BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit PP119JAA 2010/07 Svenska

AVSEDD ANVÄNDNING

BACTEC NAP TB Differentiation Test (differentieringstest) är en test för differentiering av Mycobacterium tuberculosis-komplexet från andra mykobakterier. Produkterna används huvudsakligen med BACTEC 460TB-instrumentet. BACTEC NAP (ρ-nitro-α- acetylamino-β-hydroxy-propiofenon) TB Differentiation Test rekommenderas för användning med BACTEC 12B Medium för snabb differentiering av TB-komplexet (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum och M. microti) från andra mykobakterier än M. tuberculosis (MOTT). Denna test bör användas i samband med bakteriell morfologi på utstryk och tillväxtegenskaper i BACTEC 12B Medium.

SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING

BACTEC 12B-medium möjliggör inte observation av kolonimorfologi, GI-resultat (Growth index, tillväxtindex) kan dock vara karakterisktiska för vissa mykobakteriespecies. M. tuberculosis och M. bovis visar långsam tillväxt med en 2- till 3-dubbel ökning i dagligt GI-resultat medan andra mykobakterier (MOTT-bacilli) kan visa en daglig ökning på så mycket som 10 gånger. Visuellt visar tillväxt av M. tuberculosis i BACTEC 12B-medium små fläckar eller klumpar med ett klart medium. Andra mykobakterier växer i mycket små partiklar med ett något grumligt medium.

Utstryk från en positiv flaska (GI = 100 eller mer) kan ge en indikation på den typ av mykobakterier som växer i mediet. Förekomst av spiralformade strängar och klumpar är karakteristiskt för M. tuberculosis (M. bovis och M. kansasii kan också bilda strängar).

Andra mykobakterier har annan karakteristisk morfologi, t.ex. M. avium/M. intracellulare som visar förgreningar med långa bacilliesträngar.

BACTEC NAP-testen är ett ytterligare hjälpmedel vid snabb differentiering av M. tuberculosis, den viktigaste av alla mykobakteriespecies. Denna test är oberoende av niacin-testen. Ett prov av aktivt växande kultur inokuleras i NAP-flaskan som innehåller en lapp med 5 µg NAP. Flaskan, tillsammans med kontrollen, inkuberas och tillväxt i närvaro av NAP övervakas på BACTEC 460TB-instrumentet. Analysering av de dagliga GI-avläsningarna inom följande 3 till 5 dagar är till hjälp vid differentiering av TB-komplexet från andra mykobakterier.

PRINCIPER FÖR METODEN

NAP (ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiofenon), en indeterminant förening i syntesen av kloramfenikol, inhiberar nästan helt mykobakterier som tillhör TB-komplexet (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum och M. microti), medan andra mykobakterier visar antingen en lätt eller ingen inhibition alls. När mykobakteriell tillväxt inhiberas i närvaro av NAP inhiberas också utvecklingen av ¹⁴CO₂, vilket indikeras av antingen ingen ökning eller en minskning av GI-värdet. Denna effekt på GI används som ett redskap för identifiering.

REAGENSER

BACTEC NAP-satsflaskorna innehåller en papperslapp med följande aktiva ingrediens:

ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiofenon 5 µg Varningar och försiktighetsbeaktanden:

Avsedd för in vitro-diagnostik.

Denna produkt innehåller torrt naturgummi.

Patogena mikroorganismer, inklusive hepatitvirus och humant immunbristvirus, kan förekomma i kliniska prover. ”Allmänna försiktighetsbeaktanden”^1-4och institutionens riktlinjer bör följas vid hantering av alla föremål som kontaminerats med blod eller andra kroppsvätskor.

En flaska med NAP differentieringstest FÅR INTE användas om den visar tecken på kontamination, missfärgning eller om den inte innehåller en papperslapp. Fukt, särskilt vid högre temperaturer orsakar en snabb försämring av NAP.

Iakttag alltid aseptisk teknik och vedertagna infektionsförebyggande försiktighetsåtgärder mot mikrobiella risker.⁵Använd alltid i ett biologiskt säkerhetsskåp. Undvik kontakt med papperslappen. Efter användning skall provbehållare och annat kontaminerat material steriliseras i autoklav.

