterar i mucinproduktion och frisättning av inflammatoriska cytokiner (7). Den överdrivna cytokinproduktionen kan sedan leda till destruktiva effekter på lever, hjärtat, njurarna och/eller det centrala nervsystemet, vilket resulterar i multipel organdysfunktion (7,28). Av följande anledning anses den okontrollerade överproduktionen av inflammatoriska cytokiner en viktig faktor för den kliniska sjukdomsbilden av Covid-19.

Covid-19 diagnostik

Snabba och precisa diagnostiska tester behövs för att begränsa spridningen av Covid-19. Exempel på de diagnostiska tillämpningarna är realtids reverse transcriptase polymerase chain reaction (realtids RT-PCR) och serologisk diagnostik (16,29). Diagnostik med realtids RT-PCR påvisar pågående Covid-19 infektion genom detektion av SARS-CoV-2 virusgenomet i luftvägarna med ett nasofarynx-, orofarynx och/eller sputumprov (29). Den serologiska diagnostiken används för att detektera pågående eller genomgående infektion av SARS-CoV-2. Den mäter kroppens immunologiska svar på infektionen genom att påvisa de antikroppar eller markörer som bildats mot viruset i serum eller plasma (16,30). De ovannämnda diagnostiska tillämpningarna är tekniskt krävande och dyra. Dessutom tas provtagningen i första hand av vårdpersonaler, eftersom det är svårt att utföra egenprovtagning på ett korrekt sätt,

(7)

3

samt att provtagningen kan orsaka obehag för individen. Därmed, utgör provtagningen en risk för smittspridning till vårdpersonalerna. På grund av ovannämnda kan salivprov vara en fördel vid en Covid-19 diagnostik (16,31). Eftersom saliv kan samlas in genom en icke-invasiv provtagningsmetod, med möjlighet till självprovtagning. Salivdiagnostik möjliggör detektion av viruspatogener men även detektion av antikroppar, cytokiner, kemokiner och andra biologiska molekyler (29,31).

Studier har visat närvaro av bland annat kortisol och TNF-a i saliv. Därav, användes saliv för att definiera exponering och förutsäga utveckling av Covid-19 sjukdomsgrad (31).

Enzyme-linked immunosorent assay (ELISA)

Både kortisol och TNF-a i saliv kan analyseras med enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). En analysteknik som används för att detektera och kvantifiera specifika antigener eller antikroppar. Den möjliggör detektion av antigener genom att kombinera specificitet med känslighet mellan antikroppar och enzymmärkta antigener, eller vice versa, detektion av antigener med enzymmärkta antikroppar, för detektion av biologiska molekyler (32). Det finns olika ELISA-metoder, bland annat kompetetiv ELISA och Sandwich ELISA, se Figur 1. Metodprincipen för kompetetiv ELISA (Figur 1a) är den konkurrerande reaktionen om bindningsstället på den primära antikroppen mellan provantigenet och det konkurrerande enzymmärkta antigenet, eller vice versa (32). Mikrotiterplattan för en kompetetiv ELISA är ofta klädd med en antigenspecifik antikropp. Där provantigen och det enzymmärkta antigenet tillsätts. De här antigenerna konkurrerar sedan om att binda till den antigenspecifika antikroppen. Enzymaktiviteten detekteras med ett enzymsubstrat som tillsätts till mikrotiterplattan och en färgreaktion genereras. Färgomslaget för kompetetiv ELISA är omvänt proportionell till antigenkoncentrationen i provet (32,33).

Vid sandwich ELISA (Figur 1b) detekteras målantigenet via en förankring mellan två antikroppar som binder till olika epitoper på antigenet. Mikrotiterplattan för en sandwich ELISA är klädd med en antikropp, specifikt för antigenet som ska detekteras. Efter antigen-antikroppsreaktionen mellan antikroppen och målantigenet tillsätts en detektionsantikropp som är enzymmärkt. Enzymsubstrat tillsätts till mikrotiterplattan och färgreaktion genereras för enzymaktivitet detektion. Färgomslaget för en sandwich ELISA är proportionell till mängden antikropp bundna till antigen i provet. (33).

Figur 1: a) Kompetetiv ELISA där brunnen är klädd med antikroppar riktade mot provantigenet.

Provantigen och ett konkurrerande enzymmärkt antigen sätts till brunnen. Substratlösning tillsätts för att omvandla de enzymmärkta antigenkonjugaten till ett färgomslag (32,33).

b) Sandwich ELISA där brunnen är klädda med antikroppar riktade mot provantigenet. Provantigen sätts till brunnen. Enzymmärkt antikropp och substratlösning tillsätts för färgomslag (33).

Antikropp Provantigen Enzymmärkt antigen Substratlösning Enzymmärkt antikropp Färgad produkt a) Kompetetiv ELISA b) Sandwich ELISA • ⑧ By D D

(8)

4

Syfte

Syftet med studien var att undersöka utsöndringen av biomarkörerna kortisol och TNF-a i saliv hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 samt hos individer utan diagnostiserad Covid-19 (kontrollgrupp) med analystekniken ELISA. Det för att undersöka huruvida kvarvarande symtom kunde associeras till förändrade nivåer av kortisol respektive TNF-a.

(9)

5

Material och metod

Studiedesign

Studien inkluderade 40 individer (n = 40), rekryterade från region Jönköpings län, varav 20 individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 (mars 2020 – mars 2021) samt 20 individer utan diagnostiserad Covid-19. Individerna i studien utgjordes av individer från 22 år till 67 år. Inklusionskriterier för individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 var inga pågående infektioner samt tidigare diagnostiserad med positivt PCR-test för Covid-19. Inklusionskriterier för individer utan diagnostiserad Covid-19 var inga pågående infektioner eller andra förkylningssymtom de sista fyra veckorna samt ingen tidigare eller symtomatisk Covid-19 infektion. Alla individer fick även fylla i ett frågeformulär om deras allmänna hälsotillstånd och symtom associerade med Covid-19 infektion (bilaga 1 (Covid-19 gruppen) och 2 (kontrollgruppen)).

Provtagning och hantering av salivprover

Salivproverna samlades in på morgonen, av individerna själva, 30 minuter efter att de vaknade och sköljt munnen noggrant med vatten. Proverna samlades in med hjälp av SalivaBio Oral Swab provtagningskit (Salimetrics LLC, State College, PA), där bomullstussen placerades på insidan av kinden i 1–2 minuter. För individer med dåligt salivflöde rekommenderades 5 minuter för uppsamling av saliv. Bomullstussen placerades sedan i den övre provförvaringsbehållaren i röret som tillhörde provtagningskitet och provet förvarades i frys (-20 grader °C) till dess att provet analyserades. Förväntad provvolym mellan 200– 1000 µl beroende på individens salivflödehastighet, hydratiseringsstatus, sleminnehåll och applicering av stimulus. Vid analys fick proverna anta rumstemperatur, vortexades och centrifugerades vid 2000 x g i 10 minuter för att extrahera saliv ur bomullstussen.

