Direktresistensbestämning för blododlingar : Volymoptimering och reproducerbarhet

Direktresistensbestämning

för blododlingar

Volymoptimering och reproducerbarhet

HUVUDOMRÅDE: Biomedicinsk laboratorievetenskap FÖRFATTARE: Natalee Westman

HANDLEDARE:Jessica Björklund, Helena Enroth, Unilabs laboratoriemedicin, SkaS, Skövde JÖNKÖPING 2021 mars

Sammanfattning

Vid direktresistensbestämning används blododlingsmedium för tillverkning av bakteriesuspensioner. Metoden är inte standardiserad och det finns ingen rekommenderad volym blododlingsmedium som bör användas. Syftet med studien var att optimera metoden för direktresistensbestämning genom att bestämma en volym blododlingsmedium som används för tillverkning av bakteriesuspensioner. Den optimerade metodens prestanda utvärderades därefter på kliniska patientisolat. Metoden optimerades genom att direktresistensbestämningar (n=160) utfördes baserat på fyra volymer (50 µL, 75 µL, 100 µL och 125 µL) blododlingsmedium, som var inokulerade med fyra olika referensstammar. Den optimerade metodens reproducerbarhet testades på frysta och färska patientisolat (n=120) genom jämförelse av SIR-kategorisering mellan direktresistensbestämning samt resistensbestämning enligt EUCASTs metod för diskdiffusion. Den optimala volymen blododlingsmedium med kända referensstammar fastställdes vara 75 µL då samtliga direktresistensbestämningar godkändes för tre av fyra referensstammar, för den fjärde referensstammen godkändes åtta av tio. Då metoden implementerades på kliniska patientisolat från positiva blododlingar var känsligheten och specificiteten 100 % avseende kategorisk överensstämmelse enligt SIR-systemet. Inga avvikelser avseende SIR-kategorisering observerades. Resultaten visar att det är möjligt att optimera metoden avseende volymen blododlingsmedium som används för direktresistensbestämning på blododlingsflaskor. Då den optimerade metodens känslighet och specificitet var 100 %, är det möjligt att implementera metoden i rutinarbetet.

Summary

Direct antimicrobial susceptibility testing on blood cultures – volume optimization and

reproducibility

Direct antimicrobial susceptibility testing (dAST) is not a standardized method and there are no recommendations regarding the volume of blood culture media to be used. The aim of the study was to optimize dAST method by determining a volume of blood culture media to be used and to test the reproducibility of the optimized method. The dASTs (n=160) were performed on blood culture bottles inoculated with four bacterial strains, using four test volumes (50 µL, 75 µL, 100 µL and 125 µL). The optimized method was implemented on frozen and fresh bacterial isolates (n=120) derived from blood cultures. Susceptibility tests according to EUCASTs method for disk diffusion was also performed. Deviations in SIR-categorical agreement was calculated. The optimal volume of blood culture media for dAST was 75 µL. All dASTs were approved for three out of four reference bacteria whereas eight out of ten dASTs was approved for the fourth reference bacteria. No deviation in categorical agreement was observed. In reproducibility testing, the optimized method showed a 100 % sensitivity and specificity, suggesting a possibility of its implementation in routine work.

Innehållsförteckning

Inledning ... 1

Bakgrund ... 1

Sepsis ... 1

Resistensbestämning ... 1

Resistensbestämning för positiva blododlingar ... 2

Metodprincip blododling ... 3

Syfte ... 4

Material och metod ... 5

Studiedesign ... 5

Avvikelser vid kategorisering enligt SIR ... 5

Volymoptimering ... 5 Reproducerbarhet ...7 Positiva blododlingar ... 7 Frysta isolat ... 8 Etiska överväganden ... 8

Resultat ... 9

Diskussion ... 12

Slutsatser ... 16

Referenser ... 17

Bilagor ... 19

Bilaga 1. Etisk egengranskning ... 19

Förkortningar

ATU – Area of Technical Uncertainty

CFU – Colony-Forming Unit

EUCAST – European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

I – Känslig vid ökad exponering

KNS – Koagulasnegativa stafylokocker

mE – Minor error

ME – Major error

MIC – Minsta inhiberande koncentration

R – Resistent

S – Känslig

1

Inledning

År 2019 avled 747 individer i Sverige till följd av sepsis, där bland annat Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas spp och Staphylococcus aureus (S. aureus) är vanliga sepsisorsakande bakterier (1, 2). Det är av stor vikt för patienternas tillstånd att den behandlande läkaren får kunskap så snabbt som möjligt med avseende på bakterieart och dess resistensmönster. Studier har visat att chansen till överlevnad vid sepsis eller septisk chock ökar ju snabbare ett verksamt och mot patogenen riktat antibiotika sätts in i förhållande till att diagnos ställs (3, 4). Det finns olika metoder för att utföra en resistensbestämning på positiva blododlingar inom klinisk mikrobiologi, där direktresistensbestämning med diskdiffusion enligt European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) är en av de metoder som används vid Unilabs laboratorie för klinisk mikrobiologi i Skövde. Som metoden för direktresistensbestämning ser ut idag, tas blododlingsmedium direkt från blododlingsflaskan för att tillverka en bakteriesuspension. Den volym som tas från de positiva blododlingsflaskorna som sedan används vid tillverkningen av suspensionerna är fyra, sju eller tio droppar. Att blododlingsmedium tas droppvis tillåter viss variabilitet vid utförandet av metoden. Även den tillväxta arten i blododlingsflaskan spelar roll, då gasbildande bakterier tenderar till att generera större droppar än icke-gasbildande arter. Betydelsen av att ha en standardiserad metod där en specifik volym blododlingsmedium används är att minska skillnader som beror på utförandet av metoden. Det leder i sin tur till ett mer tillförlitligt och kvalitetssäkrat resultat för patienterna. Ur ett sådant kvalitetsperspektiv är det av intresse att bestämma den optimala volymen blododlingsmedium i mikroliter som bör användas vid tillverkning av bakteriesuspensioner för direktresistensbestämningar på positiva blododlingar.

Bakgrund

Sepsis

Traditionellt har gramnegativa patogener, till exempel E. coli, Klebsiella spp och Pseudomonas spp varit dominerande fynd hos patienter med sepsis. Grampositiva bakterier som S. aureus och Enterococcus spp anses däremot vara på uppgång och ta plats bland de vanligaste patogenerna som orsakar sepsis, även om de gramnegativa bakterierna fortfarande tycks vara i majoritet (5). Vid klinisk misstanke om sepsis är det av stor vikt för patientens överlevnad att snabbt få vård (4). Det är viktigt att rätt antibiotika snabbt sätts in i ett tidigt skede eftersom tiden för administration av antibiotika avsevärt påverkar patientens tillstånd (3, 6). Det finns två olika aspekter kring vikten av att utföra en resistensbestämning. Patientens hälsa och överlevnad, men även det globala hotet om antibiotikaresistens. Genom överdriven eller felaktig användning av antibiotika ökas det redan växande problemet med multiresistenta bakterier, ett växande hot mot vår globala hälsa (7, 8). Behandling med overksam antibiotika med avseende på den invasiva bakterien är samtidigt ett direkt hot mot patientens prognos (8, 9). För att möta behovet av snabb diagnostik, har det utvecklats laboratoriemetoder med fokus på att så snabbt som möjligt ge besked om vilken art som ligger bakom infektionen samt dess resistensmönster. Det är samtidigt av största intresse att metoderna som utvecklas är så standardiserade som möjligt, att metoden kan upprepas med samma resultat oberoende vem som arbetar med provet på laboratoriet (10).

