TIGIT-uttryck som prognostisk markör
vid prostatacancer
En immunohistokemisk utvärdering av T cell
immunoreceptor with Ig and ITIM domains-uttryck i primärtumören hos prostatacancerpatienter med eller utan lymfkörtelmetastas
TIGIT expression as a prognostic
marker for prostate cancer
An immunohistochemistry evaluation of T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains
expression in the primary tumor of prostate cancer patients with or without lymph node metastases
Författare: Fredrik Ähdel
Vårterminen 2021
Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap
Biomedicinska analytikerprogrammet, inriktning laboratoriemedicin BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng
Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Handledare: Sabina Davidsson, docent & affilierad forskare, Örebro universitet
A
BSTRAKTProstatacancer utgör idag den vanligaste cancerformen bland män i västvärlden och enbart i Sverige diagnostiseras cirka 10 000 män årligen med sjukdomen.
Immunförsvaret och mer specifikt CD8+ T-cellerna spelar en viktig roll i förmågan att eliminera tumöromvandlade celler innan en klinisk relevant cancer uppstår.
T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and tyrosine-based inhibitory motif
domain (TIGIT) är ett inhibitoriskt checkpoint protein som har visat sig ha en dämpande effekt på CD8+ T-celler vilket tumörceller utnyttjar för att öka sin tillväxt. Detta protein har identifierats i hög grad i flera olika cancertyper samt kan användas som prognostisk markör för ett antal olika cancersjukdomar.
Ett immunohistokemiskt protokoll optimerades och användes för att detektera TIGIT-uttryck i formalinfixerad och paraffininbäddad prostatatumörer från män med eller utan lymfkörtelmetastas vid diagnostillfället.
Resultatet var att av patienter med lymfkörtelmetastas hade 17 (77,3 %) TIGIT-uttryck i sin primärtumör och för män utan lymfkörtelmetastas hade 27 (79,4 %) TIGIT-uttryck. Fisher’s exact test användes för att studera associationen mellan TIGIT-uttryck i
primärtumören hos prostatacancerpatienter och lymfkörtelmetastas. Testet visade ingen signifikant skillnad mellan dessa grupper, p = 1,00. Vår slutsats är att TIGIT inte kan användas som prognostisk markör för prostatacancermetastasering, men ytterligare studier krävs för att definitivt kunna dra några slutsatser.
ABSTRACT
Prostate cancer constitutes the most common form of cancer among men in the western world today and, in Sweden alone, about 10,000 men are diagnosed with the disease annually. The immune system and specifically CD8+ T cells play an important role in the ability to eliminate tumour cells before a clinically significant cancer occurs. T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and tyrosine-based inhibitory motif domain (TIGIT) is an inhibitory checkpoint protein that has been shown to have a suppressing effect on CD8+ T cells in which tumour cells exploit to increase in size. This protein has been identified in several types of cancer and can be used as a prognostic biomarker in a range of different cancer diseases.
A protocol for immunohistochemistry was optimized and used for detecting TIGIT expression in formalin-fixed and paraffin-embedded tissues of prostate tumour from men either with lymph node metastases or not by the time of diagnosis.
The results from patients with lymph node metastases was that 17 (77,3 %) had TIGIT expression in their primary tumour while for men without lymph node metastases 27 (79,4 %) had TIGIT expression. Fisher’s exact test was used to study the association between TIGIT expression in the primary tumour of prostate cancer patients and lymph node metastases. The test showed no significant difference between these groups, p = 1,00. Our conclusion is that TIGIT can not be used as a prognostic biomarker for prostate cancer metastases, but further study is needed to definitely draw any
conclusions.
INNEHÅLL
Introduktion ... 1
Prostatacancer ... 1
Immunförsvarets roll vid cancerutveckling ... 2
Immunohistokemi ... 4 Förbehandling ... 5 Bakgrundsblockering ... 6 Antikroppar ... 6 Detektion ... 6 Kromogen ... 8
Motfärgning & Montering ... 8
Felsökning ... 8
Syfte & Frågeställning ... 8
Material och Metod ... 9
Material ... 9
Utvärdering ... 10
Etisk reflektion ... 10
Statistisk bearbetning ... 10
Resultat ... 11
Optimering av IHC protokoll för detektion av TIGIT ... 11
Association mellan TIGIT-uttryck och metastaserad prostatacancer ... 12
Diskussion ... 14
1
INTRODUKTION
Prostatacancer
Prostatacancer utgör idag den vanligaste cancerformen bland män i västvärlden och enbart i Sverige diagnostiseras cirka 10 000 män årligen med sjukdomen. I Sverige och Europa samt i övriga västvärlden utgör prostatacancer dessutom den vanligaste
cancerrelaterade dödsorsaken bland män (1–3). I dagsläget finns det ingen etablerad orsak till att män drabbas av prostatacancer men ett antal riskfaktorer har identifierats så som ålder, etnicitet, ärftlighet och kronisk inflammation i prostatan (3–5).
Prostatacancer är väldigt vanligt hos åldrande män och är den snabbast ökande cancerformen i Sverige (1).
