EXAMENSARBETE INOM KEMITEKNIK, GRUNDNIVÅ STOCKHOLM, 2018
Metodutveckling för bestämning av vattenhalten i en frystorkad
proteinprodukt
Rana Said
1
EXAMENSARBETE
Högskoleingenjörsexamen Kemiteknik
Titel: Metodutveckling för bestämning av
vattenhalten i en frystorkad proteinprodukt
Engelsk titel: Method development for determination of the water content in a freeze-dried protein product.
Sökord: Karl Fischer (KF), Loss on drying (LOD),
Vattenhaltsbestämning, Kvantitativ analys, Nära infraröd spektroskopi (NIR), Frystorkning
Arbetsplats: Octapharma AB
Handledare på
arbetsplatsen: Ann-Charlotte Hinz
Handledare på
KTH: Catharina Silfverbrand Lindh
Student: Rana Said
Datum: 2018-05-28
Examinator: Catharina Silfverbrand Lindh
Sammanfattning
Vattenhalten i ett frystorkat proteinläkemedel bestämdes med KF och LOD som är två primära och traditionella metoder som används för bestämning av vattenhalten i produkter inom flera industrier.
Istället för KF och LOD, som är tidskrävande och destruktiva, kan den sekundära, snabba och icke- destruktiva metoden NIR användas. För att kunna implementera NIR måste en kalibrering gentemot en primär metod ske.
Syftet med detta projekt var att med en kvantitativ analys finna ett samband mellan NIR och KF samt mellan NIR och LOD för den frystorkade produkten. Det initiala steget var att upprätta en kalibreringsuppsättning och samla in spektrum med NIR. Därefter gjordes försök att bestämma vattenhalten med KF och LOD för den frystorkade proteinprodukten med inledande tester som verifierades genom att spetsa prover med vatten. LOD utfördes i en exsickator och KF-analyserna utfördes kolometriskt på två olika sätt, med och utan extraktion av proverna med metanol. Det slutgiltiga steget var att korrelera insamlat spektrum från NIR med bestämda referensvärden genom att skapa en kalibreringsmodell. Data från insamlat spektrum förbehandlades med multiple scatter correction (MSC), andra derivatan och Savitzy Golay, innan en kalibreringsmodell skapades med partial least square (PLS).
Resultatet från LOD-analyserna med exsickator tydde på att tillvägagångssättet som användes inte var lämpligt för produkten och en kalibreringsmodell upprättades inte. Vattenhalten bestämdes med KF med extraktion av åtta prover till 0,144 – 0,558 % [w/w], och med KF utan extraktion till 2,34–
2,972 % [w/w] för åtta prover. Det förväntade värdet var 0,62-1,61 % [w/w]. En kalibreringsmodell upprättades för KF med och utan extraktion samt för det förväntade referensintervallet. Detta resulterade i en korrelationsfaktor på 0,9496 för KF med extraktion, 0,97418 för KF utan extraktion och 0,9932 för de förväntade värdena. Metoderna KF med och utan extraktion var inte lämpliga för produkten i detta projekt, utan fler försök behöver utföras med större kalibreringsuppsättningar för att kunna dra en slutgiltig slutsats.
Abstract
The water content of a lyophilized protein drug is determined using KF and LOD which are two primary and traditional methods used by several industries for determination of water content in products. Instead of KF and LOD, which are time consuming and destructive, the secondary, fast and non-destructive method near infrared spectroscopy (NIR), can be used. To implement NIR, a
calibration towards a primary method must be performed.
The purpose of this study was to find a relation between NIR and KF and between NIR and LOD for the lyophilized product with a quantitative analysis. The initial step was to establish a calibration set and collect a spectrum with NIR. Attempts to determine the water content of KF and LOD for the lyophilized protein product were made with initial tests which later were verified by spiking samples with water. LOD was performed in a desiccator and the KF analyses were performed calorimetrically in two different ways: with and without extraction of the samples with methanol. The last step was to correlate the collected spectrum from NIR with determined reference values by creating a calibration model with partial least square (PLS). Prior to model development, data from collected spectrum was pre-treated with multiple scatter correction (MSC), second derivative and Savitzy- Golay filter.
The result of the LOD analyses with a desiccator indicated that the method used was not suitable for the product and a calibration model was not established. The water content was determined by KF with extraction of eight samples to 0.144 - 0.558 % [w/w], and with KF without extraction of eight samples to 2.34-2.972 [w/w]. The expected value was 0.62-1.61 % [w/w]. A calibration model was established for KF with extraction of the samples, KF without extraction of the samples and for the expected reference interval. The developed calibration models resulted in a correlation factor of 0.9496 for KF with extraction, 0.97418 for KF without extraction and 0.9932 for the expected values.
KF with and without extraction of the samples was not suitable for the product in this project. More experiments are needed with bigger calibration sets to be able to make a conclusion.
Innehållsförteckning
1 Inledning ... 1
1.1 Syfte och mål ... 1
1.2 Avgränsningar ... 1
2 Teoretisk bakgrund ... 2
2.1 Frystorkad proteinprodukt ... 2
2.2 Karl Fischer titrering (KF) ... 3
2.2.1 Kolometrisk titrering ... 3
2.2.2 Reaktionssteg ... 4
2.2.3 Påverkande faktorer ... 4
2.3 Loss on drying (LOD) ... 5
2.4 Nära infraröd spektroskopi (NIR) ... 5
2.4.1 Apparat och mätteknik ... 6
2.4.2 Bestämning av vattenhalt ... 7
3 Metod ... 8
3.1 Kvantitativ analys för vattenhalts bestämning ... 8
3.2 Apparatur och material ... 9
3.3 Referensmetoder ... 10
3.3.1 LOD ... 10
3.3.2 KF-analysprogram ... 10
3.3.3 KF med och utan extraktion ... 10
3.3.4 Förväntade referensvärden utifrån ett referensvärde ... 11
3.4 Provförberedelse och utförande ... 10
3.4.1 Bestämning och verifiering av ett referensvärde genom KF med extraktion ... 11
3.4.2 LOD – inledande tester och verifiering ... 12
3.4.3 KF med och utan extraktion ... 12
3.5 Spektrum och analys av data ... 14
4 Resultat ... 15
4.1 LOD ... 16
4.2 KF-analys utan extraktion ... 17
4.3 KF-analys med extraktion ... 22
4.4 Kalibrering utan en referensmetod ... 25
4.5 Kvantifiering av provflaskor ... 27
5 Diskussion ... 28
6 Slutsats ... 31
7 Referenser ... 32
8 Bilagor ... 34
5
8.2 Bilaga 2 – Spektrum på provvialerna A-H ... 35
8.3 Bilaga 4 – LOD ... 36
8.4 Bilaga 5 - Beräkningar ... 37
8.5 Bilaga 6 - Riskbedömning ... 41
1 Inledning
Octapharma är ett svenskt företag som forskar, tillverkar och säljer plasmabaserade och rekombinanta proteinläkemedel. Produkterna som Octapharma tillhandahåller tillverkas från humanplasma och används mot blödarsjuka, sjukdomar i immunförsvaret och inom intensivvård. För att hålla en hög kvalitet på produkterna sker arbetet enligt ett strikt kvalitetssäkringssystem som även uppfyller Good Manufacturing Practice (GMP) (Octapharma AB, 2017) (Octapharma AB, 2016).
En av Octapharmas produkter är en frystorkad proteinprodukt som tillhör området inom intensivvården. Produkterna frystorkas eftersom de behöver en ökad lagringsstabilitet och har krav på att dess vattenhalt måste ligga inom tillåtna gränsvärden. Vatten är en viktig kvalitetsparameter att ta hänsyn till eftersom den har en negativ inverkan på produktens livslängd (Reich, 2005). Två traditionella och primära metoder som används för att mäta vattenhalten i läkemedelsprodukter är Karl Fischer (KF) och “loss on drying” (LOD). Karl Fischer är en selektiv men tidskrävande metod för vattenhaltsbestämning och kräver en extraktion med metanol av det frystorkade proteinet, vilket leder till att provet blir oanvändbart efteråt. LOD är en gravimetrisk metod som också är tidskrävande då den tar flera timmar att utföra.
Istället för KF och LOD har Octapharma utvecklat en metod där den spektrofotometriska analystekniken ”Nära infraröd reflektans” (NIR) kan användas för att bestämma vattenhalten i de frystorkade proteinprodukterna. Analyser med NIR är snabba och icke destruktiva då ett prov direkt kan mätas genom de transparenta bottnarna av vialerna, som produkten är placerad i, utan att förstöras. NIR är dock en sekundär metod som måste korreleras gentemot en primär metod för att kunna implementeras.
1.1 Syfte och mål
Syftet med detta projekt var att med en kvantitativ analys ta fram ett samband mellan NIR och KF samt mellan NIR och LOD för den frystorkade proteinprodukten och verifiera att analysmetoden var korrekt.
Målet var att bestämma vattenhalten i de frysta proteinprodukterna med referensmetoderna KF och LOD och att korrelera dessa värden med provernas spektrum från NIR.
1.2 Avgränsningar
Arbetet gällde en specifik produkt som fanns tillgänglig i åtta provflaskor.
Referensanalyserna utfördes med en kolometrisk KF-titrering samt med en exsickator. Spektrum samlades in med mättekniken diffus reflektans och förbehandlades med Savitzky-Golay filter, andra ordningens derivata och multiplicative scatter (MSC) med inställningar som rekommenderades av programvaran TQ-analyst. Kalibreringsmodellen skapades med det kemometriska verktyget partial least squares (PLS). Varken intern eller extern validering av metoden utfördes.
2 2 Teoretisk bakgrund
I följande kapitel presenteras produkten som analyserades samt teori kring metoderna och apparaturerna som användes.
2.1 Frystorkad proteinprodukt
Produkten är ett frystorkat och sterilt protein som produceras från human plasma som kommer från donatorer med samma ABO-grupp. Plasman, som är sammanslagen från flera donatorer, har genomgått flera tester för att inte riskera patienternas säkerhet. Plasman testas för HIV och Hepatit och måste ge ett negativt resultat för att kunna användas. Utöver det testas plasman även för B19 virus och genomgår ett eller flesta steg för att inaktivera virus. När samtliga reningssteg har utförts fryses plasman ner för att sedan frystorkas (COUNCIL OF EUROPE, 2015)
Frystorkning är en process som består av två huvudsteg, primär och sekundär torkning som föregås av frysning. I den primära torkningen sker en sublimering som innebär att energi tillförs (cirka 2805 kJ/kg) för att kunna omvandla is till vattenånga. I det andra steget transporteras den bildade vattenångan bort från den torkade produkten (Oetjen & Peter, 2003) och resulterar i ett vitt eller gultonat pulver (COUNCIL OF EUROPE, 2015).
Vattenhaltsbestämning
Frystorkning brukar oftast utföras på produkter som behöver ökad lagringsstabilitet, vilket innefattar produkter som är injicerbara eller som direkt ska kunna lösas upp och användas. Ett viktigt kvalitetskriterium för frystorkade produkter är att dess vattenhalt är låg (Reich, 2005) eftersom vatten har en inverkan på en produkts kemiska och fysikaliska stabilitet, formulering, hållbarhet samt aktiva ämnen. Vattenhaltsbestämning är således en viktig parameter inom läkemedelsindustrin och är ett av de moment som utförs mest frekvent (Padivitage, et al., 2013). Två traditionella men tidskrävande metoder som används för att bestämma vattenhalten i till exempel läkemedel eller livsmedel är Karl Fischer (KF) och “Loss on drying” (LOD). Båda metoderna är primära och kan därför används som referens till den sekundära analystekniken NIR (Padivitage, et al., 2013) (Reich, 2005).
Den frystorkade produkten som önskas analyseras med NIR, innehåller fritt vatten med en ungefärlig fukthalt på 1 viktprocent (% [w/w]) (Hinz, 2016).
Good Manufacturing Practice (GMP)
GMP är en kvalitetssäkringsmetod som gäller samtliga aktörer (leverantörer, konsulter, laboranter m.m.) som arbetar med läkemedel. Syftet är att patientsäkerheten alltid ska vara i fokus. Produkters säkerhet upprätthålls genom att tillverkningsprocesser, som sker i aseptisk miljö, kontrolleras. Att följa GMP innebär att det finns en garanti på att produkterna blir konsekvent tillverkade och kontrollerade enligt uppsatta kvalitetskrav. Det skapas ett systematiskt sätt att sköta tillverkningsprocesser och kontaminering samt korskontaminering förhindras (Octapharma AB, 2016).
2.2 Karl Fischer titrering (KF)
KF är en direkt och selektiv metod som används för bestämning av vattenmängden i vätskor, fasta ämnen och gaser i bland annat läkemedel- och livsmedelsindustrin (Mettler-Toledo, 2011). Metoden är väletablerad för vattenhaltsbestämning och har använts sedan år 1935 (Padivitage, et al., 2013).
Metoden baseras på att en kvantitativ reaktion mellan svaveldioxid (SO2) och jod (I) sker i ett vattenfritt medium (ROH) i närvaro av en bas (RN). Jod kan enbart reagera med vatten, vilket innebär att reaktionen endast kan ske när det finns vatten närvarande i reaktionsblandningen. Mängden vatten som finns i provet bestäms utifrån hur mycket jod som har förbrukats i titreringen. Det stökiometriska förhållandet mellan jod och vatten är 1:1 (E. Wrolstad, et al., 2005) (Padivitage, et al., 2013) (COUNCIL OF EUROPE, 2008).
Kolometrisk titrering
Kolometrisk titrering är en metod som producerar jod in situ och har en hög känslighet, vilket gör den lämplig för bestämning av prover som innehåller små mängder vatten (10 ug-10mg) (COUNCIL OF EUROPE, 2008) (E. Wrolstad, et al., 2005). Apparaturen består av en reaktionscell som utgörs av en magnetomrörare samt två huvuddelar, en stor anod och en liten katod. Både anoden och katoden innehåller varsin platinaelektrod som används som ”generator- och indikatorelektrod”.
Generatorelektroden kan vara separerad med ett diafragma som används när låga mängder (<50 µg) vatten ska bestämmas (Mettler-Toledo, 2011) (COUNCIL OF EUROPE, 2008) (figur 1). Vid anoden kommer den genererande elektroden att oxidera jodid och skapa jod som direkt reagerar med vattnet i provet (Reich, 2005). När vattnet är konsumerat indikeras det av indikatorelektroden som detekterar ett överskott av jod och därmed stoppas produktionen av jod. (COUNCIL OF EUROPE, 2008).
Figur 1. En kolometrisk apparatur där jod genereras elektrokemiskt under titrering (Mettler-Toledo, 2011).
4 Mängden jod som produceras kan bestämmas genom att mäta andelen elektricitet som har använts under titreringen, och utifrån det kan vattenhalten sedan presenteras (Padivitage, et al., 2013). För att kunna generera jod används en viss mängd elektricitet, Coulumb (C), som står i proportion till mängden vatten som finns i provet. Faradays konstant (96 485 C) är mängden ström som behövs för att producera 1 mol av en kemisk substans som kräver en elektron. Enligt reaktion 1 (avsnitt 2.2.2), frisläpps 2 mol vid anoden för att skapa 1 mol jod, vilket innebär att 2* 96 485 C/mol behövs för 1 mol vatten (18,015 g/mol). Sammanfattningsvis betyder det att 1 mol jod motsvarar 1 mol vatten, och en mängd elektricitet på 10,71 C är ekvivalent med 1 mg vatten (COUNCIL OF EUROPE, 2008) (Mettler- Toledo, 2011).
Reaktionssteg
Jod skapas elektrokemiskt vid anoden i reaktionscellen genom oxidation av jodid enligt reaktion 1.
Reaktion 1 2 𝐼− → 𝐼2 + 2𝑒−
Vid katoden sker den kompletterande reaktionen, en reduktion, som producerar vätgas (H2) från ammoniumsalt enligt reaktion 2.
Reaktion 2 2 𝑅𝑁𝐻+ + 2𝑒− → 𝐻2(𝑔) + 2𝑅𝑁
Mängden jod som har producerats (reaktion 1) reagerar omedelbart med vatten och svaveldioxid enligt reaktion 3. Reaktion 3 sker simultant med reaktion 1, vilket innebär att jod fortsätter att genereras tills vattnet är konsumerat (Mettler-Toledo, 2011).
Reaktion 3 𝑅𝑂𝐻 + 𝑆𝑂2 + 3𝑅𝑁 + 𝐼2 + 𝐻2𝑂 → (𝑅𝑁𝐻) ∗ 𝑆𝑂4𝑅 + 2(𝑅𝑁𝐻)𝐼
Påverkande faktorer
KF är en teknik som är användbar för många olika material, men för att metoden ska fungera korrekt finns det faktorer och villkor som måste tas i beaktande (Padivitage, et al., 2013). Faktorer som kan påverka resultatet är omgivande fukthalt och bireaktioner mellan provet och KF- reaktanterna.
