Verifiering av en förstärkningslösning vid manuella serologiska metoder

Verifiering av en förstärkningslösning

vid manuella serologiska metoder

Verification of an enhancement solution

for manual serological tests

Författare: Malin Carlsson

Vårtermin 2021

Examensarbete: Grundnivå (G2E), 15 högskolepoäng Huvudområde: Biomedicinsk laboratorievetenskap Biomedicinska analytikerprogrammet inriktning laboratoriemedicin

BMLV, Examensarbete, 15 högskolepoäng

Institutionen för hälsovetenskaper, Örebro universitet. Handledare: Aseel Alshamari, MD, Örebro

universitetssjukhus

SAMMANFATTNING

De humana blodgrupperna består av A, B, AB samt O. Antigen kan detekteras av alloantikroppar, att en reaktion sinsemellan kan ske är ett krav för att en molekyl ska kunna kallas antigen. Antigen och antikroppar är vitala för analys inom transfusionsmedicin och möjliggör transfusioner av blod samtidigt som man förhindrar allvarliga transfusionsreaktioner. För att effektivisera manuella serologiska analyser används saltlösning med låg jonstyrka. Syftet med arbetet var att verifiera lösningen MLB 2 (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland). Denna lösning ska förstärka reaktioner i antikroppsidentifiering, blodgruppskontroll med antikropps-screening samt förenlighetsprövning, men även för fenotypning av erytrocyter gällande antigenen s, Fya, Fyb, Kpa, Kpb samt Lua.

Metod

Totalt fenotypades 61 prover varav 31 var positiva och 30 var negativa för sökt fenotyp. Av de 31 positiva var 17 fenotyper av känt heterozygot anlag. Vid varje analystillfälle utfördes kontroller som bestod av heterozygot positiva samt negativa celler från Örebropanelen för vardera fenotyp. För antikroppsidentifiering ämnade två antikroppar, anti-E samt anti-Lea, att analyseras från två prover där de tidigare identifierats. Beträffande blodgruppskontroll med antikroppsscreening samt förenlighetsprövning analyserades tre prover från patienter som varit i behov av transfusioner och som tidigare påvisat antikroppar.

Resultat och slutsats

Samtliga provers resultat överensstämde fullständigt vid fenotypning. För antikroppsidentifiering bekräftas tidigare påvisad anti-E för ett av proven, men för det andra provet erhölls inte resultat fullständigt överensstämmande med patientens anti-Lea. För blodgruppskontroller med antikropps-screen samt förenlighetsprövning överensstämde samtliga resultat. Effekten av förstärkningslösningen MLB 2 bedöms som god. Tydligt blir dock att gelteknik, som idag används som golden standard, är överlägsen de äldre rörteknikerna.

Nyckelord

fenotypning erytrocytantigen, antikroppsidentifiering rörteknik, immunhematologi, förenlighetsprövning rörteknik

ABSTRACT

Human blood groups are defined as A, B, AB and O. Antigens are detectable by alloantibodies and a reaction between them is necessary in order to denominate as such. Antigens and antibodies respectively are essential within immunohematology to enable transfusion therapy while evading severe transfusion reactions. To improve the efficiency of manual serological test, low ionic strength saline is used. The purpose of this study was to verify MLB 2 (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Germany) for use as low ionic saline solution (LISS) in indirect agglutination technique (IAT) tube-tests for antibody identification, blood group verification with antibody-screen and compatibility test, also for phenotyping antigens s, Fya, Fyb, Kpa, Kpb and Lua.

Methods

A total of 61 samples, of which 31 were previously known positive and 31 negative were tested. Of the 31 positive, 17 were heterozygous. At every assay, positive heterozygous and negative cells for each of the phenotype was applied as control, from the Örebro panel. For antibody identification, two previously positive samples were used. For blood group verification with antibody-screen and compatibility test, three samples with previous need for transfusion therapy and positive antibody screen were used.

Results and conclusion

All samples phenotyped present fully consistent results compared to the previous ones. For antibody identification the results for one of the samples are completely confirmed. The second sample showed inconsistencies to the previous result. For blood group verification with antibody-screen and compatibility test all samples had equivalent results. The effect from MLB 2 in IAT-LISS tube tests are adequate. A distinct observation can be made; gel column technology is superior to the tube tests.

Keywords: phenotyping red blood cell antigen, antibody detection, antibody

Innehållsförteckning

Introduktion ... 1

1.1 Blodgrupper och dess kliniska signifikans ... 1

1.2 Immunhematologiska undersökningar ... 4

1.3 Syfte ... 7

Material och metod ... 9

2.1 Material ... 9

2.2 Etik ... 10

2.3 Metod ... 10

2.3.1 Fenotypning av erytrocyter i rörteknik ... 10

2.3.2 Antikroppsidentifiering i rörteknik ... 11

2.3.3 Blodgruppskontroll med antikropps-screening och förenlighetsprövning i rörteknik ... 12

Resultat ... 13

3.1 Fenotypning av erytrocyter ... 13

3.2 Antikroppsidentifiering ... 14

3.3 Blodgruppskontroll med antikropps-screening och förenlighetsprövning ... 15

Diskussion ... 16

4.1 Syfte ... 16

4.2 Resultat ... 16

4.2.1 Fenotypning av erytrocyter ... 16

4.2.2 Antikroppsidentifiering ... 16

4.2.3 Blodgruppskontroll med antikropps-screening och förenlighetsprövning ... 18

4.3 Slutsats ... 19

4.4 Tackord ... 19

Bilagor ... 22

Örebropanelen antigram ... 22

Örebro Screen- & BAS-testceller antigram ... 23

1

INTRODUKTION

1.1 Blodgrupper och dess kliniska signifikans

Humant blod delas in i grupper, något som baseras på Karl Landsteiners experiment som visade att blod agglutinerade när det blandades med serum från andra personer. Detta är vad som idag är känt som blodgrupperna A, B, AB samt O (ABO). Blodgrupper definieras som en ärvd egenskap på erytrocyters cellyta, antigen. Blodgruppsantigen är ytmarkörer bestående av protein eller kolhydrat som är fäst till erytrocytens membran med ett protein eller en lipid. De kan detekteras av en specifik alloantikropp. Antikropparna kan vara proteiner, glykoproteiner eller glykolipider som reagerar med sin peptiddel eller kolhydrat-del. En molekyl kan inte kallas ett antigen om det inte finns en reaktion med en antikropp (1).