Morfologiskt diagnostiseras och bedöms prostatatumörer med hjälp av
Gleasongradering och TNM-klassifikation. Gleasongradering är den dominerande metoden för tumörgradering av primärtumören vid prostatacancer. Den histopatologiska bedömningen i anaplasi som Gleasongraderingen delar in tumören i ger en bild av hur långt ifrån en normal vävnad tumören är. Siffrorna 1–5 får representera graden av anaplasi där 1 är nära normal vävnad och 5 låg nivå av differentiering. Den
dominerande (vanligast förekommande) graden summeras med den högsta graden som påträffats för att ge resultatet Gleasonsumma (1). TNM-systemet är ett
stadiegraderingssystem för indelning av tumören gällande anatomisk spridning där T står för lokalt stadium – hur utbredd tumören är i och kring prostatakörteln. N-stadiet beskriver om tumören gett upphov till metastaser i regionala lymfkörtlar och där N0 betyder icke påvisad lymfkörtelmetastas och N1 påvisade lymfkörtelmetasetaser. M-stadiet beskriver fjärrmetastasering, på samma sätt som N gör, för huruvida
metastasering i andra organ påträffats (1). För män med en lokaliserad tumör, det vill säga där tumören inte gett upphov till lymfkörtelmetastaser, finns det botande
behandlingsalternativ såsom operation och strålning, medan det i dagsläget inte finns botande behandling för prostatcancerpatienter med metastaserad sjukdom (6). Tyvärr kan dock inte de verktyg som används kliniskt på ett adekvat sätt särskilja aggressiva och indolenta (ej aggressiva) tumörer redan vid diagnostillfället vilket leder till att man ser en stor överbehandling på patienter diagnosticerade med prostatacancer. Denna överbehandling har stora konsekvenser för patienter med indolenta tumörer på grund av
2 att både operation och strålning är behäftade med komplikationer, såsom nedsatt
erektion och urinläckage (1,7). För att på ett bättre sätt kunna omhänderta patienter diagnosticerade med prostatacancer är det därför av stor betydelse att finna nya prognostiska markörer för sjukdomen.
Immunförsvarets roll vid cancerutveckling
Som skydd mot uppkomst av alla typer av tumörer spelar kroppens immunförsvar en viktig roll då specifika immunceller har förmåga att känna igen och eliminera
tumöromvandlade celler innan en kliniskt relevant cancer uppstår. Konceptet ”Cancer immunoediting” är en modell som förklarar hur immunförsvaret kontrollerar och interagerar med tumöromvandlande celler och visar att sammansättningen av
immunceller spelar en viktig roll vid tumörinitiering och progression (8). En initierande fas, eliminationsfasen, domineras av immunceller som är kopplade både till den akuta och den kroniska immunresponsen men utgörs till största del av CD4+ och CD8+
T-celler. Dessa celler, men specifikt CD8+ T-celler, har rapporterats som avgörande för ett
effektivt tumörhämmande immunsvar. Vid en ofullständig eliminering av
transformerade celler inträder en jämviktsfas där immuncellerna inte kan eliminera transformerade celler fullständigt, men där en kliniskt relevant cancer ej heller
uppkommer. Under denna fas, som kan pågå över en lång tid, kan vissa transformerade celler skapa förutsättningar att undgå immunförsvaret vilket ger upphov till den tredje fasen, flykt-fasen, där tumörer kan öka sin tillväxt och därmed ge upphov till en kliniskt relevant cancer. I denna fas undgår tumörer att bli eliminerade av immunförsvaret via olika mekanismer där en mekanism är att dämpa den tumör-hämmande effekten hos CD8+ T-celler genom att stimulera en uppreglering av inhibitoriska checkpoint proteiner
(8).
Checkpoint proteiner är en grupp proteiner vars normala funktion är att skapa ett balanserat immunsvar. Det finns både stimulerande och inhiberande checkpoint proteiner där de stimulerande proteinerna aktiverar ett T-cells medierat immunsvar medan de inhiberande proteinerna har en dämpande effekt på T-cells-aktivering i syfte att skydda kroppen mot uppkomst av exempelvis autoimmuna sjukdomar. För att en T-cell ska aktiveras krävs två olika signaler. Den första signalen genereras genom
antigen-3 presenterande celler (APC). Den andra signalen genereras då en interaktion sker mellan CD28 och B7-proteinerna B71 eller B72. För att det ska bli en T-cells aktivering krävs både den första och den andra signalen. När en T-cell väl är aktiverad uppregleras olika feedback-mekanismer vilka utgörs till stor del av olika stimulerande och inhiberande checkpointproteiner (9). Inhibitoriska checkpoint proteiner är en viktig del i
motverkandet av okontrollerad T-cell aktivering som kan leda till vävnadsskada och uppkomst av autoimmuna sjukdomar (8). Genom att stimulera till uppreglering av dessa checkpoint proteiner skapar tumörcellerna en immunosupprimerande mikromiljö och därmed förbättrade tillväxtmöjligheter. Ett antal olika inhiberande checkpoint proteiner har identifierats där de mest studerade är cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4), programmed cell death protein 1 (PD-1) samt liganden programmed death-ligand 1 (PD-L1)(10).
Ett betydligt mindre studerat inhibitoriskt checkpoint protein är T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and tyrosine-based inhibitory motif domain (TIGIT) som uttrycks på T-celler och NK-celler. Tidigare forskning har visat att TIGIT har en
immundämpande effekt på tumörinfiltrerande CD8+ T-celler och ett högt uttryck i olika
cancervävnader har associerats med en sämre prognos. Ett högt TIGIT-uttryck har identifierats i ett flertal olika cancertyper, så som melanom, lungcancer, koloncancer, bröstcancer, njurcancer och livmodercancer (11,12). Forskning har även visat att TIGIT och PD-1 kan användas som prognostiska markörer för till exempel magcancer och i en nyligen publicerad artikel av Zhao et al. rapporterades det att TIGIT-uttryck på gennivå var högre hos prostatacancer patienter klassade med högrisktumörer jämfört med lågriskpatienter (11,13). I denna studie ville vi studera om TIGIT-uttryck i primärtumör kan användas som prognostisk markör för prostatacancer genom att studera skillnader i TIGIT-uttryck mellan prostatacancerpatienter diagnosticerade med eller utan
4
Immunohistokemi
Immunohistokemi (IHC) är en mycket användbar metod inom både forskning och kliniken för att visualisera cellulära komponenter i vävnaden så som proteiner och andra makromolekyler. Metoden är baserad på att till vävnaden tillsätta specifika antikroppar riktade mot målmolekylen. Antikroppen är inmärkt med ett enzym som får reagera med ett substrat vilket resulterar i ett färgomslag som sedan går att detektera i mikroskop. Immunohistokemi är således ett användbart tillägg till vanlig histologisk infärgning vid diagnostisk patologi. Detektion av målmolekylerna är också viktigt vid riktad
behandling samt vid identifiering av prognostiska markörer (14).