Resistensbestämning

Bestämning av en bakteriearts känslighet för ett givet antibiotika kan utföras på både ett fenotypiskt och ett genotypiskt sätt. Fenotypen representerar bakteriens uttryck i närvaro av antibiotikumet, jämfört med dess genotyp som beskriver dess genuppsättning. Genotypen detekteras genom DNA-baserade analyser. Resultatet behöver däremot inte överensstämma med fenotypen eftersom det sätt bakterier uttrycker resistens på för ett antibiotikum kan vara förvärvade, plasmidburna, resistensmekanismer (11). Att resultatet av en DNA-analys visar på känslighet behöver därmed inte betyda att det fenotypiska uttrycket beter sig så. Det är därför viktigt att rutinmässigt utföra fenotypiska resistensbestämningar för att kunna lämna besked om verksamma antibiotikaalternativ. Ett sätt att fenotypiskt bestämma en arts antibiotikakänslighet är med EUCASTs metod för resistensbestämning med diskdiffusion (9, 11, 12). Som en av de äldsta metoderna för resistensbestämning, är diskdiffusion trots det den mest frekvent

2

använda metoden i rutinarbetet gällande undersökning av resistens inom klinisk mikrobiologi (13, 14). Vid tillverkning av bakteriesuspensioner som används till inokulering av agarplattor baseras suspensionerna på en grumlighetsstandard för att få den mängd bakterier som krävs för adekvat tillväxt på plattorna. Den grumlighetsstandard som används är 0,5 McFarland vilket enligt EUCAST motsvarar 1-2 x 108 _{koloniformande enheter (CFU)/mL för E. coli. För att tillverka en bakteriesuspension enligt}

standarden för resistensbestämning med diskdiffusion krävs det en isolerad, ren framväxt av bakterier som blandas med fysiologisk koksaltlösning för att tillverka en suspension med grumlighetsstandard 0,5 McFarland. Pappersdiskar indränkta i antibiotika med given koncentration placeras på agarplattor. När diskarna placeras på agarns yta kommer antibiotikan att diffundera ut i agarbasen. Under inkubering av plattorna kommer eventuella hämningszoner att ses som uppklarnade zoner intill antibiotikadiskarna. Hämningszonernas diameter mäts i millimeter (13, 15). Resistensbestämning med diskdiffusion må vara den mest frekvent använda metoden inom rutinarbete på mikrobiologiska laboratorier, men golden standard och referensmetod för resistensbestämning är trots det buljongspädning. Den fenotypiska referensmetoden resulterar i bestämning av minsta inhiberande koncentration (MIC). Utifrån MIC-värdet har brytpunkter i sin tur utvecklas för diskdiffusion, där hämningszonernas zondiameter översätts till SIR-systemet och korrelerar med dess MIC-värde (13, 16, 17). Med hjälp av EUCASTs tabell för brytpunkter tolkas bakteriestammens känslighet för antibiotikumet enligt SIR-systemet med utgångspunkt i den uppmätta hämningszonen. Känslig (S) innebär att arten är känslig för antibiotikumet vid den givna koncentrationen. Arten kan också utifrån brytpunkterna tolkas som resistent (R) vid given koncentration eller i vissa fall, känslig vid ökad exponering i infektionshärden (I). För några bakteriearter kan även Area of Technical Uncertainty (ATU) uppstå. Vid ATU har resistensbestämningen inte lyckats enligt SIR-systemet och det är inte möjligt att avgöra om stammen är S, I eller R för det givna antibiotikumet (18).

Resistensbestämning för positiva blododlingar

Metod för resistensbestämning vid positiva blododlingar kan utföras på olika sätt, som direktresistensbestämning och slutresistensbestämning enligt EUCASTs metod för diskdiffusion. Beroende på fyndets karaktär, så kan även rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) enligt EUCASTs metod utföras, vilket är ännu en förkortning av analystiden. Avläsning av hämningszoner sker sex timmar efter inkubation, till skillnad från en resistensbestämning med diskdiffusion enligt EUCASTs metod som avläses inom 16-20 timmar efter inkubation (14, 19). RAST-avläsning kan ske redan efter 4 timmar, men en studie har visat att färre stammar kunde avläsas efter endast fyra timmar och fler stammar med mindre felprocent rapporterades då inkubationen tilläts ta längre tid (14). RAST som metod är dock begränsad till de åtta arter som enligt metoden har specifika RAST-brytpunkter, vilket betyder att metoden inte alltid kan utföras (20). Dessutom kräver RAST att agarplattor inkuberas i god tid för att de ska hinna inkuberas i sex timmar och samtidigt hinna avläsas under samma arbetsdag (6, 19). Då RAST inte är möjligt att utföra, kan direktresistensbestämning utföras, alternativt en så kallad slutresistensbestämning enligt EUCASTs metod för diskdiffusion. Vid fynd av blandflora kan inte heller RAST utföras (19).

I nuläget finns det ingen standardiserad metod för direktresistensbestämning. Vid en direktresistensbestämning kan blododlingsmedium direkt från flaskan blandas med natriumkloridlösning för tillverkning av bakteriesuspension. Suspensionen kan sedan användas för att utföra en resistensbestämning med diskdiffusion. Då direktresistensbestämningen inte kräver en isolerad framväxt av bakteriekolonier, som vid en slutresistensbestämning, förkortas tiden det tar att få fram ett preliminärt provsvar (19). I en studie utförd 2017 vid University of California, USA, testades prestandan av direktresistensbestämning, i studien kallad direktdiskdiffusion. I studien inokulerades blododlingsflaskor med gramnegativa bakterieisolat varpå direktresistensbestämningar och resistensbestämningar enligt referensmetod för diskdiffusion utfördes. Resultaten jämfördes och i studien konstaterades det att den bakteriekoncentrationen som gav bäst resultat var inom spannet 7,6 x 107 _{och 5,0 x 10}8 _{CFU/mL. Efter 18 timmar inkubering iakttogs mellan 86 och 92 % överensstämmande}

kategorisering enligt SIR-systemet för bakterier inokulerade i blododlingsflaskor av olika fabrikat. I studiedesignen användes fyra droppar blododlingsmedium till att direkt inokulera Mueller-Hintonagar. Det konstaterades alltså ingen optimerad mängd blododlingsmedium i mikroliter (21). Som metoden för direktresistensbestämning är utformad vid laboratoriet för klinisk mikrobiologi i Skövde, sätts antingen fyra, sju eller tio droppar kultiverat blod från blodflaskan till 1,5 mL fysiologisk koksaltlösning vid tillverkning av bakteriesuspensioner. Antalet droppar som tillsätts baseras på fyndets karaktär. Vid fynd av gramnegativa bakterier tas fyra droppar respektive sju droppar vid grampositiva fynd. Vid

3

misstanke om Streptococcus pneumoniae tas tio droppar. Om en direktresistens efter inkubering inte visar på konfluerande växt alternativt är för tjock så ska en standardresistensbestämning enligt EUCASTs metod för diskdiffusion utföras. Om direktresistensbestämningen anses se bra ut behöver ingen slutgiltig resistensbestämning enligt EUCASTs metod för diskdiffusion genomföras (19, 22). Värdet av utföra en direktresistensbestämning med diskdiffusion kontra en standardiserad slutresistensbestämning enligt EUCASTs metod för diskdiffusion med framodlade isolat är en vinst i tid. Genom att tillverka bakteriersuspensioner med material direkt från blododlingsflaskan förkortas analystiden avsevärt jämfört i väntan på att bakterierna ska växa fram på agarplattor. Svarstiden förkortas och rätt behandling kan sättas in i ett tidigare skede, vilket är av värde eftersom patienter vid misstänkt sepsis behandlas empiriskt med antibiotika utifrån klinisk och epidemiologisk information (9).

Metodprincip blododling

Venöst blod tillsätts till anaeroba och aeroba blododlingsflaskor. Från vuxna individer bör 20-30 mL blod tillsättas till varje blododlingsflaska (23). Blododlingsflaskorna som innehåller en anrikad buljong gynnar bakterietillväxt under inkubationen som sker i blododlingsinstrument. Vid laboratoriet för klinisk mikrobiologi i Skövde används BacT/ALERT ® VIRTUO ™ (Biomerieux, USA) (19). I blododlingsflaskornas bottnar finns en pH-känslig indikator, vilken ger ett färgomslag då koldioxid bildas vid bakteriell tillväxt i flaskorna. En utmaning när blodflaskor inkommer till laboratoriet är dock att svårt insjukna patienter ofta redan fått antibiotika insatt. På marknaden har flaskor därför blivit designade att utöver näringsämnen även innehålla antibiotikabindande ämnen i syfte att bakteriell tillväxt ska kunna fortskrida i flaskorna (24). Odlingsinstrumentens detektionsprincip är att med hjälp av en ljusdiod upptäcka färgförändringar i blododlingsflaskans pH-indikator. Med hjälp av ljusdioden reflekteras ett ljus via indikatorn vilket i sin tur mäts med en fotodetektor. Koldioxidnivåer mäts med hjälp av tillhörande datorprogram. Den information som genereras jämförs med en initial mätning av koldioxid och för att blododlingsflaskan ska anses vara positiv, att det har skett en tillväxt av bakterier, ska hastigheten av koldioxidproduktionen vara bibehållen under inkubationen. Instrumentet kan även larma positivt vid en blododlingsflaska med en initialt hög koldioxidnivå (25, 26). Då en blododlingsflaska larmat som positiv tas den ut för vidare diagnostik med gramfärgning (direktmikroskopi), typning av art och slutligen resistensbestämning (19). En blododlingsflaska kan betraktas som negativ först efter fem dygns inkubation utan tydlig signal om ökning av koldioxid. En flaska skulle därmed kunna larma positivt dag fem om bibehållen koldioxidstegring. Dock har en studie visat att prover som inkuberades i BacT/ALERT ® Virtuo ™ larmade positivt redan inom tre dagar hos patienter med bakteriemi (27).

4

Syfte

Syftet var att optimera den volym blododlingsmedium som används vid direktresistensbestämningar på positiva blododlingar samt därefter utvärdera den volymoptimerade metodens reproducerbarhet på kliniska patientisolat avseende SIR-kategorisering.

5

Material och metod

Studiedesign

Studiens design inkluderade bestämning av optimal volym blododlingsmedium till direktresistensbestämning samt utvärdering av den bestämda volymen. Till optimering av volymen blododlingsmedium inokulerades blododlingsflaskor (n=60) med fyra referensstammar. Efter inkubering tillverkades bakteriesuspensioner baserat på fyra volymer av blododlingsmedium, 50 µL (n=60), 75 µL (n=60), 100 µL (n=60) och 125 µL (n=60). Bakteriesuspensionerna användes till inokulering av blodagar (n=240) för beräkning av antalet CFU/mL samt Mueller-Hinton (MH) agar (n=240) för direktresistensbestämning. För att bestämma den optimala volymen blododlingsmedium som bör användas vid test av den optimerade metodens reproducerbarhet behövde två parametrar uppfyllas. Hämningszonens diameter behövde befinna sig inom det godkända intervallet enligt EUCASTs tabell för intern kvalitetskontroll. Växten på MH-agar behövde även vara jämn och konfluerande. Då metoden optimerats avseende volymen blododlingsmedium implementerades den för positiv blododlingar (n=60) under en fyraveckors period. Den optimerade metoden applicerades även på frysta patientisolat (n=60) av arterna E. coli, Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), S. aureus och Enterococcus faecalis (E. faecalis). Resistensbestämningar enligt EUCASTs metod för diskdiffusion utfördes för samtliga frysta isolat samt positiva blododlingar. Direktresistensbestämningarna för både patientstammar och frysta patientstammar kategoriserades enligt SIR-systemet och jämfördes med dess motsvarande slutresistensbestämning. Andelen avvikelser i form av very major errors, major errors och minor errors beräknades i procent. Den optimerade metodens känslighet och specificitet beräknades i procent avseende optimering av den volym blododlingsmedium som används vid direktresistensbestämning.

Avvikelser vid kategorisering enligt SIR

För att definiera de olika feltyper som kan uppstå vid tolkning kan begreppen very major errors (VME), major errors (ME) och minor errors (mE) använda. Very major error kan definieras som ett falskt susceptibelt resultat där en resistent stam tolkas som känslig. Major error kan ses som falskt resistent, då en stam i själva verket är känslig men tolkas som resistent. Minor error kan definieras som felaktig kategorisering mellan S och I respektive R och I (28).

Volymoptimering

Fyra referensstammar odlade på blodagar användes för att inokulera blododlingsflaskor enligt metodprincipen som kan studeras i figur 1. Stammar som användes var E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 29213 samt E. faecalis ATCC 29212. Kolonier blandades med 0,85 % (w/v) natriumkloridlösning till 0,5 McFarland och grumligheten mättes spektrofotometriskt. De tillredda bakteriesuspensionerna späddes i en tvåstegsspädning till en slutlig lösning med spädningsfaktor 1:1 000 000 enligt metodprincipen som kan ses i figur 1. Totalt tio blododlingsflaskor inokulerades från respektive referensstam varvid 1 mL av den tvåstegsspädda lösningen tillsammans med 4 mL defibrinerat hästblod (Håtunalab, Bro, Sverige) tillsattes till blododlingsflaskorna (Biomerieux, Durham, USA). För de grampositiva referensstammarna samt E. coli inokulerades aeroba (n=15) och anaeroba (n=15) blododlingsflaskor. Endast aeroba blododlingsflaskor användes för P. aeruginosa (n=10). Blododlingsflaskorna inkuberades i BacT/ALERT ® VIRTUO ™ (Biomerieux, USA) i 14 ± 2 timmar.

6

Figur 1. Metodprincip för inokulering av blododlingsflaskor med referensstam. En

bakteriesuspension med turbiditet 0,5 McFarland späddes i två steg till totalt 1:1 000 000. Av den spädda suspensionen tillsattes 1 mL till en anaerob eller aerob blododlingsflaska tillsammans med 4 mL defibrinerat hästblod.

Bakteriesuspensioner tillverkades från respektive flaska efter inkubation enligt metodprincip som kan ses i figur 2. Blododlingsmedium pipetterades i volymerna 50 µL, 75 µL, 100 µL och 125 µL till individuella rör innehållande 1,5 mL 0,85 % (w/v) natriumkloridlösning. Således tillverkades fyra bakteriesuspensioner från varje blododlingsflaska och därmed 40 direktresistensbestämningar för varje referensstam. Samtliga bakteriesuspensioner inokulerade till MH-agarplattor (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, Sverige) avseende direktresistensbestämning samt blodagarplattor (Becton Dickinson, Franklin Lakes New Jersey, USA) avseende beräkning av CFU/mL. Inokulerade MH-agarplattor stämplades med antibiotikadiskar (Oxoid, Hampshire, Storbritannien) enligt schemat som ses i tabell 1. För E. coli inokulerades två MH-agarplattor. Bakteriesuspensionerna späddes i två steg med spädningsfaktor 1:1 000 000 varpå två blodagarplattor inokulerades med 100 µL respektive 1000 µL. Inkubering av MH-agar utfördes aerobt vid 35,1 ± 1C i och blodagar inkuberades aerobt med tillsats av 5 % koldioxid vid 35,1 ± 1C. Efter inkubering i 18 ± 2 timmar mättes hämningszonernas diameter med digitalt skjutmått och beräkning av medelvärde för varje stam avseende CFU/mL utfördes.

Figur 2. Hantering av positiva blododlingsflaskor avseende metodprincip för

tillverkning av bakteriesuspensioner till direktresistensbestämning och inokulering på blodagar. En bestämd volym blododlingsmedium extraheras från flaskan och blandas med 1,5 mL natriumkloridlösning vid tillverkning av bakteriesuspensioner. Suspensionerna används till a) inokulering av MH-agarplattor till direktresistensbestämning, samt b) utodling i två volymer på blodagarplattor för beräkning av CFU/mL. Suspensionerna späddes i två steg till spädningsfaktor 1:1 000 000 innan inokulering på blodagar utfördes.

7

Tabell 1. Schema för vilka antibiotikadiskar som tillsattes MH-agarplattor för respektive art vid

direktresistensbestämning. Totalt 40 individuella direktresistensbestämningar utfördes för respektive stam.

Referensstam Antibiotika E. coli (n=40) Amoxicillin-clavulansyra (20-10 µg) Cefotaxime (5 µg) Ceftazidime (10 µg) Ciprofloxacin (5 µg) Meropenem (10 µg) Piperacillin-tazobactam (30-6 µg) Tobramycin (10 µg) Trimethoprim-sulfamethoxazole (1,25-23,75 µg) P. aeruginosa (n=40) Ceftazidime (10 µg) Ciprofloxacin (5 µg) Imipenem (10 µg) Meropenem (10 µg) Piperacillin-tazobactam (30-6 µg) Tobramycin (10 µg) S. aureus (n=40) Cefoxitin (30 µg) Klindamycin (2 µg) Erytromycin (15 µg) Fusidinsyra (10 µg) Tobramycin (10 µg)

E. faecalis (n=40) Ampicillin (2 µg) Gentamicin (30 µg) Linezolid (10 µg) Vancomycin (5 µg)

Den optimala volymen blododlingsmedium bestämdes utifrån uppfyllande av vissa parametrar. För att en direktresistensbestämning utförde med viss volym skulle gå vidare i processen krävdes det att direktresistensbestämningen genererade zondiametrar som föll inom tillåtet intervall enligt EUCASTs tabell för kvalitetskontroll (22), att växten på plattorna var jämn och konfluerande och hämningszonerna skarpa. För att en volym skulle anses vara godkänd krävdes det att samtliga zondiametrar vid direktresistensbestämningen var inom tillåten avvikelse. Även gramtillhörighet vägdes in för att avgöra om arternas gramtillhörighet påverkade vilken volym som genererade mest optimalt resultat. Andelen avvikande resultat enligt feltyperna VME, ME och mE beräknades i procent.

Reproducerbarhet

Positiva blododlingar

Den optimala volymen blododlingsmedium för direktresistensbestämning bestämdes till 75 µL. Under en fyraveckorsperiod användes de blododlingsflaskor som larmade positivt (n=60) till att utföra en direktresistensbestämning med den bestämda volymen för blododlingsmedium. Resistensbestämning utfördes därefter enligt EUCASTs metod för diskdiffusion med hjälp av 1,5 mL 0,85 % (w/v) natriumkloridlösning (15). En blododlingsflaska per patient användes och prover med blandflora uteslöts. Inokulering utfördes på MH-agar och plattorna stämplades med antibiotika enligt intern prickningslista för respektive art (29). Efter inkubering mättes hämningszonernas diameter och SIR-kategoriserades enligt EUCASTs tabell för brytpunkter (18). För samtliga prover utfördes slutresistensbestämning enligt EUCASTs metod för diskdiffusion efter isolerad framväxt på blodagarplattor. Liksom vid direktresistensbestämning inokulerades MH-agar och antibiotika applicerades enligt intern prickningslista (29). Inkubering för samtliga MH-agarplattor utfördes aerobt

8

vid 35,1 ± 1C i 18 ± 2 timmar varpå hämningszoner avlästes. Inkubering av blodagar utfördes aerobt med tillsats av 5 % koldioxid vid 35,1 ± 1C i 18 ± 2 timmar.

Frysta isolat

Blododlingsflaskor inokulerades med frysta patientisolat (n=60) enligt metodprincipen som ses i figur 1. Isolat som användes var E. coli (n=15), P. aeruginosa (n=15), S. aureus (n=15) och E. faecalis (n=15). De grampositiva stammarna samt E. coli fördelades slumpmässigt till aeroba samt anaeroba blododlingsflaskor. Frysta stammar av P. aeruginosa sattes enbart till aeroba blododlingsflaskor. Blododlingsflaskorna inkuberades i BacT/ALERT ® VIRTUO ™ (Biomerieux, USA) i 14 ± 2 timmar. Efter inkubation isolerades stammarna på blodagarplattor. Då blodagarplattor inkuberats aerobt med tillsats av 5 % koldioxid vid 35,1 ± 1 C i 18 ± 2 timmar tillverkades slutresistensbestämningar enligt EUCASTs metod för diskdiffusion (15). Direktresistensbestämningar utfördes. Suspensioner inokulerades till MH-agar och antibiotika applicerades artvis enligt tabell 1. Hämningszonernas diameter avseende direktresistensbestämningar samt slutresistensbestämningar mättes med digitalt skjutmått och SIR-kategoriserades enligt EUCASTs tabell för kvalitetskontroll (22).

Etiska överväganden

Inga etiska överväganden har behövts göras eftersom arbete med mikroorganismer i syfte att utveckla den diagnostiska verksamheten har utförts, vilket inte kräver särskild etisk granskning. Blododlingsflaskor från patienter var avkodade utan känslig personinformation. Frysta isolat var avkodade utan koppling till patient. Etisk egengranskning har genomförts enligt Hälsohögskolans anvisningar (se bilaga 1).

9

Resultat

Samtliga resultat redovisas exklusive bortfall vilka redovisas i separat stycke, se reproducerbarhet. Till optimering av metoden för direktresistensbestämning av positiva blododlingar användes fyra referensstammar och totalt 40 blododlingsflaskor inokulerades avseende volymoptimering. Den optimala volymen blododlingsmedium bestämdes till 75 µL. Vid testning av den optimerade metodens reproducerbarhet inkluderades frysta patientisolat (n=60) samt färska patientisolat bestående av renkultur från positiva blododlingar (n=60). Testerna visade inte någon förekomst av VME, ME eller mE.

Volymoptimering

Vid utförande av volymoptimering visade resultaten, då 50 µL blododlingsmedium suspenderades till 1,5 mL NaCl, att samtliga direktresistensbestämningar godkändes för de gramnegativa stammarna men inga godkända resultat erhölls för de grampositiva avseende jämn och konfluerande växt samt skarpa zonkanter. Resultaten avseende 75 µL blododlingsmedium visade däremot att samtliga direktresistensbestämningar godkändes för tre av fyra referensstammar. För E. faecalis godkändes åtta av tio direktresistensbestämningar, se tabell 2. De två resistensbestämningar som inte erhöll godkänt resultat bedömdes vara för tunna i dess växt på agarn med för få kolonier och därmed utan avläsningsbara hämningszoner. När 100 µL blododlingsmedium användes vid tillverkning av bakteriesuspensioner visade resultaten av direktresistensbestämningarna att endast för de grampositiva referensstammarna erhölls enhälligt godkända resultat. För E. coli godkändes tre av tio resistensbestämningar och för P. aeruginosa en av tio. För de grampositiva stammarna var resultaten enhälligt godkända även då 125 µL blododlingsmedium användes till utförande av direktresistensbestämningar. Inga godkända resultat erhölls avseende E. coli samt P. aeruginosa. Samtliga resultat med avseende på hämningszoner föll inom godkänt intervall enligt EUCASTs tabell för intern kvalitetskontroll, med undantag för E. faecalis vid test mot gentamicin. Hämningszoner kring antibiotikalappen för gentamicin (dos) befann sig i genomsnitt tre millimeter utanför den övre intervallgränsen för godkänt resultat enligt EUCASTs tabell för internkontroll (30).

Tabell 2. Godkända resultat avseende volymoptimering vid tillverkning av bakteriersuspensioner för

direktresistensbestämningar utförda på referensstammar. Inom parentes ses antalet utförda direktresistensbestämningar för respektive testvolym samt art. Godkända resultat avser både tillfredsställande växt samt hämningszoner inom tillåtet intervall enligt EUCASTs tabell för intern kvalitetskontroll (30). Totalt utfördes 160 direktresistensbestämningar fördelat på fyra testade volymer blododlingsmedium samt fyra referensstammar.

Godkända direktresistensbestämningar avseende volymoptimering

Referensstam 50 µL 75 µL 100 µL 125 µL E. coli 10 (10) 10 (10) 3 (10) 0 (10) P. aeruginosa 10 (10) 10 (10) 1 (10) 0 (10) S. aureus 0 (10) 10 (10) 10 (10) 10 (10) E. faecalis 0 (10) 8 (10) 10 (10) 10 (10) n = 160 Bestämning av CFU/mL

För de gramnegativa stammarna iakttogs gemensamma medelvärden för CFU/mL mellan 1,04 och 1,40 × 108 _{CFU/mL, se tabell 3. Gällande de grampositiva stammarna var medelvärdet för antal}

koloniformerande enheter inom spannet 2,71 och 5,30 × 107 _{CFU/mL. På grund av felkällor som uppstod}

vid inokulering av blodagarplattor i syfte att beräkna CFU/mL ändrades metoden under projektets gång. Avseende gramnegativa referensstammar inokulerade två blodagarplattor med respektive 100 µL samt 1000 µL. Då blodagarplattor skulle inokuleras med grampositiva stammar suspenderades istället 100 µL respektive 500 µL av bakteriesuspensionerna till blodagarplattor.

10

Tabell 3. Medelvärde avseende beräkning av CFU/mL, för varje

bakteriesuspension innehållande 50, 75, 100 eller 125 µL

blododlingsmedium, för använda referensstammar kategoriserade utefter gramtillhörighet.

CFU/mL

Volym Gramnegativ (mv) Grampositiv (mv)

50 µL 7,16 × 107 2,71 × 107 75 µL 1,04 × 108 3,34 × 107 100 µL 1,08 × 108 4,19 × 107 125 µL 1,40 × 108 5,30 × 107 n = 160

Reproducerbarhet

Bortfall i studien (n=25) inkluderade fall där antibiotikalappar lossnat från agarytan (n=2) samt fall där stammar vid direktresistensresistensbestämning kategoriserats enligt SIR-systemet, men som vid resistensbestämning enligt jämförande metod blivit ATU (n=13). För P. aeruginosa var tre stammar ATU för piperacillin-tazobactam. För E. coli iakttogs sex fall av ATU för amoxicillin-clavulansyra, tre fall för ciprofloxacin och ett fall för piperacillin-tazobactam. Vid ett fall för E. coli saknades även antibiotikalapp avseende piperacillin-tazobactam. För S. aureus visade en direktresistensbestämning en otillfredsställande växt där hämningszoner inte var avläsningsbara. Totalt saknade 5 stammar antibiotikalappar för tobramycin och behandlades därmed som bortfall, inkluderat S. aureus och koagulasnegativa stafylokocker. Resultaten i tabell 4 är exkluderade bortfall.

Då den optimerade metodens reproducerbarhet testades förekom inte något fall av felaktig kategorisering enligt SIR-systemet. Resultaten visade att den optimerade metoden för direktresistensbestämning hade en total analytisk känslighet samt specificitet på 100 %, se tabell 4. För detaljerade artspecifika resultat, se bilaga 2. Stammarna som inkluderades var E. coli (n=29), P. aeruginosa (n=18), S. aureus (n=25), koagulasnegativa stafylokocker (KNS) (n=19), Enterococcus spp (n=17), övriga gramnegativa stavar (n=7) samt utöver stafylokocker övriga grampositiva kocker (n=5). De övriga gramnegativa stavar som testades var av arterna Morganella morganii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella aerogenes samt Citrobacter koseri. De övriga grampositiva kocker som inkluderades var Streptokock grupp C/G, Streptococcus vestibularis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus agalactiae samt Corynebacterium pseudodiphteriticum. Åtta typer av antibiotika testades mot E. coli samt övriga gramnegativa stavar och sex typer av antibiotika mot P. aeruginosa. Mot stafylokocker testades fem typer av antibiotika. Gällande övriga grampositiva kocker testades streptokocker mot tre sorters antibiotika och C. pseudodiphteriticum mot fyra typer. På antibiotikanivå utfördes totalt 654 individuella tester, bortfall exkluderade. Resultaten är även exkluderade dem för gentamicin och enterokocker. Samtliga stammar av E. coli visade på jämn och konfluerande växt med skarpa zonkanter vid både direktresistensbestämning samt resistensbestämning med referensmetod, resistensbestämning med diskdiffusion enligt EUCAST. Likaså för P. aeruginosa och övriga gramnegativa stavar. För S. aureus växte en stam på ett icke tillfredsställande sätt vilket resulterade i bortfall medan resterande stammar gav resistensbestämningar med jämn och konfluerande växt. De stammar av KNS som inkluderades var S. epidermidis (n=7), S. capitis (n=4), S. hominis (n=6) och S. warneri (n=1). Från samtliga stammar erhölls resistensbestämningar som var avläsningsbara avseende hämningszoner. För S. epidermidis, S. capitis och S. warneri var växten mycket jämn och konfluerande. För S. hominis bedömdes växten vara godkänd men inte fullt så konfluerande och jämn som önskvärt, då växten vid direktresistensbestämningar var prickig. Övriga grampositiva kocker visade på mycket jämn och konfluerande växt.

11

Tabell 4. Resultatjämförelse av SIR-kategorisering mellan den optimerade metoden för direktresistensbestämning

i förhållande till referensmetoden diskdiffusion enligt EUCAST. Resultaten är exkluderade bortfall samt gentamicin för enterokocker. GRAMNEGATIVA GRAMPOSITIVA

R

e

fer

e

n

sm

e

to

d

R

e

fe

re

n

sm

et

o

d

R

0

0

46

n = 272

12

Diskussion

Syftet med studien var att optimera metoden för direktresistensbestämning genom att volymbestämma mängden blododlingsmedium i µL som används vid tillverkning av bakteriesuspensioner för direktresistensbestämning. Då den mest optimala volymen blododlingsmedium fastställdes, testades den optimerade metoden avseende dess reproducerbarhet på kliniska isolat. SIR-kategorisering från direktresistensbestämningar jämfördes med dess motsvarande kategori från studiens referensmetod slutresistensbestämning. Resultaten visade att den optimerade metodens känslighet och specificitet var 100 % då inga avvikelser gällande SIR-kategorisering observerades.

Val av metod

I den befintliga metodbeskrivningen för direktresistensbestämning vid laboratoriet för klinisk mikrobiologi, Unilabs Skövde, tas fyra eller sju droppar blododlingsmedium från blododlingsflaskorna vid tillverkning av bakteriesuspensioner till direktresistensbestämning. Observationer vid laboratoriet har visat att olika bakterier kan ge olika stora droppar beroende på dess gasproduktion i blododlingsflaskan. För att standardisera den interna metoden för direktresistensbestämning är det därför av värde att använda en exakt volym i µL. Valet av volymer att inkludera i studien baserades på experimentella försök att uppskatta volymen av de antal droppar som används i rutinarbetet. Det var önskvärt att inkludera volymer som rörde sig kring de uppskattade volymerna. Efter ett försök vid laboratoriet att uppskatta de volymer som användes, uppskattades fyra till sju droppar motsvara cirka 50 µL till 100 µL. Därför valdes volymerna 50 respektive 100 µL till att ingå i studien, samt en mellanliggande volym, 75 µL, liksom en större volym om 125 µL. Referensstammar som inkluderades utgjorde av två gramnegativa och två grampositiva stammar för att upptäcka huruvida det skulle krävas två olika volymer blododlingsmedium vid direktresistensbestämning, baserat på bakteriernas olika karakteristika avseende gramtillhörighet. Referensstammarna E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 29213 samt E. faecalis ATCC 29212 inkluderades då det är stammar med tydliga värden enligt EUCASTs tabell för intern kvalitetskontroll. De fyra stammarna i fråga är även mycket kända vid laboratoriet för klinisk mikrobiologi, Unilabs Skövde, då de används dagligen som kontroller för antibiotikatester. Samtliga referensstammar förutom P. aeruginosa inokulerades till både aeroba och anaeroba blododlingsflaskor. Eftersom P. aeruginosa ses vara mer livskraftig under aeroba tillväxtförhållande inokulerades endast aeroba blododlingsflaskor med stammen. En studie har visat att P. aeruginosa kan växa fram under anaeroba förhållanden men endast i en väldigt liten utsträckning, varför den här studien exkludera anaeroba förhållanden för att undvika bortfall (31). Då den optimala volymen blododlingsmedium bestämts, implementerades den optimerade metoden parallellt med rutinarbetet med positiva blododlingar under en fyraveckors period vid laboratoriet för klinisk mikrobiologi, Unilabs Skövde. Eftersom det inte är något jämnt inflöde av positiva blododlingar inkluderas därför även frysta patientisolat av arter motsvarande de referensstammar som användes vid optimering av metoden. Totalt 60 frysta patientisolat inkluderades och antalet som inkluderades begränsades av studiens omfattning. De frysta patientisolaten utgjordes av stammar som i stor mängd fanns tillgängliga på det mikrobiologiska laboratoriet. En nackdel med studiens utformning är att den inte innefattar någon egenkontroll. Avläsning av zondiametrar sker relativt subjektivt och det förekommer därför en viss individualitet både inter- och intrapersonellt. Förekomst av felaktiga kategoriseringar enligt SIR-systemet skulle därför ha kunnat vara en indikation på ojämnt handhavande av metodens utförande. Inga felaktiga kategoriseringar har dock observerats och handhavandet av metoderna antas ha utförts med godkänt resultat. Zondiametrar har varit överensstämmande mellan direktresistensbestämning och referensmetod eller differentierat ± 1-2 mm, dock alltid med kategorisk överensstämmelse avseende känslighet eller resistens. Det observerades inte någon trend som kunde visa att zoner skulle vara större vid den ena eller den andra metoden.

Volymoptimering

Resultaten av volymoptimeringen visade att den volym som genererade flest godkända direktresistensbestämningar var då 75 µL blododlingsmedium användes för att tillverka bakteriesuspensioner för inokulering av agarplattor. Då 75 µL blododlingsmedium användes kunde direktresistensbestämningarna för samtliga gramnegativa arter och S. aureus godkännas. För E. faecalis underkändes dock två av tio direktresistensbestämningar till följd av för tunn växt på agarplattorna vilket resulterade i att hämningszonerna inte var avläsningsbara. För att växt på

13

agarplattorna skulle anses vara tillfredsställande krävdes en jämn och konfluerande växt med tydliga zonkanter, utan avsevärda inhopp av kolonier eller flikiga kanter. För de två underkända testerna med E. faecalis iakttogs inga tydliga zonkanter. För E. faecalis uppstod också ett problem med gentamicin. Oberoende vilken volym blododlingsmedium som användes så var hämningszonerna konsekvent utanför den högsta godkända intervallgränsen. Gentamicin är dock ett antibiotika som används i diagnostiskt syfte att upptäcka enterokocker som är högresistenta mot aminoglykosider. Vid test av den optimerade metodens reproducerbarhet kommer även gentamicin att exkluderas från resultaten, då det är ett antibiotika som inte kan kategoriseras enligt SIR-systemet utan endast klassificeras som positiv eller negativ för höggradig aminoglykosidresistens (18). Därför exkluderades resultaten för gentamicin, i samråd med laboratoriet och resultaten bedömdes vara godkända trots gentamicinzoner utanför godkänt intervall. I en varning utfärdad i februari 2020 redogör EUCAST att en möjlig orsak till problem gällande avvikande resultat för aminoglykosider kan vara på grund av innehållet av katjoner i agarbasen. Att vidhålla den standardiserade metoden för diskdiffusion utan avvikelser menar EUCAST är av yttersta vikt liksom att kontrollera att kvaliteten av både antibiotikadiskar och agarbas (32). Det är därför möjligt att orsaken till hämningszoner utanför tillåtet intervall kan bero på fel vid tillverkning av MH-agar eller antibiotikadiskar, alternativt fel vid utförande av metoden. Viktigt att komma ihåg är att EUCASTs tabell för kvalitetskontroll baseras på dess metod för diskdiffusion, vilket har frångåtts i och med att direktresistensbestämningar har utförts med material direkt från blododlingsflaskor till skillnad från isolat som odlats på agarplattor över natt. För stora hämningszoner kan därmed inte uteslutas bero på metoden för direktresistensbestämning vilken avviker från den jämförande referensmetoden. Det är dock fortfarande möjligt att varierande innehåll i agarbasen gällande katjonkompositionen kan vara en bidragande faktor samt kvaliteten på antibiotikadiskarna. Det hade också varit intressant att ha noterat tiden då referensstammen odlats ut på agarplattan. Om den framväxta stammen var gammal och därmed inte var lika vital som ett ungt isolat så är det ytterligare en möjlig felkälla. Inga problem för gentamicin och enterokocker iakttogs vid efterkommande tester. För E. coli sågs ett test för meropenem då 75 µL blododlingsmedium användes resultera i en ojämn hämningszon, vilket orsakats av att antibiotikadisken inte var placerad helt plant mot agarytan. Därför har fullständig diffundering av antibiotika ut i agarn inte skett. Eftersom orsaken var felaktig placering av antibiotikadisken så togs beslutet att bortse från detta resultat.

Då en lägre volym användes kunde endast resultatet för de gramnegativa stammarna godkännas då de grampositiva stammarna inte genererade en tillfredsställande växt med tydliga zonkanter. Vid en större volym än 75 µL kunde endast de grampositiva godkännas. Växten på agarplattor inokulerade med gramnegativa stammarna var tjock och zonkanterna flikiga. Att en större volym fungerade bättre för grampositiva arter och en lägre volym för gramnegativa arter kan ses som ett resultat av de olika stammarnas tillväxthastighet. Gramnegativa bakterier, speciellt E. coli, har generellt en snabbare tillväxthastighet i jämförelse med grampositiva arter, även om det finns många olika faktorer som påverkar tillväxthastigheten (33). Dock observerades en gemensam volym som verkade generera godkända resultat oberoende av artens gramtillhörighet. Att använda en gemensam volym blododlingsmedium oavsett gramtillhörighet är fördelaktigt eftersom det skulle förenkla handhavandet av metoden. Eftersom volymen 75 µL gav flest godkända resultat så valdes den volymen för att gå vidare i processen till test av metodens reproducerbarhet. En gemensam volym indikerade godkända resultat för både grampositiva och gramnegativa stammar och valdes att implementeras för kommande direktresistensbestämningar oavsett gramtillhörighet. För de arter som inokulerats till både aerob och anaerob blododlingsflaska iakttogs ingen skillnad i resultat. Således kan det antas att bakteriens tillväxtförhållande inte inverkar på resultatet av direktresistensbestämning.

Beräkning av CFU/mL

Alla bakteriesuspensioner späddes 1:1 000 000 i syfte att kunna erhålla ett beräkningsbart antal koloniformande enheter. Initialt inokulerades blodagarplattor med 100 respektive 1000 µL bakteriesuspension innehållande E. coli samt P. aeruginosa. Dock visade sig 100o µL vara en för stor mängd att absorberas av agarplattan då plattorna fortfarande var blöta 18 ± 2 timmar efter inkubation. Därmed kunde antalet CFU/mL endast uppskattas, och de erhållna resultaten är inte tillförlitliga. Antalet CFU/mL för de gramnegativa referensstammarna kan därför inte anses vara representativa. På plattor inokulerade med 100 µL suspension var växten tillfredsställande och det gick att beräkna antalet CFU/mL. Det kan dock vara fördelaktigt att även ha en större volym som inokuleras till blodagarn då det finns en risk att antalet bakterier som följer med i den mindre volymen inte är representativ. När suspensioner innehållande grampositiva referensstammar inokulerades på blodagar användes istället

14

volymerna 100 respektive 500 µL. Halveringen av den större volymen visade sig ge utmärkta resultat då ingen överflödig vätska sågs på agarn efter inkubation och antalet koloniformande enheter kunde räknas utan problem. Vid en resistensbestämning med diskdiffusion enligt EUCAST tillsätts bakterieisolat till fysiologisk koksaltlösning och blandas till turbiditeten 0,5 McFarland. Då 0,5 McFarland enligt EUCAST motsvarar 1-2 × 108 _{CFU/mL för E. coli hade det varit önskvärt att hitta en volym blododlingsmedium}

som vid tillsats av 1,5 mL fysiologisk koksaltlösning har ett bakterieantal som motsvarar 1-2 × 108

CFU/mL. Viktigt att komma ihåg är dock att referensmetoden utgår från framväxta isolat på agar, vilket tillåter att antalet bakterier i bakteriesuspensionerna kan standardiseras på ett sätt som metoden för direktresistensbestämning inte kan. Eftersom tillverkning av bakteriesuspension vid direktresistensbestämning sker från det material som finns i blododlingsflaskorna är det helt och hållet beroende på vilken art som har tillväxt, då dess tillväxthastighet varierar, men även hur många bakterier som fanns i blododlingsflaskan från början innan inkubering kommer att påverka hur många CFU/mL som kommer att ses efter att agarplattor inokuleras och inkuberas i 18 ± 2 timmar. Därför kan inte resultaten av beräkningen CFU/mL ses som den enda avgörande faktorn avseende vilken testvolym som bör gå vidare i processen. Däremot kan resultaten ge en fingervisning och uppskattning om det i bakteriesuspensionerna är ett mer eller mindre antal bakterier. Syftet med att beräkna livskraftiga koloniformande enheter var att få en uppskattning om de testade volymerna genererade ett enormt antal CFU/mL eller väldigt få. Resultaten visade att suspensioner med gramnegativa referensstammar befann sig inom 1-2 × 108 _{CFU/mL då suspensionerna utgjordes av volymerna 75, 100 eller 125 µL. De}

grampositiva stammarna visade sig innehålla en mindre mängd bakterier då spannet var mellan 2,71 och 5,30 × 107 _{CFU/mL. Att antalet CFU/mL däremot befinner sig relativt nära 1-2 × 10}8 _{CFU/mL kan}

ändå ses som en indikation på en adekvat mängd bakterier.

Reproducerbarhet

Då den optimerade metodens reproducerbarhet testades, så bedömdes resultaten på antibiotikanivå, till skillnad från processen gällande volymoptimering där bedömningen utfördes på nivån av en hel direktresistensbestämning vilken inkluderade flera olika antibiotika som behövde godkännas för att direktresistensbestämningen skulle ses som godkänd. Detta innebar att samtliga resultat, med undantag för gentamicin, var tvungna att vara godkända för att direktresistensbestämningen skulle vara godkända. Enskilda bortfall på antibiotikanivå påverkade därmed inte den för hela resistensbestämningen. Bortfall inkluderade direktresistensbestämningar som saknade antibiotikalappar eller där lappar ej fäst ordentligt vid agarytan och därmed inte en fullständig diffundering av antibiotikat ut i agarn. Bortfallen inkluderade även de resultat som var av typen Area of Technical Uncertainty (ATU). En stam som är ATU för ett antibiotikum har inte kunnat SIR-kategoriseras med hjälp av diskdiffusionsmetod. Eftersom det inte går att avgöra huruvida stammen är känslig eller resistent krävs det att resistensbestämning utförs med annan metod som exempelvis buljongspädning (34, 35). Därmed har de fall där ATU inträffat exkluderats och hanterats som bortfall.

Vid utvärdering av upprepade direktresistensbestämningar som jämförs mot resistensbestämning med diskdiffusion enligt EUCASTs standardiserade metod är det viktigt att definiera vilka avvikelser som kan uppstå vid jämförelse av resultaten. Avvikelser kan ses som felaktig kategorisering enligt SIR-systemet. Felaktig kategorisering kan ha förödande terapeutisk effekt, exempelvis om en stam felaktigt kategoriseras som känslig, vilket innebär att patienten behandlas med overksamt antibiotika och dess tillstånd kan förvärras eller till och med leda till död (28). Resultaten visade att det inte förekom någon feltypning enligt SIR-systemet då den optimerade metoden visade 100 % känslighet och specificitet. Därför är det önskvärt att implementera den volymoptimerade metoden i rutinarbetet på laboratoriet. Förslagsvis bör metoden implementeras för E. coli, P. aeruginosa, S. aureus samt E. faecalis som samtliga uppvisat godkända resultat. Förekomsten av ATU för E. coli samt P. aeruginosa bör inte vara något hinder för införande eftersom det visat sig vara en jämn fördelning gällande resultatet ATU som iakttagits för både direktresistensbestämning likväl som resistensbestämningar enligt EUCASTs metod för diskdiffusion. Det saknas studier avseende direktresistensbestämning och möjligheter för snabb diagnostik avseende fenotypiskt resistensmönster bör fortsatt undersökas i framtiden. I en studie utförd vid University of California utfördes en variant av direktresistensbestämning då plattor inokulerades direkt med blododlingsmedium. Studien visade på potentialen av direktresistensbestämning då den SIR-kategoriska överensstämmelsen var mellan 86 och 92 % (21). Denna studie visade, till skillnad från den fyra år gamla studien, en 100 % kategorisk överensstämmelse avseende SIR-kategorisering. Det är därför tänkbart att det är en mer fördelaktig metod att före inokulering tillverka bakteriesuspensioner baserat på blododlingsmediet och metoden i denna studie kan ligga till grund till kommande studier.

15

En stor andel av de stafylokocker som inkluderats utgjorde av koagulasnegativa stafylokocker. Växten på direktresistensbestämningarna visade sig vara väldigt jämn och konfluerande för samtliga KNSer med undantag för S. hominis som växte ojämnt där enskilda CFU observerades vilket gav ett prickigt intryck. Zonkanter bedömdes trots det som tydliga och total kategorisk överensstämmelse sågs mellan de två jämförande metoderna. För framtida försök bör fler stammar av S. hominis inkluderas för att utröna huruvida direktresistensbestämning baserat på 75 µL blododlingsmedium är en optimal metod för just den arten. Inklusionen av stammar har begränsats av studiens omfattning. Ett större antal av samtliga arter i studien hade varit optimalt för att få ett större underlag för att dra slutsatser. Det är därför önskvärt att i kommande försök fortsätta utvärdera den optimerade metodens känslighet och specificitet för ett bredare urval av olika bakteriestammar. Det är inte realistiskt att kunna utföra en obegränsad mängd direktresistensbestämningar för samtliga arter som kan förekomma vid en positiv blododling. Det är däremot av vikt att resistensbestämning ingår för alla de bakteriearter som trots allt förekommer mer eller mindre frekvent i blododlingar. Därför är det av vikt att fortsätta utvärdera den optimerade metoden, särskilt fler gramnegativa stavar avseende både frekvens och artrikedom. Även streptokocker såsom alfa-hemolyserande streptokocker och S. pneumoniae är intressanta att utvärdera vidare. Syftet med kommande studier bör vara att kontrollera att resultaten för den optimerade metoden inte kommer av tillfällighet och därmed kontrollera metodens känslighet och specificitet för ytterligare bakteriearter. Skulle avvikande kategoriseringar observeras kan något lägre samt högre volymer av blododlingsmedium testas. Denna studie kan ligga till grund för kommande försök i att slutligen uppnå en standardiserad metod.

16

Slutsatser

Resultatet av den här studien visar att det är möjligt att optimera metoden avseende den volym blododlingsmedium som används vid direktresistensbestämning på blododlingsflaskor. En gemensam volym för både gramnegativa och grampositiva bakterier kunde bestämmas till 75 µL. Vid test av den volymoptimerade metodens reproducerbarhet var känsligheten och specificiteten var 100 %. Därför är det möjligt att implementera metoden i rutinarbetet vid direktresistensbestämningar. Dock bör ytterligare tester utföras för att säkerställa den optimerade metodens statistiska signifikans avseende känslighet och specificitet för fler bakteriearter som kan förekomma vid blododling än de som inkluderats i denna studie.

17

Referenser

1. Socialstyrelsen. Statistikdatabas för dödsorsaker [Statistik för dödsorsak A41 Annan septikemi] [cited 2021-03-22]. Available from: https://sdb.socialstyrelsen.se/if_dor/.

2. Mayr FB, Yende S, Angus DC. Epidemiology of severe sepsis. Virulence. 2014;5(1):4-11.

3. Sankar J, Garg M, Ghimire JJ, Sankar MJ, Lodha R, Kabra SK. Delayed Administration of Antibiotics Beyond the First Hour of Recognition Is Associated with Increased Mortality Rates in Children with Sepsis/Severe Sepsis and Septic Shock. J Pediatr. 2021;233:183-190.

4. Palmer HR, Palavecino EL, Johnson JW, Ohl CA, Williamson JC. Clinical and microbiological implications of time-to-positivity of blood cultures in patients with Gram-negative bacilli bacteremia. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2013;32(7):955-9.

5. Weiss SL, Fitzgerald JC, Pappachan J, Wheeler D, Jaramillo-Bustamante JC, Salloo A, et al. Global epidemiology of pediatric severe sepsis: the sepsis prevalence, outcomes, and therapies study. Am J Respir Crit Care Med. 2015;191(10):1147-57.

6. Lamy B, Sundqvist M, Idelevich EA, ESCMID Study Group for Bloodstream Infections EdaSE. Bloodstream infections - Standard and progress in pathogen diagnostics. Clin Microbiol Infect. 2020;26(2):142-50.

7. Åkerlund A, Jonasson E, Matuschek E, Serrander L, Sundqvist M, Kahlmeter G, et al. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) in blood cultures: validation in 55 European laboratories. J Antimicrob Chemother. 2020;75(11):3230-8.

8. Ventola CL. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P T. 2015;40(4):277-83.

9. Mancini S, Bodendoerfer E, Kolensnik-Goldmann N, Herren S, Röthlin K, Courvalin P, et al. Evaluation of standardized automated rapid antimicrobial susceptibility testing of Enterobacterales-containing blood cultures: a proof-of-principle study. J Antimicrob Chemother. 2020;75(11):3218-29.

10. Peter TF, Shimada Y, Freeman RR, Ncube BN, Khine AA, Murtagh MM. The need for standardization in laboratory networks. Am J Clin Pathol. 2009;131(6):867-74.

11. Turner PE, Williams ES, Okeke C, Cooper VS, Duffy S, Wertz JE. Antibiotic resistance correlates with transmission in plasmid evolution. Evolution. 2014;68(12):3368-80.

12. Kriegeskorte A, Idelevich EA, Schlattmann A, Layer F, Strommenger B, Denis O, et al. Comparison of Different Phenotypic Approaches To Screen and Detect. J Clin Microbiol. 2018;56(1).

13. Matuschek E, Brown DF, Kahlmeter G. Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. 2014;20(4):O255-66.

14. Jonasson E, Matuschek E, Kahlmeter G. The EUCAST rapid disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood culture bottles. J Antimicrob Chemother. 2020;75(4):968-78.

15. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST disk diffusion method www.eucast.org2021 [cited 2021-03-22] [Version 9.0:[Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Disk_test_documents/2021_man uals/Manual_v_9.0_EUCAST_Disk_Test_2021.pdf.

16. Kronvall G, Giske CG, Kahlmeter G. Setting interpretive breakpoints for antimicrobial susceptibility testing using disk diffusion. Int J Antimicrob Agents. 2011;38(4):281-90.

17. Folkhälsomyndighetens nationella referenslaboratorier för Antibiotikaresistens www.folkhalsomyndigheten.se: Folkhälsomyndigheten; [cited 2021-03-22]. Available from:

https://www.folkhalsomyndigheten.se/globalassets/laboratorieanalys/slim/nrl-34-antibiotikaresistens.pdf.

18. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables för interpretation of MICs and zone diameters www.eucast.org2021 [cited 2021-03-22] [Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_11.0_Break point_Tables.pdf.

19. Ramström H. Metodbeskrivning klinisk mikrobiologi. VGR Blododling. [cited 2021-03-22] [Metodbeskrivning interdokument]. In press 2020.

20. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Methodology - EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST)

directly from positive blood culture bottles www.eucast.org2019 [cited 2021-03-22] [Version

1.1:Available from:

https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/RAST/EUCAST_RAST_metho dology_v1.1_Final.pdf.

18

21. Chandrasekaran S, Abbott A, Campeau S, Zimmer BL, Weinstein M, Thrupp L, et al. Direct-from-Blood-Culture Disk Diffusion To Determine Antimicrobial Susceptibility of Gram-Negative Bacteria: Preliminary Report from the Clinical and Laboratory Standards Institute Methods Development and Standardization Working Group. J Clin Microbiol. 2018;56(3).

22. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine and extended internal quality control for MIC determination and disk diffusion as recommended by EUCAST www.eucast.org2021

[cited 2021-03-22] [Version 11.0:[Available from:

https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/QC/v_11.0_EUCAST_QC_tabl es_routine_and_extended_QC_pdf.pdf.

23. Folkhälsomyndigheten. Referensmetodik Klinisk mikrobiologi Provtagning - Blododling [cited 2021-03-22]. Available from: http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/w/Provtagning-blododling. 24. Fiori B, D'Inzeo T, Di Florio V, De Maio F, De Angelis G, Giaquinto A, et al. Performance of two

resin-containing blood culture media in detection of bloodstream infections and in direct matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) broth assays for isolate identification: clinical comparison of the BacT/Alert Plus and Bactec Plus systems. J Clin Microbiol. 2014;52(10):3558-67.

25. Jacobs MR, Mazzulli T, Hazen KC, Good CE, Abdelhamed AM, Lo P, et al. Multicenter Clinical Evaluation of BacT/Alert Virtuo Blood Culture System. J Clin Microbiol. 2017;55(8):2413-21.

26. Thorpe TC, Wilson ML, Turner JE, DiGuiseppi JL, Willert M, Mirrett S, et al. BacT/Alert: an automated colorimetric microbial detection system. J Clin Microbiol. 1990;28(7):1608-12.

27. Bourbeau PP, Pohlman JK. Three days of incubation may be sufficient for routine blood cultures with BacT/Alert FAN blood culture bottles. J Clin Microbiol. 2001;39(6):2079-82.

28. Hombach M, Böttger EC, Roos M. The critical influence of the intermediate category on interpretation errors in revised EUCAST and CLSI antimicrobial susceptibility testing guidelines. Clin Microbiol Infect. 2013;19(2):E59-71.

29. Unilabs. VGR Prickings- och antibiotikalista. [cited 2021-03-22] [Interndokument]. In press 2020. 30. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine and extended internal quality

control for MIC determination and disk diffusion as recommended by EUCAST www.eucast.org2021

[cited 2021-05-21]. Version 11.0:[Available from:

https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/QC/v_11.0_EUCAST_QC_tabl es_routine_and_extended_QC_pdf.pdf.

31. Cobos-Triguero N, Zboromyrska Y, Morata L, Alejo I, De La Calle C, Vergara A, et al. Time-to-positivity, type of culture media and oxidase test performed on positive blood culture vials to predict Pseudomonas aeruginosa in patients with Gram-negative bacilli bacteraemia. Rev Esp Quimioter. 2017;30(1):9-13. 32. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Variation in performance of Mueller

Hinton dehydrated media for antimicrobial susceptibility testing www.eucast.org: EUCAST; 2020 [cited

2021-05-21]. Available from:

https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Warnings/Warnings_docs/Warn ing_-_Mueller_Hinton_media.pdf.

33. Allen RJ, Waclaw B. Bacterial growth: a statistical physicist's guide. Rep Prog Phys. 2019;82(1):016601. 34. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Area of Technical Uncertainty (ATU)

in antimicrobial susceptibility testing (1 June, 2020) www.eucast.org: EUCAST; 2020 [cited 2021-05-21].

Available from:

https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/Area_of_Tech nical_Uncertainty_-_guidance_v2_2020.pdf.

35. The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Graphical presentation of species and agents where EUCAST has introduced an Area of Technical Uncertainty (ATU) www.eucast.org:

EUCAST; 2020 [cited 2021-05-21]. Available from:

https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Guidance_documents/ATU_v_1. 0_February_2020_Final.pdf.

19

Bilagor

22

Bilaga 2. Resultat för test av reproducerbarhet

23 Resultat för test av reproducerbarhet avseende E. coli.

24

25

Resultat för test av reproducerbarhet avseende övriga gramnegativa stavar (GNS).

26 Resultat för test av reproducerbarhet avseende S. aureus.

27

28

Resultat för test av reproducerbarhet avseende Enterococcus spp.

29