Cortisol Saliva ELISA

Provanalysering av kortisol med Cortisol Saliva ELISA kit (TECAN, IBL International GmbH, Hamburg, Tyskland) baserades på den kompetetiva ELISA metodprincipen. Efter att proverna tinades upp och centrifugerades, tillsattes 50 µl av standarder (0,00; 0,015; 0,04; 0,17; 0,70; 3,00 µg/dl), kontroller och provmaterial i duplikat till en mikrotiterplatta, klädd med kanin anti-kortisolantikroppar. Till plattan sattes 100 µl kortisol-pepparrotperoxidas (kortisol-HRP) till samtliga brunnar. Plattan täcktes med plastfilm och inkuberades på skak (400 rpm) vid rumstemperatur i två timmar. Efter inkubationstiden tvättades plattan fyra gånger med 250 µl tvättbuffert. Koncentrationen av bundet kortisol-HRP bestämdes med hjälp av en färgreaktion, där 100 µl tetramethylbenxidine (TMB) substratlösning tillsattes till samtliga brunnar, och plattan återinkuberades på skak (400 rpm) vid rumstemperatur i 30 minuter. Efter uppnått färgomslag, stoppades enzymreaktionen med 100 µl TMB-stopplösning och plattan inkuberades på skak (100 rpm) vid rumstemperatur i 30 sekunder. För att bestämma kortisolkoncentrationen, mättes proverna spektrofotometriskt vid 450 nm. Detektionsintervallet för kortisol var 0,00–3,00 µg/dl.

TNF-a ELISA

Provanalysering av TNF-a med TNF-a ELISA kit (TECAN, IBL International GmbH) baserades på sandwich ELISA metodprincipen. Efter att proverna tinades upp och centrifugerades, tillsattes 100 µl standard (23; 47; 94; 188; 375; 750; 1500 pg/ml) respektive 100 µl sample diluent samt 50 µl prov spätt med 50 µl sample diluent i duplikat till en mikrotiterplatta klädd med anti-human TNF-a antikroppar. Till plattan tillsattes 50 µl biotinylerad anti-human TNF-a och plattan täcktes med plastfilm samt inkuberades på skak (400 rpm) vid rumstemperatur i två timmar. Efter inkubationstiden tvättades plattan sex gånger med 400 µl tvättbuffert. Sedermera tillsattes 100 µl streptavidin-HRP konjugat till samtliga brunnar och plattan återinkuberades på skak (400 rpm) vid rumstemperatur i en timme. Därpå tvättades plattan sex gånger med 400 µl tvättbuffert. Sandwich-komplexet visualiserades med 100 µl TMB-substratlösning som tillsattes till samtliga brunnar och plattan inkuberades mörkt vid rumstemperatur i tio minuter. Sedermera tillsattes 100 µl TMB-stopplösningen och plattan inkuberades på skak (100 rpm) vid rumstemperatur i 30 sekunder. För att bestämma TNF-a koncentrationen mättes proverna spektrofotometriskt vid 450 nm. Detektionsintervallet för TNF-a var 0,00–1500 pg/ml.

(10)

6

Statistisk analys

Resultatet sammanställdes och bearbetades i Microsoft Excel version 16.47 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) för att bestämma koncentrationen av kortisol respektive TNF-a med hjälp av en konstruerad standardkurva ur standarderna. Resultatet samt frågeformulären bearbetades vidare i IBM SPSS Statistics version 27.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA), där icke-parametrisk test – Mann Whitney U-test samt korrelationsanalys användes för att undersöka kortisol respektive TNF-a i saliv. Valet av analys baserades på ett normalitetstest, som visade att variablerna inte var normalfördelade, samt att individerna var oberoende av varandra. Korrelationsanalys – Spearmans rho användes för att visa om det fanns något samband mellan variablerna. Även X2_{-test och linjär regressionsanalys} användes för att undersöka om det fanns någon skillnad mellan grupperna och dess bakgrundsvariabler samt relation mellan symtom och kortisol respektive TNF-a. För en signifikant skillnad användes p-värde <0,05.

Etiska överväganden

Studien genomfördes enligt Vetenskapsrådet – God forskningssed, för hur en forskning ska bedrivas enligt de fyra etiska riktlinjerna information-, samtycke-, konfidentiell- och nyttjandekravet.

Förfrågan om medverkan i studien utfördes både muntligt och skriftligt via informationsbrev (Bilaga 3 och 4). I informationsbrevet framgick en riktig och lättförståelig beskrivning av syftet med studien och tillvägagångssättet.

Deltagandet i studien var frivilligt och de kunde ångra sin medverkan när som helst utan att ange något skäl. Individernas anonymitet bibehölls då samtliga prover och frågeformulär var avkodade utan några personuppgifter. Därmed kunde ingen koppling till individerna göras. Provmaterialet och de besvarade frågeformulären användes endast för studiens ändamål. Alla framtagna material förvarades säkert, där endast behöriga i studien hade tillgång till provmaterialet och de besvarade frågeformulären.

Studien är ett examensarbete och därav behövdes den inte granskas av etikprövningsnämnden. Däremot har en etisk egengranskning genomförts enligt Hälsohögskolan i Jönköping (Bilaga 5).

(11)

7

Resultat

Analys av kortisol och TNF-a-nivåer

Resultaten visade inga signifikanta skillnader av kortisol- och TNF-α-nivåer mellan individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 och individer utan diagnostiserad Covid-19 (Figur 2). Medianen för kortisol för gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 var 1,81 µg/dl respektive 1,69 µg/dl för individer utan diagnostiserad Covid-19 (Figur 2a). Spridningen för kortisolkoncentrationen hos grupperna var 0,00–2,08 µg/dl (tidigare diagnostiserade med Covid-19) respektive 0,325–2,272 µg/dl (individer utan diagnostiserad Covid-19). Medianen för TNF-α för gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 var 235,67 pg/ml respektive 315,67 pg/ml för individer utan diagnostiserad Covid-19 (Figur 2b). Spridningen för TNF-α-koncentrationen hos grupperna var 0,00–964,00 pg/ml (tidigare diagnostiserade med 19) respektive 10,67–737,33 pg/ml (individer utan diagnostiserad Covid-19).

Figur 2: Undersökning av kortisol (a) respektive TNF-a (b) koncentrationer mellan gruppen påvisad Covid-19 respektive ej påvisad Covid-19. Skillnaden mellan grupperna var inte signifikant (p>0,05).

Korrelationen mellan kortisol och TNFa visade inget signifikant samband mellan biomarkörerna, r = -0,004, p>0,05.

(12)

8

Bakgrundsvariabler

Demografisk data från samtliga individer innefattade allmänt hälsotillstånd, symtom samt medicinska tillstånd. Resultatet visade signifikanta skillnader mellan grupperna i symtom som huvudvärk och migrän, trötthet, andnöd, försämrat lukt- och smaksinne, koncentrationssvårigheter, minnesnedsättning, att ovan besvär eller symtom medför besvär i daglig sysselsättning, annan långvarig sjukdom samt annan medicinering (tabell 1).

Tabell 1: Demografisk data, individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 samt individer utan

diagnostiserad Covid-19 där p<0,05 användes som signifikansnivå.

Bakgrundsvariabler Individer tidigare

diagnostiserade med Covid-19 (n=20) Individer utan diagnostiserad Covid-19 (n=20) p-värde Kön 0,527 Man 9 11 Kvinna 11 9 Hälsotillstånd 0,337 Mycket bra 5 7 Bra 11 12 Någorlunda 4 1

Värk i skuldror, nacke, axlar 1,000

Ja 7 7

Nej 13 13

Ryggsmärtor, ryggvärk, höftsmärtor 0,677

Ja 4 3

Nej 16 17

Värk/smärtor i händer, armbågar, ben eller knän 0,058

Ja 7 2 Nej 13 18 Huvudvärk, migrän 0,013* Ja 9 2 Nej 11 18 Trötthet 0,001* Ja 13 3 Nej 7 17 Sömnsvårigheter 0,077 Ja 8 3 Nej 12 17 Eksem, hudutslag 0,548 Ja 2 1 Nej 18 19 Återkommande magtarmbesvär 1,000 Ja 2 2 Nej 18 18 Övervikt, fetma** 0,65 Ja 5 1 Nej 14 19 Andnöd 0,008* Ja 6 0 Nej 14 20 Hjärtklappning 0,072 Ja 3 0 Nej 17 20 Feber 0,147 Ja 2 0 Nej 18 20 Bröstsmärtor 0,147 Ja 2 0 Nej 18 20 Hosta 0,151

(13)

9 Ja 4 1 Nej 16 19 Illamående, kräkningar 0,147 Ja 2 0 Nej 18 20 Försämrat luktsinne <0,001* Ja 12 1 Nej 8 19 Försämrat smaksinne <0,001* Ja 12 0 Nej 8 20 Yrsel 0,072 Ja 3 0 Nej 17 20 Koncentrationssvårigheter 0,002* Ja 8 0 Nej 12 20 Minnesnedsättning 0,017* Ja 5 0 Nej 15 20

Medför ovan besvär i daglig sysselsättning*** 0,020*

Ja 5 0

Nej 15 19

Annan långvarig sjukdom 0,028*

Ja 8 2

Nej 12 18

Autoimmun sjukdom 0,548

Ja 2 1

Nej 18 19

Medicinerats med kortison 0,072

Ja 3 0

Nej 17 20

Behandlats med annan medicinering 0,006*

Ja 10 2

Nej 10 18

Fysisk aktivitet uppdelat i två grupper 0,113

Aldrig, oregelbundet,

mer sällan än en gång 8 13

1–7 gånger 12 7

* Betecknar statistisk signifikans

** Internt bortfall hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 *** Internt bortfall hos individer utan diagnostiserad Covid-19

Inga signifikanta samband mellan nivåer av kortisol respektive TNF-a och signifikanta symtom så som huvudvärk och migrän, trötthet, andnöd, försämrat lukt- och smaksinne, koncentrationssvårigheter, minnesnedsättning, att ovan besvär eller symtom medför besvär i daglig sysselsättning, andra långvarig sjukdom samt annan medicinering kunde utrönas med linjär regressionsanalys, p>0,05.

(14)

10

Diskussion

Syftet med studien var att undersöka utsöndringen av biomarkörerna kortisol och TNF-a i saliv hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 infektion samt hos individer utan diagnostiserad Covid-19, för att undersöka huruvida kvarvarande symtom efter infektion kunde associeras till biomarkörerna. Studiens resultat visade inga signifikanta skillnader mellan grupperna med avseende på kortisol respektive TNF-a utsöndring eller samband mellan de två biomarkörerna. Däremot visade resultaten signifikanta skillnader mellan grupperna när symtom associerade till Covid-19 studerades. Symtomen kunde inte associeras till ökade nivåer av kortisol och TNF-a.

Metoddiskussion

I studien deltog initialt 46 individer, varav sex individer exkluderades från studien på grund av för lite provmaterial, fel provförvaring samt att inklusionskriterierna inte uppfylldes. Därav utgjorde totalt 40 individer underlag för resultatet. Studien innehöll en jämn könsfördelning och stor åldersspridning där den yngsta individen var 22 år gammal och äldsta 67 år gammal. Medelåldern bland individerna var 37 år.

I studien användes saliv som provmaterial, eftersom saliv kan samlas in genom en icke-invasiv provtagningsmetod, samt att saliv har väldig hög känslighet och specificitet vid Covid-19 diagnostik i jämförelse med nasofarynxprov (34). Salivprov är att föredra på grund av dess enkelhet och kostnadseffektivitet men framför allt för möjligheten till självprovtagning. Dock kan självprovtagningen medföra ett metodiskt problem där preanalytiska faktorer bör övervägas noggrant under tolkningen. Förutom provtagning kan andra faktorer ha signifikanta effekter på resultaten, bland annat provförvaring, provbearbetning men även analytens dygnsvariation (35). Individerna ansvarade för att följa provtagningsanvisningarna; att varken dricka, äta eller borsta tänderna innan provtagningen samt att de ska skölja munnen noggrant med vatten innan provtagning. Individerna ansvarade även för tiden de hade bomullstussen i munnen samt att provet förvarades fryst tills dess att provet lämnades in för analys. I aktuell studie exkluderades de individer där tydliga preanalytiska faktorer kunde påverka resultatet så som mängd provmaterial och fel förvaringstemperatur.

Utöver salivprov fick individerna även svara på ett frågeformulär om deras allmänna hälsotillstånd och symtom associerade till Covid-19 infektion samt medicinska tillstånd. Det för vidare sambandsanalys mellan symtom och analyserade biomarkörer.

Studien ämnade analysera kortisol och TNF-a på grund av deras association med virusinfektioner men även dess påverkan på individens hälsotillstånd. Det negativa samspelet mellan kortisol och TNF-a kan leda till fysiska- och psykiska hälsoeffekter, försämrad livskvalité, ökad sjukdomsgrad samt dödsfall vid en Covid-19 infektion (7–9). Det är därav värdefullt att analysera biomarkörerna kortisol och TNF-a för hantering och förbättring av den kliniska behandlingen vid en Covid-19 infektion samt minska dödligheten associerad med viruset (4,20,28). Biomarkörerna kortisol och TNF-a analyserades med ELISA på grund av dess tillförlitlighet, känslighet och specificitet. Metoden har flera fördelar, bland annat låg detektionsgräns (hög känslighet och specificitet), kort analystid och en relativ billig analysteknik (36).