Naturliga ABO-antikroppar finns för de antigen man saknar, något som kallas Landsteiners regel, dessa benämns även som reguljära antikroppar då de förekommer naturligt hos individer. Övriga antikroppar mot andra blodgruppsantigen produceras vid immunisering som kan ske vid oförenlig transfusion eller vid graviditet då det föreligger en oförenlighet mellan moderns och fostrets blodgruppsantigen. Dessa antikroppar benämns som irreguljära. När de främmande antigenen stöts på sker en sensibilisering, immunförsvarets T- och B-lymfocyter stöter på okända antigen och svarar med att producera en mindre mängd antikroppar, med låg affinitet för antigenet. B-lymfocyter utvecklas till att bli plasmaceller, som producerar specifika antikroppar och blir sedan kvar som minnesceller. När immunförsvaret för andra gånger stöter på samma antigen sker en mycket kraftigare reaktion. Den andra responsen innebär en snabbare produktion av antikroppar, som är mer potenta och specifika än de som producerades vid sensibiliseringen. Vidare kan B-lymfocyterna även stimuleras till antikroppsproduktion direkt, oftast av antigen av kolhydrat-bas. Sker stimuli via T-lymfocyter rör det sig i allmänhet om protein-antigen (1, 2, 3, 4).

Erytrocytantikroppar är immunoglobuliner (Ig) av M- eller G-typ men de kan även förekomma i A-typ. Naturligt förekommande antikroppar är huvudsakligen IgM, varav de som skapas vid immunisering normalt sett är av IgG. IgM-antikroppar kommer direkt att agglutinera antigen-positiva erytrocyter i en lösning tack vare sin

2 pentamer-struktur som underlättar agglutinationen men även hindrar den från att passera cellmembran. IgM-antikroppar är oftast ett svar på T-oberoende antigen. IgG antikroppar är mindre men kan passera membran. In vitro kräver de en tillsats av antihumant immunoglobulin för att agglutinera och eventuellt en förstärkande effekt för att effektivisera agglutination. De finns i 4 subklasser, vars struktur har mindre skillnader men vanligast är IgG1 (1, 4, 5, 6).

Figur 1. Illustration av antikroppar i olika former av IgG-typ. De olika former som finns är IgG1, IgG2, IgG3 samt IgG4. Vid immunisering är antikroppar normalt sett i denna typ, vars koncentration normalt domineras av IgG1. Tack vare dess simplare struktur kan de passera membran. Emellertid krävs det vid laboratorieundersökningar antihumant immunoglobulin (AHG) för att påvisa dem samt en förstärkande effekt om man vill effektivisera reaktionen (1, 3).

3 Figur 2. Strukturen av antikropp i IgM-form, som antar en pentamer struktur med 5 subenheter. Naturligt förekommande antikroppar är av denna struktur och de möjliggör för effektiv agglutination men kan däremot inte passera membran (1, 3).

Blodgrupper har stor klinisk signifikans, framför allt när patienter vårdas med hjälp av blodtransfusioner eller är i behov av transplantation. Transfusion med inkompatibla blodenheter kan potentiellt orsaka allvarliga transfusionsreaktioner där patienten drabbas av intravasal koagulation, njursvikt eller kan i värsta fall avlida. Signifikansen är även hög vid graviditet, då IgG-antikroppar har förmåga att passera placentan, vilket kan resultera i att fostret drabbas av allvarliga hemolytiska tillstånd, där erytrocyter med motsvarande antigen hemolyseras (1, 5).

De många olika blodgruppsantigen som existerar klassas i system av The International Society of Blood Transfusions (ISBT). De mest kliniskt relevanta systemen utöver ABO-systemet är Rhesus (Rh) som avgör om blodet är att betrakta som positivt, om

4 antigen D uttrycks eller negativt om det inte uttrycks. Andra vanligt förekommande antigen är MNSs (MNS), Duffy (Fy) och Kell (K). Antigen ärvs genetiskt via kromosomer från mor och far till avkomman. Där ett antigen finns uttryckt på erytrocyterna betecknas individen som positiv för det aktuella antigenet. Antigen kan vara antitetiska då de förekommer i par, ett exempel på detta är inom Duffy systemet där det finns Fya och Fyb. Andra system som även har antitetiska antigen är i de vanliga MNS- samt Kell-systemen. Antitetiska innebär att de är besläktade och lika varandra och att en av allelerna alltid uttrycks i normala fall, en individ kan ha ärvt båda antigen men proteinet som bildas av det genetiska anlaget kan endast presentera en av dem. En individ med ärvd allel för Fya från både mor och far har ett homozygot anlag för antigenet, anlag från båda antitetiska antigen betraktas som heterozygot anlag. Fenotypning av erytrocyter innebär att man undersöker vilka antigen som finns på erytrocyternas yta. Detta utförs vid utvidgad gruppering av blodgivare eller blodenheter för att identifiera antigen-negativa enheter inför transfusion. Analysen sker även på patienter med upprepade blodbehov, att bestämma fenotyp hjälper för att kunna förhindra en eventuell immunisering. I populationer med personer av kaukasisk och svart härkomst är fenotyper med s+ anlag allra vanligast, fenotyper med s- förekommer men i lägre grad. Vad gäller Duffy-systemet är ett heterozygot anlag vanligt i vita populationer men mindre vanlig hos svarta populationer där de oftast inte bär på anlag för något av antigenen. I asiatiska populationer föreligger vanligen ett homozygot anlag för Fya. Ett anlag för Lua och Kpa är ovanligt, i nästan alla populationer finns det tvärtom ett frekvent homozygot uttryck för Lub och Kpb (2, 3, 6, 7).

1.2 Immunhematologiska undersökningar

Undersökningsmetoder som tillämpas ger direkt eller indirekt agglutination. Dessa typer av undersökningar vilar på hemagglutination som ett resultat av reaktioner mellan antigen och antikroppar. En direkt agglutination mellan antigen och antikropp används vanligen vid IgM och enstaka IgG-antikroppar som har optimala reaktionstemperaturer under kroppstemperaturen 37 C (Celsius). Metoden fungerar bäst för IgM-antikroppar som med sin struktur har förmåga att nå fler antigen att binda och tillämpas för blodgruppering. Denna metod behöver således normalt ingen

5 förstärkning för att en reaktion ska ske. Indirekt agglutination används vid antikroppar som inte har förmåga att ge en direkt agglutination, dessa reaktioner får hjälp att bilda en indirekt agglutination för att bli synliga. För att kunna tillämpa metoderna inom transfusionsmedicin finns det metoder för att förstärka reaktionen så den blir synlig makroskopiskt och kan ske snabbare (1).

För att förstärka en reaktion påverkar man miljön de utförs i. Olika parametrar går att påverka, som temperatur, pH, jonstyrka samt tiden reaktionen pågår. Den kemiska bindningen associerat med antigen av kolhydratbas är vätebindningar, som är stark vid låga temperaturer. Icke-polära molekyler deltar i hydrofoba bindningar som sker vid högre temperaturer, dessa är associerade till antigen av proteinbas (1).

Genom att påverka jonstyrkan testet utförs i kommer hastigheten i reaktionen förändras, något som utnyttjas i metoder med low ionic strength saline (LISS). Denna lösning är en tillsatslösning av Na+ samt Cl- joner som kan inverka på polära bindningar mellan antigen och antikropp, deras verkan är större vid mer koncentrerad saltlösning. Jonerna kommer att samlas runt de polära delarna på proteiner och bidrar till att neutralisera deras laddningar. Jonstyrkan får däremot inte vara så stark att den neutraliserar för mycket, det är då risk att erhålla falska reaktioner. Detta gör det mycket viktigt att kontrollera jonstyrkan samt använda negativa kontroller vid varje analystillfälle (1).

Reaktioner som inte kan ske direkt analyseras genom indirekt agglutination, som utförs med hjälp av att tillämpa antiglobulinteknik. Antiglobulinteknik innebär tillsats av antihumanglobulin (AHG) som används för att kunna upptäcka erytrocyter som blivit sensibiliserade. Detta utnyttjas vid indirekt antiglobulin teknik (IAT) och detekterar antikroppar av IgG-klass som på grund utav sin storlek inte klarar av att agglutinera direkt. Med hjälp av centrifugering och tvättning kan obundna immunglobuliner avlägsnas och AHG tillsättas. Har erytrocyterna blivit sensibiliserade kommer AHG att binda till antikropparna och på så sätt assistera agglutination mellan dem. Genom centrifugering kan agglutination framhävas och bli synligt makroskopiskt, vilket anger antikroppens förekomst. Även vid direkt

6 antiglobulin teknik (DAT) som ämnar att detektera in vivo sensibilisering tillämpas tekniken på samma sätt (1).

AHG finns i två olika typer, polyspecifikt samt monospecifikt. Ett reagens av polyspecificitet innehåller mestadels anti-immunoglobulin av G, A eller M-typ men också antikroppar mot komplement (anti-C3d). Monospecifika AHG innehåller endast en av dessa, ofta anti-IgG eller anti-C3d antikroppar. Polyspecifika reagens kan vara användbara för detektion av särskilda antikroppar men genom att använda monospecifikt reagens av anti-IgG kan man undvika reaktioner mellan komplement och köldantikroppar. Det finns studier som visar att polyspecifika AHG-reagens kan genom de innehållande anti-komplementen ge upphov till positiva reaktioner med köldantikroppar som betraktas som kliniskt icke-signifikant, som de betraktar som falska agglutinationer. Antikroppar med klinisk signifikans som kan upptäckas med hjälp av anti-komplement menar författarna av dessa studier, är ovanligt. Detta talar för användandet av monospecifika reagens men valet av reagens bör relateras till analyssyftet. Genom att använda polyspecifika reagens minskar risken för en missad detektion av komplement-fixerande antikroppar. Vid fall där man använt monospecifikt AHG för förenlighetsprövning uteblev detektionen av viktiga blodgruppsantikroppar, något som hade kunnat främjats av den polyspecifika typen som alternativ (8).

Antikroppsidentifiering utförs då en antikropps-screening inte får väntat utfall eller då det föreligger en misstanke om antikroppar. Förenlighetsprövning utförs före varje transfusion av erytrocyter och granulocyter till vuxna och barn äldre än 4 månader. En reaktion mellan mottagare och givare vid prövningen innebär oförenlighet, där en transfusionsreaktion kan utlösas hos mottagaren som kan vara av hög risk. Förenlighetsprövning före transfusion är mycket viktigt då patienter med behov av upprepade blodtransfusioner ofta förknippas med en högre risk för immunisering. Även fenotypning är en viktig analys, som tillämpas för att kunna identifiera antigen-negativa enheter inför transfusion. Vanligen utförs dessa analyser i gelkortsteknik, där agglutination sker i kolonner med gel. Denna metod har på senare år ersatt rörteknikerna. I fall där gelteknik inte fungerar, som i fall av starka köldantikroppar

7 eller antikroppar som störs utav gelen, kan analysen genomföras med IAT-LISS i rör (6).

Analyserna sker med hjälp av framställda paneler av erytrocytsuspensioner, från blodgivare med kliniskt betydelsefulla antigen. En av dessa är örebropanelen, se bilaga 1. För att sätta upp en sådan panel för antikroppsidentifiering ska minst åtta blodgivare ingå, vars blodgrupp är O och bidrar med minst två positiva antigen och två negativa vardera. För antikropps-screening används Örebros screentestceller, se bilaga 2. Dessa suspensioner är producerade av Blodcentralen på Örebros universitetssjukhus. Plasma eller erytrocyter från patienter eller blodgivare testas mot dessa suspensioner beroende på vilken analys som utförs (6).

Serologiska tester kan misslyckas med att detektera svaga eller ofullständiga antigen, som då vid transfusion skulle inducera sensibilisering och senare även immunisering. För att hindra detta kan genotypning tillämpas, för att på genomisk nivå studera antigen med sannolikhet att förekomma. Detta är dock inte en metod som tillämpas i större utsträckning idag (9).

1.3 Syfte

Enligt nya direktiv från Europeiska unionen (EU) som träder i kraft 2022, ”In Vitro Diagnostic Medical Devices Regulation” (IVDR) måste lösningar för analyser inom transfusionsmedicin följa beskrivningar för märkningen Conformité Européenne (CE). CE-märkta varor är godkända genom hela Europa, de delas in i olika klasser utefter vad de ska användas till och dessa klasser ställer olika krav på varan. De ska vara kvalitetstestade samt ha tekniska dokument som medföljer produkterna. På Universitetssjukhuset i Örebro har man använt en köpt lösning för att förstärka reaktioner, men vars ändamål av tillverkaren är för provspädning. Denna skall bytas ut mot lösningen MLB 2 (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Germany), vars ändamål är att förstärka bindningen mellan antikroppar och antigen i indirekta antiglobulin-test i rörteknik och innehar CE-märkning för detta (6, 10, 11).

8 Lösningen verifieras för antikroppsidentifiering, blodgruppskontroll med antikropps-screening och förenlighetsprövning men även för fenotypning av erytrocyter

gällande antigenen s, Fya, Fyb, Kpa, Kpb samt Lua. Övriga fenotyper analyseras utan förstärkningslösningen och följer därmed CE märkningen för respektive reagens. De kommer inte ingå i denna verifiering.

9

MATERIAL & METOD

Provmaterial bestod av venöst blod från blodgivare som genomgått kontrollgruppering vid tillfället för blodgivning och redan var fenotypade genom gelteknik. Patientprover som användes till blodgruppskontroll med antikropps-screen och förenlighetsprövning samt antikroppsidentifiering var prover som redan blivit analyserade på respektive metod med gelteknik. Prover var tagna i 4 mL rör med EDTA-tillsats (VACUETTE® K3EDTA, Greiner Bio-One International GmbH, Kremsmünster, Österrike). För att genomföra fenotypning användes reagens för respektive fenotyp som analyserades. För fenotyp s samt Fya var detta Seraclone® (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland). För resterande fenotyper Kpa, Kpb, Lua, samt Fyb var detta Coombsreactive Antisera (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland). För heterozygot samt negativ kontroll användes erytrocytsyspensioner från örebropanelen (bilaga 1). Vid fall där dessa inte uppfyllde kraven för heterozygositet användes andra panelceller, Panocell -16 lot 06625 (Immucor, INC. Norcross, USA) samt Biotestcell lot 3104011-00 (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland).

Förstärkningslösningen som användes för alla analyser var MLB 2 (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Germany), se bilaga 3. Lösning av antihumanglobulin som användes var Anti-Human-Globulin Color (AHG) (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland). För att pipettera lösningar som är framställda av blodcentralen på universitetssjukhuset i Örebro användes engångspipetter av plast (VWR® Disposable Graduated Transfer Pipets 612-4545, VWR International LLC, Radnor, USA) vars uppmätta dos per droppe är 50µL. För mindre exakta mätningar, som vid blandning av erytrocytsuspension om 3-5% användes stråpipetter (Biohospital AB, Kopparberg, Sverige).

Vid antikroppsidentifiering användes örebropanelen för att identifiera eventuella antikroppar, som består av donerat blod från givare med särskilda fenotyper. Denna panel samt DAT-positiva kontrollerytrocyter är preparerade av Blodcentralen på Örebros universitetssjukhus och består av erytrocyter suspenderade i näringslösningen

10 ID-cellstab (Bio-Rad DiaMed GmbH, Cressier, Schweiz). Under tiden för analyserna användes satsnummer 2108, 2112 samt 2116 av Örebropanelen samt Screen- & BAStestceller, dessa är ständigt av samma uppsättning, se bilaga 1 samt 2.

Vid analys av blodgruppskontroll med antikropps-screening och förenlighetsprövning användes reagens Anti-A samt Anti-B Seraclone® (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland) för blodgruppskontroll. Örebros screentestceller (bilaga 2) användes som screen mot eventuellt förekommande antikroppar. Vidare användes slangsegment från blodpåsar i blodbanken på Örebro universitetssjukhus för förenlighetsprövning mot utvalda givare.

2.2 Etik

Provmaterial som användes var tagna för rutinsjukvård, från blodgivare samt patienter där analys var begärd enligt vårdsyfte. Proven hade analyserats enligt normala rutiner för analyserna och kasseras normalt efter dessa är utförda. Provrören var avidentifierade och särskiljs med hjälp av tappningsnummer gällande blodgivare och randomiserade provnummer för patienter. De rapporter med resultat som användes för jämförelse var helt avidentifierade. Analyserna klassas som internt kvalitetsarbete som var godkänt från avdelningschef samt medicinskt ansvarig. Ingen etikprövning var nödvändig.

2.3 Metod

Samtliga metoder utfördes enligt anvisningar för förstärkningslösningen som användes, MLB 2 (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland), se bilaga 3. Där ingen reaktion blev synlig bedömdes den som negativ. Agglutination graderades på en skala från ett till fyra plus i styrka, där 1+ är positiv men grumlig och 4+ den starkast positiva reaktionen med en enda stor agglutination synlig.

2.3.1 Fenotypning av erytrocyter i rörteknik

Prover valdes ut med stöd av tidigare analyserad fenotyp, där det önskades positiva samt negativa för s, Fya, Fyb, Kpa, Kpb, samt Lua. Utvalda prover förbereddes genom att centrifugeras i 990 g under 5 minuter (Hettich Rotina 380, Andreas Hettich GmbH

11 & Co. KG, Tuttlingen, Tyskland) och därpå separera en mängd erytrocyter med stråpipett. Vidare tvättades dessa erytrocyter manuellt, i rör med isoton koksaltlösning (0,9 % egenframställd, Blodcentralen USÖ) som centrifugerades i OleDich bordscentrifug (Ole Dich Type 158, OleDich Instrumentmakers APS, Hvidovre, Danmark) under 1-5 minuter, varpå supernatanten frånskiljdes rören. Rören fylldes åter med isoton koksaltlösning tills en 3–5% suspension erhölls.

Fenotypning utfördes genom att tillsätta en droppe testreagens till glasrör, dit en droppe av 3–5% erytrocytsuspension av prov tillsattes med engångspipett. Vid varje analystillfälle användes även heterozygot positiv och negativ kontroll för vald fenotyp som togs ifrån erytrocytsuspensioner i Örebropanelen. Low ionic strengt saline (LISS) adderades med två droppar till vardera rör som därefter genomgick inkubering under 10 minuter i 37° C vattenbad (Grant Instrument TFX200 ST38, Grant Instruments Europe B.V., Amsterdam, Nederländerna). Därefter utfördes tvättning med isoton koktalslösning tre gånger med celltvättscentrifug DiaCent-CW (Bio-Rad Laboratories DiaMed GmbH, Cressier, Schweiz). Därefter tillsattes två droppar Anti-Human-Globulin Color (AHG) (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland) till samtliga rör och centrifugerades vid 800g under 20 sekunder. Resultatet avlästes makroskopiskt över ett ljusbord och negativa avlästes även mikroskopiskt. Samtliga negativa genomgick en kontroll av AHG genom tillsats av DAT-positiva kontrollerytrocyter. Separat analyserades även DAT på samtliga fenotypningar.

2.3.2 Antikroppsidentifiering i rörteknik

Prover förbereddes genom att centrifugera rören under fem minuter 1500 g (MPW M-DIAGNOSTIC, MPW MED-INSTRUMENTS, Warsawa, Polen) varpå blodkroppar och plasma separerades. Erytrocyterna tvättades manuellt i rör med isoton koksaltlösning som centrifugerades i bordscentrifug OleDich varpå supernatanten frånskiljdes rören. Rören fylldes därpå med isoton koksaltlösning tills en 3–5% suspension erhölls. I en serie glasrör adderades en droppe från Örebropanel-celler 1– 10 samt patientens egna 3–5% erytrocytsuspension som kontroll i separat rör. Till dessa droppades två droppar plasma samt två droppar MLB 2, som genomgick inkubation under 10 minuter i 37° C vattenbad TFX200. Proverna centrifugerades åter

12 i bordscentrifug under 20 sekunder varpå de över ljusbord granskades avseende agglutination samt hemolys. Proverna genomgick tvättning med isoton koktalslösning tre gånger med celltvättscentrifug DiaCent-CW. Därefter tillsattes två droppar AHG till samtliga rör och de centrifugerades vid 800g under 20 sekunder. Resultatet avlästes makroskopiskt över ett ljusbord, där negativa även avlästes mikroskopiskt. Samtliga negativa genomgick en kontroll av AHG genom tillsats av DAT-positiva kontrollerytrocyter.

2.3.3 Blodgruppskontroll och förenlighetsprövning i rörteknik

För blodgruppskontroll centrifugerades patientprov för att separera plasma och erytrocyter. Med pipett togs en andel erytrocyter och blandades med isoton koksaltlösning för att erhålla en suspension med styrkan 4–5%. En droppe suspension tillsattes i 2 glasrör, där en droppe Anti-A respektive Anti-B reagens adderades till varsitt rör. Innehållet blandades och centrifugerades under 20 sekunder, varpå avläsning skedde makroskopiskt över ljusbord. Vid negativ reaktion avlästes de även mikroskopiskt.

Antikropps-screening utfördes genom att två droppar patientplasma läts reagera med en droppe testerytrocyt-suspensioner ÖI, ÖII samt ÖIII i separata glasrör. För förenlighetsprövning mellan mottagare och givare förbereddes en suspension på 4– 5% erytrocytsuspension från slangsegment av blodpåsar från blodbanken. Dessa erytrocyter tvättades genom centrifugering i isoton koksaltlösning med OleDich, där supernatanten kasserades och de späddes med isoton koksaltlösning till 4–5%. En droppe av dessa läts reagera med två droppar plasma från mottagare. Samtliga rör fick med tillsats av två droppar LISS-lösning genomgå inkubation i 37° C vattenbad TFX200 under 10 minuter. Därefter utfördes en 20 sekunders centrifugering i bordscentrifug OleDich varpå kontroll av agglutination samt eventuell hemolys skedde. Proverna genomgick tvättning med isoton koksaltlösning 3 gånger med celltvättscentrifug DiaCent-CW. Därefter tillsattes två droppar AHG till samtliga rör och de centrifugerades vid 800g under 20 sekunder. Avläsning skedde makroskopiskt ovanför ljusbord, alla negativa reaktioner avlästes även mikroskopiskt samt kontrollerades med DAT-positiva kontrollerytrocyter.

13

RESULTAT

3.1 Fenotypning av erytrocyter i rörteknik

Totalt analyserades 61 prover varav 31 var positiva och 30 var negativa för sökt fenotyp. Av de 31 positiva var 17 fenotyper av känt heterozygot anlag. Vid varje analystillfälle utfördes kontroller som bestod av heterozygot positiva samt negativa celler från Örebropanelen för vardera fenotyp. Samtliga utav dessa genererade godkända resultat.

Tabell 1. Sammanlagt analyserades 61 prover som var positiva eller negativa för sökta fenotyper. Alla analyserades med hjälp av indirekt antiglobulinteknik. Av 31 positiva prover var 17 av dessa känt heterozygota för sökt fenotyp. Som positiv kontroll

användes heterozygota fenotyper samt negativa som negativ kontroll, från någon av de tillgängliga cellerna i Örebropanelen (Blodcentralen USÖ, Örebro, Sverige), Panocell -16 lot 06625 (Immucor, INC. Norcross, USA) eller Biotestcell lot 3104011-00 (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Tyskland). Inga prover för fenotyperna Lua+ och Kpb- kunde hittas. Fenotyp Antal positiva utvalda Antal bekräftade positiva Bekräftade positiva varav heterozygota Stringens Antal negativa utvalda Antal negativa bekräftade Stringens Fya 10 10 4 100% 6 6 100% Fyb 6 6 5 100% 6 6 100% s 8 8 3 100% 7 7 100% Kpa 4 4 3 100% 5 5 100% Kpb 3 3 2 100% 0 0 - Lua 0 0 - - 6 6 100%

14 Totalt utvalda Totalt bekräftade Totalt bekräftade heterozygota Totalt utvalda Totalt bekräftade 31 31 17 30 30 3.2 Antikroppsidentifiering i rörteknik

Två prover analyserades där antikroppar hade påvisats. Prov 0146 stämde väl överens med tidigare observerade resultat. Prov 0149 reagerade svagare än vad som hade observerats vid första analys.

Tabell 2. Redovisar två prover som tidigare påvisat förekomst av antikroppar, analyserade med indirekt antiglobulinteknik i rör. Resultatet för prov 0146 med påvisad anti-E, visade starka reaktioner likt de tidigare. Resultatet för prov 0149 med påvisad anti-Lea, reagerade svagare i detta försök med indirekt antiglobulinteknik (IAT). Suspensionen av patients egna erytrocyter som användes fungerar som en autokontroll.

Örebropanelen Prov 0146 Prov 01491

Cell nr. (1-10) 1 ˗ ˗ 2 ˗ ˗ 3 3+ ˗ 4 ˗ ˗ * 5 ˗ ˗ 6 ˗ ˗ 7 3+ ˗ 8 ˗ ˗ 9 ˗ 1+ * 10 3+ ˗ * Egna erytrocyter ˗ ˗

1_{Antikropp hos prov 0149 blev inte synlig i två av tre reaktioner, där * markerar de} avvikande.

15

3.3 Blodgruppskontroll med antikropps-screening och förenlighetsprövning i rörteknik

För denna metod analyserades tre prover från patienter som varit i behov av transfusioner som vid tidigare utredningar påvisat antikroppar. Resultatet motsvarar det som iakttagits vid tidigare analys.

Tabell 3. Resultaten från tre prov där en respektive två enheter blod hade begärts, samtliga tidigare reaktioner blev synliga.

Blodgruppskontroll Prov 0134 Prov 0315 Prov 0190

Anti-A 4+ 4+ 4+ Anti-B ˗ ˗ ˗ Antikropps-screen ÖI ˗ ˗ ˗ ÖII 1+ 1+ 2+ ÖIII ˗ 1+ ˗ Förenlighetsprövning Enhet 1 ˗ ˗ ˗

16

DISKUSSION

Syftet med detta projekt var att verifiera lösningen MLB 2 (Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH, Dreieich, Germany) för indirekt antiglobulinteknik (IAT-LISS). Lösningen tillämpas för antikroppsidentifiering, blodgruppskontroll med antikropps-screening samt förenlighetsprövning men även för fenotypning av erytrocyter gällande antigenen s, Fya_{, Fy}b_{, Kp}a_{, Kp}b _{samt Lu}a_{. Bedöms resultatet som godkänt ämnas} lösningen att tas i bruk för att kunna följa direktiv från Europeiska unionen (EU) som träder i kraft 2022.

4.2 Resultat

4.2.1 Fenotypning av erytrocyter i rörteknik

Samtliga antigener som analyserades fick förväntade resultat. Av de 31 positiva för olika antigen som analyserade påvisades alla 31 vara positiva vid analysen med IAT-LISS i rörteknik. På grund utav att flera antigen är mer sällsynta kunde inte Lua+ eller Kpb- analyseras. Anlaget blev emellertid synligt i reaktionerna, till exempel för de åtta prover som analyserades för antigen s. De heterozygot positiva för antigenet översteg inte vid något tillfälle en reaktionsstyrka på 3+. Majoriteten homozygota för antigenet bedömdes ha en högre reaktionsstyrka som motsvarade 4+, för två av de fem homozygota blev reaktionsstyrkan bedömd som 3+. Falska resultat för fenotyper kan förekomma, men har inte inträffat under mina försök för någon av alla 61 utförda fenotypningar och lösningen bedöms fungera mycket väl (9).