Materialet som används vid immunohistokemi (IHC) är oftast vävnader som genomgått formalinfixering och paraffininbäddning (FFPE). Fryssnitt går också att använda vid IHC men kräver snabbt omhändertagande vilket gör det olämpligt för retrospektiva studier. FFPE förhindrar autolys och enzymatisk nedbrytning av epitoper samt att vävnadsmorfologin bibehålls. Formalinet bildar bryggor inom och mellan proteiner samt nukleinsyror i vävnaden så att cellulära nedbrytningsmolekyler som aktiveras vid apoptos inte kan mobiliseras (14,15).
För att kunna undersöka en mängd biopsiprover på en begränsad yta kan tissue
microarray (TMA) användas. Från originalsnittet som bäddats in i paraffin kan ett flertal cylindriska stansar plockas ut från utvalda delar av vävnaden där intresse finns att studera. Dessa stansar är av samma ytstorlek så att vidare analys med exempelvis IHC och fluorescens in situ hybridisering lättare kan standardiseras och reproduceras. En till fördel med detta är att TMA sparar på värdefull vävnad och att originalsnittet finns kvar efter analys. Storleken på stansarna är varierande: med en 0,6 mm nål kan 600 stansar enkelt placeras på ett enda normalstort mikroskopiglas. Detta medför att på metoder som kräver en viss mängd reagens per mikroskopiglas som tidigare endast höll biopsin från ett fåtal anatomiska placeringar istället kan analysera upp till 600 stansar från lika många olika placeringar. På grund av stansens smärre storlek behövs däremot ett flertal stansar per biopsi så att resultatet från analys blir homogeniserad och representativ. För att få en så överensstämmande bild av vävnaden som möjligt krävs minst två stansar per biopsi för få minst 95 % överensstämmelse och fyra stansar för att få en mycket hög jämförbarhet (16).
5 Objektsglasen som används till IHC är positivt laddade eller behandlade med kemikalier så att celler, som oftast är negativt laddade, elektrostatiskt attraheras och adherar till glasets yta. Detta är mycket viktigt vid vidare preparering då hård behandling kan göra att preparatet släpper från glaset. Glasen får en positiv laddning genom att en
polymerbeläggning läggs på glaset och får binda kovalent med kiseldioxiden på glasets yta (14).
Förbehandling
Innan IHC görs en avparaffinering genom att först ”baka” snitten i 37 °C över natt eller i 60 °C i en till två timmar för att snittet ska brännas fast på glaset och sedan använda en av de många avparaffineringsmetoder som finns tillgängliga. Antingen görs detta
genom att doppa vävnadsglasen i blandningsbar vätska som xylen, som kan ersätta paraffinet i vävnaden, och sedan rehydrera vävnaden genom att doppa glasen i sjunkande koncentration alkohol, eftersom alkohol är blandningsbar med både xylen och vatten (14). Alternativt används en kommersiellt tillgänglig produkt som
kombinerar deparaffinering med heat induced epitope retrieval.
Heat induced epitope retrieval (HIER) används för att bryta upp metylenbryggor och åter öppna upp epitoper som tidigare blockerats av formaldehyd vid inbäddning, så kallad epitopåtervinning. Epitopåtervinning är ett viktigt steg i IHC för att öka sensitiviteten utöka metodens användningsområden. Epitopåtervinning går att göra enzymatiskt, via värme, eller både och. I nuläget är HIER den mest populära metoden som använder värme för att bryta upp bryggorna. Flera sätt att tillsätta värme på
preparaten har använts, så som vattenbad, mikrovågsugn, autoklav och tryckkokare men det viktigaste är inte vilken maskin som används utan mängden värmeenergi som får reagera med vävnaden (15). Viktiga parametrar som måste ändras vid en optimering är således gradantal och tid. Vid användning av en bufferlösning samtidigt som HIER reagerar med vävnaden samt en efterföljande avparaffineringslösning behövs inte de mer manuella stegen med Xylen vilket sparar tid för analytikern samt kostnad för avlägsnande av farligt avfall (15).
6
Bakgrundsblockering
Immunohistokemiprincipen börjar med bakgrundsblockering. Vid detektion används enzym för att katalysera reaktionen av ett substrat. Substratet är ofta fluorescerande markörer eller enzymer som aktiveras av alkalisk fosfatas (ALP) eller horseradish peroxidase (HRP). Peroxidas finns endogent i vissa vävnader så som i leukocyter och erytrocyter samt i tumörer så detta måste inhiberas genom att tillsätta väteperoxid, så att inte detektionen blir ospecifik (14,17).