De kommersiella kit som användes i studien var Cortisol Saliva ELISA och TNF-a ELISA från TECAN IBL International GmbH, vilka innehöll kommersiella kontroller och standarder. För Cortisol Saliva ELISA fanns sex standarder och två kontroller (låg och hög) medan TNF-a ELISA innehöll sju standarder och en blank. Allt material analyserades i duplikat, därav beräknades ett genomsnitt absorbansvärde för samtliga. Reproducerbarheten mellan absorbansduplikat för samtliga standarder, prov, kontroller respektive blank var väldig höga (89% för Cortisol Saliva ELISA respektive 93% för TNF-a ELISA). Standarder för Cortisol Saliva ELISA och TNF-a ELISA samt blank hade godkända absorbansvärden.

(15)

11

Resultatdiskussion

Vid utvärdering av kortisol respektive TNF-a utsöndring mellan grupperna kunde inga signifikanta skillnader identifieras och resultaten visade inga samband mellan de två biomarkörerna. Däremot var medianen för kortisol hos gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 högre än gruppen utan diagnostiserad Covid-19. Resultaten visade ett omvänd förhållande för TNF-a. Även demografiska data analyserades där analyserade data visade att individerna i gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 var främst kvinnor (n=11) samt att individerna i gruppen (n=12) tränade 1–7 gånger/vecka. Många av de hade även betydligt fler symtom medan gruppen utan diagnostiserad Covid-19 bestod främst av män (n=11) och flera av individer i gruppen (n=13) tränade aldrig, oregelbundet eller sällan, samt att få antal individer hade symtom. Tidigare rapporterad forskning har visat att kvinnor är mer motståndskraftiga mot virus samt att fysisk aktivitet har en skyddande effekt för att insjukna i Covid-19 (37,38). Resultat som inte stödjer fynden i aktuell studie. Skillnaderna beror troligtvis på en alltför liten studiepopulation i aktuell studie. En utökad studiepopulation hade troligen visat en annorlunda könsfördelning samt en annan fördelning på fysisk aktivitet.

En möjlig anledning till att medianen för kortisol hos gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 var högre kunde bero på att tre individer i gruppen hade medicinerats med kortison senaste månaden. Dock visade de tre individerna inte högre nivåer av kortisol vilket därmed inte bidrog till högre median. Tidigare studier har visat att utsöndringen av kortisol påverkas av bland annat kön, livsstil, grad av fysisk aktivitet samt fysiska- och psykiska sjukdomar (21,37). Studier har visat att könsskillnader kan spela en viktig faktor vid kortisolkoncentrationer då det finns fler affektiva störningar hos kvinnor än män. Att fysisk aktivitet (träningsintensitet och varaktighet) stimulerar HPA-axeln och resulterar i kortisolproduktion samt att fysiska- och psykiska sjukdomar är externa stressfaktorer (21,37–39). Därav kan den något högre medianen för kortisol i gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 bero på andra faktorer ej kopplade till en Covid-19 infektion, så som kön och grad av fysisk aktivitet. I en liten studiepopulation kan könsfördelningen med flertalet kvinnor få en större genomslagskraft där möjligen kvinnor kan uppleva psykiska obehag i större utsträckning än män efter en Covid-19 infektion. Även hård fysisk aktivitet kan öka utsöndringen av kortisol (38). Fler individer i gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 tränade flertalet gånger per vecka jämfört med gruppen utan diagnostiserad Covid-19 vilket kan ha påverkat kortisolnivåerna.

En trolig anledning till att medianen för TNF-a hos gruppen utan diagnostiserad Covid-19 var högre kan vara på grund av den låga fysiska aktiviteten bland individerna. Studier har visat att fysisk aktivitet inhiberar cytokin-kemokinproduktion och att regelbunden fysisk aktivitet betraktas som en antiinflammatorisk behandling (40,41). Eftersom flera individer i gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 tränar 1–7 gånger/vecka, kan det leda till att gruppen har lägre TNF-a medianvärde. Två individer från gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 hade däremot TNF-a koncentrationen >800 pg/ml, vilket var högre än de andra individerna. Därav granskades deras demografiska data vidare. Eftergranskningen visade att ena individen hade värk/smärtor i händer/armbågar/ben/knän, huvudvärk/migrän, trötthet, eksem/hudutslag, återkommande magtarmbesvär, andnöd, illamående/kräkningar, försämrat luktsinne, försämrat smaksinne, yrsel, koncentrationssvårigheter samt minnesnedsättning. Individen hade även svarat att ovan besvär medför besvär i daglig sysselsättning samt att individen hade annan långvarig sjukdom, autoimmun sjukdom, medicinerats med kortison och behandlats med annan medicinering. Den andra individen hade också värk/smärtor i händer/armbågar/ben/knän, minnesnedsättning, annan långvarig sjukdom, autoimmun sjukdom, medicinerats med kortison och behandlats med annan medicinering men även sömnsvårigheter och övervikt/fetma. De nämnda symtom samt medicinska tillstånd förklarar troligtvis de högre TNF-a koncentrationerna. Eftersom kroniska smärtor, sjukdomar och infektion samt vissa autoimmuna sjukdomar är associerade med T-hjälparceller och uttryck av proinflammatoriska cytokiner som TNF-a (24,25). I studien valde vi att inte exkludera ovan individer då de inte påverkade medianvärdet eller eventuell signifikans.

Korrelationsanalys mellan biomarkörerna visade inget signifikant samband. Avsaknaden av signifikanta skillnader mellan grupperna i utsöndring av kortisol och TNF-α kan möjligtvis bero på att individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 varit sjuka i Covid-19 sedan en tid tillbaka och är friskförklarade, men även på grund av halveringstiden för kortisol respektive TNF-a som är korta. Därav kan nivåerna på biomarkörerna sjunka till lägre vid provtagningstillfället (42,43). Enligt Mortaz et. al., ska serum TNF-a hos svårt sjuka Covid-19 individer med intensivvård vara signifikant högre än de friska individer. Det ska även finnas en signifikant skillnad mellan mild sjuka Covid-19 individer och friska individer

(16)

12

(44). Enligt Pal et. al., ska serum kortisolkoncentrationen hos Covid-19 individer vara signifikant högre än de friska individer. Svårighetsgraden av Covid-19 måste definieras väl vid tolkning av kortisolkoncentrationen på grund av kortisoldynamiken i relation till stress och eller andra sjukdomsrelaterad kortikosteroidinsufficiens (45). I aktuell studie undersöktes huruvida biomarkörerna kunde associeras till kvarvarande symtom, vilket inte har kunnat associerats. Kvarvarande symtom efter en Covid-19 infektion kan därmed bero på andra inflammatoriska markörer. Den demografiska datan visade att tio symtom samt medicinska tillstånd visade signifikanta skillnader mellan grupperna och att de signifikanta symtomen var huvudvärk och migrän, trötthet, andnöd, försämrat lukt- samt smaksinne, koncentrationssvårigheter, minnesnedsättning, att ovan besvär eller symtom medför besvär i daglig sysselsättning, annan långvarig sjukdom men även behandlats med annan medicinering. De nämna signifikanta symtomen överensstämmer mycket med de symtomen samt medicinska tillstånd som de två individerna med TNF-a koncentrationen >800 pg/ml hade. Därav, studerades de signifikanta symtomen samt medicinska tillstånd vidare med linjär regressionsanalys för att hitta samband mellan symtom och nivåer av kortisol respektive TNF-a. Inget signifikant samband mellan symtom och biomarkörerna kunde utrönas. Den demografiska datan som har fått fram baserades på individernas uppskattning om deras allmänna hälsotillstånd och symtom som de angav i frågeformulären. Flera individer i gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 upplever betydligt fler symtom än gruppen utan diagnostiserad Covid-19. Däremot uppskattades endast fyra av de i gruppen tidigare diagnostiserade med Covid-19 att de har kvarvarande symtom. Många av de har även svarat ja på att de fortfarande har försämrat lukt- samt smaksinne (n=12). Vilket är två av de vanligaste symtomen som kan förekomma vid en Covid-19 infektion (4). Det kan vara så att de upplever att de är friska och mår bra i allmänhet och inte har några kvarvarande symtom trots att så inte är fallet eller vice versa. Kvarvarande symtom efter en Covid-19 infektion är vanligt och är olika för alla. För vissa avtar symtomen gradvis medan andra kan få långvariga till allvarliga symtom, där utredningar, behandlingar och uppföljningar behövs. De kvarvarande symtomen kan bero på tidigare kroniska sjukdomstillstånd som individen lider av eller relaterade till Covid-19. Oftast förbättras det postinfektiösa tillståndet med tiden även om det kan ta upp till ett eller flera år. Vidare forskning om kvarvarande symtom efter en Covid-19 infektion behövs med långsiktiga uppföljningar hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19 (46,47). Biomarkörerna har kort halveringstid och det viktiga inklusionskriteriet för att medverka i studien var friska individer utan några pågående infektioner. Studien tog inte hänsyn till asymtomatiska individer som kan vara symtomfria men är potentiella virusbärare.

Vid vidare studier bör större populationer undersökas med utökad Covid-19 kategorisering som asymtomatisk diagnostiserad 19, mild symtomatisk diagnostiserad 19, svårt sjuka Covid-19 samt en kontrollgrupp utan diagnostiserad Covid-Covid-19 med antikroppstest. Det för att säkerställa att kontrollgruppen inte är asymtomatiska virusbärare. Samtliga standarder, prov, kontroller respektive blank kan vidare analyseras i triplikat för att förbättra resultat mätosäkerhet. Även utökade biomarkörer bör övervägas på grund av de överdrivna inflammatoriska reaktionerna vid Covid-19 infektion, så som cytokinstorm. Bland annat IL-1 som deltar aktivt i den inflammatoriska kaskaden mot en infektion men även IL-6 som är involverad i inflammatoriska reaktioner, immunsvar och hematopoes samt dess förmedling av TNF-a vars överproduktion förknippades med sjukdomsgrad (4,20,48,49).

(17)

13

Slutsatser

Utsöndring av kortisol och TNF-a är associerade med fysiska- och psykiska hälsoeffekter, sjukdomsgrad samt dödsfall hos individer med Covid-19. Dock visade inte studien några signifikanta skillnader mellan grupperna tidigare diagnostiserade med Covid-19 respektive utan diagnostiserad Covid-19 med avseende på kortisol- och TNF-α-utsöndring. Studien visade vidare inget samband mellan de två biomarkörerna samt inga samband mellan rapporterade symtom associerade med Covid-19 infektion och analyserade markörer. För att vidare utvärdera den inflammatoriska profilen kopplad till Covid-19 infektion och dess symtom bör studien utökas med en större studiepopulation, utökat antal inflammatoriska biomarkörer samt en ingående analys av sjukdomsförloppet. Vidare forskning om kvarvarande symtom efter en Covid-19 infektion krävs med långsiktiga uppföljningar hos individer tidigare diagnostiserade med Covid-19.

(18)

14

Referenser

1. Li Q, Guan X, Wu P, Wang X, Zhou L, Tong Y, et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus–Infected Pneumonia. N Engl J Med. 2020 Mar 26;382(13):1199– 207.

2. Ningthoujam R, Khomdram D. WHO statement – “Older people are at highest risk from COVID-19”: Should the hypothesis be corroborated or rejected? Medical Hypotheses. 2020 Nov;144:109896.

3. Kluge HHP, Wickramasinghe K, Rippin HL, Mendes R, Peters DH, Kontsevaya A, et al. Prevention and control of non-communicable diseases in the COVID-19 response. The Lancet. 2020 May;395(10238):1678–80.

4. Huang C, Wang Y, Li X, Ren L, Zhao J, Hu Y, et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 2020 Feb 15;395(10223):497–506.

5. Chang D, Xu H, Rebaza A, Sharma L, Dela Cruz CS. Protecting health-care workers from subclinical coronavirus infection. Lancet Respir Med. 2020 Mar;8(3):e13.

6. Alpert O, Begun L, Garren P, Solhkhah R. Cytokine storm induced new onset depression in patients with COVID-19. A new look into the association between depression and cytokines -two case reports. Brain, Behavior, & Immunity - Health. 2020 Dec;9:100173.

7. Leija-Martínez JJ, Huang F, Del-Río-Navarro BE, Sanchéz-Muñoz F, Muñoz-Hernández O, Giacoman-Martínez A, et al. IL-17A and TNF-α as potential biomarkers for acute respiratory distress syndrome and mortality in patients with obesity and COVID-19. Med Hypotheses. 2020 Nov;144:109935.

8. Raony Í, de Figueiredo CS, Pandolfo P, Giestal-de-Araujo E, Oliveira-Silva Bomfim P, Savino W. Psycho-Neuroendocrine-Immune Interactions in COVID-19: Potential Impacts on Mental Health. Front Immunol. 2020 May 27;11:1170.

9. Assaf AM, Al-Abbassi R, Al-Binni M. Academic stress-induced changes in Th1- and Th2-cytokine response. Saudi Pharmaceutical Journal. 2017 Dec;25(8):1237–47.

10. Deng S-Q, Peng H-J. Characteristics of and Public Health Responses to the Coronavirus Disease 2019 Outbreak in China. J Clin Med. 2020 Feb 20;9(2).

11. Shereen MA, Khan S, Kazmi A, Bashir N, Siddique R. COVID-19 infection: Emergence, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 2020 Jul;24:91–8.

12. Lau SKP, Chan JFW. Coronaviruses: emerging and re-emerging pathogens in humans and animals. Virol J. 2015 Dec;12(1):209.

13. Walls AC, Park Y-J, Tortorici MA, Wall A, McGuire AT, Veesler D. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell. 2020 Apr 16;181(2):281-292.e6. 14. Kahn JS, McIntosh K. History and Recent Advances in Coronavirus Discovery. Pediatric

Infectious Disease Journal. 2005 Nov;24(11):S223–7.

15. Malik AA, Butt NS, Bashir MA, Gilani SA. A scientometric analysis on coronaviruses research (1900–2020): Time for a continuous, cooperative and global approach. Journal of Infection and Public Health. 2021 Mar;14(3):311–9.

16. Suleman S, Shukla SK, Malhotra N, Bukkitgar SD, Shetti NP, Pilloton R, et al. Point of care detection of COVID-19: Advancement in biosensing and diagnostic methods. Chemical Engineering Journal. 2021 Jun;414:128759.

17. Paces J, Strizova Z, Smrz D, Cerny J. COVID-19 and the Immune System. Physiol Res. 2020 Jun 30;379–88.

18. Chen N, Zhou M, Dong X, Qu J, Gong F, Han Y, et al. Epidemiological and clinical characteristics of 99 cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan, China: a descriptive study. The Lancet. 2020 Feb;395(10223):507–13.

19. Astuti I, Ysrafil. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2): An overview of viral structure and host response. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Reviews. 2020 Jul;14(4):407–12.

20. Diao B, Wang C, Tan Y, Chen X, Liu Y, Ning L, et al. Reduction and Functional Exhaustion of T Cells in Patients With Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). Front Immunol. 2020 May 1;11:827.

21. Wüst S, Wolf J, Hellhammer DH, Federenko I, Schommer N, Kirschbaum C. The cortisol awakening response - normal values and confounds. Noise Health. 2000;2(7):79–88.

22. Goldstein DS. Adrenal Responses to Stress. Cell Mol Neurobiol. 2010 Nov;30(8):1433–40. 23. Peters EMJ, Schedlowski M, Watzl C, Gimsa U. To stress or not to stress:

(19)

15 Neurobiology of Stress. 2021 May;14:100296.

24. Zhang L, Yao CH. The Physiological Role of Tumor Necrosis Factor in Human Immunity and Its Potential Implications in Spinal Manipulative Therapy: A Narrative Literature Review. Journal of Chiropractic Medicine. 2016 Sep;15(3):190–6.

25. Clark IA, Alleva LM, Vissel B. The roles of TNF in brain dysfunction and disease. Pharmacology & Therapeutics. 2010 Dec;128(3):519–48.

26. Takahashi S, Fukushima H, Yu Z, Tomita H, Kida S. Tumor necrosis factor α negatively regulates the retrieval and reconsolidation of hippocampus-dependent memory. Brain, Behavior, and Immunity. 2021 Mar;S0889159121000982.

27. Upton JW, Kaiser WJ, Mocarski ES. Cytomegalovirus M45 Cell Death Suppression Requires Receptor-interacting Protein (RIP) Homotypic Interaction Motif (RHIM)-dependent Interaction with RIP1. Journal of Biological Chemistry. 2008 Jun;283(25):16966–70.

28. Udomsinprasert W, Jittikoon J, Sangroongruangsri S, Chaikledkaew U. Circulating Levels of Interleukin-6 and Interleukin-10, But Not Tumor Necrosis Factor-Alpha, as Potential Biomarkers of Severity and Mortality for COVID-19: Systematic Review with Meta-analysis. J Clin Immunol. 2021 Jan;41(1):11–22.

29. Afzal A. Molecular diagnostic technologies for COVID-19: Limitations and challenges. Journal of Advanced Research. 2020 Nov;26:149–59.

30. Velay A, Gallais F, Benotmane I, Wendling MJ, Danion F, Collange O, et al. Evaluation of the performance of SARS-CoV-2 serological tools and their positioning in COVID-19 diagnostic strategies. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2020 Dec;98(4):115181.

31. Fernandes LL, Pacheco VB, Borges L, Athwal HK, de Paula Eduardo F, Bezinelli L, et al. Saliva in the Diagnosis of COVID-19: A Review and New Research Directions. J Dent Res. 2020 Dec;99(13):1435–43.

32. Gan SD, Patel KR. Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology. 2013 Sep;133(9):1–3.

33. Aydin S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 2015 Oct;72:4–15.

34. Güçlü E, Koroglu M, Yürümez Y, Toptan H, Kose E, Güneysu F, et al. Comparison of saliva and oro-nasopharyngeal swab sample in the molecular diagnosis of COVID-19. Rev Assoc Med Bras. 2020 Aug;66(8):1116–21.

35. de Oliveira LC, Pereira NB, Moreira CHV, Bierrenbach AL, Salles FC, de Souza-Basqueira M, et al. ELISA Saliva for Trypanosoma cruzi Antibody Detection: An Alternative for Serological Surveys in Endemic Regions. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 2020 Apr 1;102(4):800–3.

36. Nilsson AC, Holm DK, Justesen US, Gorm-Jensen T, Andersen NS, Øvrehus A, et al. Comparison of six commercially available SARS-CoV-2 antibody assays—Choice of assay depends on intended use. International Journal of Infectious Diseases. 2021 Feb;103:381–8. 37. Lavretsky H, Newhouse PA. Stress, Inflammation, and Aging. The American Journal of Geriatric

Psychiatry. 2012 Sep;20(9):729–33.

38. Hill EE, Zack E, Battaglini C, Viru M, Viru A, Hackney AC. Exercise and circulating Cortisol levels: The intensity threshold effect. J Endocrinol Invest. 2008 Jul;31(7):587–91.

39. Basta M, Chrousos GP, Vela-Bueno A, Vgontzas AN. Chronic Insomnia and the Stress System. Sleep Medicine Clinics. 2007 Jun;2(2):279–91.

40. Smart NA, Larsen AI, Le Maitre JP, Ferraz AS. Effect of Exercise Training on Interleukin-6, Tumour Necrosis Factor Alpha and Functional Capacity in Heart Failure. Cardiology Research and Practice. 2011;2011:1–6.

41. Santos RVT, Viana VAR, Boscolo RA, Marques VG, Santana MG, Lira FS, et al. Moderate exercise training modulates cytokine profile and sleep in elderly people. Cytokine. 2012 Dec;60(3):731–5.

42. Jung C, Greco S, Nguyen HH, Ho JT, Lewis JG, Torpy DJ, et al. Plasma, salivary and urinary cortisol levels following physiological and stress doses of hydrocortisone in normal volunteers. BMC Endocr Disord. 2014 Dec;14(1):91.

43. Zahn G, Greischel A. Pharmacokinetics of tumor necrosis factor alpha after intravenous administration in rats. Dose dependence and influence of tumor necrosis factor beta. Arzneimittelforschung. 1989 Sep;39(9):1180–2.