4.2.2 Antikroppsidentifiering i rörteknik

Identifiering av antikroppar utfördes i liten skala på grund utav den mindre mängden provmaterial tillgängligt efter ursprunglig analys. Två prover kunde analyseras i sin helhet där ett utav dem stämde överens helt med tidigare resultat med anti-E, se tabell 2. Prov 0149 stämde inte överens med tidigare observerat resultat. Det yttrades skillnader i 3 reaktioner, för screenceller fyra, nio samt tio. Samtliga dessa celler hade vid tidigare analys med IAT-LISS i gelteknik uppgått i styrkan 2+. Vid mitt försök kunde endast 1+ observeras för screencell nio med övriga negativa. Patienten i fråga hade bekräftats vara immuniserad mot Lea. I Örebropanelen är cellerna fyra, nio samt

17 tio homozygota för Lea, att reaktionen endast blev synlig för en av dessa ger en oklar bild. Vore detta resultatet vid rutinanalys hade man inte kunnat fastställa vilken antikropp det rör sig om. Kraven för att kunna fastställa en antikropp är att reaktionerna ska korrespondera med minst 3 enskilda celler för antikroppen (1, 3, 8).

Anti-Lea förekommer oftast av IgM-typ och kan påvisas vid rumstemperatur men även vid 37°C, men kan då uppvisa en svagare agglutination. Antikroppen kan reagera med IgG eller komplement då den är en så kallad ”komplement-fixerande antikropp”. Detektionen främjas därav med hjälp av polyspecifikt antihumanglobulin (AHG) så antikropparna kan reagera med ingående komplement-faktorer. Denna typ av AHG användes, en mer tydlig reaktion med anti-C3d borde ha skett men reaktionen verkar inte blivit fullständig. Orsaker till falskt negativa resultat vid LISS-IAT kan vara felaktigheter på AHG, felaktig tvättning, bristfälliga inkubationsförhållanden, defekter i panelcellernas styrka, för svag centrifugering eller missbedömning vid avläsning av agglutination. Flera av dessa kan avvisas, som att det skulle vara felaktigheter på AHG eller tvättprogrammet och dess centrifugering då dessa användes genomgående och inte vid något annat tillfälle visat tvivelaktigheter. Tvättning och centrifugering utfördes även automatiserat vilket höjer tryggheten för att detta skett på ett uniformt sätt genom alla försök. Vad gäller avläsning och bedömning följdes denna enligt metoden och eventuella tveksamheter togs upp med handledare på plats för en samlad bedömning. Resultatet som erhölls var emellertid inte falskt negativt, utan svagare än när analysen ursprungligen utförts, vilket har varit med hjälp utav gelteknik som är känt känsligare för dessa typer utav antikroppar (12, 13).

Avseende kvaliteten på panelcellerna, vore den bristfällig skulle detta troligen även blivit synligt i analysen av prov 0146 med anti-E, då den utfördes simultant. För analyser som utförs i LISS-miljöer bör förhållandet mellan serum och erytrocyter i reaktionen vara minst 40:1 enligt beräkningen nedan (1).

(𝑉𝑜𝑙𝑦𝑚 𝑠𝑒𝑟𝑢𝑚) ∗ 100

18 Suspensionen av erytrocyter blandas till 4%, detta är styrkan som används för alla manuella metoder i rörteknik. I röret för analys ska suspension tillsammans med serum ha motsvarat 50:1. Dålig omrörning av panelcellerna skulle kunna påverka att mindre erytrocyter ingår i analysen men förhållandet blir då större, detta bör därav inte vara orsaken till uteblivna reaktioner.

Man skulle kunna ifrågasätta kvaliteten hos prov 0149. Båda proven analyserades i samband med varandra både vid tillfället av första analys och upprepning av analys i det här försöket. Prov 0146 var även äldre då det provtagits en dag tidigare, men som vid båda analyser påvisar anti-E. Anti-E förekommer i både IgG- samt IgM-form med fall av den förstnämnda mer vanligen, som effektivt kan fastställas med IAT-LISS. I prov 0149 gick det vid min upprepning inte att påvisa anti-Lea. Komplement-fixerande antikroppar är känt särskilt känsliga och klarar inte att lagras längre tid då komplementaktiviteten minskar. Detta gör att AHG inte kan detektera dem. Enligt en studie kunde man helt inaktivera komplement genom att tillsätta 0,1mol/L K2EDTA som drastiskt påverkade detektionen av IgM-antikroppar. Det går dock inte utifrån mina resultat, veta om detta har skett. Reflektioner kan föras om eventuell inhibering av dessa antikroppar skulle kunna undvikas vid provtagning, genom att nyttja rör utan EDTA-tillsats. Provmaterialet skulle då vara serum, vilket skulle kunna orsaka en större reaktivitet med komplement-bindande köldantikroppar som inte är kliniskt signifikanta. En sådan åtgärd är däremot inte nödvändig på grund av anti-Lea som också tillhör icke kliniskt signifikanta antikroppar då de kan neutraliseras av Le-antigen. En förändring skulle i längden ge en negativ påverkan med hänsyn till behovet av effektivitet inom transfusionsmedicin då det kan handla om livsavgörande insatser som operation samt transfusion (2, 8, 12, 14).

4.2.3 Blodgruppskontroll med antikropps-screening och förenlighetsprövning i rörteknik

Vid blodgruppskontrollen sker ingen tillsats av LISS, den analyseras endast med erytrocytsuspension och anti-A samt anti-B reagens och därav kommer den delen inte att behandlas här. De två prover som ingick i försöket hade vid tidigare analys i IAT-LISS gelteknik påvisat svaga reaktioner för några av screen-cellerna. Provet har

19 tidigare analyserats genom automation på ORTHO VISION™ Analyzer (Ortho-clinical Diagnostics GmbH, Neckargemuend, Tyskland) och är av roboten avläst som 0,5+ för ÖII. Vid IAT-LISS i rörteknik just detta, prov 0135 för cell ÖII, särskilt svag och syntes dåligt makroskopiskt. Då agglutination fanns närvarande, om än i låg grad, bedömdes den som lägsta positiva på den manuella skalan, 1+. Samtliga prover för denna analys hade fall av svaga reaktioner, som med hjälp av handledare kontrollerades i mikroskop för att ge en rättfärdig bedömning. Detta resultat gör det tydligt att agglutinationsbedömningen vid serologiska analyser i rörteknik kräver erfarenhet.

4.3 Slutsats

Gelteknik är en av vår tids större framsteg inom transfusionsmedicin och var redan vid sitt inträde i immunhematologi överlägsen de äldre manuella teknikerna. Idag används tekniken effektivt med hjälp av automatisering. Trots detta är de manuella essentiella som reservrutiner och måste kunna tillämpas. Detta framhäver vikten av personal med särskild expertis inom transfusionsmedicin och erfarenhet av den noggranna agglutinationsbedömning som är en del av varje analys (13, 14).

Då antigen och antikroppar av olika former har skillnader i sin kemiska struktur och reaktivitet tillämpas metoder för att kunna gynna så många som möjligt, som att bruka polyspecifika AHG samt att arbeta i temperaturintervall 20-37°C. Nyttoeffekten av detta begränsas av provmaterialets kvalitet, som alltid är central. De få avvikande resultat som betraktats genom mina försök kan inte uteslutas vara på grund utav defekt provmaterial. Effekten av förstärkningslösningen MLB 2 bedöms vara god, då de även kan förklaras av metodens lägre känslighet, som är känd sedan tidigare.

4.4 Tackord

Avslutningsvis vill jag uttrycka ett stort tack till mina handledare BMA Hanna Dahl och Dr Aseel Alshamari som bidragit med betydande kunskaper under arbetets gång. Ett särskilt tack till Hanna, som varit behjälplig vid agglutinationsbedömningar som stundtals var svåra. Utan er hjälp hade detta arbete inte varit möjligt.

20

REFERENSER

1. Daniels G, Bromilow I. Essential guide to blood groups. 3. uppl. Chichester, West Sussex, UK: Wiley-Blackwell; 2014.

2. Reid ME, Lomas-Francis C, Olsson ML. The blood group antigen. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier/Academic Press; 2012.

3. Klein HG, Anstee DJ. Mollison's blood transfusion in clinical medicine. 12th _ed. Chichester, West Sussex, UK: John Wiley and Sons, Inc.; 2014.

4. Duboeuf S, Flourié F, Courbil R, Benamara A, Rigal E, Cognasse F, et al. Identification d'allo-anticorps et leurs associations: bilan d'une année à

l'Établissement français du sang Auvergne-Loire [Identification of alloantibodies and their associations: balance sheet of a year at the Auvergne-Loire French Blood Establishment]. Transfus Clin Biol. 2012;19:358-65.

5. Garraty, G. Evaluating the clinical significance of blood group alloantibodies that are causing problems in pretransfusion testing. Vox Sang. 1998;285-90 6. Handbok för blodverksamhet [Internet]. Uppsala: Swedish Blood Alliance; -

[uppdaterad 2021 April 1; citerad 2021 April 4 ]. Tillgänglig från: https://transfusion.se/

7. Flegel WA. The genetics of the Rhesus blood group system. Blood Transfus. 2007;5:50-7.

8. Wang SS, Zhang H, Qu L, Zhao Z, Li L. A renewed understanding of anti-human globulin reagents: interference constraints using an optimization method in pretransfusion compatibility tests. J Clin Lab Anal.

2021;35:e23695.

9. Shih, AW et al. Utilising red cell antigen genotyping and serological phenotyping in sickle cell disease patients to risk-stratify patients for alloimmunization risk. Tranfus Med. 2020;30;263-274.

10. Europaparlamentets och rådets förordning (EU) 2017/746 om

medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik och om upphävande av direktiv 98/79/EG och kommissionens beslut 2010/227/EU. (2017/746). Bryssel: Europaparlamentet.

21 11. CE-märkning [Internet]. Karlstad: Konsumentverket. [uppdaterad 2020 maj

29; citerad 2021 feb 16] Tillgänglig från:

https://www.konsumentverket.se/for-foretag/produktsakerhet/ce-markning/ 12. Cooling, L. ABO, H and Lewis Blood groups. Fung M, Grossman B, Hillyer

C, Westhoff C, editor(s). American association of Blood Banks Technichal Manual. Bethesda: AABB; 2014. P291-315.

13. Garg S, Saini N, Bedi RK, Basu S. Comparison of micro column technology with conventional tube methods for antibody detection. J Lab Physicians. 2017;9:95-99.

14. Walker, PS. Hamilton JR. Identification of Antibodies to Red Cell Antigens. Fung M, Grossman B, Hillyer C, Westhoff C, editor(s). American association of Blood Banks Technichal Manual. Bethesda: AABB; 2014. P391-424. 15. Shirey RS, Boyd JS, Barrasso C, King KE, Ness PM. A comparison of a new

affinity column system with a conventional tube LISS-antiglobulin test for antibody detection. Immunohematology. 1999;15;75-77.

16. Judd WJ, Steiner EA, Knafl PC. The gel test: sensitivity and specificity for unexpected antibodies to blood group antigens. Immunohematology. 1997;13;132-135.

22

BILAGOR

23

Bilaga 2, Örebro Screen- & BAS-testceller antigram

24

Bilaga 3, MLB insert (LISS-lösning)