Före användning bör varje flaska undersökas för tecken på skada.

Flaskor som visar tecken på skada skall kasseras före inokulation. I sällsynta fall kan sprickor ha uppstått i glasflaskan och halsen kan gå sönder när locket dras av eller under hantering. Det kan också vid sällsynta tillfällen förekomma att flaskan inte är fullständigt förseglad. I båda fallen kan flaskans innehåll läcka eller spillas ut, speciellt om flaskan vänds upp och ned. Om flaskan har inokulerats skall det utläckta eller spillda materialet hanteras med försiktighet eftersom det kan innehålla patogena organismer/agens. Innan de kasseras skall alla inokulerade flaskor steriliseras i autoklav.

Positiva odlingsflaskor för renodling eller färgning: Före uttagning av prov ur flaskan måste man släppa ut den gas som kan bildas av den mikrobiella metabolismen. Iakttag alltid aseptisk teknik och vedertagna infektionsförebyggande försiktighetsåtgärder mot mikrobiella risker. Utför alla förfarande i ett lämpligt biologiskt säkerhetsskåp i ett rum med fullgott ventilationssystem

0 BACTEC NAP TB Differentiation Test Kit

8

enligt rekommendationer från CDC.⁵Använd lämplig skyddsrock, munskydd och handskar vid hantering av prover och odlingar med potentiella patogener. Följ rekommendationer från CDC och OSHA.

För att minimera risken för läckage vid inokulation av prover på odlingsflaskor, skall sprutor med permanent fastsatta nålar eller Luer-Lok-spetsar användas.

Denna förenings toxicitet har inte studerats. Iakttag tillämpliga förfaranden för att undvika exponering vid dess användning.

Förvaringsanvisningar

BACTEC NAP-flaskor skall förvaras i kylskåp vid 2 – 8 °C, skyddade från direkt solljus. Får ej exponeras för hetta eller höga temperaturer eftersom NAP är instabilt vid värme.

Utgångsdatum gäller oöppnad flaska som förvarats enligt anvisningarna.

PROVTAGNING

Aktivt växande kulturer i BACTEC 12B-medium kan användas för att utföra NAP-testen. Provkulturen skall vara ren och fri från icke-mykobakteriell kontamination.

FÖRFARANDEN

Tillhandahållet material: Tio flaskor, vardera innehållande en NAP-lapp.

Material som krävs men ej medföljer: BACTEC 460TB Instrument, BACTEC 12B Medium, tuberkulinspruta med fastsatt nål, desinfektionsmedel, alkoholtork, BACTEC Diluting Fluid.

För detaljer hänvisas till BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual (MA-0029).

När en flaska med BACTEC 12B-medium visar ett GI-värde på 10 eller mer skall flaskan testas dagligen tills GI når 50 – 100.

Verifiera att kulturen inte är kontaminerad genom att utföra en Gram-färgning eller renodling. Homogenisera kulturen med en tuberkulinspruta (permanent fastsatt nål) och överför aseptiskt med samma spruta 1 mL kultur i NAP-flaskan. Torka av locket på NAP-flaskan och kontrollflaskan (originalkulturen) med lämpligt desinfektionsmedel och rengör därefter med en alkoholtork.

Testa båda flaskorna på BACTEC omedelbart för utdrivning med 5 – 10-procentig CO2. Bortse från avläsningarna. Inkubera vid 37 °C ± 1 °C eller vid optimal temperatur och testa dagligen de följande 2 till 6 dagarna. Registrera det dagliga GI-värdet i NAP- flaskan och originalflaskan som också fungerar som kontroll.

Om GI-värdet är mer än 100 skall kulturen spädas enligt följande riktlinjer innan NAP-flaskan inokuleras:

GI 50 – 100 ingen spädning

GI 101 – 200 0,8 mL i en flaska med färskt BACTEC 12B-medium GI 201 – 400 0,6 mL i en flaska med färskt BACTEC 12B-medium GI 401 – 600 0,4 mL i en flaska med färskt BACTEC 12B-medium GI 601 – 800 0,3 mL i en flaska med färskt BACTEC 12B-medium GI 801 – 999 0,2 mL i en flaska med färskt BACTEC 12B-medium GI 999 mer 0,1 mL i en flaska med färskt BACTEC 12B-medium.