Antikroppar
Huvudsyftet med IHC är att en specifik antikropp ska binda in till en epitop på en utvald antigen i vävnaden som undersöks – den kan binda nukleärt, membranöst eller
cytoplasmatiskt beroende på var antigenet sitter. TIGIT är ett cytoplasmatiskt protein och antikroppen kommer därav binda in till hela cellen förutom cellkärnan. Antikroppen kan vara monoklonal eller polyklonal och titreras för att binda in till målmolekylen så specifikt som möjligt utan att binda in till bakgrunden. En monoklonal antikropp brukar vara mer specifik medan en polyklonal antikropp är mer sensitiv, då polyklonala
antikroppar kan binda flera epitop. Eftersom polyklonala antikroppar binder till fler epitop kan fler antikroppar sedan färgas in, därav också ge starka infärgningar. Däremot genom att tillsätta en sekundär antikropp som binder till den primära antikroppen, så kallad indirekt antikroppsdetektion, kan även en monoklonal antikropp ge starka infärgningar. Tiden som antikroppen får på sig att binda till vävnaden samt
temperaturen är också två viktiga faktorer som kan påverka specificiteten av antikropp-antigen bindningen (14).
Detektion
Antikroppen behöver vara inmärkt för att senare kunna detekteras. Inmärkningen är oftast enzym som ett substrat kan reagera med för att antigen ge ett färgomslag, men kan även vara en fluorescerande markör. Som tidigare nämnt används ofta HRP som enzym, detta på grund av dess goda stabilitet, liten storlek vilket inte hindrar inbindning till närliggande epitop, låga kostnad, samt stora utbud av substrat (14).
För att få en mer sensitiv detektion går det att tillsätta en sekundär antikropp för att detektera den primära. I en traditionell metod tillsätts en primär antikropp konjugerad med ett enzym som binder till målmolekylen och får därigenom en 1:1 ratio mellan
7 antigen och detekterbart substrat. Den traditionella metoden är således snabb och enkel att sätta upp, men saknar sensitiviteten som andra metoder har då infärgningen är direkt kopplad till koncentrationen antikroppar. I en tvåstegs, indirekt metod, tillsätts först en primär antikropp för att sedan tillsätta en sekundär antikropp konjugerad med enzym. Detta ger fördelen att fler sekundära antikroppar kan binda till den primära och därigenom ge en kraftigare signal. Modernare detektionssystem använder en
påbyggnadsmolekyl till den sekundära antikroppen så att fler enzym indirekt binds till samma antigen och därav ger en starkare signal. Polymerteknik är ett sådant
detektionssystem där upp till tio sekundärantikroppar och 70 enzymmolekyler är
konjugerade till en dextranpolymer som kan binda primärantikroppen (Figur 1) (14,17).
Figur 1. Polymerteknik vid immunohistokemi. Den sekundära antikroppen och enzym är konjugerat till en dextranpolymer. Detta ger fler molekyler per antigen som kan reagera med substratet som tillsätts, för en starkare signal. Bild lånad med tillåtelse av Histolab
8
Kromogen
Enzymet som är konjugerat till antikroppen reagerar med substratet för att bilda ett färgomslag som är möjlig att detektera i mikroskop. HRP som är ett populärt enzym kan kombineras med kromogen som exempelvis 3,3α-diaminobenzin (DAB) för att bilda en stark mörkbrun utfällning som är stabil och olöslig. Andra kromogen finns tillgängliga men är ofta lösliga i alkohol och xylen vilket gör montering svårare (14,17).
Motfärgning & Montering
Kromogenet färgar in antigenet och de celler som uttrycker det, men det krävs också en motfärgning för att den generella morfologin ska urskiljas. En motfärgning ger
analytikern ett sätt att urskilja vilka celler som färgades in av kromogenet genom att det ökar kontrasten mellan kromogenet och övrig vävnad. För att undvika förväxling mellan kromogenets utfällning och motfärgningen rekommenderas att motfärgningen är av annan kulör än kromogenet. DAB ger en brun utfällning och ett exempel på
motfärgning är hematoxylin som ger en blå färg till övrig vävnad (17). Efter
motfärgningen monteras vävnaden i xylenbaserade eller vattenlösliga monteringsmedel för att vävnaden och infärgningen ska bibehållas under en längre tid.
Felsökning
Efter en lyckad IHC infärgning måste resultatet jämföras mot en positiv kontroll. TIGIT uttrycks, som tidigare nämnt, hos T-celler och NK-celler, därav är tonsill en bra positiv kontroll för detta uttryck.
Syfte & Frågeställning
Studiens syfte var att optimera ett immunohistokemiskt protokoll för att detektera TIGIT-uttryck i formalin fixerad och paraffininbäddad prostatavävnad. Det optimerade protokollet skulle sedan användas för att undersöka om ett högre TIGIT-uttryck i primärtumören hos prostatacancerpatienter är förknippat med ökad risk för lymfkörtelmetastas.
9
MATERIAL OCH METOD
Material
Totalt 61 patienter med prostatacancer inkluderades i denna studie där samtliga patienter var opererade med radikal prostatektomi och samtidig lymfkörtelutrymning vid Centralsjukhuset i Karlstad under åren 2009–2011 & 2016–2017. Utifrån en
morfologisk bedömning av både primärtumör och lymfkörtelvävnad har sedan patienten erhållit diagnosen prostatacancer med eller utan lymfkörtelmetastas (N1 respektive N0). Prostatavävnad från dessa operationer har dessutom, efter avslutat ingrepp,
formalinfixerats och paraffininbäddats. På vävnadsglas kopplat till respektive vävnadskloss har en patolog cirklat tumörområden från primärtumören. Från dessa områden har sex vävnadsstansar tagits (0,6 mm/stans) och TMAer har sedan konstruerats. Fyra mikrometer tjocka vävnadssnitt från dessa TMAer har sedan placerats på laddade glas och bakats inför IHC.