Fuktinsläpp till proverna och till titreringsutrustningen är den största felkällan vid en KF-mätning, eftersom det har en direkt inverkan på resultatet (Mettler-Toledo, 2011). Ju högre fukthalt som finns i omgivningen desto större kan felkällan bli. Ett sätt att minimera fuktinsläpp är att täta samtliga öppningar i titreringsutrustningen. I titreringsutrustningen förekommer det vanligtvis en viss fukthalt som är svår att eliminera fullständigt. Vid en KF-analys kommer den befintliga fukthalten i titreringsutrustningen att titreras, vilket tas i beaktande när den verkliga fukthalten för provet ska beräknas. Ett högt driftvärde är en indikation på att halten fukt i titreringsutrustningen är för hög (>10 µg/min) (Mettler-Toledo, 2011).
Bireaktioner, som är en annan felkälla, kan ske parallellt med KF-reaktionen och ge ett missvisande resultat. De tre främsta bireaktioner som kan inträffa vid en KF-analys är om komponenter i provet som ska analyseras reagerar med metanol, vatten och/eller jodid. Beroende på vilken av de tre bireaktioner som inträffar leder det till att vattenmängden i provet antingen konsumeras eller ökas, vilket leder till ett felaktigt resultat på vattenmängden i provet.
Ett villkor som måste uppfyllas är att vattnet i provet ska komma i lösning med metanol annars går det inte att extrahera vattnet. För att kunna mäta den totala vattenhalten måste allt vatten i provet ha löst upp sig (Padivitage, et al., 2013) (Oetjen & Peter, 2003).
2.3 Loss on drying (LOD)
LOD, uttrycks i procent (w/w), är den andra traditionella metoden som används för vattenhaltsbestämning. Dess princip är att torka ett prov och mäta den massa som förloras under en viss tid och/eller temperatur. LOD kan utföras genom att låta provet torka i en exsickator eller under ett specifikt temperaturintervall i ugn eller under vakuum (Padivitage, et al., 2013) (COUNCIL OF EUROPE, 2015).
Trots att LOD är en vanlig metod för bestämning av vattenmängder finns det flera nackdelar med metoden. Den förlorade massan som uppstår under torkning kan bero på andra orsaker än förlust av vatten. Provet kan innehålla andra flyktiga ämnen som bidrar till skillnaden i massa, vilket skapar osäkerhet i resultatet då den förlorade massan inte enbart gäller fukten. Ett annat problem som kan förekomma är att vattenmolekylerna i provet kan vara bundna till analyten på olika sätt. Om vattenmolekylerna är för starkt bundna till provet finns det risk att de kringgår bestämningen, vilket leder till minskad mätprecision. Utöver det är metoden tidskrävande då den tar flera timmar att utföra (Padivitage, et al., 2013).
2.4 Nära infraröd spektroskopi (NIR)
NIR-spektroskopi är en väletablerad analysmetod som används inom bland annat livsmedel-, kemikalie- och läkemedelsindustrin. Tekniken används för kvalitativa och kvantitativa analyser, såsom identifiering och bestämning av substanser och halter (Reich, 2016) (Sandorfy, et al., 2006) (European Medicines Agency, 2003).
NIR (12,800–4000 cm-1 eller 800–2500 nm) är tillsammans med FIR (40–20 cm-1) och MIR (4000-400 cm-1) undergrupper till infraröd spektroskopi (IR) som mäter molekylära vibrationer (translationer, rotationer, vibrationer) på ett spektrum mellan 12,500 och 20 cm-1, se figur 2 (Reich, 2016) (Siesler, et al., 2007). Molekylära vibrationer uppstår när molekyler absorberar elektromagnetisk strålning (energi) från en ljuskälla vilket resulterar i signaler som kallas för absorptionsband och åskådliggörs på ett spektrum (Siesler, et al., 2007). Upptaget av energi kallas för absorbans och den del av strålningen som inte absorberas av provet benämns som transmittans eller reflektans (Sandorfy, et al., 2006)
6 Absorptionsbanden som kan observeras i NIR-regionen utgörs av övertoner och kombinationer av fundamentala vibrationer från – CH, – NH, – OH och – SH funktionella grupper (Reich, 2016) (Reich, 2005). När molekyler absorberar strålning hamnar de i ett exciterat tillstånd där en eller flera atomer vibrerar. Atomen kommer att vibrera med hög frekvens kring ett jämviktsläge vilket kan beskrivas med kvantfysikens modell för oscillatorer som antingen kan vara harmoniska eller icke harmoniska (Petrozzi, 2012). För en harmonisk oscillator kan endast en energinivå i taget nås. Det innebär att en molekyl som befinner sig i sitt grundtillstånd (v=0) endast kan excitera till den första nivån (v=1).
Denna specifika energitransport kallas för en fundamental övergång och dominerar ett IR-spektrum.
Molekyler beter sig även enligt den icke harmoniska oscillatorn som innebär att energiövergångar till mer än en nivå är tillåtet (v=0 → v=2,3 el.4). Absorptionsband som kommer från dessa multinivå energiövergångar kallas för övertoner (780–2000 nm) (Metrohm, 2013) och är 10–100 gånger svagare än den fundamentala absorptionen som de härstammar ifrån (Reich, 2016) (Siesler, et al., 2007), se figur 3. Den låga absorptiviteten möjliggör att strålning kan genomtränga vätskor och fasta substanser med flera millimeter. NIR:s penetrationsdjup tillsammans med att de flesta material är transparenta (t.ex. glas) i NIR-området medför att analystekniken inte förstör provet som ska analyseras (Reich, 2016) (COUNCIL OF EUROPE, 2014) Utöver övertonerna, som utgör grunden inom NIR spektroskopi (Siesler, et al., 2007), förekommer även kombinationsband (1900-2500 nm) (Metrohm, 2013) som uppkommer då vibrationer interagerar med varandra (Reich, 2016).
Figur 3. Illustration av en fundamental energiövergång och övertoner (Reich,2016).
Absorptionsbanden i NIR är oftast breda, överlappar varandra och innehåller kemisk och fysikalisk information som måste extraheras på grund av låg känslighet och selektivitet. Informationen från spektrumet extraheras med kemometri för att kunna koppla samman informationen med provets specifika egenskaper (Reich, 2016). Mätningar med NIR är en sekundär metod som måste jämföras med en primär metod såsom Karl Fischer och LOD för att kunna implementeras (Metrohm, 2013).
Apparat och mätteknik
NIR-spektrofotometri är en teknik som kan generera ett spektrum på en tiondels sekund och ge flera analyser efter en mätning där ingen eller endast lite provförberedelse behövs. Prover som ska analyseras kan mätas direkt genom vialen utan att öppnas och kan därmed behålls i sitt ursprungliga skick både före och efter en mätning (Reich, 2016) (Sandorfy, et al., 2006). LOD (Sandorfy, et al., 2006). Grunden i NIR-spektrofotometri är att skicka ljus genom eller i ett prov för att mäta den försvagning som uppstår i den överförda strålen efter att provet har absorberat en del utav den. En av huvudkomponenterna i ett NIR instrument är därför en ljuskälla som till exempel kan vara en tungsten-halogenlampa eller superluminiscens LED. Övriga komponenter i ett NIR-instrument utgörs av en monokromator (AOTF, prisma), provbehållare och detektor som mäter försvagningen i den överförda strålen (COUNCIL OF EUROPE, 2014) (Reich, 2005)
Det finns tre olika mättekniker som kan användas när ett prov ska analyseras, och det är transmittans, transmission och diffus reflektion. De två första metoderna används vanligtvis till analyter som består av en vätska medan diffus reflektion är en mätteknik som är lämplig för fast material. Vid diffus reflektion analyseras provet direkt, i en lämplig provbehållare eller på en fiberoptisk sensor. Analysen med diffus reflektion ger ett mått på reflektansen (R) som är förhållandet mellan intensiteten av det reflekterade ljuset (I) av ett prov och reflektansen av en bakgrund eller referensyta (Ir). Vid analysen kommer en strålning att tränga igenom provet och absorberas av analyten. Den del av strålningen som inte absorberas kommer att reflekteras tillbaka och fångas upp av detektorn. Spektrat från mätningen åskådliggörs i ett diagram vars y-axel beräknas med log10 (1/R) och x-axeln utgörs av våglängd eller vågnummer (COUNCIL OF EUROPE, 2014).
Bestämning av vattenhalt
NIR-spektroskopi kan användas till att bestämma vatten- eller fukthalten i ett prov och identifiera vattnets tillstånd (bundet eller fritt). Vatten har starka OH-bindningar som absorberar i NIR-regionen, vilket gör NIR-spektroskopi till en lämplig metod. Den starka OH- absorbansen åskådliggörs i ett spektrum med fem absorptionstoppar (760,970,1190,1450 och 1940 nm) som oftast har en bra upplösning. Den starkaste absorptionstoppen, som är en kombinationsvibration, kan observeras vid 1940 nm. Absorptionstoppen vid 1450 nm tillhör den första övertonen av OH- sträckningsvibrationen (Reich, 2016) (COUNCIL OF EUROPE, 2014).
Påverkande faktorer
Det finns flera faktorer som kan påverka signalerna från en NIR-mätning. En av faktorerna är temperatur och avser då både provets och omgivningens temperatur. En skillnad på några grader kan ge spektrala förändringar som kan påverka analysen. När en analys ska utföras är det viktigt att ytan som provet ska placeras på är ren för att undvika interferenser som kan störa analysen. Provets tjocklek är en annan faktor som kan leda till spektrala variationer. För att strålningen från ljuskällan ska kunna analysera provet krävs en tjocklek på minst 5 mm. Provets ålder kan också ha en inverkan på resultatet. De kemiska, fysikaliska och spektrala egenskaperna av ett prov kan förändras över tiden då ett prov, beroende på hur länge det har lagrats, kan ha adsorberat eller desorberat vatten.
Samtliga faktorer är viktiga att ta hänsyn till då NIR-analysen ska kunna representera framtida prov (COUNCIL OF EUROPE, 2014).
8 3 Metod
Till utvecklingen av kalibreringsprocessen fanns det åtta provflaskor (förslutna med gummilock) med frystorkad proteinprodukt att tillgå. Projektet utgick från att provflaskorna innehöll en ungefärlig fukthalt på 1 viktprocent. Samtliga provflaskor (1–8) vägdes och analyserades initialt med NIR- spektroskopi. Referensvärden till kalibreringen samlades därefter in på fyra olika sätt i syfte att undersöka vilket/vilka tillvägagångssätt som var lämpliga att använda till att upprätta en kalibrering.
Följande metoder användes:
1. LOD
2. KF-analys utan extraktion 3. KF-analys med extraktion
4. Förväntade referensvärden utifrån inledande försök 3.1 Kvantitativ analys för vattenhaltsbestämning
Ett NIR-spektrum består av överlappande absorptionsband som kommer från flera komponenter i ett prov och innehåller både kemisk och fysikalisk information som måste behandlas kemometriskt. Det innebär att relevant information extraheras och ej relevant (t.ex. interferenser, brus) minimeras för att kunna relatera spektral information till analytens egenskaper. Detta kallas för kalibrering (Reich, 2005) (COUNCIL OF EUROPE, 2014) och utförs innan en kvantitativ analys. En kalibreringsprocess för en kvantitativ metod innehåller generellt följande steg:
1. Bestämma en kalibreringsuppsättning.
2. Samla ett spektrum och bestämma referensvärden.
3. Kemometrisk behandling för att korrelera spektrala variationer till analytens referensvärden 4. Metodvalidering.
I syfte att skapa en robust kalibreringsmodell bör kalibreringsuppsättningen täcka ett bredare intervall än det som har specificerats och omfatta variationer av både kemiska och fysikaliska egenskaper för de prover som ska analyseras (European Medicines Agency, 2003) (Reich, 2005).
Kalibreringsuppsättningen ska bestå av verifierade referensvärden som har samlats in med en lämplig referensmetod (t.ex. KF eller LOD) (European Medicines Agency, 2003)
Innan referensvärden bestäms för proverna i den upprättade kalibreringsuppsättningen måste spektrum samlas in för dem. Efter att proverna primärt skannats med NIR-spektrofotometern kan referensvärdena bestämmas med referensmetoderna (Padivitage, et al., 2013). Utöver kaliberingsuppsättningen som ska användas till att skapa en kalibreringsmodell rekommenderas även att en kalibreringsuppsättning för intern validering av modellen skapas (European medecines agency, 2014).
Valet av referensmetod, resultat från denna, samt hur proverna hanteras är av betydelse för kalibreringen, eftersom NIR-metodens precision påverkas av dem. En faktor som kan påverka resultatet är väntetiden mellan en referens- och NIR-analys. Proverna bör därför mätas med referensmetoden direkt efter en NIR-analys för att undvika att förändringar i provernas komposition (t.ex. fukthalt) uppstår (Reich,
2016). Samtliga resultat från mätningarna med NIR-spektrofotometri måste vara inom ramen av den utvecklade kalibreringsmodellen, vilket betyder att mätningarna ska vara inom kalibreringsgränserna.
(COUNCIL OF EUROPE, 2014).
När referensvärden har samlats in för kalibreringsuppsättningen måste de korreleras till provernas insamlade spektrum. Spektrum som erhålls från NIR-analyser är multivariata och behöver behandlas med både matematiska och statistiska verktyg för att kunna korrelera spektral information till analytens referensvärden (Metrohm, 2013).
När kemometri ska tillämpas på rådatan är det första steget en förbehandling av de insamlade spektrumen. Detta görs för att minimera, filtrera eller standardisera de oönskade effekterna. De oönskade effekterna kan vara variationer mellan proven, brus från både prov och instrument och ströljus. Förbehandligen som krävs kan delas in i två delar, normalisering- och deriveringsmetoder där multiplicative scatter corrections (MSC) och Savitzky-Golay filter är exempel från respektive metod.
Normalisering används för att korrigera för ströljus och baslinjeförskjutning medan derivering även kan tillämpas för att förbättra upplösningen mellan överlappande toppar (Padivitage, et al., 2013).
Andra förbehandlingar som kan appliceras på spektrat är utjämning, centrering samt första och andra ordningens derivata. Om andra ordningens derivata tillämpas kan den både förbättra den spektrala upplösningen och lösa upp närliggande toppar. Det andra steget i optimeringen av NIR-data är en regressionsanalys som används för att processa datan som kan vara insamlad vid flera hundra olika våglängder. Principal component analysis (PCA), generic analysis (Ga) och partial least squares (PLS) är tre algoritmer som används i kvantitativa kalibreringsprocesser. PLS reducerar mängden data genom att jämföra spektrala data med referensvärden för att därefter identifiera den våglängd som bäst beskriver referensvärdet samtidigt som en regression utförs (Padivitage, et al., 2013) (Metrohm, 2013).
Den utvecklade kalibreringsmodellen som består av referensvärden gentemot predikterade värden plottas för att åskådliggöra linjäritet, bias och lutning för den utvecklade modellen. Optimalt värde för en god korrelation mellan referens och predikterade värden är 1. Lutning, bias och skärningspunkt har optimala värden på 1, 0 och 0 respektive (European Medicines Agency, 2003).
Det slutgiltiga steget i en kvantitativ analys är att en extern metodvalidering sker. Den externa metodvalideringen innefattar parametrarna riktighet, linjäritet, precision (repeterbarhet och intermediär precision), robusthet och specificitet (COUNCIL OF EUROPE, 2014).
Valideringsuppsättningen ska vara oberoende av kalibreringsuppsättningen och bestå av prov från en annan sats (European Medicines Agency, 2003).
3.2 Apparatur och material
Till LOD-analyserna användes en exsickator som var placerad i ett fuktreducerat rum.
En kolometer (C30 Mettler Toledo) användes till Karl Fischer titreringen. Reagenterna HYDRANAL- Coulomat AG (analyt) och HYDRANAL-Coulomat CG (katalyt) användes till att fylla titreringsutrustningen och HYDRANAL water standard 1,0 samt vattenfri metanol (99,8 %) användes
10 till den förprogrammerade metoden.
NIR-analyserna utfördes med instrumentet Near infrared Red Fourier Transform Spektrofotometer som benämns NIR Antaris II (Thermo Fischer Scientific).
3.3 Referensmetoder 3.3.1 LOD
Analyser med LOD utfördes genom att väga upp prover i vågskepp som sedan torkades i en exsickator under 48 timmar. Masskillnaden före och efter torkningen i exsickatorn beräknades för att erhålla viktprocent enligt ekvation 1, där W1=Vikt före analys (gram) och W2=vikt efter analys (gram).
𝑉𝑎𝑡𝑡𝑒𝑛 % 𝑤/𝑤 = 𝑊1𝑊−𝑊2
1 (1)
3.3.2 KF-analysprogram
Tireringsutrustningen förbereddes genom att fyllas med cirka 200 ml HYDRANAL-Coulomat AG (analyt). En ampull bestående av 5 ml HYDRANAL-Coulomat CG (katalyt) bröts av och hälldes i den ena elektroden.
Till KF-analyserna användes ett program som var avsett för frystorkade proteinprodukter. I programmet ingick en förtitrering som utfördes för att allt vatten i reaktionscellen skulle konsumeras.
För system suitability utfördes ett test där 200 mikroliter kontrollprov (Hydranal Water standard 1,0) injicerades med en Hamiltonspruta i duplikat genom septumet på kolometern. Godkända värden för kontrollprovet var mellan 195 och 205 mikrogram vatten. Vattenfri metanol användes till att lösa upp vatten i proverna och som blankprov. I tre omgångar injicerades ett blankprov med en engångsspruta (5 ml) som hade sköljts med vattenfri metanol. Därefter injicerades 1 ml prov i kolometern.
Viktprocent vatten beräknades enligt ekvation 2.
𝑉𝑎𝑡𝑡𝑒𝑛 [% 𝑤/𝑤] =(𝑋𝑝𝑟𝑜𝑣− 𝑋𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘)∗𝑉𝑚𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙
𝑊∗𝑉𝑝𝑟𝑜𝑣∗10000 (2)
I ekvation 2 utgör:
Xprov = registrerad vattenmängd i provet av KF-instrumentet (µg) Xblank = medelvärdet av blank i triplikat (µg)
Vmetanol = volym som användes till att lösa upp provet (ml) W =provmängd (g)
Vprov= prov som injicerades till kolometern (ml)
Provmängden W beräknas enligt ekvation 3 där W1=provbehållares vikt inklusive produkt (g) och W2=provbehållares vikt efter tvätt och tork exklusive produkt (g).
W = W1 - W2 (3)
3.3.3 Karl Fischer med och utan extraktion
De två olika metoderna som användes till KF-titreringen var analyser med och utan extraktion. Till
analyserna utan extraktion vägdes prover upp i vågskepp. När godkända värden erhållits i KF-metoden kunde ett prov tillsättas i kolometern genom att ta loss kolometerns propp och sedan försiktigt tillsätta produkten direkt från vågskeppet. Ett system suitability test med HYDRANAL water standard 1,0 utfördes 5 gånger mellan varje analys. Vågskeppen vägdes både före och efter vattenbestämningen för att kunna ta reda på den verkliga mängden produkt som användes i KF-analysen.
Det andra tillvägagångssättet som användes var KF-analyser med extraktion. I dessa fall extraherades hela innehållet av provflaskor och vialer med 200 respektive 20 ml metanol. När provflaskorna och vialerna extraherades kunde två skikt observeras, en suspension i botten och en vätska ovanför. En engångsspruta användes för att dra upp 1 ml av vätskan som injicerades i kolometern genom dess propp och septum.
3.3.4 Förväntade värden utifrån ett referensvärde
En annan metod som användes för att utveckla en kalibreringsmodell var att använda förväntade värden på vattenhaltsbestämningen för prov A–H som referens. Det innebar att vattenhalten antogs vara cirka 1 % i ospetsade prov. Ett antal prov kunde spetsas med vatten för att därefter anta att halten ökade med det som tillsattes.
3.4 Provförberedelse och utförande
Initialt förbereddes ett antal prov för att undersöka vilken/vilka metoder av LOD och KF med och utan extraktion som kunde vara lämpliga att använda till att upprätta en kalibreringsuppsättning. Utöver det bestämdes även ett utgångsvärde för vattenhalten som samtliga provflaskor kunde antas innehålla.
Av provflaskorna 1-8 analyserades provflaska 1 med KF med extraktion för att erhålla ett utgångsvärde. Provflaska 4 analyserades med KF med extraktion för att verifiera resultatet som erhölls från provflaska 1. Provflaska 2 användes för att upprätta en kalibreringsuppsättning för metoderna LOD samt KF med och utan extraktion.
3.4.1 Bestämning och verifiering av ett utgångsvärde genom KF med extraktion
Provflaska 1 användes till att bestämma ett utgångsvärde som samtliga provflaskor kunde antas innehålla. Provflaska 1 vägdes, gummiproppen avlägsnades och sedan extraherades innehållet med 200 ml vattenfri metanol genom att tillsätta lösningen direkt i provflaskan med en bägare, se figur 4.
Efter KF-analysen med extraktion tvättades och torkades provflaska 1 i en ugn för att sedan vägas.
Efter vägningen kunde produktvikten i provflaska 1 erhållas och viktprocent vatten beräknas.
Viktprocent vatten för provflaska 1 användes som utgångsvärde för KF med och utan extraktion vid beräkning av förväntade värden.
12
Figur 4. Extraktion av innehållet i provflaska 1 med 200 ml metanol.
Provflaska 4 användes till att verifiera resultatet av extraktionen på provflaska 1. Detta utfördes genom att injicera 100 µl destillerat vatten med en Hamiltonspruta i provflaska 4 som sedan analyserades med KF med extraktion genom att extrahera innehållet med 200 ml metanol. Efter KF-analysen med extraktion tvättades och torkades provflaska 4 i en ugn för att sedan vägas. Viktprocent vatten kunde sedan beräknas.
I nästa steg undersöktes LOD samt KF med och utan extraktion för att avgöra om de var lämpliga metoder att bestämma vattenhalten med för den frystorkade proteinprodukten.
3.4.2 LOD – inledande tester och verifiering
Från provflaska 2 förbereddes prover till de inledande LOD-testerna genom att väga upp 0,05 och 0,01 g lyofiliserad proteinprodukt i vågskepp som placerades i en exsickator. Masskillnaden före och efter torkningstiden (48 timmar) i exsickatorn registrerades genom att väga proven.
För att verifiera resultatet av proverna från de inledande testerna med LOD vägdes 12 prover á 0,05 g upp i vågskepp från provflaska 2, se tabell 1. Proverna fördelades i fyra grupper som spetsades med 1, 2 och 4 mikroliter destillerat vatten varav 3 prov ej spetsades (0 µl), enligt tabell 1. Proverna torkades i en exsickator och vägdes efter 48 timmar. Det förväntade resultatet var att den förlorade massan skulle motsvara injicerad och befintlig fuktmängd.
Tabell 1. Provuppsättning bestående av 3 prover vardera. Proverna användes till LOD.
Provgrupp 1 2 3 4
Antal prov i varje provgrupp 3 3 3 3 Injicerad mängd vatten (µl) 0 µl 1 µl 2 µl 4 µl
3.4.3 KF med och utan extraktion KF utan extraktion - Inledande test
Ur provflaska 2 vägdes 0,02 g frystorkat proteinprodukt upp i 4 st. vågskepp och analyserades med KF utan extraktion i ett inledande test för att undersöka om det var en lämplig metod att använda.
Vattenmängden registrerades i KF-apparaturen och viktprocent vatten kunde beräknas enligt ekvation 2.
KF med och utan extraktion - Framtagande av referensvärden och verifiering
Från provflaska 2 upprättades en provuppsättning genom att tillsätta lyofiliserad proteinprodukt i 8 glasvialer som markerades (A-H) och förslöts med gummiproppar. Proverna fördelades i 4 grupper bestående av 2 prover vardera, se tabell 2. Vialerna behövde fyllas till en viss höjd för att NIR-
analysen skulle ge ett tillförlitligt resultat. Detta resulterade i en produktvikt på cirka 0,9 g i varje vial.
För att kunna verifiera KF med och utan extraktion och för att erhålla ett brett referensintervall injicerades olika volymer vatten (se tabell 2) med en engångsspruta genom vialernas gummilock.
Vialerna tätades med gummilock och parafilm för att minimera fuktinsläpp och ställdes i ett fuktreducerat rum i 48 timmar för att uppnå en jämvikt av vattenfördelningen i provet.
Mängden vatten som injicerades i vialerna bestämdes utifrån att fukthalten i provflaska 2 antogs vara cirka 1 %. För att kunna erhålla en variation mellan varje provgrupp och för att verifiera KF- analyserna ökades fuktinnehållet med 1 viktprocent. Den befintliga (okänd) vattenmängden ”x” i 0,9 g prov beräknades för att kunna erhålla önskad viktprocent vatten, se ekvation 4.
𝑥
0,9 𝑔= 0,01 = 1,0 % [w/w] (4)
Den befintliga vattenmängden ”x” i vialerna beräknades till 9000 µg vid en provmängd på 0,9 g.
Eftersom 1 µl motsvarar 1000 µg innebär det att 1 viktprocent är ekvivalent med 9 µl. Mängden vatten som vialerna spetsades med var därför 3, 6 och 9 µl vatten varav provgrupp 1 inte spetsades alls, se tabell 2. När proverna hade stått i 48 timmar samlades spektrum in med NIR- spektrofotometern och därefter analyserades de med båda KF- metoderna.
Tabell 2. Fyra provuppsättningar från provflaska 2 bestående av 2 prover vardera. Proverna användes till KF med och utan extraktion.
Provgrupp (nr) 1 2 3 4
Antal prov i varje provgrupp (st.) 2 (A-B) 2 (C-D) 2 (E-F) 2 (G-H) Injicerad mängd vatten (µl) 0 µl 3 µl 6 µl 9 µl Förväntad viktprocent vatten % [w/w] 0,62 0,95 1,28 1,61
Analyserna med KF utan extraktion utfördes innan KF med extraktion för att inte förstöra proverna.
Proverna från provgrupp 1-4 analyserades en i taget genom att väga upp cirka 0,0200 g produkt i ett vågskepp till KF utan extraktion. Uppvägningen utfördes i ett fuktreducerat rum för att minimera fuktinsläpp till provet. Därefter fördes vågskeppet med prov till KF-apparaturen och tillsattes i kolometern genom att ta loss locket och försiktigt hälla i provet. Vattenmängden registrerades, vågskeppet vägdes och viktprocent vatten kunde beräknas. Detta upprepades för varje prov. Totalt analyserades 8 st. prov som benämndes A1-H8.
KF med extraktion utfördes genom att använda samma provuppsättning (A-H) som användes till KF utan extraktion. Proverna vägdes om och extraherades med 20 ml vattenfri metanol för att därefter skakas i cirka 5 sekunder. 1 ml prov injicerades från vialen till kolometern genom dess propp och septum. Vattenmängden registrerades, vialerna vägdes och viktprocent vatten kunde beräknas.
Analysen utfördes på samtliga prover och benämndes A9-H16.
Kvarstående flaskor
Kvarstående provflaskor (3,5,6,7 och 8) lämnades i sitt ursprungliga tillstånd och kvantifierades med en av kalibreringsmodellerna som upprättades för de olika metoderna.
14 Samtliga spektrum som erhölls för ordinarie provflaskor (1–8) och upprättade prov i vialer (A-H) samlades in med NIR innan KF och LOD analyserna utfördes. Varje provflaska och vial placerades på den integrerade sfären som kunde mäta proverna genom dess glasbotten. Mätningen repeterades tre gånger för varje prov som även roterades manuellt mellan varje mätning. Insamlingen av spektrum skedde med diffus reflektans med en upplösning på 8 cm-1. Från 8 provflaskor (1-8) och 8 vialer (A-H) samlades totalt 48 spektrum in. Med den inbyggda programvaran TQ-analyst kunde spektrum för de åtta vialerna (A-H) laddas upp och tilldelas ett referensvärde beräknat från KF- analyserna med och utan extraktion. Varje uppladdat spektrum ansattes som kalibrering utifrån valen: kalibrering, validering och ignorera. PLS valdes som kalibreringsmodell och spektrumen behandlades med MSC, andra derivatan och Savitzky-Golay filter. Efter kalibreringen erhölls predikterade NIR värden, skillnaden mellan verkliga och predikterade värden för samtliga metoder, korrelationsfaktor och RMSEC.
4 Resultat
Redovisade värden för viktprocent vatten % [w/w] är avrundade till en decimal, medan värden som användes till dess beräkningar inte var avrundade. Insamlat spektrum för de ordinarie provflaskorna 1–8 samt provvialerna (A-H) åskådliggörs i bilaga 1 och 2.
4.1 Bestämning av ett utgångsvärde
Insamlat spektrum för provflaska 1 (ej spetsad), provflaska 4 (ej spetsad) och provflaska 4 (spetsad) sammanfördes i ett diagram, se figur 5. Efter insamling av spektrum analyserades provflaskorna med KF med extraktion.
Figur 5. Insamlat spektrum med NIR för provflaska 1 (ej spetsad), provflaska 4 (ej spetsad), provflaska 4 (spetsad).
Provflaska 1 utgörs av de tre översta linjerna, medan de lägsta linjerna tillhör provflaska 4 (spetsad). Den första övertonen förekommer vid 6900 cm-1 och kombinationsband vid 5200 cm-1.
KF med extraktion av provflaska 1 och 4
Tabell 3 innehåller resultatet från KF-analysen med extraktion av hela innehållet av provflaska 1 (ej spetsad) och provflaska 4 (spetsad).
Tabell 3. Resultatet från KF med extraktion av provflaska 1 (ej spetsad) och 4 (spetsad)
Provflaska Medelvärde av trippelblank (µg)
Registrerad vattenmängd för 5 ml
prov i KF (µg)
Produktvikt (g)
1 (ej spetsad) 84,36 559,3 15,21
4 (spetsad) 97,7 1 336,6 14,67
Viktprocent vatten för provflaska 1 kunde utifrån resultatet från KF-analysen (tabell 3) beräknas enligt ekvation 2. Se ekvation 5 för beräkning av viktprocent vatten i provflaska 1.
Viktprocent % [w/w] = (559,3−84,36)∗200
15,21∗10 000 = 0,62 (5)
Med utgångspunkten att provflaska 1 innehöll 0,62 viktprocent vatten (ekvation 5) förväntades provflaska 4 (spetsad) innehålla 1,28 viktprocent vatten enligt ekvation 6.
16 Till beräkningen av ekvation 6 användes samma parametrar som i ekvation 5 med en addition på 100 000 som motsvarar mängden vatten (100 mikroliter= 100 000 mikrogram) som provflaska 4 injicerades med.
Genom att använda registrerad vattenmängd i KF från tabell 3 för provflaska 4 (spetsad) kunde verklig viktprocent vatten % [w/w] beräknas, se ekvation 7.
Viktprocent % [w/w] =(1 336,6−97,7)∗200
(14,67∗10 000) = 1,68 (7)
Utifrån ekvation 6 och 7 kunde utbytet för vattenhalten i provflaska 4 (spetsad) beräknas enligt ekvation 8.
𝑉𝑒𝑟𝑘𝑙𝑖𝑔𝑡 𝑢𝑡𝑏𝑦𝑡𝑒
𝑡𝑒𝑜𝑟𝑒𝑡𝑖𝑠𝑘𝑡 𝑢𝑡𝑏𝑦𝑡𝑒= 1,68
1,28∗ 100 = 131,25 % (8)
Ekvation 8 visar att utbytet var 131,25 %, vilket innebär att provflaska 4 (spetsad) inbehöll 31,25 %
mer vatten än förväntat. Tabell 4 innehåller en sammanställning av viktprocent vatten för provflaska 1 (ej spetsad) och provflaska 4 (spetsad).
Tabell 4. Beräknad viktprocent vatten för provflaska 1 (ej spetsad) och 4 (spetsad).
Provflaska Viktprocent vatten % [w/w]
1 (verklig) 0,62 4 (teoretisk) 1,28 4 (verklig) 1,68
4.2 LOD
Resultatet från de inledande testerna som gjordes med LOD presenteras i tabell 5. Tabell 5 visar den totala vikten före och efter analys för provuppsättningarna 1 (0,05 gram) och 2 (0,01 gram) samt dess masskillnad. Positiva värden i kolumnen för masskillnad visar på att massan ökade medan negativa värden innebär att massan minskade.
Tabell 5. Provuppsättningarna 1 och 2 bestående av proverna 1–3 (0,05 gram) och 4–6 (0,01 gram) från provflaska 2 analyserades med LOD. I kolumn ”masskillnad” går det att utläsa att massan ökade efter LOD-analysen.
Provuppsättning Prov Total vikt före torkning inklusive
vågskepp (g)
Total vikt efter torkning inklusive
vågskepp (g)
Masskillnad (g)
1
1 0,7124 0,7168 0,0044
2 0,7055 0,7102 0,0047
3 0,7053 0,7101 0,0048
2
4 0,6318 0,6337 0,0019
5 0,6708 0,6723 0,0015
6 0,6518 0,6536 0,0018
För att kunna verifiera resultatet i tabell 5 upprättades fyra provuppsättningar bestående av tre prov (0,05 gram) som spetsades med en specifik mängd vatten och analyserades med LOD. Resultatet som erhölls från denna verifiering finns i tabell 6. En utökad tabell finns i bilaga 3 som inkluderar
vågskeppets vikt och verklig tillsatt vattenmängd.
Tabell 6. Resultatet av masskillnaden för fyra provuppsättningar som spetsades med 0,1,2 och 4 µl vatten. I kolumnen
”masskillnad” observeras både en ökning (+) och minskning (-) av provmassan efter 48 h.
Provuppsättning Prov Tillsatt mängd vatten (µl)
Total vikt före torkning inklusive
vågskepp (g)
Total vikt efter torkning inklusive
vågskepp (g)
Masskillnad före och efter torkning
(g)
1
1
0
0,6395 0,6412 0,0017
2 0,7221 0,7242 0,0021
3 0,6783 0,6800 0,0017
2
4
1
0,6672 0,6676 0,0004
5 0,6688 0,6684 – 0,0004
6 0,6332 0,6337 0,0005
3
7
2
0,6998 0,6994 – 0,0004
8 0,7286 0,7282 – 0,0004
9 0,7113 0,7107 – 0,0006
4
10
4
0,6929 0,6906 – 0,0023
11 0,6334 0,6311 – 0,0023
12 0,6913 0,6886 – 0,0027
Korrelation mellan LOD och NIR utfördes inte, då vattenhalten ökade istället för att minska under LOD-analysen (tabell 6).
4.3 KF-analys utan extraktion
KF utan extraktion användes till att bestämma vattenmängden i fyra prov à 0,0200 g som ingick i de inledande testerna. Provförberedelsen och bestämd vattenmängd samt viktprocent vatten går att utläsa i tabell 7 och 8. Beräkningar av viktprocent vatten för de initiala testerna och verifiering samt data från KF-analysen redovisas i bilaga 4.
Tabell 7. I de inledande testerna analyserades fyra prov med KF utan extraktion. Vågskeppen som användes vägdes både före och efter KF-analysen.
Prov Vågskepp exklusive
produkt (g) Provmängd (g) Vågskepp inklusive
produkt (g) Verklig provmängd (g)
1 0,6145 0,0201 0,6148 0,0198
2 0,6184 0,0202 0,6191 0,0195
3 0,6422 0,0201 0,6428 0,0195
4 0,5999 0,0202 0,6004 0,0197
Vid KF utan extraktion utfördes ett system suitability test fem gånger mellan varje KF-analys som gav ett värde mellan 195 och 205 mikrogram. Samtliga analyser av vattenmängden i tabell 7 gjordes på följd efter varandra där trippelblankens medelvärde blev 84,4 mikrogram. De registrerade vattenmängderna för proverna 1–4 användes för att beräkna viktprocent vatten, se tabell 8.
18
Tabell 8. Bestämd vattenmängd och viktprocent vatten i fyra prov med KF utan extraktion.
Prov Registrerad vattenmängd i KF (µg)
Viktprocent vatten
% [w/w]
1 534,2 2,27
2 447,5 1,86
3 386,0 1,55
4 372,5 1,46
Verifiering av testomgång
Vattenmängden i provuppsättningarna 1–4, tabell 9, som bestod av frystorkad proteinprodukt från provflaska 2, analyserades med KF utan extraktion för att verifiera resultatet i tabell 8. Resultatet av provförberedelsen och uppmätt vattenmängd för verifieringen med KF utan extraktion finns i tabell 9 och 10.
Tabell 9. Provförberedelse till analysen med KF utan extraktion.
Provuppsättning Prov Vågskepp exklusive produkt (g)
Uppvägd provmängd
(g)
Vågskepp inklusive produkt (g)
Vågskepp efter KF- analys (g)
Verklig provmängd
(g)
1 A1 0,7090 0,0214 0,7303 0,7100 0,0203
B2 0,6019 0,0209 0,6228 0,6027 0,0201
2 C3 0,6046 0,0209 0,6254 0,6058 0,0196
D4 0,5859 0,0205 0,6064 0,5870 0,0194
3 E5 0,5920 0,0209 0,6128 0,5923 0,0205
F6 0,6140 0,0209 0,6347 0,6152 0,0195
4 G7 0,6430 0,0204 0,6632 0,6444 0,0188
H8 0,6280 0,0213 0,6492 0,6298 0,0194
Tabell 10. Bestämda vattenmängder för prov A1-A8
Provuppsättning Prov Uppmätt vattenmängd i KF (µg)
1
A1 555,4
B2 547,7
2
C3 544,1
D4 515,4
3
E5 550,2
F6 430,0
4
G7 622,0
H8 577,3
De uppmätta vattenmängderna med KF utan extraktion för prov A1-H8 i tabell 10 användes för att bestämma viktprocent vatten, se tabell 11.
Tabell 11. Beräknad viktprocent vatten % [w/w] för prov A1–H8.
Provuppsättning Mängd tillsatt
vatten (µl) Prov Viktprocent vatten % [w/w]
1 0 A1 2,345
B2 2,368
2 3 C3 2,417
D4 2,454
3 6 E5 2,204
F6 2,809
4 9 G7 2,785
H8 2,972
Viktprocent vatten för proverna A1–H8 sattes gentemot den tillsatta mängden vatten (0,3,6 och 9 µl), se figur 6. Prov E5 från provuppsättning 3 (gulmarkerad i tabell 11) var en misstänkt outlier som eliminerades, se figur 6 och 7.
Figur 6. Prov A1–H8 åskådliggörs i diagrammet. Prov E5 (gulmarkerad) var en misstänkt outlier.
Tillsatt vattenmängd (µl)
10 8
KF utan extraktion
3,2 y = 0,0545x + 2,299
3 R² = 0,5134
2,8 2,6 2,4 2,2
2
0 2 4 6
Viktprocent vatten % [w/w]
20
Figur 7. Elimination av prov E5 förbättrade linjäriteten för de kvarstående proverna A1–D4 och F6–H8.
En kalibreringsmodell skapades för proverna A1–D4 och F6–H8 i metoden för KF utan extraktion.
Prov E5 användes inte i kalibreringsmodellen eftersom linjäriteten förbättrades utan den enligt figur 7. Uppmätta spektrum (21 stycken) för proverna A1–D4 och F6–H8 ansattes som kalibrering, se tabell 12.
Tillsatt vattenmängd (µl)
10 8
6 4
2 0
3 2,8 2,6 2,4 2,2 2
y = 0,0652x + 2,3206 R² = 0,8848 3,2
KF utan extraktion
Viktprocent vatten % [w/w]
Tabell 12. Predikterade NIR-värden för prov A1–D4 och F6–H8 erhölls från den upprättade kalibreringsmodellen för KF utan extraktion.
Prov Spektrum Användning
Referensmetod (verklig) %
[w/w]
NIR predikterat (beräknad) %
[w/w]
Skillnad % [w/w]
1 1 av 3 Kalibrering 2,345 2,407 0,062
1 2 av 3 Kalibrering 2,345 2,354 0,009
1 3 av 3 Kalibrering 2,345 2,386 0,041
2 1 av 3 Kalibrering 2,369 2,335 -0,034
2 2 av 3 Kalibrering 2,369 2,287 -0,082
2 3 av 3 Kalibrering 2,369 2,295 -0,074
3 1 av 3 Kalibrering 2,417 2,417 0
3 2 av 3 Kalibrering 2,417 2,456 0,039
3 3 av 3 Kalibrering 2,417 2,402 -0,015
4 1 av 3 Kalibrering 2,454 2,489 0,035
4 2 av 3 Kalibrering 2,454 2,538 0,084
4 3 av 3 Kalibrering 2,454 2,499 0,045
6 1 av 3 Kalibrering 2,809 2,765 -0,044
6 2 av 3 Kalibrering 2,809 2,809 0
6 3 av 3 Kalibrering 2,809 2,71 -0,099
7 1 av 3 Kalibrering 2,785 2,836 0,051
7 2 av 3 Kalibrering 2,785 2,857 0,072
7 3 av 3 Kalibrering 2,785 2,815 0,03
8 1 av 3 Kalibrering 2,972 2,959 -0,013
8 2 av 3 Kalibrering 2,972 2,885 -0,087
8 3 av 3 Kalibrering 2,972 2,951 -0,021
Predikterade NIR-värden plottades gentemot referensvärden som var uppmätta med KF utan extraktion, se figur 8.
22
Figur 8. Kalibreringsmodell för KF utan extraktion där NIR värden plottades gentemot referensvärden.
Sammanfattning av kalibreringsmodellen för KF analys utan extraktion (tabell 16 och figur 8) presenteras i tabell 13.
Tabell 13. En sammanfattning av kalibreringsmodellen för KF utan extraktion av proverna A1–D4 och F6–H8.
Parameter Resultat
Korrelationsfaktor 0,97418
y-Intercept 0,1323
Lutning 0,9489
Root Mean Square Error of Calibration, RMSEC 0,0532
Antalet kalibreringsprover 21
Kalibreringsintervall 2,345–2,972
4.3 KF-analys med extraktion
KF-analys med extraktion användes för att bestämma vattenmängden i den frystorkade proteinprodukten som var fördelade i 8 vialer (prov A9–H16), se tabell 14. Innan vialerna analyserades samlades spektrum för dem in med NIR, se bilaga 2. Beräkningar för viktprocent vatten samt data från KF-analysen redovisas i bilaga 4.
KF (verklig) % [w/w]
3,2 3
2,8 2,6
2,4 2,2
3,2 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2
NIR mot KF
NIR (beräknad) % [w/w]
Tabell 14. Sammanställning av analysen KF med extraktion av vialer.
Provuppsättning Prov Injicerad mängd vatten (µl) Vial med produkt (g) Tom vial (g) Verklig produktvikt (g) Registrerad vattenmängd för 1 ml i KF (µg) Viktprocent vatten [w/w]
1 A9
0 37,6444 36,7768 0,8676 294,0 0,45
B10 37,6071 36,7212 0,8859 161,9 0,14
2 C11
3 37,2853 36,4108 0,8745 201,4 0,24
D12 37,2002 36,3086 0,8916 213,6 0,26
3 E13
6 37,7991 36,9325 0,8666 219,1 0,28
F14 37,9819 37,0943 0,8876 256,7 0,36
4 G15
9 38,3019 37,4065 0,8954 348,1 0,56
H16 37,4911 36,6061 0,8850 297,2 0,45
Genom att eliminera prov 1 (gulmarkerad) i tabell 14 från beräkningarna förbättrades linjäriteten i analysmetoden KF med extraktion. En jämförelse av linjäriteten för prov A9-H16 med
och utan prov A9 åskådliggörs i figur 9a och 9b.
Kalibreringsmodell
En kalibreringsmodell för prov B10–H16 upprättades utifrån provernas viktprocent från tabell 14.
Prov A9 med tillhörande spektrum (1–3) uteslöts från kalibreringsmodellen eftersom provet försämrade linjäriteten enligt figur 9a. Samtliga spektrum som tillhörde prov B10–H16 tilldelades kalibrering som användningsområde, se tabell 15.
R² = 0,3686
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 5 10
Viktprocent i KF
Tillsatt volym vatten (µl)
Extraktion av vialer (prov 1-8)
R² = 0,8772
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 5 10
Viktprocent i KF
Tillsatt volym vatten (µl)
Extraktion av vialer (prov 2-8)
Figur 9b). Linjäriteten för proverna utifrån tabell 14.
Linjäriteten optimerades genom att eliminera prov A9 (gulmarkerad) i figur 9a.
Figur 9a). Linjäriteten för vattenmängden i samtliga prover (A9–H16) utifrån tabell 14. Prov A9 (gulmarkerad) var en misstänkt outlier.
24
Tabell 15. Predikterade NIR-värden för prov B10–H16 erhölls från den upprättade kalibreringsmodellen för KF med extraktion.
Prov Spektrum Användning Referensmetod (verklig) [%]
NIR predikterat (beräknad) [%]
Residuals (skillnad) [%]
2 1 av 3 Kalibrering 0,144 0,101 -0,043
2 2 av 3 Kalibrering 0,144 0,121 -0,023
2 3 av 3 Kalibrering 0,144 0,115 -0,029
3 1 av 3 Kalibrering 0,236 0,264 0,028
3 2 av 3 Kalibrering 0,236 0,266 0,03
3 3 av 3 Kalibrering 0,236 0,257 0,021
4 1 av 3 Kalibrering 0,259 0,252 -0,007
4 2 av 3 Kalibrering 0,259 0,234 -0,025
4 3 av 3 Kalibrering 0,259 0,257 -0,002
5 1 av 3 Kalibrering 0,279 0,313 0,034
5 2 av 3 Kalibrering 0,279 0,304 0,025
5 3 av 3 Kalibrering 0,279 0,305 0,026
6 1 av 3 Kalibrering 0,357 0,393 0,036
6 2 av 3 Kalibrering 0,357 0,372 0,015
6 3 av 3 Kalibrering 0,357 0,397 0,04
7 1 av 3 Kalibrering 0,558 0,503 -0,055
7 2 av 3 Kalibrering 0,558 0,515 -0,043
7 3 av 3 Kalibrering 0,588 0,552 -0,036
8 1 av 3 Kalibrering 0,449 0,436 -0,013
8 2 av 3 Kalibrering 0,449 0,457 0,008
8 3 av 3 Kalibrering 0,449 0,422 -0,027
Från tabell 15 ansattes värdena från referensmetoden (verklig) mot NIR predikterat (beräknad). Dessa värden plottades även i ett diagram, se figur 10.
Figur 10. NIR-värdena plottades gentemot värdena från KF med extraktion för prov B10–H16.
Sammanfattning av kalibreringsmodellen för KF analys med extraktion för prov B10-H16 kan observeras i tabell 16.
y = 0,9328x + 0,0201 R² = 0,9496
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
NIR (beräknad) % [w/w]
KF (verklig) % [w/w]
NIR mot KF
Tabell 16. En sammanställning av kalibreringsmodellen för KF med extraktion av proverna B10-H16.
Parameter Resultat
Korrelationsfaktor 0,9496
y-Intercept 0,0201
Lutning 0,9328
Root Mean Square Error of Calibration (RMSEC) 0,0287
Antalet kalibreringsprov 21
Kalibreringsintervall 0,144–0,558
4.4 Kalibrering utan en referensmetod
Förväntad viktprocenten vatten för de åtta spetsade vialerna i provuppsättning 1-4 (tabell 2) var 0,62, 0,95, 1,28 och 1,61. Dessa värden ansattes gentemot motsvarande spektrum, se tabell 17.
Tabell 17. Kalibreringsmodell för metoden utan en referensmetod.
Prov Spektrum Användning
Referensmetod (verklig) %
[w/w]
NIR predikterat (beräknad) %
[w/w]
Skillnad
% [w/w]
1 1 av 3 Kalibrering 0,62 0,647 0,027
1 2 av 3 Kalibrering 0,62 0,701 0,081
1 3 av 3 Kalibrering 0,62 0,629 0,009
2 1 av 3 Kalibrering 0,62 0,595 -0,025
2 2 av 3 Kalibrering 0,62 0,603 -0,017
2 3 av 3 Kalibrering 0,62 0,611 -0,009
3 1 av 3 Kalibrering 0,95 0,946 -0,004
3 2 av 3 Kalibrering 0,95 0,96 0,01
3 3 av 3 Kalibrering 0,95 0,954 0,004
4 1 av 3 Kalibrering 0,95 0,932 -0,018
4 2 av 3 Kalibrering 0,95 0,939 -0,011
4 3 av 3 Kalibrering 0,95 0,955 0,005
5 1 av 3 Kalibrering 1,28 1,226 -0,054
5 2 av 3 Kalibrering 1,28 1,228 -0,052
5 3 av 3 Kalibrering 1,28 1,222 -0,058
6 1 av 3 Kalibrering 1,28 1,31 0,03
6 2 av 3 Kalibrering 1,28 1,298 0,018
6 3 av 3 Kalibrering 1,28 1,296 0,016
7 1 av 3 Kalibrering 1,61 1,598 -0,012
7 2 av 3 Kalibrering 1,61 1,605 -0,005
7 3 av 3 Kalibrering 1,61 1,651 0,041
8 1 av 3 Kalibrering 1,61 1,616 0,006
8 2 av 3 Kalibrering 1,61 1,638 0,028
8 3 av 3 Kalibrering 1,61 1,602 -0,008
26 Från tabell 17 ansattes värdena från referensmetoden (verklig) mot NIR predikterat (beräknad).
Dessa värden plottades även i ett diagram, se figur 11.
Figur 11. Förväntade värden 0,62, 0,95, 1,28, och 1,61 viktprocent vatten kalibrerades gentemot tillhörande spektrum i NIR.
Sammanfattning av kalibreringsmodellen för de förväntade värdena kan observeras i tabell 18
Tabell 18. Sammanfattning av kalibreringsmodellen utan en referensmetod.
Parameter Resultat
Korrelationsfaktor 0,9932
y-skärningspunkt 0,0076
Lutning 0,9932
Root Mean Square Error of Calibration, RMSEC 0,0304
Antalet kalibreringsprov 24
Kalibreringsintervall 0,62–1,61
Förväntade värden
1,8 1,6
1,4 1,2
1 0,8
0,6 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6
NIR mot förväntade värden
värden värdvärden vs
NIR (beräknad) % [w/w]
Förväntade värden % [w/w]