än en dag

Låt inte kulturen växa mer än till GI-toppvärdet (999). Om en kultur har växt för mycket, renodla i en flaska med BACTEC 12B-medium, inkubera och testa dagligen till önskat GI erhålls.

Om en odling på fast medium skall testas, gör en suspension genom att skrapa av ett par representativa kolonier och slamma upp dem i ett rör med sterilt vatten eller BACTEC spädningsvätska. Justera suspensionens grumlighet så att den är jämförbar med McFarland-standard nr. 1. Inokulera 0,1 mL av denna suspension i en flaska med BACTEC 12B-medium. Inkubera och testa dagligen på BACTEC 460TB-instrumentet. Följ förfarandet som beskrivs ovan när GI når 50 – 100.

KVALITETSKONTROLL

Följande positiva och negativa kontroller bör inkluderas i varje testomgång för att säkerställa testens noggrannhet.

M. tuberculosis, H37Rv ATCC nr. 27294

M. kansasii ATCC nr. 35775

M. intracellulare ATCC nr. 13950

M. avium ATCC nr. 35717

*För detaljer hänvisas till BACTEC 460TB System Product and Procedure Manual (MA-0029).

Flaskorna FÅR EJ användas efter utgångsdatum.

Spruckna eller defekta flaskor som visar tecken på sprickor eller andra defekter FÅR EJ användas utan skall kasseras på föreskrivet sätt.

Kvalitetskontrollbevis medföljer varje NAP kit-sats. Kvalitetskontrollbevis visar testorganismerna som används för denna typ av produkt.

Som en del i det dagliga undershållsschemat skall prestandatestflaskor (BACTEC Performance Test Kit) testas på BACTEC- instrumentet. Om låga avläsningar erhålls trots att testen med prestandatestflaskorna utfördes korrekt, kan det tyda på eventuella instrumentproblem (se förpackningsinlagan till BACTEC PTK, PP-046JAA).

Kvalitetskontroll måste utföras i enlighet med gällande bestämmelser eller ackrediteringskrav samt laboratoriets etablerade procedurer för kvalitetskontroll. Det rekommenderas att användaren konsulterar tillämpliga NCCLS-riktlinjer och CLIA- föreskrifter för lämpliga kvalitetskontrollförfaranden.

TOLKNING AV RESULTAT

Kontrollens dagliga GI (originalodlingsflaskan) kommer att fortsätta att öka. I NAP-testflaskan beror ökningen eller minskningen på den mykobakteriespecies som förekommer. Minskat eller oförändrat GI-värde indikerar TB-komplex, medan ökat GI indikerar MOTT-bakterier. Följande kriterier bör gälla nästan alla mykobakterier i NAP-flaskan.

TB-komplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum)

• två konsekutiva signifikanta minskningar av GI efter inokulationen

• en lätt, men inte signifikant, ökning de första två dagarna och därefter en minskning eller ingen ökning av GI MOTT-bacilli

• den dagliga GI-avläsningen ökar till över 400 inom fyra dagar

• en lätt ökning eller ingen ökning alls den första till tredje dagen efter inokulationen, därefter två konsekutiva dagliga signifikanta ökningar efter dag två

En “signifikant” ökning eller minskning innebär en förändring på mer än 20 % från en dag till nästa.

METODENS BEGRÄNSNINGAR

Separation av TB-komplex från MOTT med BACTEC NAP TB differentieringstesten är endast möjligt med isolerade renkulturer. En blandad kultur av TB-komplex och MOTT-bacilli kommer att resultera i en ökning av GI, vilket indikerar endast MOTT-bacilli.

Kontamination med andra bacilli än mykobakterier kan också resultera i en falsk ökning av GI när kontaminanten nyttjar substratet. NAP-flaskor bör kontrolleras visuellt för eventuell tydlig kontamination och/eller grumlighet. Ett ABF-utstryk från NAP-flaskan i händelse av ett ökat GI kan vara till hjälp vid verifiering av förekonst av MOTT-bacilli och TB eller kontaminerande bakterier.