Heat induced epitope retrieval utfördes i tryckkokaren Decloaking Chamber NxGen (Biocare, CA, USA) på 95 °C med epitopåtervinningslösningen Borg Decloaker (Biocare, CA, USA) i 10 min. Efter epitopåtervinning doppades glasen i 1X Hot Rinse (Biocare, CA, USA) några gånger tills allt paraffin löst sig från glasen. Till Hot Rinse tillsattes gradvis avjoniserat vatten tills inget Hot Rinse fanns kvar, varpå glasen sedan sattes i 1X bufferlösning TBS Auto Wash Buffer (Biocare, CA, USA).
Immunohistokemi utfördes med intelliPATH FLX (Biocare, CA, USA). I ett första steg blockerades endogent peroxidas med Dako EnVision Flex Peroxidase-Blocking
Reagent (Agilent, CA, USA) som fick inkubera på glasen i 15 min. Därefter tillsattes Background Punisher (Biocare, CA, USA) som fick inkubera under 10 min för att motverka ospecifik infärgning. För att detektera TIGIT i vävnaden tillsattes i nästa steg en ready-to-use primär monoklonal antikropp från kanin riktad mot TIGIT (RM
BLR047F, Biocare, CA, USA). Efter att primär antikroppen varit placerad på vävnaden i 30 min tillsattes MACH 4 Mouse Probe (Biocare, CA, USA) i 10 min och sedan sekundär antikropp MACH 4 Universal HRP-Polymer (Biocare, CA, USA) i 35 min. För att visualisera inbunden primär/sekundär antikropp tillsattes kromogenet Betazoid DAB Substrate Chromogen (Biocare, CA, USA) enligt företagets rekommendationer i 5
10 min. Efter varje steg tvättades preparaten i 1X bufferlösning TBS Auto Wash Buffer (Biocare, CA, USA).
Motfärgning utfördes med Mayers Hematoxylin (Histolab Products, Askim, Sverige) under 2 min och sköljdes därefter med kranvatten till ingen färg löstes från preparatet. Preparaten dehydrerades i stegrande koncentration alkohol där slutsteget var xylen och monterades sedan med Pertex mounting medium (Histolab Products, Askim, Sverige).
Utvärdering
Utvärdering av IHC utfördes av författaren på högupplösta bilder från mjukvaran Caseviewer (3DHISTECH, Budapest, Ungern) efter att preparaten skannats i
Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Budapest, Ungern). Vävnadsstansarna utvärderades i kategorierna noll till fyra där noll är inget TIGIT uttryck, ett är 0≤5 % total TIGIT-uttryck i vävnaden, två är 5≤20 % och tre är >20 % total TIGIT-TIGIT-uttryck.
Etisk reflektion
Ett övervägande gjordes i huruvida kontakt med forskningsdeltagarna för informerat samtycke var nödvändig. Majoriteten av deltagarna var vid tidpunkten för studien avlidna. Risken med att kontakta de få deltagare som överlevt är att deltagarfrekvensen bland de patienter som överlevt länge hade minskat, vilket skulle kunna innebära en risk för selektivt bortfall och minskade möjligheter att dra slutsatser kring denna
patientgrupp. Då alla identifierbara data hanterats med yttersta försiktighet och all analys och presentation av data skett på gruppnivå ansåg vi att risken för
integritetsintrång är mycket liten. Etikprövningsmyndigheten har godkänt att vi för denna studie inte inhämtar samtycke från patienterna som lever (diarienummer 2018/320).
Statistisk bearbetning
I den här studien studerade vi associationen mellan TIGIT-uttryck och lymfkörtelmetastas hos patienter med prostatacancer. För att analysera denna association användes Fisher’s Exact test i programmet SPSS (IBM, USA).
Signifikansnivån sattes till α = 0,05. Inklusionskravet var att minst två av sex stansar kunde utvärderas efter utförd IHC.
11
RESULTAT
Optimering av IHC protokoll för detektion av TIGIT
För att öka känsligheten och färgintensiteten från ursprungsprotokollet enligt tillverkarens rekommendationer, ändrades parametrar kopplat till förbehandling, inkuberingstid med primärantikropp och användningen av prob. Tonsill användes som positiv kontrollvävnad enligt tillverkarens rekommendationer. Vid utförande av IHC med det initiala protokollet, beskrivet ovan, resulterade färgningen i en något ospecifik infärgning med bakgrundsfärgning och otydlig cytoplasmainfärgning (Figur 2 A). Förbehandlingen HIER ändrades då till 110 °C i 15 min för att öppna upp ytterligare epitoper och en ny körning resulterade i en klarare motfärgning och mindre
bakgrundsfärg medan specificiteten fortfarande var något låg (Figur 2 B). I nästa steg ändrades inkubationstiden med primärantikroppen till 60 min vilket ökade sensitiviteten då cytoplasmainfärgningen vart starkare när antikroppen fick längre tid på sig att binda in till dess epitop (Figur 2 C). I ett försök att ytterligare öka färgintensiteten plockades proben bort på inrådan av tillverkaren. Utan prob resulterade i en mörkare infärgning av vävnaden och en starkt infärgad cytoplasma. Detta protokoll bedömdes vara optimalt för att utvärdera vävnaden efter uttryck av TIGIT då tonsillen hade en stark infärgning av cytoplasma, ingen nämnvärd bakgrundinfärgning kunde urskiljas samt epitel och bindväv ej färgats in (Figur 2 D). Slutgiltiga protokollet blev således: Förbehandling med HIER på 110 °C i 15 min, peroxidasblockering i 15 min, Background Punisher i 10 min, inkubation av primärantikropp i 60 min, sekundär antikropp i 35 min och
12 Figur 2. Resultat från immunohistokemi. Tonsill infärgad med T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and tyrosine-based inhibitory motif domain monoklonal
antikropp (RM BLR047F Biocare, CA, USA) med detektionssystemet MACH 4 Universal HRP-Polymer Detection System (Biocare, CA, USA) och motfärgad i hematoxylin. Optimering från (A) tillverkarens rekommenderade protokoll till (B) förbehandling med HIER 110 °C i 15 min samt även ändra tiden för (C) inkubation med primärantikropp i 60 min och (D) utan användning av prob. Samtliga bilder är i 40X förstoring.
Association mellan TIGIT-uttryck och metastaserad prostatacancer
Av de 61 inkluderade patienterna exkluderades 5 patienter på grund av att enbart en stans från dessa patienter kunde utvärderas. Av de kvarvarande 56 patienterna var 22 patienter (39,3 %) diagnosticerade med lymfkörtelmetastas medan övriga 34 patienter ej hade påvisade lymfkörtelmetastaser. Vid utvärdering av de infärgade glasen noterade vi att TIGIT hade lågt uttryck i prostatavävnad – endast få celler per patient. Ingen av de undersökta TMA-stansarna utvärderades till kategori två eller högre, vilket gjorde att TIGIT-uttrycket dikotomiserades dvs kategoriserades i två olika grupper TIGIT-uttryck ja eller nej. Representativa bilder från IHC färgningen av TIGIT ses i figur 3.
13 Figur 3. Infärgning av checkpoint proteinet T-cell immunoreceptor with
immunoglobulin and ITIM domain (TIGIT) i prostatacancer. Bild A visar inget TIGIT-uttryck och bild B ett TIGIT-TIGIT-uttryck i några celler mitt i bilden. Tumören är infärgad med monoklonal antikropp TIGIT (RM BLR047F, Biocare, CA, USA)
detektionssystemet MACH 4 Universal HRP-Polymer Detection System (Biocare, CA, USA) och motfärgad i hematoxylin. Bilderna är i 40X förstoring.
Utvärderingen av de infärgade glasen från IHC visade att 44 (78,6 %) av de totalt i analyserna inkluderade 56 patienter hade tumörer som uttryckte TIGIT. Av patienter med lymfkörtelmetastas hade 17 (77,3 %) TIGIT-uttryck i sin primärtumör och för män utan lymfkörtelmetastas hade 27 (79,4 %) TIGIT-uttryck. När vi sedan använde Fisher’s exact test för att studera associationen mellan TIGIT-uttryck och lymfkörtelmetastas observerades ingen signifikant skillnad mellan dessa grupper, p = 1,00.
14
DISKUSSION
T-cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain är ett checkpoint protein av intresse på grund av dess tumörerstimulerande effekt. Dock finns ytterst lite forskning gjord när det gäller vilken roll TIGIT spelar när det gäller utvecklingen av prostatacancer. Därför genomfördes denna studie för att studera det potentiella värdet av TIGIT som prognostisk markör vid prostatacancer. I denna studie utfördes en
optimering av ett immunohistokemiprotokoll för att analysera TIGIT-uttryck i prostatatumörvävnad som sedan användes för att utvärdera uttrycket på 61 patienter. Baserat på resultatet av det statistiska testet drog vi slutsatsen att ingen association mellan TIGIT-uttryck och risk för lymfkörtelmetastas kunde ses och att TIGIT därför inte kan användas som prognostisk markör för prostatacancer.
Detta resultat har emellertid inte tidigare beskrivits. Ett flertal tidigare studier har visat att TIGIT-uttryck är kopplat till sämre prognos och även en självständigt missgynnande faktor för observerad och sjukdomsfri överlevnad (11,18). Även om det prognostiska värdet i TIGIT kan anses högt så är dessa studier däremot baserade på
magcancertumörer respektive muskelinvasiv blåscancer och behöver således inte vara relaterade till prostatacancer. En annan studie jämförde hepatocellulär cancervävnad mot intilliggande tumörfri vävnad med IHC, vilket konfirmerades med Westernblot, och såg att TIGIT-uttrycket var ökat i cancervävnaden (19).
Tidigare forskning har visat att TIGIT är uppreglerat hos T-celler i en mängd
cancertyper, däremot har inte mycket forskning visat på TIGITs relation i prostatacancer (20). I kontrast till våra resultat har en studie av Zhao et al. visat att TIGIT uttrycks till en högre nivå hos högriskpatienter än hos lågriskpatienter (13). Deras resultat är
däremot baserade på gennivå från publika databaser och inte av resultat från IHC vilket kan ha påverkande resultat, samt att skillnaden i nivå av TIGIT inte är markant och är således svår att basera en prognostisk markör på separat.
15 Vi valde att använda IHC till denna studie för att det är en bra metod för att detektera protein i paraffininbäddad och formalinfixerad vävnad. Andra metoder som hade kunnat ersätta IHC för studiens syfte inkluderar bland annat: Fluorescence.activated cell sorting (FACS), Enzyme-linked immunostorbent assay (ELISA) och Westernblotting.
Exempelvis så använde sig Johnston et al. av FACS för att analysera TIGIT-uttryck i icke småcellig lungcancer och Duan et al. av Westernblotting för att analysera TIGIT-uttryck i hepatocellulär cancer (12,19). Med Westernblotting var det möjligt att kvantitativt jämföra uttryck av protein mellan olika vävnad och på så sätt utröna om vävnaden av intresse hade ett högre uttryck, medan i studien där de använde FACS jämfördes TIGIT+ celler mot TIGIT- celler procentuellt genom att kvantitativt mäta
dessa. Den unika fördelen med IHC framför andra metoder som kan detektera proteiner är dess förmåga att demonstrera var detta protein befinner sig i relation till vävnaden. Denna fördel utnyttjas främst när utvärderaren är erfaren att bedöma histologiska preparat. Utvärderarens erfarenhet är avgörande för IHC specificitet då ospecifika infärgningar kan tolkas som positiva celler och det utgör en svaghet med denna studie, samt att författaren har utvärderat infärgningarna själv. För att säkerställa resultatens korrekthet hade det varit optimalt om minst en till person hade utvärderat resultaten av infärgningen. Däremot ger både IHC samt användandet av TMA en här en fördel då originalvävnaden inte gått förlorad och de infärgade glasen går att utvärdera och användas i ett annat syfte vid en senare tidpunkt. Användningen av TMA ger en standardiserad yta på vävnaden och underlättar då analys där totalt uttryck ska undersökas, även analyser där antal celler per area ska räknas är det optimalt med väl dragna gränser där området tar slut. Metoden skulle även kunna göras på större snitt för att se hela tumören vilket kunde vara till användning vid korrelation till tumörgradering, då exempelvis Duan et al. såg en tendens till att TIGIT-uttryck ökade när
celldifferentieringen gick från hög till låg (19). Tumörgradering görs i samband med diagnos och TMA hade därför inte påverkat denna faktor vid tillgång till
patientjournaler. Tyvärr på grund av pandemi med relaterad tidsbrist under durationen av studien var tillgången till patientjournalen bristfällig, därav kunde inte Gleasongrad tas med i bearbetningen.
16 Immunohistokemi är en komplex metod med många variabler som måste optimeras för att öka sensitiviteten och specificiteten. Valet av antikropp är avgörande för att få en så specifik infärgning som möjligt. Till detta protokoll valdes en CE-märkt ready-to-use antikropp, med hög in vitro-diagnostisk standard och genomgått noggrann
kvalitetskontroll, detta för att undvika ospecifik infärgning. Att antikroppen kan användas direkt utan spädning ger en variabel mindre att optimera samt felsöka om resultatet inte är tillfredställande. Vi bestämde oss för att antikroppen skulle vara monoklonal för att öka specificiteten jämfört med en polyklonal antikropp som kan binda in till fler epitop. Eftersom en monoklonal antikropp däremot får sämre sensitivitet användes även polymerteknik för att öka sensitiviteten vid detektion och även en prob som även den skulle öka sensitiviteten. Proben var däremot mus-specifik och fungerade inte med vår primära kaninantikropp varvid beslutet att ta bort proben resulterade i en mer specifik infärgning.
Valet av detektionsmedel stod mellan kromogen och fluorescens. Valet föll på
kromogen på grund av dess förmåga att, förutom färga in uttrycket som undersöks, även att se var detta uttrycks i vävnaden. Detta går inte att på ett lika tillfredställande sätt att åstadkomma med fluorescens. Fluorescens medför även problemet med fotoblekning, det vill säga effekten av att fluoroforets förmåga att flourera avtar med tiden, vilket inte kromogen har (21). Kromogen är istället mycket tidsbeständigt och gör att materialet som skapats i IHC kan sparas för framtida forskning. HRP användes för att enzymatiskt oxidera DAB till en brun fällning. Eftersom HRP användes som enzym användes en peroxidas blockerare för att motverka att endogent peroxidas ger upphov till ospecifik infärgning när DAB reagerar med peroxidaset. Även med alternativa enzym som alkaliskt fosfatas från kalvtarm vilket också är ett populärt enzym, måste endogent alkaliskt fosfatas blockeras, varpå detta steg inte kan undvikas (14).
17 När det gäller HIER valde vi att använda en tryckkokare för att få en så jämn
temperaturfördelning som möjligt över vävnaden. Användningen av en mikrovågsugn eller andra värmekällor som det är svårt att specificera temperaturen på gör att det blir svårare att få samma resultat vid fler försök. Inbindningstiden som antikropparna har på sig att binda till epitop och tiden som HIER får verka på vävnaden påverkar båda hur mycket antikroppar som kan binda in och således hur mycket kromogen som färgar preparatet.
I den här studien kunde vi inte hitta några kopplingar mellan TIGIT och prognostisk markör men vidare studier behövs för att bekräfta resultatet. Det optimerade IHC protokollet skulle kunna användas för att utforska detta. Behandling riktad mot
checkpoint protein har gett oss ett nytt revolutionerande sätt att behandla cancer på och utgör en viktig del för fortsatt forskning. I vissa fall har denna typ av immunterapi lett till att patienter gått i remission utan att visa kliniska symtom eller tecken på cancer (22). Behandling mot CTLA-4 och PD-1/PD-L1 har visat ge effekt mot en varierad mängd cancer men än så länge ingen effekt mot prostatacancer. Det finns i nuläget tillräckligt med bevis för att TIGIT reglerar T-cellens tumörigenkänning och ett flertal läkemedel för att blockera dess effekt är under utveckling (20). Immunterapi mot ett enskilt checkpoint protein kan ge god effekt för en viss typ av cancer eller en delgrupp inom samma typ, men troligen krävs en kombinationsterapi riktad mot de protein som tumören uttrycker (22). En studie har visat på att tumörväxt kan kontrolleras mer effektivt om anti-TIGIT kombineras med anti-PD-1 vilket visar att TIGITs effekt vid tumörväxt inte ska underskattas (12). När det gäller godkända terapimedel för att
hämma checkpoint proteiner, exempelvis PD-1, så har man än inte sett någon effekt mot prostatacancer. Den uteblivna effekten av immuncheckpoint inhibitorer när det gäller prostatacancer är i linje med mina resultat och kan betyda att checkpoint proteiner inte har någon betydande roll vad gäller behandling av prostatacancer. För att utveckla detta påstående behövs ytterligare studier som bekräftar checkpoint proteiners roll i
18 Studiens kohort är unik i det avseendet att patienterna genomgick samtidig
lymfkörtelutrymning vid prostatektomin och således fick lymfkörtelmetastasdiagnos (baserat på histologiska fynd) samtidigt. Det ger en styrka till studiens syfte eftersom det ger en direkt relation från tumörens proteinuttryck till samtidig metastas, istället för om metastasdiagnosen kommit senare. Svagheter med denna studie inkluderar det begränsade antalet inkluderade patienter. Användandet av TMA utgör även en svaghet då analystiden förkortas på bekostnad av att det begränsar det anatomiska
analysområdet. En ytterligare svaghet ligger i att endast ett kliniskt utfall analyserades (N1 och N0) då tillgång till patientjournaler ej var möjlig på grund av den rådande covid-19 situationen. En betydande del av studier som dessa läggs på att optimera ett protokoll eftersom optimeringen är helt avgörande för ett gott immunohistokemiresultat. Det optimerade protokollet kommer att användas i fortsatt forskning för att studera TIGITs roll som prognostisk markör för urologiska cancertyper.
Konklusionen baserat från resultaten i denna studie är att TIGIT inte kan användas som prognostisk markör för prostatacancer, men att ytterligare studier behöver göras för att kunna dra några definitiva slutsatser.
19
REFERENSER
1. Regionala cancercentrum i samverkan. Prostatacancer Nationellt vårdprogram [Internet]. 2020. Available from:
https://kunskapsbanken.cancercentrum.se/globalassets/cancerdiagnoser/prostatacan cer/vardprogram/nationellt-vardprogram-prostatacancer.pdf
2. Socialstyrelsen. Statistik om nyupptäckta cancerfall 2019 [Internet]. 2020. Available from: https://www.socialstyrelsen.se/globalassets/sharepoint-dokument/artikelkatalog/statistik/2020-12-7132.pdf
3. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71:209–49. 4. Häggström C, Stocks T, Ulmert D, Bjørge T, Ulmer H, Hallmans G, et al.
Prospective study on metabolic factors and risk of prostate cancer. Cancer. 2012;118:6199–206.
5. Bratt O, Drevin L, Akre O, Garmo H, Stattin P. Family History and Probability of Prostate Cancer, Differentiated by Risk Category: A Nationwide Population-Based Study. J Natl Cancer Inst. 2016;108:djw110.
6. Regionala cancercentrum i samverkan. Standardiserat vårdförlopp för prostatacancer v3.1 [Internet]. 2020. Available from:
https://cancercentrum.se/globalassets/cancerdiagnoser/prostatacancer/vardforlopp/ svf-prostatacancer.pdf
7. Kumar V, Abbas AK, Aster JC, Perkins JA. Robbins basic pathology. 10th ed. 2018.
8. Chen DS, Mellman I. Oncology Meets Immunology: The Cancer-Immunity Cycle. Immunity. 2013;39:1–10.
9. Chen L, Flies DB. Molecular mechanisms of T cell stimulation and co-inhibition. Nat Rev Immunol. 2013;13:227–42.
10. Chen DS, Irving BA, Hodi FS. Molecular Pathways: Next-Generation Immunotherapy—Inhibiting Programmed Death-Ligand 1 and Programmed Death-1. Clin Cancer Res. 2012;18:6580–7.
11. Xu D, Zhao E, Zhu C, Zhao W, Wang C, Zhang Z, et al. TIGIT and PD-1 may serve as potential prognostic biomarkers for gastric cancer. Immunobiology. 2020;225:151915.
12. Johnston RJ, Comps-Agrar L, Hackney J, Yu X, Huseni M, Yang Y, et al. The immunoreceptor TIGIT regulates antitumor and antiviral CD8(+) T cell effector function. Cancer Cell. 2014;26:923–37.
20 13. Zhao H, Zhang X, Shi Z, Guo B, Zhang W, He K, et al. Identification of a
Prognostic Signature Model with Tumor Microenvironment for predicting Disease-free Survival after Radical Prostatectomy. J Cancer. 2021;12:2371–84. 14. Suvarna SK, Layton C, Bancroft JD, editors. Bancroft’s Theory and Practice of
Histological Techniques. 8th ed. Elsevier; 2019.
15. Yamashita S. Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry. Prog Histochem Cytochem. 2007;41:141–200.
16. Jawhar NMT. Tissue Microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Ann Saudi Med. 2009;29:123–7.
17. Ramos-Vara JA. Technical Aspects of Immunohistochemistry. Vet Pathol. 2005;42:405–26.
18. Liu Z, Zhou Q, Wang Z, Zhang H, Zeng H, Huang Q, et al. Intratumoral TIGIT+ CD8+ T-cell infiltration determines poor prognosis and immune evasion in patients with muscle-invasive bladder cancer. J Immunother Cancer. 2020;8:e000978.
19. Duan X, Liu J, Cui J, Ma B, Zhou Q, Yang X, et al. Expression of TIGIT/CD155 and correlations with clinical pathological features in human hepatocellular carcinoma. Mol Med Rep. 2019;20:3773–81.
20. Chauvin J-M, Zarour HM. TIGIT in cancer immunotherapy. J Immunother Cancer. 2020;8:e000957.
21. Petersen K, Pedersen HC. Detection Methods. In: Taylor CR, Rudbeck L, editors. Immunohistochemical Staining Methods. 6th ed. 2013.
22. Sharma P, Allison JP. The future of immune checkpoint therapy. Science. 2015;348:56–61.