44. Mortaz E, Tabarsi P, Jamaati H, Dalil Roofchayee N, Dezfuli NK, Hashemian SM, et al. Increased Serum Levels of Soluble TNF-α Receptor Is Associated With ICU Mortality in COVID-19 Patients. Front Immunol. 2021 Apr 22;12:592727.

45. Pal R, Banerjee M, Bhadada SK. Cortisol concentrations and mortality from COVID-19. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 2020 Oct;8(10):809.

(20)

16

46. Zhou M, Cai J, Sun W, Wu J, Wang Y, Gamber M, et al. Do post-COVID-19 symptoms exist? A longitudinal study of COVID-19 sequelae in Wenzhou, China. Annales Médico-psychologiques, revue psychiatrique. 2021 Mar;S000344872100086X.

47. Willi S, Lüthold R, Hunt A, Hänggi NV, Sejdiu D, Scaff C, et al. COVID-19 sequelae in adults aged less than 50 years: A systematic review. Travel Medicine and Infectious Disease. 2021 Mar;40:101995.

48. Conti P. Induction of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) and lung inflammation by COVID-19: anti-inflammatory strategies. J Biol Regul Homeost Agents. 2020 Mar;34(2):1. 49. Costela-Ruiz VJ, Illescas-Montes R, Puerta-Puerta JM, Ruiz C, Melguizo-Rodríguez L.

SARS-CoV-2 infection: The role of cytokines in COVID-19 disease. Cytokine Growth Factor Rev. 2020 Aug;54:62–75.

(21)

17

Bilagor

Bilaga 1 – Frågeformulär för individer tidigare diagnostiserade med

Covid-19

1. Födelseår

2. Kön: Man Kvinna Annat

3. Påvisad Covid-19 med laboratorietest: Nej Ja 4. Datum (ungefär) för påvisad Covid-19 .

5. Var är

Sverige Ett annat land i Norden övriga Europa Ett land i Ett land utanför Europa Vet inte

a. ..Du född? b. ..Din mamma född? c. ..Din pappa född?

6. Hur bedömer du ditt allmänna hälsotillstånd?

Mycket bra Bra Någorlunda Dåligt Mycket dåligt

7. Om du tänker på din kroppsliga hälsa, hur många dagar efter din påvisade Covid-19 diagnos var du fortfarande påverkad av infektionen?

.dagar

8. Om du tänker på din psykiska hälsa, hur många dagar efter din påvisade Covid-19 diagnos var du fortfarande påverkad av infektionen?

..dagar

9. Har du något/några av följande besvär eller symtom efter din Covid-19-infektion? 9a. Värk i skuldror, nacke eller axlar?

Nej

Ja, lätta besvär Ja, svåra besvär

9b. Ryggsmärtor, ryggvärk, höftsmärtor eller ischias?

Nej

9c. Värk eller smärtor i händer, armbågar, ben eller knän?

Nej

(22)

18

9d. Huvudvärk eller migrän?

£ Nej

£ Ja, lätta besvär £ Ja, svåra besvär

9e. Trötthet?

£ Nej

9f. Sömnsvårigheter?

£ Nej

9g. Eksem eller hudutslag?

£ Nej

9h. Återkommande mag-/tarmbesvär?

£ Nej

9i. Övervikt, fetma?

£ Nej

9j. Andnöd?

£ Nej

9k. Hjärtklappning?

£ Nej

9l. Feber?

£ Nej

9m. Bröstsmärtor?

£ Nej

9n. Hosta?

£ Nej

9o. Illamående/Kräkningar?

£ Nej

(23)

19

9p. Försämrat luktsinne?

£ Nej

9q. Försämrat smaksinne?

£ Nej

9r. Yrsel?

£ Nej

9s. Koncentrationssvårigheter?

£ Nej

9t. Minnesnedsättning?

£ Nej

9u. Andra symtom?...

10. Medför ovan rapporterade besvär att din arbetsförmåga är nedsatt eller hindrar dig i dina andra dagliga sysselsättningar?

£ Nej £ Ja

11. Har du någon långvarig sjukdom, besvär efter olycksfall, någon nedsatt funktion eller annat långvarigt hälsoproblem (ej kopplat till Covid-19)?

£ Nej

£ Ja, sjukdom………

12. Har du haft någon av följande sjukdomar under de senaste 3 månaderna och om Ja, ungefär hur många gånger? Sätt ett kryss framför det alternativ du tror är riktigt. antibiotika (penicillin)

a. Vanlig förkylning £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

b. Halsfluss £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

c. Maginfluensa £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

d. Vanlig influensa £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

e. Öroninflammation £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

f. Lunginflammation £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

g. Hjärnhinneinflammation £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

h. Annan infektion som krävt _£

(24)

20

13. Har du haft någon av följande infektionssjukdomar? Sätt kryss för ett alternativ på varje rad.

a. Röda hund £ Nej £ Ja £ Vet ej

b. Påssjuka £ Nej £ Ja £ Vet ej

c. Vattenkoppor £ Nej £ Ja £ Vet ej

d. Kikhosta £ Nej £ Ja £ Vet ej

e. Mässling £ Nej £ Ja £ Vet ej

f. Borrelia (fästingburen infektion) £ Nej £ Ja £ Vet ej

g. Mask i magen £ Nej £ Ja £ Vet ej

h. Annan speciell infektion £ Nej £ Ja £ Vet ej

i. I så fall vad?

14. Har du någon autoimmun sjukdom?

Nej Ja

Om ja, vilken?...

15. Har du medicinerats med kortison senaste månaden?

Nej Ja

16. Har du behandlats med annan medicinering senaste månaden? Nej

Ja

Om ja, vilken medicin?………..

17. Hur många gånger tränar du minst 30 minuter sammanhängande tid under en vecka och på ett sådant sätt att du blir andfådd och/eller svettas

£ Aldrig £ Oregelbundet £ Mer sällan än en gång £ 1-2 ggr £ 3-4 ggr £ 5-7 ggr 18. Vikt: ______kg 19. Längd: ______cm

(25)

21

Bilaga 2 – Frågeformulär för individer utan diagnostiserad Covid-19

1. Födelseår

2. Kön: Man Kvinna Annat

3. Påvisad Covid-19 med laboratorietest: Nej Ja 4. Var r

Sverige Ett annat land i Norden övriga Europa Ett land i Ett land utanför Europa Vet inte

a. ..Du född? b. ..Din mamma född? c. ..Din pappa född?

5. Hur bedömer du ditt allmänna hälsotillstånd?

Mycket bra Bra Någorlunda Dåligt Mycket dåligt

6. Har du något/några av följande besvär eller symtom? 6a. Värk i skuldror, nacke eller axlar?

Nej

6b. Ryggsmärtor, ryggvärk, höftsmärtor eller ischias?

Nej

6c. Värk eller smärtor i händer, armbågar, ben eller knän?

Nej

6d. Huvudvärk eller migrän?

Nej

6e. Trötthet?

Nej

6f. Sömnsvårigheter?

Nej

6g. Eksem eller hudutslag?

Nej

(26)

22

6h. Återkommande mag-/tarmbesvär?

£ Nej

6i. Övervikt, fetma?

£ Nej

6j. Andnöd?

£ Nej

6k. Hjärtklappning?

£ Nej

6l. Feber?

£ Nej

6m. Bröstsmärtor?

£ Nej

6n. Hosta?

£ Nej

6o. Illamående/Kräkningar?

£ Nej

6p. Försämrat luktsinne?

£ Nej

6q. Försämrat smaksinne?

£ Nej

6r. Yrsel?

£ Nej

6s. Koncentrationssvårigheter?

£ Nej

(27)

23

6t. Minnesnedsättning?

£ Nej

6u. Andra symtom?...

7. Medför ovan rapporterade besvär att din arbetsförmåga är nedsatt eller hindrar dig i dina andra dagliga sysselsättningar?

£ Nej £ Ja

8. Har du någon långvarig sjukdom, besvär efter olycksfall, någon nedsatt funktion eller annat långvarigt hälsoproblem?

£ Nej

£ Ja, sjukdom………

9. Har du haft någon av följande sjukdomar under de senaste 3 månaderna och om Ja, ungefär hur många gånger? Sätt ett kryss framför det alternativ du tror är riktigt. antibiotika (penicillin)

10. Har du haft någon av följande infektionssjukdomar? Sätt kryss för ett alternativ på varje rad.

a. Röda hund £ Nej £ Ja £ Vet ej

b. Påssjuka £ Nej £ Ja £ Vet ej

c. Vattenkoppor £ Nej £ Ja £ Vet ej

d. Kikhosta £ Nej £ Ja £ Vet ej

e. Mässling £ Nej £ Ja £ Vet ej

f. Borrelia (fästingburen infektion) £ Nej £ Ja £ Vet ej

g. Mask i magen £ Nej £ Ja £ Vet ej

h. Annan speciell infektion £ Nej £ Ja £ Vet ej

i. I så fall vad?

11. Har du någon autoimmun sjukdom?

Nej Ja Om ja, vilken?...

a. Vanlig förkylning £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

b. Halsfluss £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

c. Maginfluensa £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

d. Vanlig influensa £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

e. Öroninflammation £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

f. Lunginflammation £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

g. Hjärnhinneinflammation £ aldrig £ 1-5ggr £ 6-10ggr £ 11-15ggr £ fler än 15ggr

h. Annan infektion som krävt _£

(28)

24

12. Har du medicinerats med kortison senaste månaden?

Nej Ja

13. Har du behandlats med annan medicinering senaste månaden?

Nej Ja

Om ja, vilken medicin?………..

14. Hur många gånger tränar du minst 30 minuter sammanhängande tid under en vecka och på ett sådant sätt att du blir andfådd och/eller svettas

£ Aldrig £ Oregelbundet £ Mer sällan än en gång £ 1-2 ggr £ 3-4 ggr £ 5-7 ggr 15. Vikt: ______kg 16. Längd: ______cm

(29)

25

Bilaga 3 – Informationsbrev för individer tidigare diagnostiserade med

Covid-19

Informationsbrev och förfrågan om medverkan i en studie som

undersöker biomarkörer i saliv hos individer tidigare

diagnostiserade med Covid-19.

Syftet med studien är att undersöka biologiska markörer i saliv hos patienter med tidigare diagnostiserad Covid-19 infektion.

Studien är en del i ett examensarbete på Hälsohögskolan, Jönköping University. Vi kommer att undersöka biomarkörer i saliv som är associerade med Covid-19. Vi kommer även att undersöka symtom hos individer som kan kopplas till Covid-19 infektion. Infektionen kan hos vissa individer inducera kvarstående symtom vilket kan påverka individens livskvalité. Genom att analysera biomarkörer och koppla samman dessa med symtom så hoppas vi kunna utröna varför vissa individer får kvarvarande symtom efter en Covid-19 infektion. Om du väljer att delta i studien så kommer du att få besvara ett frågeformulär samt ta ett salivprov. Då salivprovet ska tas 30 minuter efter att du vaknar på morgonen så får du frågeformulär och provtagningskit samt provtagningsinstruktioner hemskickat till dig med posten. Du lämnar sedan fryst salivprov och frågeformulär till ansvariga på Hälsohögskolan, Jönköping University

Salivprov samt frågeformulär är helt avidentifierade och kan inte spåras tillbaka till dig. Bomullspinnen kommer att sparas i en frys som bara forskare har tillgång till. Ditt frågeformulär kommer att sparas inlåst.

Att vara med i studien är frivilligt och du kan ångra dig när som helst, utan att förklara varför.

Om du väljer att delta i studien så kontakta Emma Carlsson, som är ansvarig för studien,

via e-post, emma.carlsson@ju.se.

Vänliga hälsningar

Emma

Emma Carlsson Universitetslektor

Biomedicinska analytikerprogrammet

Avdelningen för naturvetenskap och biomedicin Hälsohögskolan i Jönköping

Tel: 036-101706

(30)

26

Bilaga 4 – Informationsbrev för individer utan diagnostiserad Covid-19

Informationsbrev och förfrågan om medverkan som kontroll i

en studie som undersöker biomarkörer i saliv kopplade till

Covid-19.

Syftet med studien är att undersöka biologiska markörer i saliv hos patienter diagnostiserade med Covid-19.

Studien är en del i ett examensarbete på Hälsohögskolan, Jönköping University där vi avser analysera biologiska markörer i saliv hos patienter med påvisad Covid-19 samt hos kontroller. Vi behöver därav kontroller som inte har haft bekräftad

Covid-19-infektion eller andra förkylningssymtom de senaste fyra veckorna. Om du väljer att

delta i studien så kommer du att få besvara ett frågeformulär samt ta ett salivprov. Då salivprovet ska tas 30 minuter efter att du vaknar på morgonen så får du frågeformulär och provtagningskit samt provtagningsinstruktioner hemskickat till dig med posten. Du lämnar sedan salivprov och frågeformulär till Louise Poolsri.

Salivprov samt frågeformulär är helt avidentifierade och kan inte spåras tillbaka till dig. Bomullspinnen kommer att sparas i en frys som bara forskare har tillgång till. Ditt frågeformulär kommer att sparas inlåst.

Att vara med i studien är frivilligt och du kan ångra dig när som helst, utan att förklara varför.

Om du väljer att delta i studien så kontakta Louise Poolsri, polo18zp@student.ju.se

Vid övriga frågor, kontakta Emma Carlsson som är ansvarig för studien, via e-post,

emma.carlsson@ju.se. Vänliga hälsningar Emma Emma Carlsson Universitetslektor Biomedicinska analytikerprogrammet

Avdelningen för naturvetenskap och biomedicin Hälsohögskolan i Jönköping