Enstaka stammar av M. kansasii kan inhiberas av NAP till den grad att resultaten rapporteras inkorrekt. Ytterligare specificering skall utföras med andra metoder.

På grund av de i odlingsmedier ingående biologiska materialens natur och organismernas variabilitet, skall användaren vara medveten om möjligheten för varierande resultat vid påvisning av vissa organismer.

FÖRVÄNTADE VÄRDEN

Resultatens rapporteringstid varierar från 2 till 6 dagar beroende på mykobakteriernas species. Resultaten skall endast rapporteras när en tydlig trend åstadkoms. Om Gi förblir oförändrat, skall identifiering av TB-komplex inte tolkas efter mindre än 4 dagar. Genomsnittlig tid för slutförd NAP-test har rapporterats vara 4 dagar.^6,7-11

NAP-testresultat skall stödjas av tillväxtkarakteristik och ABF-morfologi på ett syrafast färgat utstryk. Utstryket kan också indikera förekomst av blandade kulturer eller kontamination.

KLINISKA PRESTANDA

Även om de flesta NAP-test är lätta att tolka kan vissa test kräva ytterligare inkuberingstid för att kunna påvisa en tydlig trend.

Detta är av största vikt med mykobakterier som delvis inhiberas av NAP och visar en fördröjd ökning av GI eller en längre tröghetsfas i närvaro av NAP (t.ex. vissa stammar av M. kansasii, M. gastri, M. szulgai, M. terrae och M. triviale). Alla MOTT-bacilli som studerades under NAP-utvärderingen visade en ökning av GI inom 5 till 6 dagar.^5,7 Enstaka stammar av M. kansasii kan dock inhiberas mer än vanligt av NAP och därför identifieras på felaktigt sätt med testen. Inkubering vid optimal temperatur är nödvändig för att korrekta resultat skall erhållas. Mykobakterier som t.ex. M. chelonae och M. marinum, som växer vid lägre temperaturer än 37 °C, och M. xenopi, som växer vid en högre temperatur, kan ge inkorrekta resultat om de testas vid 37 °C. I fall där den optimala inkuberingstemperaturen inte har fastställts bör testen utföras vid mer än en temperatur. I tidigare studier beräknades testens totala sensitivitet och specificitet vara 98 – 99 %.^7,10

TILLGÄNGLIGHET Kat. nr. Beskrivning

442103 BACTEC NAP TB Differentiation Kit, 5 µg NAP per flaska, 10 flaskor per kartong 442004 BACTEC 12B Medium, 4 mL, 100 per kartong

REFERENSER

1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.

2. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80.

3. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.

4. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.

5. Kent, P.T. et al. Public health mycobacteriology, a guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Division of Laboratory Training and Consultation. Atlanta, GA, 1985.

6. Gross, W.M. et al. Radiometric selective inhibition tests for differentiation of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, and other mycobacteria. J. Clin. Microbiol., 21:565-568, 1985.

7. Laszlo, A. et al. Evaluation of a rapid radiometric differentiation test for the Mycobacterium tuberculosis complex by selective inhibition with ρ-nitro- α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone. J. Clin. Microbiol., 19:694-695, 1984.

8. Libonati, J.P. et al. Identification and direct drug susceptibility testing of mycobacteria by the radiometric method. Abstract C300, A.S.M. Meeting, St. Louis, MO 1984.

9. Morgan, M.A. et al. Evaluation of the ρ-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenone differential test for identification of Mycobacterium tuberculosis complex. J. Clin. Microbiol., 21:634-635, 1985.

10. Siddiqi, S.H. et al. Rapid radiometric methods to detect and differentiate Mycobacterium tuberculosis / M. bovis from other mycobacterial species. Amer. Rev. Respir. Dis., 130:634-640, 1984.

11. Stager, C.E. et al. Identification of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens by direct inoculation of the BACTEC NAP Test. Abstract C267, A.S.M. Annual Meeting, Las Vegas, NV, 1985.

%

O

Sparks, MD 21152 USA 800-638-8663 www.bd.com/ds

$

Shannon, County Clare, Ireland

ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection.